Hoofdstuk 7 Moleculaire biologie
20 14
Polymerase ketting reactie
Pr
es
s
De polymerase ketting reactie (PCR) is een snelle in vitro methode voor de selectieve amplificatie van een specifiek geselecteerd deel van een DNA-sequentie. Dit kan een gen, een deel van een gen, een niet-coderende sequentie, … zijn. PCR wordt zeer veel toegepast in de moderne moleculaire biologie: aanmaak van probes in blottingstechnieken (D4H6, pag. 212), genklonering en –manipulatie, DNA-mutagenese (zie D4H7, pag. 262) en -sequencing (D4H5, pag. 187); DNA- en gentypering; SNP analyse; expressiestudies … De techniek houdt drie stappen in: 1) Denaturatie bij 94 °C: de oplossing wordt verhit om dsDNA te denatureren en ss template DNA te krijgen. 2) Aanhechting van de primers (annealing), complementair aan de ss DNA templates tussen 45 en 60 °C, afhankelijk van de prime sequentie. 3) Polymerisatie, voornamelijk bij 72 °C (afhankelijk van het gebruikte polymerase), waarbij de nieuwe DNA streng wordt aangemaakt.
ia
Deze drie stappen vormen een cyclus die 25-40 keer herhaald wordt (Fig. 7.1.).
Ac a
de m
Een PCR-reactie mengsel bevat steeds de volgende bestanddelen: yyTemplate DNA: dit bevat het specifieke deel van het DNA dat geamplificeerd moet worden. Het template DNA kan volledig genomisch DNA, cDNA, een reeds eerder geamplificeerd PCR product of een plasmide zijn yyPrimers: zijn complementair aan de doel DNA-sequentie en hechten aan het 3’ uiteinde van elke DNA streng. De gebruikte concentratie is meestal 1µM; yydNTPs: de vier deoxynucleotiden dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Die worden ingebouwd tijdens de PCR-reactie en vormen zo nieuwe strengen op basis van het DNA-template. De beste resultaten worden verkregen als de concentratie aan dNTPs tussen 200 en 400 µM ligt. Let op! dNTPs zijn zeer gevoelig aan regelmatig invriezen en opnieuw ontdooien. Na een aantal cycli is de werking ervan verlaagd
©
yyMgCl2: Mg2+ ionen vormen een stabiel complex met de dNTPs, wat essentieel is voor de dNTP-incorporatie. Ze stimuleren de polymerase-activiteit en verhogen de smelttemperatuur (Tm) van het dsDNA en de primer/template-interactie. Een te lage concentratie aan MgCl2 geeft een onvoldoende rendement, terwijl een overmaat resulteert in een accumulatie van niet-specifieke producten. De concentratie is ideaal tussen 15 en 25 mM. yyBuffer: de pH moet stabiel blijven tijdens de reactie. Vandaar dat een geschikte buffer noodzakelijk is. De buffers zijn specifiek voor het gekozen DNA-polymerase
M o lec u lai r e b i o lo g i e
Book- Labo 2.indb 233
233
25/09/14 12:31
yyDNA polymerase (bv. Taq, Pfu, …): Zorgt voor de synthese van de nieuwe DNA-streng. Het is een thermostabiel polymerase. Het meest gebruikte polymerase is het Taq polymerase, afkomstig van de bacterie Thermus aquaticus, die leeft in warmwaterbronnen in Yellowstone National Park. De optimale polymerisatiesnelheid is 35-100 nucleotiden per seconde bij 70-80 °C.
Stap 1: Denaturatie: 1 min. bij 94°C 5’
5’
3’
3’
5’
es
s
3’
20 14
Het resultaat is een exponentiële toename in het fragment van jouw interesse.
3’
Pr
5’ Stap 2: Aanhechting: 45 sec. bij 54°C 3’
5’
de m
ia
5’
3’
Stap 3: Polymerisatie: 1 min. bij 72°C
Ac a
3’
5’
3’
Voorbeeld van de verschillende stappen van een PCR reactie.
©
Fig. 7.1.
5’
234
Book- Labo 2.indb 234
Hoofdstuk 7
25/09/14 12:31
Template DNA
20 14
Voor de aanmaak van het template DNA (genomisch, cDNA, plasmide DNA) verwijzen we naar D4H3, pag. 59. De hoeveelheid totaal DNA in de PCR-reactie heeft een groot effect op het resultaat van deze reactie. Indien er te veel DNA gebruikt wordt, zal dit DNA aggregeren onderaan het reactiebuisje en dit kan leiden tot slechte aanhechting van de primers en een slechte DNA synthese omdat het Taq-polymerase niet vrij kan diffunderen. Indien er echter te weinig DNA genomen wordt, is er een grote kans dat dit verloren gaat door o.a. absorptie aan de wand, DNA afbraak etc. Verder moet de concentratie DNA gebalanceerd worden met het aantal cycli van de reactie. Gebruik van hoge concentraties DNA gecombineerd met een hoog aantal cycli leidt tot de verhoogde aanmaak van niet-specifieke PCR -producten.
Pr
es
s
Tips Bij de initiële opzet van een experiment is het raadzaam om een verdunningsreeks van het template DNA uit te testen om de beste startconcentratie template DNA te bepalen. De ideale concentratie is 105 tot 106 doelmolecule DNA. bv. gemiddeld gezien bevat 1 µg genomisch humaan DNA ongeveer 3 x 105 doelmolecule DNA. Dit komt meestal neer op een concentratie genomisch DNA van 0.05 tot 1 µg/ µL.
ia
Ontwerp de primers
de m
Primers zijn synthetische nucleotidesequenties van ongeveer 18-22 bp lang en zijn zodanig ontworpen dan ze aanhechten aan de 3’ zijde van beide strengen van de doelsequentie. Het ontwerpen van de primers gebeurt met gespecialiseerde computerprogramma’s (o.a. Primer 3, Webprimer, Genefisher, …).
