DE ROL VAN MESENCHYMALE STROMALE CELLEN BIJ TUMORPROGRESSIE IN COLORECTAALKANKER

   

      Academiejaar 2010 ‐ 2011 

           

 

DE ROL VAN MESENCHYMALE STROMALE CELLEN BIJ TUMORPROGRESSIE IN COLORECTAALKANKER        Bernard DEPYPERE 

      Promotor: Dr. O. De Wever  Co‐promotor: Lic. Astrid De Boeck    Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot  MASTER IN DE GENEESKUNDE         

  “De auteur en de promotor geven de toelating dit afstudeerwerk voor consultatie beschikbaar  te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de  beperkingen  van  het  auteursrecht,  in  het  bijzonder  met  betrekking  tot  de  verplichting  uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit afstudeerwerk.”        Datum: 06/05/2011            Bernard Depypere   

 

 

 

 

 

Olivier De Wever & 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Astrid De Boeck 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

     

   

       

 

VOORWOORD    Bij het schrijven van dit voorwoord gaat het volgende door me heen: “Alweer een hoofdstuk  in mijn leven dat voorbij is”. De voorbije twee jaar waren zeer leerrijk voor mij en hebben  deuren  geopend  naar  nieuwe  hoofdstukken  in  mijn  leven.  Dit  is  dan  ook  het  uitgelezen  moment om dankbaar te zijn. Ik ben Prof. Dr. Bracke dankbaar dat ik in zijn labo onderzoek  mocht  doen.  Dr.  De  Wever  en  Astrid  De  Boeck  omdat  zij  mij  lieten  deelnemen  aan  hun  onderzoeken  en  constant  klaarstonden  om  mij  raad  en  advies  te  geven.  Ik  zal  nooit  de  oprechtheid  vergeten  waarmee  jullie  mij  hielpen.  Jullie  zullen  altijd  mijn  peetvader  en  peetmoeder blijven, jullie hebben mij geïntroduceerd in de wereld van het wetenschappelijk  onderzoek. Verder ben ik iedereen dankbaar die aanwezig was in het labo, zonder jullie zou  wetenschappelijk  onderzoek  niet  mogelijk  geweest  zijn,  en  zonder  jullie  zou  ik  nooit  zo  graag naar het labo gekomen zijn.    Gent, mei 2011    Bernard Depypere     

 

     

 

INHOUDSTABEL    ABSTRACT……………………………………………………………………………………………. P. 1  1. LITERATUURSTUDIE……………………………………………………………………………. P. 2    1.1. Ontwikkeling van een tumor: 2 modellen voor carcinogenese 1.2. Model voor carcinogenese van colorectaalkanker 1.3. Invasie, migratie en metastasering 1.4. Tumor-stroma interacties 1.4.1.

Stroma

1.4.2.

Tumorstroma

1.4.2.1.

Myofibroblasten & kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF)

1.4.2.2.

Mesenchymale Stamcellen

1.4.2.3.

Endotheliale cellen

1.4.2.4.

Macrofagen

1.4.2.5.

Adipocyten

1.4.2.6.

Fibroblasten

1.4.2.7.

Extracellulaire matrix

1.5. HER-receptoren in Colorectaalkanker 1.5.1.

HER-receptoren & liganden

1.5.2.

HER-receptoren in Colorectaalkanker (CRC)

1.5.3.

Klinische betekenis van HER

1.5.4.

Doelgerichte therapieën

1.5.4.1.

Cetuximab& panitumumab

1.5.4.2.

Pertuzumab

1.5.4.3.

Trastuzumab (Herceptine)

1.5.4.4.

Lapatinib

2. DOELSTELLINGEN………………………………………………………………..………. P. 21  3. MATERIAAL EN METHODEN…………………………………………………….………P. 22  3.1. Cellijnen 3.2. Buffers 3.3. Antilichamen voor Western Blotting 3.4. Groeifactoren 3.5. HER-inhibitoren 3.6. Isolatie van mesenchymale cellen uit colonkanker.

     

3.7. Human Mesenchymal Stem Cell Identification Kit 3.8. Proteïnenniveau 3.8.1.

Bereiden van cellysaat

3.8.2.

Bepalen eiwitconcentratie

3.8.3.

SDS-PAGE

3.8.4.

Western Blot

3.8.5.

Immunokleuring`

3.9. Type I collageen invasie test 3.10. MTT-assay 3.11. Proliferatietest 3.12. Receptor Tyrosine Kinase Array 3.13. Statistiek

4. RESULTATEN…………………………………………………….…………………………P. 45    4.1. Morfologie van de geïsoleerde mesenchymale cellen 4.2. Multipotente eigenschappen van de geïsoleerde mesenchymale cellen 4.2.1. Adipogene differentiatie 4.2.2. Osteogene differentiatie 4.3. α-SMA aanwezigheid in de geïsoleerde mesenchymale cellen 4.4. Functionele effecten van het geconditioneerde medium van TAMC1: Proliferatie 4.5. Functionele effecten van het geconditioneerde medium van TAMC1: Metabole activiteit 4.6. Functionele effecten van het geconditioneerde medium van TAMC1: Invasie 4.7. Receptor Tyrosine Kinase Array 4.8. Neureguline-1 4.9. Effect van rNRG1 op HCT8/E11 colonkankercellen 4.10.

Effect van HER-inhibitoren op functionele effecten van CM vanTAMC1

5. DISCUSSIE…………………………………………………….………………………..……P.58  6. REFERENTIES…………………………………………………….…………………………P.62 

     

