Diplomová práce
1. ÚVOD
8
2. STUDOVANÁ PROBLEMATIKA
9
2.1. BAKTERIE 2.1.1. PROTEOBAKTERIE 2.1.2. NITROSPIRA 2.2. MAGNETOTAKTICKÉ BAKTERIE 2.2.1. VYBRANÍ ZÁSTUPCI MTB 2.3. BIOMINERALIZACE 2.4. MAGNETOZÓMY 2.4.1. MAGNETOZOMÁLNÍ MEMBRÁNA (MM) 2.5 SEPARAČNÍ METODY PRO IZOLACI MTB 2.5.1. „MAGNETIC COLLECTION“ 2.5.2. „HANGING DROP“ 2.5.3. „RACE-TRACK“
9 10 11 11 12 14 15 17 18 18 19 20
3. CÍL PRÁCE
21
4. LOKALITY
22
5. METODIKA
23
5.1. ODBĚR VZORKŮ A JEJICH ZPRACOVÁNÍ 5.2. ANALÝZA VODY Z PROSTŘEDÍ 5.3. POTVRZENÍ PŘÍTOMNOSTI MTB PŘÍMÝM POZOROVÁNÍM 5.4. GRANULOMETRICKÁ ANALÝZA 5.5. STANOVENÍ CELKOVÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (TOC) 5.6. CELKOVÁ ABUNDANCE BAKTERIÍ 5.6.1. ISOPYKNICKÁ HUSTOTNÍ CENTRIFUGACE 5.6.2. STANOVENÍ ABUNDANCE BAKTERIÍ 5.7. TRANSMISNÍ ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE (TEM) 5.8. METODA KLONOVÁNÍ GENU
23 23 23 24 25 25 25 27 29 29
6. VÝSLEDKY A DISKUZE
31
6.1. ANALÝZA VODY 6.2. POTVRZENÍ PŘÍTOMNOSTI MTB PŘÍMÝM POZOROVÁNÍM 6.3. GRANULOMETRICKÁ ANALÝZA 6.4. CELKOVÝ ORGANICKÝ UHLÍK (TOC) 6.5. CELKOVÁ ABUNDANCE BAKTERIÍ 6.6. TRANSMISNÍ ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE (TEM) 6.7. KLONOVÁNÍ A SEKVENACE 16SRRNA
31 32 33 34 34 35 36
8. ZÁVĚR
39
9. LITERATURA
40
10. PŘÍLOHY
44
7
Diplomová práce
1. ÚVOD Sediment vodního prostředí, sladkovodního i mořského je považován za jedno z míst s velmi hojným výskytem bakterií. Bakterie jsou důležité svou schopností rozkladu organických hmot v akvatických ekosystémech, jsou považovány za důležitou součást při přeměně rozpuštěného uhlíku na partikulovaný. Ten může být dále předán do vyšší trofické úrovně. Bakterie se v sedimentu nacházejí
v různých morfologických i fyziologických variantách.
Jednou z těch, kterými se zabývá i tato diplomová práce
jsou tzv.
magnetotaktické bakterie (MTB). Tyto bakterie jsou typické přítomností magnetotaktických částic v cytoplazmě tzv. magnetozómů, které si sami vytváří pomocí biomineralizace. MTB jsou v dnešní době významné zejména pro svoji potencionální možnost použitelnosti v medicíně, a proto se jimi zabývá mnoho výzkumných týmů po celém světě. Vyskytují se poměrně často, ovšem kultivace v laboratorních podmínkách je ztížena nároky, které MTB vyžadují. V této práci je kladen důraz na potvrzení přítomnosti MTB na vybraných lokalitách pomocí molekulárních technik. Existují dva základní rozdíly, podle kterých se magnetotaktické bakterie rozlišují a tím je přítomnost určité sloučeniny, která z části tvoří jejich magnetozómy. Jednak je to magnetit (Fe3O4) a také greigit (Fe3S4). Typ závisí na prostředí, kde se MTB nacházejí, jelikož prvky potřebné k biomineralizaci čerpají z prostředí. Dalším rozlišovacím faktorem je tvar a uspořádání magnetozómů.
8
Diplomová práce
2. STUDOVANÁ PROBLEMATIKA 2.1. Bakterie Bakterie (Bacteria) jsou prokaryotické organismy, které se vyznačují určitými charakteristickými vlastnostmi. Je to přítomnost mureinové buněčné stěny, nukleoidu, plazmidů, prokaryotického typu ribozómů, DNA bez intronů. Velikost bakterií je rozmanitá. Obvykle se pohybuje mezi desetinami a desítkami mikrometrů. Nejen velikost, ale také tvar bakterií kolísá podle rodů a někdy i podle druhů. Bakteriální buňky mají různý tvar a seskupení – tyčinkovitý (diplobakterie, streptobakterie a palisádové bakterie), kulovitý (koky, diplokoky, tetrakoky, stafylokoky, streptokoky a sarciny), zakřivený (vibria, spirily, spirochéty), větvený či vláknitý. Tloušťka bakteriálních tyčinek se pohybuje v rozmezí 0,3 až 2 µm, délka bývá 1 až 7 µm. Průměr koků je zhruba 0,5 až 5,5 µm. Zakřivené bakterie však mohou být dlouhé až 500µm s tloušťkou 0,2 až 0,75 µm. Dle Gramova barvení dělíme tradičně na grampozitivní (Firmicutes), gramnegativní (Gracilicutes) a bakterie bez buněčné stěny (Tenericutes). Další dělení může být prováděno podle kultivačních znaků, jako je teplota (podle optima na psychrofilní /15 °C/, mezofilní /20-45 °C/, termofilní /45-70 °C/, hypertermofilní /70-90 °C/), pH (alkalofilní /nad 8/, neutrofilní /6 – 7/, acidofilní /pod 6/, acidorezistentní), vztah k O2 (aerobní, anaerobní). Rozmnožování je nepohlavní – příčným dělením, případně pučením. Aktivní pohyb je prováděn pomocí různých typů bičíků. Může být též klouzavý nebo pomocí taxe (magneto, foto, aj.). Z fylogenetického hlediska dělíme živé organismy do tří říší. Každá z nich je na nejvyšší úrovni. Dřívější skupina Prokaryota se rozdělila, Eukaryota zůstala. Rozlišuje se nyní takto: Bacteria, Archea a Eukaryota (Obr.č.1). Námi studované magnetotaktické bakterie (MTB, viz níže) patří do kmenů Proteobacteria a Nitrospira.
9
Diplomová práce
Obr.č. 1 Fylogeneze živých organismů (Brock et al. 2008)
2.1.1. Proteobakterie Jedna ze skupin říše Bacteria tvoří skupinu většinou známých gramnegativních bakterií, které jsou však dosti rozdílné z metabolického (fyziologického) hlediska. Dělí se na následující pododdělení: alfa – beta – gama – delta a epsilon proteobacteria. Do skupiny Proteobacteria patří i námi studované magnetotaktické bakterie (MTB, viz níže). Na základě sekvenace DNA byly zařazeny zejména do podskupin alfa, delta a beta.
10
Diplomová práce
2.1.2. Nitrospira Kmen Nitrospira spadající do Bacteria byl popsán na základě sekvenování ribozomální RNA. Zástupci tohoto kmene mají schopnost oxidovat NO2- a NO3- a jsou autotrofní. Navzdory těmto vlastnostem jsou ale odlišné od klasických nitrifikačních bakterií. Nitrospira např. postrádá interní membránu, běžně nacházenou u druhů nitrifikačních Proteobakterií (Brock et al. 2006). Někteří zástupci kmene Nitrospira jsou mají také magnetotaktické vlastnosti.