©
Ac a
De keuze van goede primers wordt gemaakt op basis van enkele eigenschappen: yyOptimale smelttemperatuur (Tm) ligt tussen 50 en 60°C. yyGC inhoud ligt tussen 40 en 60%. yyDe aanhechtingstemperatuur (Ta) van de primers ligt meestal 5 °C onder de Tm. Een vuistregel om deze temperatuur te bepalen: Ta = (2 °C (AT) + 4 °C (GC)) – 5°C yyTa moet laag genoeg zijn om hybridevorming mogelijk te maken en hoog genoeg om mismatch hybriden te voorkomen. yyPrimers mogen niet zelf-complementeren, vermijdt dus zoveel mogelijk interne complementaire zones!
M o lec u lai r e b i o lo g i e
Book- Labo 2.indb 235
235
25/09/14 12:31
Smelttemperatuur van nucleïnezuren
es
s
20 14
De smelttemperatuur van bv. DNA-probes of primers is een zeer belangrijk gegeven bij DNA-werk. Bij verwarmen van een dubbelstrengige DNA keten, worden de waterstofbruggen tussen de complementaire basen verbroken; het nucleïnezuur smelt en dit gaat gepaard met een toename in extinctie bij 260 nm, d.i. het hyperchroomeffect. In een enkelstrengige keten absorberen de basen ongeveer hetzelfde als die in de vrije nucleotiden. De toename in extinctie is evenredig met het AT-gehalte. Hoe hoger het percentage AT is, des de groter de toename van de extinctie. De temperatuur waarbij, onder invloed van temperatuursverhoging, twee complementaire ketens voor de helft gescheiden zijn, noemt men de smelttemperatuur, Tm. De smelttemperatuur kan experimenteel bepaald worden uit de smeltcurve. Zoals uit fig. 7.2. blijkt, neemt de smelttemperatuur toe met stijgende ionensterkte. Uit fig.7.2. kan worden opgemerkt dat Tm toeneemt met het gehalte GC. Detergennia zoals ureum en formamide beïnvloeden eveneens de Tm, o.m. omdat ze een invloed hebben op de hydrofobe interacties tussen de basenparen onderling.
E.coli Pseudomonas E.coli (0,01) (0,01) (0,1)
ia
Pr
E260nm
Ac a
de m
50% E260nm
60
©
Fig. 7.2.
70
80
90
Tm
69
76
86
(G+C)%
40
68
40
T (°C)
Smeltcurve van DNA van E. coli in 0,01 M en 0,1 M fosfaatbuffer van pH 7,8 en van Pseudomonas aeruginosa in 0,01 M fosfaatbuffer.
Smeltcurve analyse kan o.m. gebruikt worden voor de opsporing van gekende en nietgekende mutaties. Bij real-time PCR wordt het smeltpunt bepaald uit de verandering van het fluorecentiesignaal afhankelijk van de temperatuur (zie pag. 239).
236
Book- Labo 2.indb 236
Hoofdstuk 7
25/09/14 12:31
Aanmaak van de mastermix
20 14
Een mastermix is een mengsel dat alle componenten bevat om meerdere PCR-reacties te laten plaatsvinden. De component hoeveelheden kunnen sterk verschillen omdat ze niet gelden voor elke reactie. Bepaal de optimale PCR-condities (temperaturen, duur, aantal cycli, concentraties van de verschillende componenten, …) met test-DNA. Wanneer de meest optimale combinatie van alle factoren gevonden is, worden de condities toegepast op het DNA-staal.
Pr
es
s
Tips! • Bereken de mastermix altijd voor TEN MINSTE 1 extra reactia. • Pipetteer altijd eerst het grootste volume in het epje. • Pipetteer de volgende component IN het aanwezige volume en niet tegen de wand! • Bij het pipetteren van de componenten, KIJK of de volumes effectief in het epje gevoegd worden. • Verdeel de mastermix in dunwandige, kleine PCR-epjes en voeg dan pas het DNA toe aan elk epje. • Voeg nooit template DNA aan de mastermix toe! • Zorg ook steeds voor een negatieve controle (= reactie zonder template). • Voer indien mogelijk een positieve controle uit.
Voorbeeld:
25 µL-reactie
6 x mastermix
Steriel water 10x PCR-buffer 25 mM MgCl2 2 mM dNTP 15 µM forward primer 15 µM reverse primer Taq polymerase Template DNA
18,4 µL 2,5 µL 2 µL 1,5 µL 1,5 µL 1,5 µL 0,3 µL 1 µL
110,4 µL 15 µL 12 µL 9 µL 9 µL 9 µL 1,8 µL /
Ac a
de m
ia
Product
©
yyDe mastermix wordt verdeeld over dunwandige microcentrifugeerbuisjes van 200 µL of in een 96-wellplaat, waarvan de wells een volume van 200 µL inhouden. yyVoeg overal template-DNA toe (meestal 1 µL). yyIndien nodig kunnen de stalen gedurende 1 minuut op een lage snelheid gecentrifugeerd worden om zeker alle oplossing in de tip van het recipiënt te krijgen. yySluit de microcentrifugeerbuisjes of wells goed af met daarvoor voorziene dopjes of strips. Door de hitte in het PCR-toestel zouden die kunnen openspringen en dit mag niet gebeuren! yyIndien het PCR-toestel niet beschikt over een verwarmend deksel, moet de oplossing bedekt worden met wat minerale olie.
M o lec u lai r e b i o lo g i e
Book- Labo 2.indb 237
237
25/09/14 12:31