ABSTRACT     Tumorinvasie en metastasering worden gedirigeerd door een wederzijdse kruissignalisatie tussen kankercellen en stromale cellen. Tumor geassocieerde stromale cellen omvatten endotheelcellen, leukocyten, macrofagen, zenuwcellen en mesenchymale stromale cellen zoals myofibroblasten, mesenchymale stamcellen en adipocyten. 25% Van de mesenchymale stromale cellen zijn afkomstig van mesenchymale stamcellen uit het beenmerg. DOEL. Het doel van dit onderzoek is om na te gaan wat de rol is van deze tumor geassocieerde mesenchymale stromale cellen (TAMC) bij de progressie van colorectaal kanker (CRC) en de betrokken mechanismen te onderzoeken. METHODE en RESULTATEN. In dit onderzoek werden mesenchymale stromale cellen geïsoleerd uit colon tumor biopsies. Deze werden gekarakteriseerd om de aanwezigheid van mesenchymale stamcellen en myofibroblasten na te gaan. Vervolgens werd nagegaan wat het effect was van deze TAMC op proliferatie, metabolische activiteit en invasie van colonkankercellen in vitro. Door secretie van oplosbare factoren zagen we dat TAMC de groei, proliferatie en invasie gaan bevorderen. Aan de hand van een een Receptor Tyrosine Kinase (RTK) array werd de HER3 activatie aangetoond na behandeling van colonkankercellen met geconditioneerd medium (CM) van TAMC. Neureguline (NRG1) is de belangrijkste activator van HER3. Via Western Blot werd onderzocht of TAMC NRG1 tot expressie brachten. Om aan te tonen dat de geobserveerde functionele effecten op een NRG1/HER3 afhankelijke wijze gemedieerd waren werd gebruik gemaakt van recombinant neureguline-1 (rNRG1), klinische HER-inhibitoren en antilichamen. Met het rNRG1 zagen we dezelfde effecten op proliferatie, metabolische activiteit en invasie als met het CM van TAMC. Pertuzumab, een HER2/HER3-dimerisatie-inhibitor, kon de geobserveerde effecten inhiberen. Cetuximab en panitumumab, HER1-inhibitoren die gebruikt worden in de behandeling van CRC, konden de effecten van het geconditioneerde medium van TAMC niet ongedaan maken. CONCLUSIE. Deze resultaten wijzen erop dat TAMC in carcinogenese de metabole activiteit, groei en invasie gaat promoten. De geobserveerde functionele effecten werken op een NRG1/HER3 afhankelijke wijze. Opmerkelijk was dat de HER1-inhibitoren de functionele effecten van het geconditioneerde medium van TAMC niet ongedaan konden maken. Dit is zeer suggestief voor een paracriene NRG1 signalisatie door TAMC die verantwoordelijk is voor resistentie tegen de huidige HER1-doelgerichte therapieën.

     

LITERATUUR I RSTUDIE      6.1.Ontw wikkeling van een tum mor: 2 modeellen voor carcinogen c nese

Het woordt algemeeen aanvaard dat d neoplastiische transformatie een ‘m multistep’ prroces is vero oorzaakt door de d accumulaatie van muutaties en epigenetische e e veranderinngen. Twee modellen worden voorgeesteld om tumorontwikkkeling te verklaren.(F Figuur 1) In I het ‘stoochastische model’ verondderstelt men dat elke kankercel k de capaciteit heeft h om tee prolifererenn en een tu umor te regeneereren. Daareentegen, in het h ‘kankerstamcel modeel’ wordt verrondersteld ddat slechts eeen klein gedeeltte van de ceellen in de tuumorpopulatiie de capacitteit heeft om m tumorontwiikkeling en groei g te initiëreen en in standd te houden((1). Deze cellen worden kankerstamc k ellen genoem md (CSC). CSC C zijn mogeliijks ontstaann als gevolg van een trannsformatie van normale stamcellen uuit het weefssels van originee. Anderzijdss kunnen CS SC ook ontstaaan vanuit geemuteerde prrecursoren ddie extensief kunnen prolifeereren maar de d zelf-herniieuwing kannkereigenschappen niet vertonen. v Ditt impliceert dat een progennitorcel mutaaties moet onndergaan diee geassocieeerd zijn met het opnieuw w verkrijgen van de zelf-heernieuwing.(1)

FIGUU UR 1. A. Kannker is een heterogene h v verzameling van v cellen maar m het grootste deel ka an gaan prolifeereren en meetastasen voormen. B. Kaanker is een n heterogenee verzamelinng van cellen maar enkel de d kankerstam mcellen (CSC C) kunnen gaaan prolifereeren en metaastasen vormen.(2) Stamceellen wordenn deze dagenn uitvoerig besproken b in de literatuuur als deel vaan het tumorrstroma, de messenchymale stamcel (MS SC). De stam mcellen zoud den nu dus ook o een rol kkunnen speleen in de parencchymale fracttie van de tumor, de CSC C. In dit mod del ontstaan kankercellen k nuit de transfformatie

     

van stamcellen.(2) Omdat de carcinogenese bestaat uit de accumulatie van talloze mutaties en epigenetische veranderingen lijken stamcellen omwille van hun lange levensduur en zelfvernieuwingseigenschap het ideale doelwit om deze processen te ondergaan. Daar waar meer gedifferentieerde cellen korter leven en dus minder kans hebben om alle mutaties simultaan te ondergaan.(1) In vaste tumoren zijn kankercellen aanwezig die fenotypisch verschillen en waarvan slechts een klein deel in staat zijn nieuwe kolonies te vormen in vitro en in vivo.(3) Dit gaat van 1op 1000 tot 1 op 5000 voor longkanker, ovariumkanker en neuroblastoma.(2)Deze bevindingen doen vermoeden dat slechts een aantal kankercellen tumorvormend zijn, deze cellen worden beschouwd als CSC. Nu zijn er twee verklaringen voor dit fenomeen: alle kankercellen hebben een kleine kans om te gaan prolifereren en zicht te gedragen als CSC of er is een kleine, definieerbare groep CSC die de mogelijk heeft om te gaan prolifereren en nieuwe tumoren te vormen. Deze vraag is tot op heden nog niet opgeklaard. Deels omdat CSC nog steeds niet exact geïndentificieerd zijn. Nu zijn, aan de hand van CD133 en CD44, reeds CSC geïsoleerd uit acute myeloide leukemie, acute lymfatische leukemie,