2.2. Magnetotaktické bakterie Magnetotaktické bakterie (MTB) byly objeveny téměř před 40-ti lety, v roce 1975 (Frankel 2009). MTB řadíme mezi gramnegativní prokaryota, podskupiny α (alfa) a δ (delta) skupiny Proteobacteria a do kmene Nitrospira (Obr.č. 3). Tyto bakterie se vyskytují kosmopolitně, byly zjištěny v mnoha lokalitách po celém světě, například v USA (Blakemore et al. 1979), Japonsku (Kawaguchi et al. 1995), Řecku (Sievert et al. 1999), Brazílii (Spring et al. 1998), Německu (Flies et al. 2005a, Flies et al. 2005b) a Číně (Liu et al. 2006). MTB jsou převážně akvatické – sladkovodní i mořské a pohybují se podél geomagnetického pole Země (Frankel 2009). Bakterie se na severní polokouli pohybují převážně k jižnímu pólu, bakterie na jižním pólu naopak k severu. Nejnovější poznatky ale také potvrzují přítomnost MTB na severní polokouli, které se pohybují k severnímu pólu magnetu. Magnetotaktické bakterie tuto svoji schopnost pravděpodobně používají v případech, kdy jsou vlivem turbulence různého původu vytrženy ze svého prostředí. Největší množství MTB se nachází v nebo blízko tzv. “oxic-anoxic transition zone” (Flies et al. 2004) (Obr.č. 2). Oxicko-anoxická zóna (OATZ) se ve sladkovodním prostředí nachází v místě přechodu sediment/voda,
na rozhraní aerobního a anaerobního
metabolismu. Mechanismem, který pomáhá k orientaci - magnetotaxi jsou tzv. magnetozómy (viz 2.4.) (Flies et al. 2004). Termín magnetotaxické bakterie nemá žádný taxonomický význam, ale i přesto má skupina těchto bakterií několik společných znaků. Jejich metabolismus je výhradně respirační, jsou mikroaerofilní nebo anaerobní či obojí dohromady a jsou to mezofilové, kteří mají nitrogenázovou aktivitu a pravděpodobně mohou fixovat atmosférický dusík. Nejdůležitější je však přítomnost magnetických bakteriálních částic. 11
Diplomová práce
Obr.č. 2 Oxicko-anoxická zóna (Bazylinski et al. 2002) Přestože nebylo publikováno mnoho studií zabývajících se nároky MTB na chemismus prostředí, tento faktor bude hrát jistě nezanedbatelnou roli. Například studie Bazylinskiho (Bazylinski 2004) dokazují závislost výskytu magnetotaktických kmenů MV-1a MV-2 na chemismu prostředí. Tyto chemolitoautotrofní bakterie vyžadují jako donor elektronů S2O32- / H2S, N2O / O2 jako konečného příjemce elektronů a HCO3- / CO2 využívá pro zdroj uhlíku (Bazylinski et al. 2004).
2.2.1. Vybraní zástupci MTB Magnetotaktické bakterie jsou typickými gradientními mikroorganismy. To je také důvod, proč nelze napodobit ideální podmínky v laboratoři. Proto je tedy většina známých MTB laboratorně nekultivovatelná. Ta část známých MTB, které jsou kultivovatelné a lze tedy získat čistou kulturu,
patří
do
rodu
Magnetospirillum
(Alphaproteobacteria):
M.gryphiswaldense kmen MSR-1 (Schleifer et al. 1991), M.magnetotacticum MS-1 (Schleifer et al. 1991), M.magnetotacticum AMB-1 (Matsunaga et al. 1991). Ostatní kultivovatelné kmeny: mořská vibria MV-1 a MV-2 (Bazylinski et al. 1988, Amann et al. 2007), mořské koky MC-1 (Meldrum et al. 1993), rod spirillum kmene MMS-1 (MV-4) (Meldrum et al. 1993) a anaerobní sulfát redukující MTB Desulfobactermagneticus kmen RS-1 (Sakaguchi et al. 1993, Sakaguchi et al. 2002 ). Všichni
kultivovatelní
zástupci
rodu
Magnetospirillum
rostou
chemoorganoheterotrofně. Jako zdroj uhlíku a elektronů využívají určité organické kyseliny, nevyužívají cukry ani fermentací ani oxidací. Jako konečné akceptory elektronů složí kyslík nebo nitráty u všech kultivovatelných kmenů a
12
Diplomová práce všechny mohou být považovány za denitrifikační bakterie, které redukují nitráty (NO3) na plynné produkty oxidu dusného (N2O) či dusíku (N2) (Bazylinski et al. 2007). Jednou
z velmi
zajímavých
magnetotaktických
bakterií
je
Magnetobacterium bavaricum. Je to velká tyčinkovitá bakterie, jež byla izolována z vápenatých sedimentů
v alpském jezeře Chiemsee v Horním
Bavorsku. Dále také později vyizolovaný kmen MHB-1, morfologicky velmi podobný M.bavaricum. Místem nálezu je jezero Wallen See, Brémy. Oba zástupci patří do kmene Nitrospira. Celkový seznam objevených MTB se neustále rozšiřuje. Jsou nacházeny nejen nové kmeny, ale i různé morfotypy. Pro nastínění nynějšího rozčlenění MTB přikládám fylogenetický strom magnetotaktických bakterií (Obr.č.3.).
Obr.č.3 Fylogenetický strom MTB (Bäuerlein 2004)
Magnetotaxické bakterie lze ve vzorku velmi snadno detekovat. Jednou z metod je tzv. „hanging drop“, které může předcházet metoda „magnetic collection“ (viz. 2.5.1., 2.5.2.).
13
Diplomová práce
2.3. Biomineralizace Biomineralizace je proces (Obr.č.4), při němž organismy produkují tzv. biogenní minerály, které se stávají součástí jejich organismu. Jedná se o řízené ukládání v organické matrici, která je tvořena přírodními polymery nebo polysacharidy. Mezi biogenními minerály převažují uhličitany vápníku (kalcit, aragonit), fosforečnany vápníku (apatit, francolit) a vodnatý oxid křemičitý (opál). Biogenní magnetit nebo sulfidy Fe (pyrhotin a greigit Fe3S4) umožňují magnetotaktickým bakteriím orientaci v geomagnetickém poli. V ojedinělých případech biomineralizací vzniká fluorit, pyrit, sádrovec, celestin, baryt nebo goethit. U mikroorganismů byly popsány dva způsoby vzniku materiálů: tzv. biologicky indukovaná biomineralizace („biologically induced mineralization“ – BIM) a biologicky řízená mineralizace („biologically controlled mineralization“ – BCM) (Bazylinski et al. 2005). V biologicky indukované mineralizaci vznikají částice extracelulárně ve vnějším prostředí z metabolitů produkovaných mikroorganismy. Vlastnosti těchto minerálů jsou určeny podmínkami vnějšího prostředí. Obecně se vyznačují variabilním chemickým složením, zhoršenou krystalinitou, různou velikostí a nedostatkem specifické krystalové morfologie, která se v případě magnetitu neliší od krystalické struktury magnetitu vznikajícího ryze anorganickou cestou. Biologicky řízená produkce magnetitu je typická pro skupinu tzv. magnetotaktických bakterií. Tyto mikroorganismy vytvářejí intracelulární struktury, nazývané bakteriální magnetické částice neboli magnetozomy (viz. 2.4.) (Schüler 2008). Dalšími
mikroorganismy,
které
vytvářejí
indukovanou mineralizací jsou např. železo
magnetit
biologicky
redukující bakterie a sulfát
redukující bakterie. Extracelulární magnetit produkují rovněž heterotrofní bakterie Geobacter metallireducens (GS-15) a Thermoanaerobacter ethanolicus (TOR-39). Regulačním mechanismem biomineralizace je koncentrace Fe, nukleace krystalů, redox potenciál a pH. Biochemickou kontrolu procesů umožňuje kompartmentarizace v magnetozómech.