chronische

myeloide

leukemie,

colonkanker,

borstkanker,

prostaatkanker,

hersentumoren, longtumoren, levertumoren, en wordt er volop onderzoek gedaan naar de betekenis van deze CSC.(4) Er is ook bewezen dat uitgezaaide en circulerende kankercellen worden teruggevonden in het lichaam zonder dat zij ooit metastasen vormen. Ook hier zou het immuunsysteem deze cellen kunnen onderdrukken of zouden het kankercellen zijn die geen vermogen hebben om verder te ontwikkelen omdat enkel de beperkt aanwezige CSC kunnen groeien tot metastasen.(2) Dit model is een vrij recent model dat ontstaan is onder impuls van toenemende belangstelling naar de rol van stamcellen en nieuwe technologieën. Het stochastisch model is een ouder model dat meer gebaseerd is op de histologische stadia die men microscopisch kan onderscheiden. Histologisch zijn er verschillende stadia in de carcinogenese te onderscheiden (Figuur 2). Eerst treedt hyperplasie op, gekenmerkt door ongecontroleerde groei maar met behoud van differentiatie. Als vervolgens het vermogen tot differentiatie verloren gaat spreken we van een carcinoma in situ.Vanaf hier spreekt men van kanker alhoewel tumoren pas echt maligne worden als ze gaan invaderen en zo zeer moeilijk behandelbaar worden. De reden waarom sommige kankers ontaarden van hyperplastische celgroei tot carcinoma in situ is nog steeds een punt van onderzoek. Verschillende oncogenen en tumor-suppressor genen spelen een rol in deze adenoma-carcinoma sequentie. De veranderingen in het genotype kunnen erfelijk of verworven zijn. Vaak is er een combinatie van beiden. Erfelijke mutaties zijn de reden waarom sommige kankers familiaal meer voorkomen. Deze mutaties worden dan via de geslachtscellen doorgegeven. Bij verworven mutaties spelen milieufactoren een grote rol. Het zijn dan ook de epitheelcellen, die het meest in

     

contact komen met deze milieufactoren, die vaakst gaan ontaarden. Denk aan huidtumoren, tumoren van de respiratoire en urinaire tractus en tumoren van de gastro-intestinale tractus zoals bij colorectaalkanker (CRC). Tumoren worden ingedeeld in stadia volgens de TNM-classificatie. Die houdt rekening met de grootte en dieptegroei van de tumor in het omliggend weefsel (T), de aanwezigheid van metastasen in lokale lymfenodi (N) en op afstand (M).(5)

6.2. Model voor carcinogenese van colorectaalkanker

Het optreden van mutaties is één zaak, al dan niet in een random epitheelcel of stamcel, maar het is de plaats waar ze optreden in het genoom die bepalend is voor de ontwikkeling van een kankercel. Door de mutaties kunnen bepaalde genen geactiveerd of geïnhibeerd worden. Zo zal activatie van een tumorpromotorgen of oncogen, inhibitie van tumorsuppressorgen, en vaak een combinatie

van

beide,

leiden

tot

ongecontroleerde

celgroei.

Specifieke

mutaties

in

tumorsuppressorgenen zijn mutaties in de DNA herstellende genen en apoptose-inducerende genen zoals p53. Door mutaties in de apoptose-regelende genen kan een cel niet meer in apoptose gaan. Zo kunnen zwaar disfunctionele cellen toch blijven groeien in plaats van vernietigd en gefagocyteerd te worden wanneer hun DNA beschadigd is door fysische, chemische agentia en oxidatieve stress. Ook mutaties in DNA herstellende genen kunnen ervoor zorgen dat fouten in het DNA te weinig worden gerepareerd en andere mutaties gemakkelijk kunnen worden doorgegeven aan dochtercellen. (6) De observatie dat de accumulatie van mutaties in tumorsupressor- en oncogenen in CRC parallel verloopt aan de histologische progressie van de ziekte volgens de adenoma-carcinoma sequentie, leidde tot een model van succesieve genetische veranderingen in CRC voorgesteld door Fearon en Vogelstein in 1990.(1)(Figuur 2)

     

FIGUUR 2.Presentatie van de adenoma-carcinoma sequentie in carcinogenese bij colonkanker. De mogelijk betrokken niveau’s zijn ACP, K-RAS, P53 en mismatch-repair genen. Deze staan hier gekoppeld aan het moment in de carcinogenese waarop zij mogelijks een grote impact hebben.(1)

Een mutatie in het Adenomateus Poliposis Coli gen (APC-gen) is een voorbeeld van een mutatie in een tumorsuppressorgen die frequent voorkomt bij CRC. APC mutaties worden gezien bij Familiale Adenomateuze Poliposis (FAP) en bij 75% van de mensen met een sporadische vorm van CRC. APC is een tumor suppressor gen gelegen op chromosoom 5q. Een mutatie op dit chromosoom is verantwoordelijk voor FAP. Veel van deze mutaties leiden tot een vroegtijdig stopcodon en dus een beknopt APC proteine.(7) Het APC proteine, lid van de Wnt pathway, bindt op β-catenin. Wanneer het APC proteïne geïnactiveerd is zal β-catenin accumuleren in de nucleus.(3, 8) In dit senario zal β-catenin gaan transloceren naar de nucleus waar het een complex vormt met TCF/LEF transcripitiefactor en bepaalde Wnt target-genen gaat activeren waaronder cMyc en Cycline-D(3). Deze mutatie speelt een rol vrij vroeg in de adenoma-carcinoma sequentie. (FIGUUR 2) Dit verklaart ook waarom mensen met een mutatie in het APC-gen zich frequenter presenteren met poliepen (vorm van hyperplastische celgroei) in het colon. De mutatie in het APC gen komt vroeg in de ontwikkeling van de poliep of tumor en was een voorbeeld van een tumorsuppressorgen mutatie bij CRC. De K-ras mutatie is een proto-oncogen mutatie en treedt later op tijdens de adenomateuze fase van de adenoma-carcinoma sequentie.(8)(FIGUUR 2) RAS proteinen bezitten een GDP/GTP-binding en een intrinsieke GTPase activiteit waardoor ze kunnen omschakelen tussen een actieve vorm (GTP-gebonden) en