14
Diplomová práce
Obr.č. 4 Model biomineralizace železa – Magnetospirillum sp. (Cochise college on line)
Vznik magnetozómů v krocích: 1. Invaginace cytoplazmatické membrány 2. Příjem Fe iontů z externího prostředí do vzniklých vezikulů o Fe3+ konvertovány na Fe2+ o využití transmembránových kanálů, H+/Fe2+ antiport (sekvenční homologie s Na+/H+ antiportem), transport díky protonovému gradientu o kanály v cytoplazmatické i magnetozomální membráně 3. Nukleace magnetitových krystalů o trans-membránové proteiny Mms6
2.4. Magnetozómy Magnetozómy jsou jednodoménové, chemicky čisté částice o velikosti 35 – 125 nm s magnetickou vlastností, které si MTB vytvářejí pomocí biomineralizace (viz výše). Částice vykazují druhově specifickou, dokonalou krystalovou morfologii. Lze říci, že co bakterie, to unikátní biomineralizační systém. Krystalové částice v řetízcích bakterií jsou potom nadále všechny stejné. Základní struktura megnetozómů (Obr.č.5) je oktahedrální, dodekahedrální a kubická. Další tvary jsou již odvozené (Obr.č. 6, 8).
15
Diplomová práce
Obr.č. 5 Struktury magnetozómů (Bazylinski et al. 2004)
Obr.č. 6 Odvozené struktury magnetozómů (Scheffel et al. 2006)
Magnetozómy se uvnitř bakterie nachází buďto rozptýlené nebo v řetízcích. V tomto případě jsou krystaly navázány na cytoskelet buňky (Obr.č. 7).
Obr.č. 7 Vazba magnetozómů na cytoskelet (Scheffel et al. 2006)
Chemické složení magnetozómů je dvojího typu, podle kterého se MTB řadí do fylogenetických podskupin. Jednou z dvou hlavních je α – podskupina. Ta zahrnuje zástupce, jež mají magnetozómy tvořeny Fe3O4, magnetitem. Druhá 16
Diplomová práce podkupina – δ, má magnetozómy tvořené greigitem – Fe3S4. Magnetotaktické bakterie se také vyskytují i v jiným (pod)skupinách, a to např. mezi βproteobakteriemi a v kmeni Nitrospira. Tyto
struktury
uspořádané
v bakteriálních
buňkách
jim
udělují
magnetický dipólový moment. Cílem je reakce a orientace v případě, kdy je bakterie
vlivem
turbulence
vytržena
z místa
s optimálními
životními
podmínkami. Fungují tedy jako miniaturní interní magnety (Klaban 2001) neboli “vnitřní kompas”.
Obr.č. 8 Diverzita a uspořádání magnetozómů v různých MTB (Schüler 2008)
2.4.1. Magnetozomální membrána (MM) Membrána magnetozómů byla na strukturální a biochemické úrovni studovány na magnetozómech, které byly pomocí magnetických separací a centrifugace vyizolovány z druhu Magnetospirillum gryphiswaldense. U MM lze předpokládat podobnou strukturu. Membrána magnetozómů je podobná ostatním eukaryotním organelám. Skládá se z fosfolipidové dvojvrstvy. MM je také nazývána jako membránový vezikul, jelikož je dokázáno, že membrána magnetozómů vzniká vychlípením vnitřní cytoplazmatické membrány. MM lze 17
Diplomová práce většinou snadno vidět pod elektronovým mikroskopem (Obr.č.9) nebo pomocí kryoelektronových tomografů jako vezikulární struktury, které jsou prázdné nebo částečně zaplněné drobnými nezralými krystaly z magnetitu v na železo chudém prostředí nebo v tzv. „premagnetických“ buňkách (Schüler 2008). Většina poznatků o biochemickém složení této membrány pochází ze studií kmene MSR-1 (Drünber et al. 2004) a AMB-1 (Matsunaga et al. 2005). Membrána obsahuje proteiny, které dosud nebyly nalezeny v jiných buněčných orgánech u jiných mikroorganismů. Jedná se o proteiny Mag A, Mam a Msm (Jogler et al. 2007).
Obr.č.9 Magnetozómy izolované z M.gryphiswaldense. Magnetické krystaly mají v průměru 42 nm a jsou obaleny magnetozomální membránou – viz šipka. Měřítko odpovídá 25 nm (Šafařík et al. 2002).
2.5 Separační metody pro izolaci MTB 2.5.1. „Magnetic collection“ Metoda
„magnetic
collection“
spočívá
v
naakumulování
magnetotaktických bakterií pro efektivnější odběr. Ke sklenici se sedimentem se přiloží magnet do výšky cca 2 – 3 cm nad rozhraní sediment/voda po dobu přibližně 2 hodiny (Obr.č. 10) (Lins et al. 2003, Flies et al. 2005b). Po té se odebere vzorek pro další analýzy z oblasti magnetu, kde je předpokládán větší výskyt MTB.
18
Diplomová práce
2.5.2. „Hanging drop“ Na mikroskopické podložní sklíčko se Pasteurovou pipetou kápne kapka sedimentu z oblasti magnetu (viz výše). K ní se přidá kapka přefiltrované vody z prostředí (sterilní voda z prostředí). Na stranu sklíčka se sterilní vodou se přiloží magnet jižním pólem (Obr.č. 11) a hrana kapky se pozoruje pod mikroskopem s fázovým kontrastem (Olympus BX 60) při zvětšení 400x. Po 5 – 10 min lze pozorovat pohybující se bakterie ve směru k magnetu (Obr.č. 12).
Obr.č. 10 Metoda „magnetic collection“
Obr.č. 11 Metoda „hanging drop“
Obr.č. 12 Reakce bakterií na přiložení magnetu (tzv.magnetotaxe) (Frühwirtová 2007)
19
Diplomová práce
2.5.3. „Race-track“ Pro tento typ separace jsou používány kapiláry připravené z Pasteurových pipet. Širší konec se zkrátí cca na 1 cm délky a užší konec podle délky použité jehly. Užší konec se dále zataví nad plamenem a širší konec se nepatrně ohne nahoru. Kapiláry se sterilizují a do širšího konce se umístí kousek sterilní vaty. Kapilára se pomocí jehly naplní sterilní vodou z prostředí a na vatu se kápne vzorek sedimentu. K užšímu konci se přiloží magnet a cca po dvou hodinách se tenký konec kapiláry ulomí a separát MTB se odebere sterilní injekční jehlou (Flies et al. 2004b). Takto je separát magnetotaktických bakterií připraven k dalšímu použití.
20
Diplomová práce
3. CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce bylo: 1. Z dostupných zdrojů vybrat lokalitu s nejvyšším potvrzeným výskytem magnetotaktických bakterií. Z těchto lokalit odebrat vzorek a zpracovat jej pro další využití 2.
Vizuálně
potvrdit
přítomnost
MTB
pomocí
magnetotaxe
v laboratorních podmínkách. 3. Provést granulometrickou analýzu a stanovit celkové množství organického uhlíku a dusíku. Stanovit celkovou abundanci bakterií pomocí fluorescenčního barvení DAPI. 4. Pomocí extrakce bakteriální DNA ze sedimentu a následné metody klonování zkonstruovat fylogenetický strom.
21
Diplomová práce
4. LOKALITY První vzorek byl odebrán na malém vodním toku Sitka. Lokalita odběru se nachází cca 5 km severně od Olomouce. Sitka pramení v oblasti Hrubého Jeseníku,
v nadmořské výšce 650 m n.m., poslední úsek toku se nachází
v krajině s intenzivní zemědělskou činností. Ústí jako levostranný přítok do řeky Oskavy v blízkosti obce Chomoutova (v nadmořské výšce cca 215 m n.m.). Lokalita Sitka byla vybrána, jelikož i zde byl dříve prokázán výskyt MTB a zároveň proto, že jako jediná má tekoucí charakter. Další vzorek byl odebrán 2 km od centra města Buchlovice, které leží v podhůří lesnatého pohoří Chřiby, 12 km od Uh.Hradiště. Odebírali jsme přímo v areálu Lázní Leopoldov - Smraďavka. Nádrž je kontinuálně plněna sirným pramenem nacházejícím se pod kapličkou. Lokalita Dyje-slepé rameno se nachází blízko CHKO Pálava, mezi obcemi Milovice a Nové Mlýny Poslední dvě lokality byly vybrány podle seznamu z diplomové práce Světlany Frühwirtové. Buchlovice a slepé rameno Dyje byly podle jejich záznamů dvě z nejhojnějších lokalit na výskyt magnetotaktických bakterií.
22
Diplomová práce
5. METODIKA 5.1. Odběr vzorků a jejich zpracování Vzorky jsem získali ze tří různých lokalit (viz. kap. 4. Lokality). Sediment jsme odebírali pomocí lopatky z hloubky vody cca 0,2 až 0,5 m. Samotný vzorek obsahoval částice cca 20cm do hloubky. Získaným sedimentem jsme naplnili plastové kyblíky o objemu 5 l. Součástí odběru bylo také naplnění kanystrů vodou povrchovou i intersticiální pro následné zpracování vzorků a chemickou analýzu vody. Sediment byl zpracován pomocí síta s velikostí oka 1,5 mm a dále je přechováván v umělohmotných nádobách s objemem 0,5 l, kdy sediment zaujímá 2/3 objemu, zbylá 1/3 je voda z prostředí. Nádoby jsou uloženy v temnu při pokojové teplotě s ne úplně dovřeným uzávěrem. Vzorky jsme ponechali v klidu cca 2 měsíce. Přímým pozorováním bylo prokázáno, že po této době je výskyt bakterií ve vzorcích nejhojnější.
5.2. Analýza vody z prostředí Při odběru vzorků jsme také analyzovali charakteristiku vody prostředí, a to vody povrchové i intersticiální.
K měření byl použit multimetr HANNA
HI9892, calibration solution HI9892-25. Cílem této analýzy bylo zjistit základní parametry vody z prostředí, a to: teplota, pH, redox potenciál, vodivost, množství kyslíku a procentuální nasycení. Totální hmotnost dusíku byla později zjištěna v laboratoři. Vzorky Buchlovice a Dyje pocházejí z 27.5. 2008, lokalita Sitka z 9.7. 2008. Zjištěné hodnoty jsou uvedeny v Tab.č. 3.
5.3. Potvrzení přítomnosti MTB přímým pozorováním K potvrzení přítomnosti magnetotaktických bakterií byl používán inverzní optický mikroskop Olympus IX-70, objektiv LCACH PhF2, zvětšení 400x. Dva dny před plánovaným pozorováním byl ke stěně nádoby umístěn magnet jižním pólem směrem k sedimentu. Tento proces měl zaručit zvýšenou
23
Diplomová práce koncentraci MTB ve vzorku. Na mikroskopické podložní sklíčko jsem si připravila vzorek pomocí metody „hanging drop“. Pasteurovou pipetou jsem odebrala kapku sedimentu z oblasti přiloženého magnetu. K sedimentu jsem přidala kapku přefiltrované-sterilní vody z prostředí, kterou jsem získala přefiltrováním přes jednorázové filtry TAMDA. Na stranu sklíčka se sterilní vodou jsem přiložila magnet jižním pólem (Obr.č. 9) a hranu kapky pozorovala pod mikroskopem. Počty pozorovaných bakterií jsem zaznamenávala pomocí znamének: +_výskyt do 1-50 bakterií v zorném poli mikroskopu; ++_výskyt do 50-100 bakterií v zorném poli mikroskopu; +++_vysoký počet bakterií - nelze spočítat; 0_nevyskytovaly se žádné bakterie; -_sediment nebyl kontrolován. Pozorované počty jsou uvedeny v kapitole 6.
5.4. Granulometrická analýza Granulometrická analýza zrnitosti půd spočívá v postupném prosívání materiálu. K tomuto slouží sestava sít s různou velikostí ok, která se umístí na třepačku (Obr.č. 13) a po době cca 2 min se váží obsah jednotlivých sít. Data se dále zpracovávají pomocí software programu SeDi.
Obr.č. 13 Ilustrační foto soupravy k provádění granulometrie (VŠCHT on line)
24
Diplomová práce V tomto případě jsme použili devět sít s velikostí ok (mm): 22,40; 11,20; 8,00; 5,60; 3,00; 1,00; 0,40; 0,10 a 0,08. Síta jsme sestavili vertikálně-sestupně nad sebe a umístili na třepačku. Po dvou minutách jsme síta opatrně rozdělili, aby nedošlo ke ztrátě vzorku a postupně jsem zvážili materiál z jednotlivých sít.
5.5. Stanovení celkového organického uhlíku (TOC) Přirozeně se vyskytující celkový organický uhlík (TOC – total organic carbon) v říčních sedimentech je klíčový komponent v množství chemických, fyzikálních a biologických procesů (Ouyang et al. 2006).
TOC
představuje
celkovou sumu uhlíku vázaného v organických látkách ve vodě. K analýze jsme použili keramické misky o průměru 6 cm a hmotnosti 21,7895 g (podrobněji viz. tab.č. 5). Materiál použitý na granulometrickou analýzu jsme smíchali, aby opět došlo k rovnoměrnému rozmístění částic. Jednotlivé misky jsme naplnili až po okraj vysušeným sedimentem a zvážili. Po té jsme misky se sedimentem umístili do elektrické laboratorní pece (LH 30/13 HT 40) a při teplotě 600°C po dobu 4 hodin žíhali. Tímto procesem se spálí všechny organické částice v sušině. Rozdíl hmotností se převede na procenta celkové hmotnosti sušiny a vynásobí se koeficientem pro obsah organického uhlíku vodní biomasy, tj. 0,45. Takto získáme procentuální hodnotu TOC.
5.6. Celková abundance bakterií
5.6.1. Isopyknická hustotní centrifugace Hustotní
centrifugace
je
metoda
používaná
k
úpravám
environmentálních vzorků sedimentů (Aakra et al. 2000). Této metodě předchází postup, který bakterie uvolní z povrchu částic sedimentu. Isopyknická centrifugace v hustotním gradientu je založena pouze na principu různé hustoty částic. Ostatní vlastnosti jako například velikost, tvar či viskozita tedy nemají na průběh vliv. Základem je prostředí o měnící se hustotě (hustotní gradient), přičemž rozsah hustot média leží v oblasti očekávaných hustot dělených částic. Hustoty obvykle přibývá od hladiny média směrem ke dnu. Z fyzikálního hlediska se jedná o formu rovnovážné centrifugace.
25
Diplomová práce Principem je, že každá částice sedimentuje v centrifugační tubě pouze do té úrovně média, která odpovídá hustotou její vlastní hustotě; zde se zastaví a setrvá. V řadě experimentů, které s touto metodou pracují, je gradient vytvářen tak, že hustota na dně centrifugační tuby odpovídá hustotě částic, které chceme ze vzorku odstranit, zatímco hustotní vrstva nebo vrstvy nad ní odpovídají hustotě částic, které chceme uchovat, případně dále dělit. Jako hustotní gradient pro separaci buněk a jejich komponent se používal Nycodenz. Ten je autoklávovatelný a je na rozdíl od jiných jodovaných gradientových médií méně toxický (Obr.č. 14) (Rickwood et al. 1982).
Obr.č.14 Separace organel prostřednictvím isopyknické hustotní centrifugace s hustotním gradientem (Rickwood et al. 1982). Pro stanovení bakteriální abundance jsme použili velikostní frakci sedimentu menší než 1 mm. K 5 ml sedimentu bylo poté přidáno 5 ml fyziologického roztoku a 50 µl
detergentu Triton (Merck), který účinně
odděluje bakterie od sedimentu. Vzorek s detergentem jsme třepali po dobu 4 hod (RS 10 Control). Hustotní centrifugace byla provedena s médiem Nycodenz (hustota 1,31 g/ml; Axis- Shield). Do centrifugační zkumavky jsme nepipetovali 4 ml vzorku sedimentu a poté byly 2 ml Nycodenzu opatrně zavedeny injekční jehlou pod vzorek. Vzorky byly vloženy do centrifugy (Rotofix 32A,), po dobu 60 min, 4600 ot/min. Centrifugovali jsme vždy 2 opakování jednoho vzorku.