     

een inactieve vorm (GDP-gebonden). RAS oncogenen zijn nodig voor de progressie van het adenoom. Een mutatie promoot de cel replicatie. Zo komen K-ras mutaties voor in 50% van de CRC(9) en het vaakst in codon 12, 13 en 64.(3) Eindresultaat van al deze mutaties is een RAS proteine dat vast staat in zijn actieve, GTP-gebonden vorm en onafhankelijk wordt van stimulatie door exogene groeifactoren zoals EGF.(3) Gemuteerde K-ras proteinen activeren dan vele pathways zoals de RAF/MAPK-, JNK en de PI3-K- pathway leidend tot promotie van de groei. Downstream zal K-ras dan cycline D1, DNA methyltransferase en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) beïnvloeden.(10) Een p53-mutatie speelt ook bij CRC een belangrijke rol. Het p53 proteine zorgt normaal voor een verlengen van de celcyclus in G1 zodat DNA herstel kan doorgaan of zorgt voor apoptose als het DNA te zwaar beschadigd is. De mutatie van het p53 tumor suppressor gen komt vooral voor in het late adenoma fase,(11) wanneer het adenoom overgaat naar een kanker.(8) (FIGUUR 2) Een mutatie leidt dus tot een gedaald vermogen om DNA schade op te sporen, geen celcyclus-arrest in G1, minder apoptoses en een instabiliteit van het karyotype.(11) De meeste mutaties zijn mutaties waarbij GC in AT verandert. Deze mutatie treedt op bij 40%-50% van de sporadische CRC. De p53 is frequenter in tumoren van het distale colon en rectum dan in het proximale colon(8). Patiënten met een p53 mutatie hebben een slechtere prognose(12).

6.3. Invasie, migratie en metastasering Invasie is een proces met meerdere stappen dat kankercellen in circulatie brengt en zo naar lymfenodi en afgelegen organen waar zij groeien als een secundaire tumor die eigenschappen heeft van de primair tumor.(13) (Figuur 3) Om te kunnen invaderen gaan kankercellen gaan interageren met zijn gastheercellen en zo programma’s activeren die een aantal cellulaire gebeurtenissen teweegbrengt: homo- en heterotype cel-cel adhesie, cel-matrix adhesie, hydrolyse, migratie, overleving en celgroei. Deze cellulaire gebeurtenissen zijn op zich niet eigen aan kanker, ze komen ook voor in normale celomgevingen. Wel zou een combinatie van de cellulaire gebeurtenissen over tijd en plaats kunnen bestaan specifiek voor een maligne proces.(13)

     

FIGUUR 3. Stap 1: innvasie vanuitt primaire tuumor: de kan nkercel gaat door d de basaale membraa an en in i de kankerccel gaat in de d circulatiee, dient hiervvoor de het intersttitieel stroma. Stap 2: intravasatie: basale meembraan en endotheel vaan het bloedv dvat te doorb boren. Stap 3: 3 transport en overlevin ng in de circulatie. Stap 4: exttravasatie: de d kankercell verlaat de circulatie enn moet hiervvoor weer door d het endotheel en basale membraan m vaan het bloedvvat. Stap 5: de d kankercell groeit en iss gemetastasseerd en kan van hieruit opnnieuw metasstaseren. Wanneer W de kankercel niet groeit spreekt meen van micrometaastasen.(13)

Als de tumor invassief gewordenn is kunnen kankercellen n zich losmakken van de pprimaire tumo or en in de circculatie terechht komen. Ennerzijds is err de lymfecirrcultatie, langgs waar kankkercellen vaaak eerst metastaseren naarr sentinelnoddus of pooortwachterskn noop. Deze sentinelnoddi bevatten kanker AF), mesenchhymale stam mcellen (MSC C), macrofaggen, B-cellen n en Tgeassocieerde fibrooblasten (CA d kankercelllen. Deze seentinelnodi zijn z dus een soort bewak kers van cellen die communniceren met de p waar kankercelleen worden weerhouden. w . Daardoor worden regionaale lymfenoodi en een plaats losgekomen kankeercellen gecooncentreerd en e is hun kaans op overleving hogerr. Deze sentiinelnodi ht en geresseceerd. De aanwezigheeid van wordenn dan ook vaak bij kankerchirurggie opgezoch kankerrcellen in de sentinelnoduus een prognnostische ong gunstige factoor. Anderzzijds is er dee bloedcircullatie. Hier iss de invasie anders wantt in tegenstellling tot lym mfevaten bevatteen bloedvateen tight juncttions, pericyten en een basale b membraan. Eenmaaal een kank kercel in circulaatie is moet zij z zien te ovverleven in circuculatie c en e proberen een nieuwe locatie te inv vaderen

     

en beginnen groeien, dit is de ‘seed & soil’ theorie van Virchow en Paget(14). Zo moet de kankercel in circulatie weerstaan aan de geprogrammeerde celdood door verlies van celcontact of anoikis. Ze moet vermijden om opgepikt te worden door het immuunsysteem, weerstaan aan de scheurstress die heerst in elk bloedvat en een orgaan vinden waar ze kan prolifereren. Daarvoor moet ze eerst de circulatie opnieuw verlaten, de stress van een nieuwe, mogelijks vijandelijke, micro-omgeving overleven en angiogenese induceren om tot een meetbare metastase te evolueren.(15) Zo zullen tienduizenden kankercellen dagelijks in circulatie komen waarvan slechts 0,01% zullen overleven en macroscopisch metastasen produceren. Deze bevindingen komen overeen met de hier besproken theorie van de CSC.(4) Het feit dat 0,01% overleeft zou kunnen betekenen dat slechts 1 op 10000 een CSC was. Het feit dat bij metastasering op afstand de nieuwe micro-omgeving op de ene plaats vijandelijker is dan op andere kan mogelijks een reden zijn waarom bepaalde tumoren preferentieel naar bepaalde organen metastaseren.(16) Er is aangetoond dat de primaire tumor het implanteren van zijn circulerende kankercellen bevorderd door producten te secreteren die bepaalde locaties gunstiger maakt voor de innesteling. Men spreekt dan van pre-metastatische niches.(16)

6.4.Tumor-stroma interacties 6.4.1. Stroma Stroma komt van het grieks στρῶµα, wat bed betekend. Het stroma omvat een bindweefsel dat cellen, weefsels en organen ondersteunt. Zij zorgen voor de structuur en voorzieningen van het biologisch weefsel en de parenchymcellen.(17)