26
Diplomová práce Po ukončení centrifugace bylo jasně patrné nové uspořádání vzorku s ostrým rozhraním dvou vrstev o různé hustotě a na dně peleta tvořená částečkami sedimentu; injekční stříkačkou byla opatrně odebrána svrchní vrstva (supernatant), zde by měly být zachyceny veškeré volné bakteriální buňky.
5.6.2.
Stanovení abundance bakterií
K určení celkové abundance bakterií ve vzorku jsem použila molekulární metodu fluorescenčního barvení DAPI. DAPI neboli 4',6-diamidino-2-fenylindol je fluorescenční barvivo, které se váže na dvouřetězcovou DNA v A-T zóně, v malé rýze (minor groove) (Obr.č. 15). Používá se ve spojení s fluorescenční mikroskopií. Maximální excitace celku DAPI- DNA je dosažena ozářením UV paprsky o vlnové délce 358 nm, maximum emise probíhá v oblasti viditelného světla s vlnovou délkou 461 nm. Intenzita emise molekul s navázaným barvivem je zhruba dvacetinásobně vyšší, než molekuly nenavázané. DAPI se váže také na molekuly RNA. Zde je ale intenzita emise pětinásobně menší než u vazby DAPI DNA. Barva emitovaného světla je modrá.
15.a
15.b
15.c Obr.č. 14 a: Umístění molekuly DAPI v malé rýze (minor groove) DNA; b: Molekula DAPI; c: Strukturní vzorec molekuly fluorescenčního barviva DAPI (Wikipedia on line)
27
Diplomová práce Díky fyzikálně- chemickým vlastnostem je DAPI v mikrobiální ekologii užíváno především k zjišťování celkové bakteriální abundance mrtvých buněk, pro detekci buněk živých není příliš vhodné, protože barví také bakterie v inaktivním stavu (Cupalová 2006). Postup: 1 ml vzorku odebraný po hustotní centrifugaci jsme napipetovali do filtrační aparatury (Millipore) přidali 2 ml destilované vody a zfiltrovali (filtr Millipore, 0,2 µm GTTP; vývěva Millipore). Poté byl vzorek ještě v aparatuře promyt přefiltrováním cca 2 ml destilované vody (za účelem odstranění zbytků formalínu) a usušen na vzduchu. Na suchý filtr jsme nanesli cca 20 µl fluorescenčního barviva DAPI o koncentraci 0,0063 g.ml-1 (Sigma - Aldrich) a nechali jej na podložním sklíčku v chladničce asi deset minut. Po uplynutí této doby, nezbytné ke správnému nabarvení DNA, jsme ze vzorků vymyli nespecificky navázané zbytky barviva. Promývání jsme prováděli střídavě v etanolu a destilované vodě, přičemž poslední fází byla vždy voda; poměrně intenzivní „praní“ filtru v etanolu a následné důkladné odstranění etanolu z filtru vodou se ukázalo zásadní pro jasný obraz v mikroskopu. Filtr jsme usušili, vložili do kapky imerzního oleje (Olympus, Olympus optical co.) na podložní sklíčko, zakápli další kapkou imerzního oleje, přikryli sklíčkem krycím a hodnotili. Snímání jsme prováděli na epifluorescenčním mikroskopu Olympus BX 60 (Olympus), kamera Olympus (DP 12, Olympus). Použili jsme imerzní objektiv při excitační vlnové délce 360 nm, zvětšení 1000x. Vyhodnocení abundance bakteriálních buněk na snímcích jsme provedli v programu Lucia (Laboratory imaging, ČR). Počet buněk bakterií v 1 ml vzorku (abundance) byl potom na základě těchto hodnot vypočítán podle vzorce:
B= n * F/P *V1/V2*V3/V1*1/V
kde n je tzv. „průměrný snímek“ (tj. průměrný počet bakterií na snímek), F .... plocha filtru (resp. vnitřní průměr filtračního komína) P .... plocha, kterou stanovujeme (tj. plocha, na níž počítám, resp. plocha snímku; lze ji zjistit v programu Lucia)
28
Diplomová práce V1.. centrifugovaný objem vzorku sedimentu V2… centrifugovaný objem vzorku sedimentu + objem media Nycodenz V3… objem fyziologického roztoku přidaného k sedimentu a detergentu V .... objem zfiltrovaného vzorku v ml U každého vzorku byla provedena dvě opakování a z výsledných hodnot vypočetli průměr. Výsledná bakteriální abundance je převedna na 1ml sedimentu.
5.7. Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) Vzorky byly měřeny na transmisním elektronovém mikroskopu JEOL 2010F-typ HC (high contrast). Tento mikroskop umožňuje rozsah urychlovacího napětí od 80kV-200kV, poskytuje zvětšení od 1000x-800 000x. Pro náš vzorek bylo použito urychlovací napětí 160kV. Vzorek byl nanesen na měděné podložní síťce
s
napařenou
uhlíkovou
fólií
(obr.č.
13).
Získané
fotografie
magnetotaktických bakterií z lokalit Sitka a Buchlovice viz. kapitola 10. Přílohy.
Obr.č. 13 Měděná mřížka pro TEM (Wikipedia on line)
5.8. Metoda klonování genu Klonování genů patří mezi moderní a velmi perspektivní molekulární metody. Význam klonování spočívá v zisku čistého vzorku jednotlivého genu, odděleného od všech ostatních genů v buňce. Takto získaný čistý gen může být dále sekvenován (tj. určí se přesné pořadí nukleotidů v sekvenci) a porovnán s daty uloženými v mezinárodní bance klonů. Výsledkem je potom přiřazení klonu k již známým klonům (podle vzájemné podobnosti nukleotidových sekvencí) a vytvoření fylogenetického stromu (Brown 2007). 29
Diplomová práce Principem klonování genů je vytvoření mnoha kopií cílového genu díky přirozenému množení hostitelských buněk. Úsek DNA, který chceme klonovat, je vložen do kružnicové molekuly DNA zvané vektor – vzniká tzv. rekombinantní molekula DNA. Vektor je přenesen do hostitele (zpravidla bakterie), kde se pomnoží a produkuje velké množství vlastních kopií a zároveň kopií genu, který nese. Množením hostitelských buněk se do dceřiných buněk přenáší i kopie rekombinantní DNA, kde opět dochází k replikaci. Po mnohonásobném dělení vzniká kolonie neboli klon identických hostitelských buněk. Každá buňka klonu obsahuje jednu nebo více kopií molekuly rekombinantní DNA – gen, nesený rekombinantní molekulou DNA, se pak nazývá klonovaný (Brown 2007). Detailní popis postupu metody sekvenace a klonování DNA, který byl proveden v laboratoři HUFS v Jižní Koreji, je součástí článku uvedeného v kapitole č.10 Přílohy.
30
Diplomová práce
6. VÝSLEDKY A DISKUZE 6.1. Analýza vody Analýza povrchové a intersticiální vody se prováděla přímo na lokalitě. Pouze hodnoty dusíku byly určeny v laboratoři. Zjištěné hodnoty jsou uvedeny v tab.č. 1. Buchlovice
Buchlovice
intersticiál
povrchová voda
3,77 mg/l 41% 7,96
4,32 mg/l 49,80% 7,76
Buchlovice pramen pod kapličkou 4,5 mg/l 42% 7,6
Kyslík Nasycení pH redox potenciál teplota vodivost
- 60 mV
- 42 mV
- 36 mV
20,96 °C 600 µS/cm
19,9 °C 578 µS/cm
11,8 °C 513 µS/cm
total N
koncentrace
1,5 mg/l
Dyje sl.rameno povrchová voda 9,5 mg/l 118% 8,64
Dyje sl.r. intersticiál 3,95 mg/l 49,30% 7,15
- 112 mV
- 30,9 mV
25,2 °C 427 µS/cm
24,9 °C 497 µS/cm
Kyslík Nasycení pH redox potenciál teplota vodivost total N
Kyslík Nasycení pH redox potenciál teplota vodivost total N
1,3 mg/l Sitka povrchová voda 6,5 mg/l 69% 7,45
Sitka interstiiciál 3,9 mg/l 40% 7,1
- 43,1 mV
- 7 mV
16,9°C 258 µS/cm
16,9 °C 179 µS/cm
3,1 mg/l
Tab.č. 1 Hodnoty povrchové a intersticiální vody z vybraných lokalit
31
Diplomová práce Naměřené hodnoty uvedené v tabulce charakterizují životní prostředí magnetotaktických bakterií. Diskuze o vlivu podmínek životního prostředí na MTB uvedena v kapitole 6.5. (Abundance bakterií).
6.2. Potvrzení přítomnosti MTB přímým pozorováním Metodou přímého pozorování (viz. 5.3.) jsem potvrdila přítomnost a množství magnetotaktických bakterií pomocí znamének „+“, „-„ a „0“ (Tab.č. 2). BUCHLOVICE 1.a 2.a 3.a
5 min ++ + +++
10 min +++ + +++
5 min 0 ++ +
10 min + ++ +
5 min + + 0
10 min + ++ +
1.b 2.b 3.b
5 min + ++ ++
10 min + ++ ++
1.b 2.b 3.b
5 min ++ ++ +
10 min +++ +++ ++
4. 5. 6.
5 min 0 0 +
10 min + + +
1.c 2.c 3.c
5 min ++ + +
10 min ++ ++ +
1.c 2.c 3.c
5 min 0 0 0
10 min + + 0
7. 8. 9.
5 min -
10 min -
DYJE 1.a 2.a 3.a SITKA 1. 2. 3.
Tab.č. 2 Potvrzení přítomnosti a počtu MTB v sedimentu přímým pozorováním. Jelikož
jsou
magnetotaktické
bakterie
zřetelné
pod
fázovým
mikroskopem, bylo možno pozorovat jejich aktuální reakci na magnet. Pokud jsem magnet vychýlila, bylo zřejmé, jak se bakterie pohybují tímtéž směrem. Pokud jsem magnet odstranila úplně, MTB se rozptýlily zpět do prostoru kapky vody. Za magnetotaktické bakterie (MTB) byly považovány všechny bakterie, které reagovaly na přítomnost magnetu pohybem k němu do 5 minut. Z výše uvedených tabulek je zřejmé, že hromadění magnetotaktických bakterií na hraně kapky směrem k jižnímu pólu magnetu bylo zřetelnější po době 10-ti a více minut. Nejvíce MTB jsem pozorovala ve vzorcích 1.a a 3.a lokality Buchlovice, u lokality Dyje ve vzorcích 1.b a 2.b. Při pozorování vzorku z lokality Sitka bylo množství MTB po deseti minutách stejné.
32
Diplomová práce
6.3. Granulometrická analýza Po zpracování vysušeného sedimentu pomocí soustavy sít jsme získali hodnoty uvedené v Tab.č. 3. Granulometrická analýza Buchlovice Velikost ok (mm) hmotnost (g) 22,4 108,9 11,2 320,5 8,0 149,2 5,6 53,4 3,0 178,9 1,0 185,9 0,4 402,2 0,1 306,0 0,08 27,1 < 0,08 32,9 Hmotnost celkem 1765
% 6,169 18,158 8,453 3,025 10,135 10,532 22,787 17,337 1,535 1,864 99,995
Dyje s.r. hmotnost (g) 8,2 19,7 30,0 14,1 33,4 25,7 51,2 132,9 7,4 13,0 335,6
% 2,443 5,870 8,939 4,201 9,952 7,657 15,256 39,600 2,205 3,873 99,996
Tab.č. 3 Váhové hodnoty při zpracování sedimentu na granulometrickou analýzu. Po zpracování výše uvedených hodnot programem SeDi můžeme konstatovat, že u lokality Dyje je nejvíce zastoupena frakce o velikosti 0,18 mm. U lokality Buchlovice činí padesáti procentní kvartil 0,77 mm a u lokality Sitka 5,4 mm (viz Ta.č.4).
Lokalita Dyje Buchlovice Sitka
Q25
Q50
Q75
0,08 mm 0,15 mm 0,49 mm
0,18 mm 0,77 mm 5,4 mm
2,29 mm 7,82 mm 9,13 mm
Tab.č. 4 Vyhodnocení granulometrické analýzy Jelikož se magnetotaktické bakterie nacházejí na rozhraní oxickoanoxické zóny (OATZ) a dokáží se pohybovat podle aktuální polohy vzhledem ke geomagnetickému poli Země, nepředpokládá se jakákoliv závislost výskytu MTB a velikosti částic sedimentu. Ovšem velikost frakce souvisí s koncetrací TOC i s množstvím totálního dusíku. Obecně lze říci, že na zrnech s menší velikostí se zachytává relativně větší množství živin. Toto by mohlo mít následně vliv na výskyt MTB. Diskuze v kapitole 6.5. (Abundance bakterií).
33
Diplomová práce
6.4. Celkový organický uhlík (TOC) Metodou žíhání organického uhlíků jsem dostala průměrné procentuální hodnoty obsahu TOC. Množství TOC z lokality Sitka jsme získali z měření, které na této lokalitě probíhají již delší dobu (viz. Tab.č. 5).
č.m.
m/ miska
m/mis+sed
po žíhání
B1
22,238 g
78,305 g
4hod600°C ≈
B2
21,917 g
81,863 g
≈
m/mis+sed
hmotnost g
%
% TOC
75,182 g
3,123 g
5,57
2,5
78,824 g
3,039 g
5,06
2,28
B3
21,412 g
73,252 g
≈
70,747 g
2,505 g
4,83
2,17
D4
21,899 g
67,344 g
≈
64,127 g
3,217 g
7,07
3,18
D5
21,247 g
69,356 g
≈
65,867 g
3,489 g
7,25
3,26
D6
22,024 g
65,175 g
≈
62,033 g
3,142 g
7,28
3,27
S
22,045 g
77,335 g
≈
77,005 g
0,33 g
0,6
0,27
průměrné % TOC
2,31 % TOC(B)
3,23 % TOC(D) 0,27 % TOC (S)
Tab.č. 5 Hodnoty celkového organického uhlíku (TOC). Analýza hodnot celkového organického uhlíku ukázala, že nejvyšší obsah je u lokality Dyje (D). Vzhledem k tomu, že metoda klonování (viz 6.6.) určila nejvyšší počet DNA klonů ( D17, D28, D32 a D47) také na lokalitě D, je tedy možné, že výskyt MTB klonů pozitivně koreluje s hodnotou celkového organického uhlíku.
6.5. Celková abundance bakterií Celková bakteriální abundance se na našich lokalitách pohybovala v rozmezí 2,84 – 5,5 . 106 b/ml, tj. průměrně 4,45 . 106 b/ml sedimentu. Lokalita Buchlovice a Dyje měly velmi podobné hodnoty, třetí z lokalit – Sitka vykazovala nižší počty bakterií (viz Tab.č. 6). Tyto výsledky se shodují s prací Ch.Flies (Flies et al. 2004b), která ve své studii uvádí průměrnou bakteriální abundanci 4,86 . 106 b/ml sedimentu. Jak již bylo uvedeno, výskyt MTB může být ovlivněn chemismem vody. Množství zjištěného celkového dusíku v našich vzorcích negativně koreluje s bakteriální abundancí. Na lokalitě Sitka dosáhl dusík nejvyšší hodnoty a i zde se z hlediska abundance vyskytuje nejméně bakterií (viz. Tab.č.6). Tento vztah potvrzuje i práce Ch.Flies (Flies et al 2004b). Obecně přijímaný fakt, že hodnota 34
Diplomová práce celkového organického uhlíku vykazuje negativní korelaci se zrnitostí sedimentu, byl prokázán pouze u jednoho vzorku ze tří. Největší zrnitost byla zjištěna u lokality Sitka a i zde byl zjištěn nejnižší obsah TOC, než u ostatních lokalit, u kterých byla zrnitost menší (viz Tab.č.6).