6.4.2. Tumorstroma Tijdens de carcinogenese gaan de kankercellencommuniceren met het stroma. Door invloed van de kankercellen treden er veranderingen op in het normale stroma waardoor het sterk gaat verschillen van zijn originele vorm. Men gaat het stroma nu reactief stroma gaan noemen. Er treden fenotypische veranderingen op van de stromale cellen, remoddelering van de ECM, verhoging van de protease activiteit, angiogenese en influx van inflammatoire cellen.(18)Er is hier een cross-talk; de kankercellen produceren groeifactoren en proteasen en hebben zo ook, op een paracrien manier, invloed op de angiogenese, inflammatoire reactie en activatie van het stroma. Belangrijke aanwezigen in dit reactief stroma zijn de MSC en myofibroblasten. MSC worden, door secretie van oplosbare factoren door kankercellen, gerecruteerdnaar het tumorstroma uit de lokale

     

perivasculaire niches en het beenmerg.(19-21) Eenmaal aanwezig op de tumorsite treedt een wisselwerking op tussen de MSC en kankercellen. MSC gaan pro-invasieve groeifactoren secreteren.(22) Ook is bewezen dat MSC voorlopers zijn van myofibroblasten(23-25)en dat zij samen een belangrijke rol spelen in de tumorinvasie en metastasering.(26)

6.4.2.1.Myofibroblasten & kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF) Definitie

Myofibroblasten werden voor het eerst besproken bij wondheling. Myofibroblasten zorgen voor contractie zodat de twee randen van de wonde dichter bij elkaar komen en genezing optreedt (27). Myofibroblasten gaan het stroma moduleren in fysiologische en pathologische omstandigheden door cel-cel contact en secretie van matrix metalloproteïnasen (MMP), tissue inhibitors of MMP (TIMP), ECM-componenten, groeifactoren, cytokines en vetproducten alsook door expressie van specifieke receptoren.(28, 29) Daarnaast spelen myofibroblasten een rol in een groot aantal inflammatoire of fibroserende niet-neoplastische aandoeningen en maken ze deel uit van het reactieve stroma bij kanker waar ze CAF genoemd worden.(30, 31)Dus behalve een rol in wondheling, hebben myofibroblasten ook een tumor promotor functie door ondermeer de progressiete bevorderen en de pro-invasieve factoren te produceren (32, 33). Zo kan kanker gezien worden als een wonde die nooit geneest.(27) Tot op de dag van vandaag is er nog steeds geen specifieke, immunocytochemische merker voor myofibroblasten. De karakterisatie van myofibroblasten is daarom gebasseerd op een aantal positieve en negatieve merkers. Positieve merkers zijn α-SMA, γ-SMA, paladin 4Ig proteïne dat stressvezelvorming controleert, mucine-type transmembranaire glycoproteïne podoplanine, intermediaire filamenten vimentine en desmine, gesialyseerde transmembranaire molecule endosialine, cel-cel adhesiemolecule cadherine-11 en het collageen type I maturatie enzyme prolyl4-hydroxylase (P4H). Negatieve merkers zijn de epitheel merker cytokeratine, monocyten merker CD14, endotheel merker CD31, de fibrocyten merker CD34 en de gladde spiercel merker smootheline.(27) (Figuur 4)

     

FIGUUR 4. Merkers voor fibroblasten in tumorstroma en hun cellulaire localisatie. De merker is onderlijnd, synonieme naam tussen haakjes en de localisatie in specifieke cellen is eronder aangegeven.(27)

Precursoren van CAF

Het reactieve stroma bij invasieve tumoren bestaan uit CAF die uit het beenmerg komen en CAF afkomstig van lokale precursoren. Beenmerg afgeleide CAF komen ofwel uit circulerende MSC ofwel uit CD34+ fibrocyten, die dan CD14+ monocyten als precursor hebben.(23) Niet-beenmerg afgeleide CAF kunnen afstammen van meerdere locale gastheerprecursoren zoals endotheliale cellen, myoepitheliale cellen, epitheliale (kanker)cellen, fibroblasten, gladde spiercellen en adipocyten. De oorsprong van CAF blijft controvensieel alhoewel fibroblasten en beenmerg afgeleide precursoren (vb MSC) een hoofdfunctie lijken te spelen.(27) (Figuur 5)

     

FIGUUR 5. Precursoren van volwassen myofibroblasten. Deze cellen kunnen transformeren in myofibroblasten in normaal en pathologisch weefsel.(27)

Fibroblasten en MSC worden naar voor geschoven als progenitor van myofibroblasten of CAF in tumormilieu.(27) De transitie van MSC naar CAF gebeurt in tumormilieu deels onder invloed van TGF-β.(23-25) Dit doet vermoeden dat TGF-β een dominante, indirecte, pro-invasieve factor is bij epitheliale kankercellen. Het verandert namelijk α-SMA negatieve fibroblasten die geen invasie stimuleren naar α-SMA positieve CAF die de invasie wel gaan stimuleren.(27)In talloze studies is aangetoond dat humane beenmerg-afgeleide MSC die blootgesteld worden aan tumoraal geconditioneerd medium een CAF-fenotype aannemen. Zij gaan myofibroblasten merkers tot expressie brengen zoals α-SMA en fibroblast oppervlakteproteïnen.(34) MSC spelen op die manier een grote rol in de carcinogenese. Naast transforming groeifactor-β (TGF-β), scatter factor/hepatocyt groeifactor (SF/HGF) en de matrix metalloproteïnasen (MMP’s) zijn er nog veel moleculen ontdekt die een rol spelen in de de cross-talk tussen de CAF en kankercel(27). (Figuur 6)

     

FIGUUR 6. Moleculaire cross-talk tussen myofibroblasten en kankercellen. Efferente factoren (zwarte kader) worden geproduceerd door de kankercel en reguleren de conversie van stromale progenitorcel naar CAF. (zwarte onderbroken pijl). CAF produceren afferente factoren (rode kader) die de invasie van de kankercel gaan reguleren. (rode onderbroken pijl).(27)

Functie CAF bij carcinogenese

CAF gaan de tumorgroei en invasie promoten.(26) TGF-β induceert CAF-vorming uit MSC en fibroblasten.(23-25)