B D S
abundace 5,5 . 106 b/l 5,02 . 106 b/l 2,8 . 106 b/l
total N 0,15 g/l 0,13 g/l 0,31 g/l
GA - Q50 0,18 mm 0,77 mm 5,4 mm
TOC 2,31 % 3,23 % 0,27 %
Tab.č. 6 Výskyt bakterií ve srovnání s množstvím totální hmotnosti N a množstvím TOC.
Přestože
v současnosti
vychází
mnoho
publikací
zabývajících
se
problematikou MTB, převážná část je orientována na sekvenační analýzy genomu a principům tvorby magnetozómů, jejich separaci a praktickému využití. Studie, zabývající se ekologií a životním prostředím MTB, jsou velmi ojedinělé, proto bylo obtížné srovnat získané údaje se zahraniční literaturou.
6.6. Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) Z fotek pořízených na TEM byla v našich vzorcích sedimentu z lokality Sitka potvrzena přítomnost magnetotaktických bakterií, a to minimálně dvou druhů. Jednou z nich je kulovitá bakterie (obr.č. 14) patřící do rodu Magnetobacterium, což potvrdily i molekulární analýzy. Bakterie na druhém snímku (obr.č. 15) svým tvarem nápadně připomíná magnetotaktickou bakterii rodu Magnetospirillum, která je jako jedna z mála kultivovatelná.
35
Diplomová práce
Obr.č. 14 Kulovitá MTB ve fázi dělení; magnetozómy viz. žluté body
Obr.č. 15 MTB protáhlého tvaru, pravděpodobně rod Magnetospirillum; magnetozómy viz. zelené body
6.7. Klonování a sekvenace 16SrRNA Třicet osm procent z 24 analyzovaných sekvencí patřilo ke kmeni Proteobacteria, zatímco 25% z nich byly členy kmenu Nitrospira. Další menší skupiny
patřily
ke
kmeni
Acidobacteria
(17%),
Chloroflexi
(13%)
a
Verrucomicrobia (8%). Bylo zjištěno, že všechny klony v kmeni Nitrospira jsou příbuzné
se známou magnetotaktickou bakterií; všech šest těchto sekvencí
vykazovalo velmi vysokou podobnost (> 98% založena na RDP databázi). Tyto klony byly použity pro další fylogenetické analýzy. Ukázalo se, že frekvence MTB 36
Diplomová práce klonů byla nejvyšší ve vzorku z lokality D ( slepé rameno Dyje). Fylogenetická různorodost ve vzorku D byla tedy podstatně vyšší než v ostatních dvou vzorcích, kde byl nalezen pouze jeden klon MTB. Podle fylogenetického stromu byly všechny bakteriální 16S rRNA genové sekvence úzce příbuzné s rodem Magnetobacterium sp., patřícím do kmene Nitrospira.
Nejbližší příbuzní čtyř
klonů z lokality D (D17, D28, D32 a D47), byly nalezeny v usazeninách jedné čínské nádrže (DQ833491), v sedimentu Žlutého moře (EU652666) a dva klony rodu Magnetobacterium (EF613377 and EF613379)
v reaktoru s lávovými
kameny. Zdá se, že čtyři klony uvedené v této studii k sobě mají navzájem vztah, nicméně vysoká úroveň divergence sekvencí ukazuje, že tyto klonované sekvence by mohly patřit do různých rodů. Klon S46 z malého nížinného proudu byl nejblíže klonu Magnetobacterium ZZ L1B6 (EF613368), který rovněž z reaktoru s lávovými kameny. Poslední klon B6 z lokality B (malý lázeňský rybník Buchlovice-Leopoldov) se zdá být přinejmenším podobný klonům z ostatních českých lokalit a je úzce příbuzný s klonem TDNP USbc97 (Acc. No FJ516912)
z
mokřadu
ve
středním
Španělsku.
V našich vzorcích dominovaly fylotypy generované z klonové knihovny, a to
rod
Magnetobacterium
z kmene
Nitrospira.
Velká
magnetotaktická
tyčinkovitá bakterie předběžně pojmenovaná Candidatus Magnetobacterium bavaricum, poprvé popsaná v sedimentu ze sladkovodního jezera v Bavorsku, se často
nachází
v
sedimentech
některých
sladkovodních
jezer.
Tato
nekultivovatelná magnetotaktická bakterie je fylogeneticky přiřazená ke kmeni Nitrospira.
Předpokládáme,
že
Magnetobacterium
bavaricum
je
chemolitotrofní bakterie schopná získávat energii ze železitých sloučenin. Metodou stabilních izotopů (13C) bylo dokázáno, že organismy příbuzné rodu Magnetobacterium jsou schopné metabolizovat acetát v metanogenních sedimentech. Nekultivovatelný magnetotaktický kmen Nitrospira byl také dříve zjištěn v různých oligotrofních jezerech v Horním Bavorsku a v jezeře v severním Německu Většina
MTB klonů nalezená v našich vzorcích sedimentů z České
republiky patří do kmene Nitrospira a má poměrně vysokou podobnost s Magnetobacterium bavaricum. Ta naznačuje, že výskyt MTB patřící do této skupiny není geograficky omezen pouze na Německo. Pokud je nám známo, je toto první studie poskytující důkazy o tom, že MTB mohou pobývat v sedimentech tekoucích vod. 37
Diplomová práce
Na základě našich výsledků jsme dospěli k závěru, že všechny sekvence ze vzorků sladkovodních sedimentů byly úzce spojeny s kmenem Nitrospira, který není kultivovatelný. Našim úsilím je najít kultivovatelnou skupinu MTB, a proto je třeba provádět další rozbory sedimentů z různých sladkovodních subjektů. Tato diskuze je součást článku, který je v plné verzi přiložen v kapitole 10. Přílohy.
38
Diplomová práce
8. ZÁVĚR Při zjišťování přítomnosti magnetotaktických bakterií (MTB) se potvrdily naše předpoklady, MTB byly detekovány ve na všech třech lokalitách. Výskyt se potvrdil přímým pozorováním pod fázovým inverzním mikroskopem. Metoda klonování genu a sekvenace DNA přítomnost MTB z našich vzorků sedimentu nejen potvrdila, ale také přiřadila k rodu Magnetobacterium. Ovšem pomocí transmisní elektronové mikroskopie byly pořízeny snímky minimálně dvou druhů magnetotaktických bakterií. Protáhlá bakterie (Foto.č. 5, 6, 7, 8) svým
tvarem připomínající rod Magnetospirillum nebyl pomocí
sekvenace DNA detekován, nicméně její přítomnost je na lokalitě Sitka pozorováním pod TEM potvrzena. Rod Magnetospirillum je narozdíl od rodu Magnetobacterium kultivovatelný v laboratorních podmínkách, a proto je žádoucí se i nadále zabývat detekcí tohoto rodu v našich podmínkách, potvrdit její zařazení a získat čistou kulturu, která by sloužila k dalším výzkumům.