TGF-β zorgt op die manier voor kankerprogressie via paracriene en

autocriene effecten. Paracriene effecten zijn niet alleen de recrutering van MSC en CAF, transfomatie van MSC naar CAF maar ook stimulatie van de angiogenese en onttrekking aan beschermende rol van het immuunsysteem. Autocriene effecten van TGF-β in kankercellen met een TGF-β receptor kunnen optreden met betrekking van β-catenine of activering van Ras mutaties.(35) Er wordt reeds onderzoek gedaan naar de pro-invasieve eigenschappen van deze CAF. Via een speciaal in vitro model met collageen type 1 en Matrigel kunnen we deze invasieve eigenschappen beter begrijpen. CAF werden geïsoleerd uit colontumoren of gewonnen uit met TGF-β

     

getransdifferentieerde colon fibroblasten. Uit deze CAF konden De Wever en collega’s twee proinvasieve factoren identificiëren die gesecreteerd werden door CAF: SF/HGF en de TGF-βgeüpgeruleerde extracellulaire matrix glycoproteine tenascin-C (TNC). Beide factoren zijn noodzakelijk doch niet de enige factoren die een rol spelen bij invasie.(36)

6.4.2.2.Mesenchymale Stamcellen Definitie MSC

MSC zijn een heterogene mix van stromale stamcellen die kunnen differentiëren naar een hele reeks mesodermale cellen zoals adipocyten, osteocyten en chondrocyten.(37, 38) Zij kunnen migreren naar wonden waar ze de wondgenezing en regeneratie van beschadigd weefsel ondersteunen. MSC kunnen ook migreren naar sites van tumorigenese. Op die manier zouden MSC kunnen dienen als cellulaire transporter van therapeutische anti-tumorale agentia. Aan de keerzijde is recent ontdekt dat MSC in de micro-omgeving van de tumor de desmoplastische reactie ondersteunt en zo de tumorformatie en progressie zou versnellen.(39) (Figuur 7)

     

FIGUUR 7. Lokale MSC en BM-MSC worden gerecruteerd door chemotactische factor uitgescheiden

door

een

niet-invasieve

tumor

en

helpen

na

differentiatie

naar

myofibroblasten(=CAF), pericyten en endotheliale cellen mee aan de invasie van de tumor. Dunne pijlen duiden op cellulaire of tumorale transitie. Dikke pijlen duiden op verplaatsing of invasie. Gestippelde pijlen duiden op diffusie van oplosbare factoren.(22)

Door toenemend onderzoek naar MSC werden deze door verschillende onderzoekers op andere manieren geïsoleerd en opgekweekt waardoor criteria’s om deze MSC te definiëren zich opdrongen. Algemeen gelden nu 3 criteria om stamcellen te differentiëren van andere cellen: 1. Zij moeten kunnen verankeren en groeien op een plastieken bodem; 2. Zij moeten volgend oppervlakte antigenen tot expressie brengen: CD105, CD73, CD90. En mogen geen CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79a, CD19 of HLA-DR tot expressie brengen; 3. Zij moeten kunnen differentiëren tot osteoblasten, adipocyten en chondroblasten in vitro.(38) Specifiek voor colonkanker zouden de CSC en MSC ook nog CD133, CD44 en GRP49 als oppervlaktemerker moeten hebben.(4)

Migratie van MSC–Rekrutering naar tumorsite

De migratie van MSC naar de tumorsite is reeds bewezen voor glioma, melanoom, Kaposi sarcoom, Ewing sarcoom maar ook voor borstkanker, ovariumkanker en colorectaalkanker.(19, 4046) De onderliggende mechanismen zijn nog niet volledig gekend maar een aantal moleculen die de rekrutering mediëren zijn reeds geïdentificieerd. (Figuur 8)Cytokines en groeifactoren gescreteerd door de tumor zorgen voor rekrutering van lokale en beenmerg afgeleide MSC. De monocyt chemotactische proteine-1 (MCP-1), cyclophilin B en Hepatoma-derived groeifactor (HDGF) zijn ontdekt in het geconditioneerde medium van een borstkanker. De concentraties recombinant proteine van MCP-1, cyclophilin B en HDGF nodig om chemotaxis te bekomen in een experimentele setting zijn nog steeds hoger dan de fysiologische concentraties wat doet vermoeden dat er nog moleculen moeten ontdekt worden die bijdragen aan de chemotaxis. Hierbij is de urokinase plasminogen activator (uPA) een goede kandidaat. Hoe uPA samen met zijn receptor (uPAR) de rekrutering van MSC beïnvloedt is nog onduidelijk. Mogelijks gebeurt dit via een indirect mechanisme waarin uPA de expressie van cytokines, chemokines en groeifactoren zoals FGF-2 en VEGF beïnvloedt. FGF-2 en VEGF zijn al gekend als chemotactische molecule voor MSC in tumorprogressie.(39) Recent hebben Rattigan et al. IL-6 voorgesteld als molecule die

     

ook vooor de migrratie van MS SC kan zorggen naar de tumor. In hun h experim menten zagen n ze de concenntratie van IL-6 mRNA A en proteïïne stijgen in hypoxiscche kankerccellen (47).D Daaraan gekopppeld zagen zee ook een veerhoogde cheemotaxie van n MSC naar de tumorsitee(47, 48). Bijj hoofden nekk squameuze celcarcinom men (HNSCC C) zijn tumorr necrose facctor-α (TNF--α), VEGF, HDGF, plaatjees-afgeleide groeifactor-AB (PDGF F-AB) en de transform ming growth factor-β (T TGF-β) betrokkken bij de caarcinogenesee. Stijgende concentraties c s van deze cyytokines en ggroeifactoren n waren gerelatteerd aan hoogere progressie en reciddief van de HNSCC, terrwijl lagere concentratiees beter reageerrden op dee therapie. Hiervan H haddden PDGF-AB, VEGF F, HDGF een IL-8 een n sterke chemotactisch effeect op beenm merg-afgeleidden MSC (BM-MSC) enn spelen moggelijks een ro ol in de NSCC.(22)E Een nieuwe, zeer belanggrijke factor is de transfforming homingg van MSC naar de HN growthh factor-β (T TGF-β). Vann TGF-β is geweten datt het MSC, fibroblasten en fibrocyten doet transfoormeren naarr CAF.(23-225) Naast huun rol in dezze belangrijkke transform matie zou TG GF-β in tumorm milieu ook fuungeren als chemotactisc c ch cytokine voor v MSC.(39)