39
Diplomová práce
9. LITERATURA Aakra, A., M. Hesselsoe, and L. R. Bakken, 2000: Surface attachment of ammonia-oxidizing bacteria in soil.Microb. Ecol., Volume. 39, p. 222 – 235 Amann, R., Peplies, J., Schüler, D. (2007): Diversity and taxonomy of magnetotactic bacteria in magnetoreception and magnetosomes in bacteria, (Dirk Schüler) Springer – Verlag Berlin Heidelberg 2007, p. 25 - 36. Bazylinski, D.A., Frankel, R.B., Jannasch, H.W. (1988): Anaerobic production of magnetite by a marine magnetotactic bacterium. Nature 334, p. 518 - 519. Bazylinski, D., Frankel, R.B. (2004): Magnetosomes formation in prokaryotes. Nature Reviews Microbiol 2, p. 217 – 230. Bazylinski, A.D., Dean, A.J., Williams, T.J., Kimble Long, L., Middleton, S.L., Dubells, B.L. (2004): Chemolithoautotrophy in the marine, magnetotactic bacterial strains MV-1 and MV-2, Arch.Microbiol. 182, p. 373 – 378. Bazylinski D., Frankel R. B. (2005): Magnetic iron oxide and iron sulphide minerale within microorganismes: potential biomarkers, in biomineralization, WILEY-VCH Verlag GmbH a Co.KGaA, p.17. Bazylinski, D.A., Williams, T.J. (2007): Ecophysiology of magnetotactic bacteria, in magnetoreception and magnetosomes in bacteria, (Dirk Schüler) Springer – Verlag Berlin Heidelberg 2007, p. 44. Bäuerlein, E., Biomineralization_Progress in biology, molecular biology and application. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 2004, p. 57. Blakemore, R.P. (1975): Magnetotactic bacteria. Science 190, p. 377 – 379. Brock, T.D., Madigan, M.T., Martinko, J.M. Biology of microorganisms. Pearson Pertice Hall USA, 2006. Brown, T.A., Klonování genů a analýza DNA. UP Olomouc, 2007. Cochise College [on line]. Cit 5.8.2009. Dostupné na WWW: http://skywalker.cochise.edu/wellerr/students/biomagnetism/project_files/image00 2.gif
Cupalová, J. (2006): Detekce fylogenetických skupin bakterií v biofilmu říčních sedimentů pomocí metody FISH. Diplomová práce PřF UP Olomouc. Drünber, K., Miller, E.C., Otto, A. Reszka, R., Linder,D., Kube,M., Reinhardt, R., Schüler, D. (2004): Biochemical and proteomic analysis of the magnetotactic
membrane
in
Magnetospirillum
40
gryphiswaldense.
Diplomová práce Appl.Environ.Microbiol.70, p. 1040 - 1050. Flies, Ch.B., Jonkers, H.M., de Beer, D., Bosselmann, K., Bötcher, M.E., Schüler, D. (2004): Diversity and vertical distribution of magnetotactic bacteria
along
chemical
gradients
in
freshwater
microcosm,
FEMS
Microbiology Ecology 2005, p. 185 -195. Flies, Ch.B., Peplies, J., Schüler, D. (2004): Combined approach for characterization of uncultivated magnetotactic bacteria from various aquatic environments, Appl.and environ.microbiol 2005, p. 2723 – 2731. Flies, Ch.B., Junkers, H.M., Beer, D., Bosselmann, K., Böttcher, M.E., Schüler, D. (2005 a): Diversity and vertical distribution of magnetotactic bacteria along chemical gradients in freshwater microcosms. FEMS Microbiol Ecol 52, p. 185 – 195. Flies, Ch.B., Peplies, J., Schüler, D. (2005 b): Combined approach for characterization of uncultived magnetotactiv bacteria from various aquatic enviroments. Applied and enviromental microbiology 2005, p. 2723 – 2731. Frankel, R.B. (2009): The discovery of magnetotactic/magnetosensitive bacteria, Chinese Journal of Oceanology and Limnology 2009, p.1 – 2. Frühwirtová, S., (2007):
Studium magnetických vlastností nanočástic
produkovaných mikroorganismy. Diplomová práce PřF UP Olomouc. Jogler,
Ch.,
Schüler,
D.
(2007):
Genetic
analysis
of
magnetosome
biomineralization in magnetoreception and magnetosomes in bacteria, (Dirk Schüler) Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2007, p. 133 - 161. Kawaguchi, R., Burgess, J.G., Sakaguchi, T., Takeyama, H., Thornhill, R.H., Matsunaga, T. (1995): Phylogenetic analysis of a novel sulfate-reducing magnet bacterium, RS-1, demonstrates its membership of δ-Proteobacteria. FEMS Microbiol Lett. 126, p. 277 – 282. Klaban, V., Svět mikrobů. Ilustrovaný lexikon mikrobiologie životního prostředí. Gaudeamus Hradec Králové, 2001. Lins, U., Freitas, F., Neumann Keim, C., de Barros, H.L., Esquivel, D.M.S., Farina, M. (2003): Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms, Brazilia Journal of Microbiology 2003, p.111 – 116. Liu, Y., Gao, M., Dai, S., Peng, K., Jia, R. (2006): Characterization of magnetotactic bacteria and their magnetosomes isolated from Tieshan iron ore
41
Diplomová práce in Hubei Province of China. Mater. Sci. Eng. 26, p. 597 – 601. Matsunaga, T., Sakaguchi, T., Tadokoro, F. (1991): Magnetite formation by a magnetic bacterium capable of growing aerobically. Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, p. 651 - 655. Matsunaga,
T.,
Sakaguchi,
T.,
Okanuta,
Y.
(2005):
Molecular
and
biotechnological aspect of bacterial magnetite in biomineralization. Appl. Microbiol. Biotechnol., p. 92 - 106. Meldrum, F.C., Heywood, B.R., Mann, S., Frankel, R.B., Bazylinski, D.A. (1993): Electron microscopy study of magnetosomes in a cultured coccoid magnetotactic bacterium. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 251, p. 231 - 236. Museum Mineral [on line]. [cit 2.10. 2008]. Dostupné na WWW: http://www.museum.mineral.cz/mineraly/ucebnice/genet_min/g_37.php
Rickwood, D., Ford, T., Graham, J., 1982: Nycodenz: A new nonionic iodinated gradient medium. Analytical biochemistry, Volume 123, p. 23 - 31 Sakaguchi, T., Burgess, J.G., Matsunaga, T. (1993): Magnetite formation by a sulphate reducing bacterium. Nature 356, p. 47 - 49. Sakaguchi, T., Arakaki, A., Matsunaga, T. (2002): Desulfovibrio magneticus sp. nov., a novel sulfate-reducing bacterium that produces intracellular singledomain-sized magnetite particles. Int. J. Syst. Microbiol. 52, p. 215 - 221. Scheffel, A., Gruska, M., Faivre, D., Linaroudis, A. Draumann, P.L., Plitzko, J.M., Schüler, D. (2006): An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature 440, p. 110 – 114. Schleifer, K.H., Schüler, D., Spring, S., Weitzenegger, M., Amann, R., Ludwig, W., Koehler, M. (1991): The genus Magnetospirillum gen. nov. description of and transfer of Aquaspirillum magnetotacticum to Magnetospirillum magnetotacticum comb.nov. System. Appl. Microbiol. 14, p. 379 - 385. Schüler, D. (2008): Genetics and cell biology of magnetosome formation in magnetotactic bacteria. FEMS Microbiol Rev. 32, p. 654 - 672. Sievert, S., Brinkhoff, T., Muyzer, G., Ziebis, W., Kkuever, J. (1999): Spatial heterogenity of bacterial populations slony an enviromental gradient at a shallow submarine hydrotermal vent near Milos Island (Greece). Appl. Environ. Microbiol. 9, p. 3834 – 3842. Spring, S., Lins, U., Amann, R., Schleifer, K.H., Ferreira, L.C.S., Esquivel, D.M.S., Farina, M. (1998): Phylogenetic affiliation and ultrastructure of
42
Diplomová práce uncultured magnetic bacteria with unusually large magnetosomes. Arch, Microbiol. 169, p. 136 – 147. Šafařík, I., Šafaříková, M. (2002): Magnetic nanoparticles and biosciences. Mon.Chem. 133, p. 737 - 759. UP Olomouc [on line]. Olomouc, [cit 11.10. 2008]. Dostupné na WWW : http://botany.upol.cz/prezentace/sedlarova/MB_magnetotakticke_bakterie_t.pdf
VŠCHT [on line]. Praha, [cit. 3.7. 2009]. Dostupné na WWW: http://www.vscht.cz/met/stranky/vyuka/labcv/labor/res_stavebni_materialy_granu lometrie/index.htm
Wikipedia [on line]. [cit 11.10. 2008]. Dostupné na WWW: http://en.wikipedia.org/wiki/DAPI
Wikipedia [on line]. [cit 2.8. 2009]. Dostupné na WWW: http://en.wikipedia.org/wiki/Transmission_electron_microscopy
TEM by Mgr. Klára Šafářová, Centrum výzkumu nanomateriálů
43
Diplomová práce
10. Přílohy
44