FIGUUR 8. 8 MSC in circulatie migreren m naaar de tumorr en gaan de d tumorproggressie bevo orderen. Verschillennde factorenn zijn reeds gekend in de rekruterring van dee MSC. Dezze factoren worden geproduceeerd door dee tumor en zorgen vooor chemo-atttractie. Dezze factoren zijn TGF-β, IL-6, cyclophilinn B, HDGF, uPA/uPAR, MCP-1, VE EGD en FGF F-2. Ter hooggte van de tuumor gaan de d MSC

     

infiltreren in het stroma en bio-actieve moleculen produceren zoals CCL5(RANTES), IL-6, SDF-1 en TGF-β.(39)

6.4.2.3.Endotheliale cellen Endotheliale cellen spelen een grote rol in vorming van nieuwe bloed- en lymfevaten. Zij bevatten een Vascular Endothelial Growth Factor Recptor (VEGFR) op hun membraan die paracrien gestimuleerd wordt door VEGF afkomstig van de kankercellen en andere stromale cellen. Geactiveerde endotheliale cellen gaan delen en bloedvaten vormen. Zo kan de tumor zich voeden en later eventueel metastaseren.

6.4.2.4.Macrofagen Het nieuwe inzicht is gegroeid dat leukocyten aanwezig in de micro-omgeving van de primaire tumor niet de kankercellen proberen te bestrijden maar gerecruteerd zijn door de kankercellen zelf. Tumor geassocieerde macrofagen (TAM) helpen de kankercellen met de invasie door de productie van MMP en proteïnasen om de ECM te remodelen en basale membraan af te breken. Verder secreteren TAM zelf factoren die het immuunsysteem onderdrukken en angiogenese stimuleren.

6.4.2.5.Adipocyten Het is al langer bekend dat adipocyten ook een hormonale functie vervullen in het lichaam. Adipoctyten secreteren groot aantal cytokines, adipokines genaamd. Het is dus niet verwonderlijk dat zij deelnemen in tal van eventen zoals stimulatie van invasie en angiogenese.

6.4.2.6.Fibroblasten Fibroblasten zijn een basiscomponent van het normale stroma. Zij helpen mee de ECM op te bouwen door de secretie van collageen, laminine en fibronectine. Zij produceren ook metalloproteïnasen waardoor ze de ECM afbreken en zo voor een turn-over zorgen. Fibroblasten zijn orgaanspecifiek en gaan afhankelijk van hun locatie veel of weinig collageen produceren of andere groeifactoren en proteolytische enzymen.

     

6.4.2.7.Extracellulaire matrix De ECM geeft steun en omgevingsinformatie aan de cellen. De ECM bestaat uit eiwitten en proteoglycanen. Er zijn structurele eiwitten zoals collageen en elastine, die de flexibiliteit van het weefsel bepalen. Er zijn ook gespecialiseerde eiwitten zoals fibrilline, fibronectine en laminine. Het is het remoddeling van de ECM die ook zal bijdragen tot het invasieve karakter van een tumor.

6.5. HER-receptoren in Colorectaalkanker 6.5.1. HER-receptoren & liganden De epidermale groeifactor receptoren (EGFR) familie heeft tyrosine kinase activiteit en bestaat uit 4 verschillende receptoren: EGFR (HER1/ErbB1), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) en HER4 (ErbB4). Tyrosine kinase receptoren zijn transmembranaire receptoren met de intrinsieke eigenschap om fosfaatgroepen te transfereren op intracellulaire tyrosine substraten. Activatie gebeurt door homo- of heterodimerisatie van het receptordeel dat zich in het cytoplasma bevindt.(49, 50) (FIGUUR 9)De liganden voor deze receptoren zijn van de EGF familie en zijn verdeeld in drie groepen. In de eerste groep zitten EGF, transforming growth factor alfa (TGF-α) en amphireguline (AR), die allemaal op HER1 binden. De tweede groep bevat β-celluline (BTC), heparin-binding EGF (HB-EGF) en epi-reguline (EPR) die binden op HER1 en HER4. De derde bevat 4 neuregulines (NRG1-4) waarvan NRG1-2 op HER3 binden en NRG3-4 op HER4. NRG2 heeft een zwakke bindingscapaciteit voor HER3 en werkt voornamelijk via co-activatie van HER1 en de phospholipase C-γ rekrutering. NRG1 daarentegen heeft een hoge bindingscapaciteit voor HER3 en werkt via HER2 co-activatie met activering van de PI3K-pathway.Voor HER2 zijn er geen liganden. HER2 wordt gebruikt om te dimeriseren met andere HER. (49, 50)HER3 heeft geen intrinsieke tyrosine kinase activiteit. Activatie van de receptor brengt een cascade op gang en leidt tot downstream beïnvloeden van proliferatie, migratie, differentiatie en apoptose.

     

FIGUUR 9. Structuurr van de HER-receptor H ren met hun n liganden. De receptoor bestaat uit u drie d dat bestaat uit twee t cysteine rijke regio o’s, een domeinen: een extra-ccellulair ligaandbindend domein d met een e tyrosine kinase regioo.(51) transmembbranair domeein en een intracellulair domein

6.5.2.

HE ER-receptoreen in Colorecctaalkanker (CRC) (

d tweede meest frequen nte oorzaak van v overlijdeen aan kankeer in de Coloreectaal kankerr (CRC) is de Westerrse wereld zoowel bij mannnen als vrouuwen.(52)CR RC is jaarlijkks verantwoorrdelijk voor 655000 doden wereldwijd.(53)De laatsste jaren is de d prognose verbeterd wat w mogelijkss een gevolg g is van c technieken, betere b radio-- en chemoth herapie. vroegeere diagnose door screeniing, betere chirurgische Vandaag worden tw wee strategieeën gevolgd inzake doelg gerichte adjuuvante therappie: Inhibitiee van de epiderm male groeifa factor recepttor (EGFR/H HER1) met monoclonaale antilicham men cetuxim mab en panitum mumab. En inhibitie vann de angioggenese met bevacizumab b b, een monoclonaal antillichaam tegen de d vasculair endotheliale e groeifactor (VEGF).(52) ( )

6.5.3.

Klinische betekkenis van HE ER

Ongeppubliceerde data d van Dee Boeck en collega’s ton nen aan datt beenmergafgeleide stam mcellen (BM-M MSC)

tumoorgroei,

ovverleving

enn

invasie

bij

CRC

promoten

door

parracriene

NRG1//HER2/HER R3/AKT signnalisatie. Vann NRG1 is geweten g dat zij een belanngrijke rol sp peelt in epithelliale tumorenn. NRG1 kann geproduceeerd worden door de kankkercellen in melanoma’ss, borsten ovaariumcarcinom ma’s maar ook o door de CAF C in borstt- en maagtum moren. (54-556)De expresssie van

     

transmembranair neureguline-1 (tNRG1) en vrijstelling van functioneel actief NRG1 in BM-MSC is reeds aangetoond.HER3 activatie door NRG1 gaat vooral gebeuren door dimerisatie met HER2. Een HER2/HER3 overexpressie is daarom ook beschreven in CRC en wordt gelinkt aan vergevorderde CRC.(57)Stricto senso gaat NRG1 zowel HER3 als HER4 activeren. HER3 komt vooral tot expressie in epitheliale cellen en in het perifere zenuwstelsel. HER4 expressie daarentegen is beperkt tot het centrale zenuwstelsel, hart en skeletspieren. (58-60)We gaan er daarom vanuit dat HER3 de belangrijkste receptor is voor NRG1 in het colonepitheel. Hoewel HER3 dan een grote rol speelt in de carcinogenese van CRC zou dit vooral zijn in de vroege stadia. Waar HER4 dan zou betrokken zijn in de latere stadia van de carcinogenese bij CRC.(61, 62) Verder onderzoek moet dit nog bevestigen.

6.5.4.

Doelgerichte therapieën

Verhoogde expressie of activiteit van EGFR is sterk gelinkt aan bepaalde epitheliale kankers zoals colorectaalkanker maar ook niet-kleincellig longkanker en borstkanker. Daarom zijn er reeds inhibitoren ontwikkeld die de activiteit van EGFR/HER1 doen verminderen. Het zijn antilichamen tegen de ligand-bindingsdomeinen (cetuximab, panitumumab) of kleine moleculen tegen het tyrosine kinase domein (lapatinib).(49)(Figuur 11)Er zijn resultaten geboekt met deze inhibitoren maar meerderheid van de patiënten reageert niet op de behandeling of worden refractair. De aanwezigheid van de EGFR/HER1 is nu ook gevonden in de nucleus. Een toename van EGFR/HER1 op de nucleus is prognostisch ongunstig in borstkanker en ovariumkanker.(50) Enkel cetuximab en Panitumumab worden in de kliniek ingezet tegen CRC.(49)

     

FIGUUR 11. De HER-inhibitoren.(49) 6.5.4.1. Cetuximab& panitumumab Cetuximab is een recombinant chimerisch monoclonaal IgG1 antilichaam dat specifiek bindt op het extracellulaire domein van de menselijke EGFR/HER1 en de binding van liganden zoals EGF en TGF-α blokkeert.(52)Panitumumab is een humaan monoclonaal antilichaam tegen de EGFR (HER1) dat bindt op het ligandbindend domein. Zo kan de receptor niet geactiveerd worden.(52) 6.5.4.2. Pertuzumab Pertuzumab is de eerste van een nieuwe klasse inhibitoren, namelijk de HER dimerisatie inhibitoren (HDI). Het is een gehumaniseerd monoclonaal antilichaam gebasseerd op IgG1 dat geproduceerd wordt in chinese hamster ovaria (CHO)-culturen. Pertuzumab heeft net als trastuzumab een werking tegen het extra-cellulaire deel van de HER2. Pertuzumab bindt op een epitoop binnen sub-domein 2 waar trastuzumab bindt op sub-domein 4. Zijn werking is via de blokkering van de dimerisatie met de andere leden van de HER-familie, namelijk HER1, HER3 en HER4. Hierdoor gaat pertuzumab de ligand geïnduceerde activatie van de MAPK en PI3K pathway inhiberen. De MAPK en PI3K pathways zijn respectivelijk van belang in de groeistop en apoptose van de cel.(63)In vitro experimenten bij borstkanker hebben aangetoond dat pertuzumab de dimerisatie van HER2 met HER3 inhibeerde en trastuzumab dit niet deed. Hier is pertuzumab dus een antagonist van NRG1-2. In vivo studies op CRC-cellen geïnjecteerd bij muizen toonde een kleine anti-tumorale activiteit van pertuzumab. Gecombineerd met irinotecan of erlotinib was er zelfs een significante inhibitie van de tumorgroei.(64)

6.5.4.3. Trastuzumab (Herceptine) Trastuzumab is een chimerisch HER2-specifiek monoclonaal antilichaam dat wordt ingezet bij patiënten met borstkanker.(65) Mann et al. hebben aangetoond dat trastuzumab de kolonie formatie in de HCA-7 CRC cellijn inhibeert.(66)

6.5.4.4. Lapatinib Lapatinib heeft een duale werking als tyrosine kinase inhibitor, namelijk inhibitie van HER1 en HER2. Het kan worden ingezet bij patiënten met borstkanker die refractair zijn voor trastuzumab.(66) Ook werd het effect reeds aangetoond in prostaatkankers(67) en CRC.(68)

     

     

7. DOELSTELLINGEN  Ongepubliceerde data van De Boeck et al. hebben aangetoond dat MSC de tumorprogressie van CRC bevorderen door paracriene stimulatie van de NRG1/HER3-loop.Deze MSC worden door de kankercel naar de tumorsite gerekruteerd en gaan daar differentiëren naar CAF, pericyten en endotheliale cellen. Deze CAF, pericyten en endotheliale cellen gaan vervolgens helpen om de nog niet invasieve tumor invasief te maken.(22)Volgens Direkze et al. zijn 25% van de tumorgeassocieerde

mesenchymale

cellen

(TAMC)

afkomstig

van

MSC

uit

het

beenmerg.(25)Hieruit vloeien volgende onderzoeksvragen:Waaruit bestaan deze TAMC? Gaan TAMC ook de tumorprogressie bevorderen zoals de MSC? En wat zijn de onderliggende mechanismen? De doelstellingen van deze thesis zijn: 1.

Aanwezigheid van MSC en CAF in tumor geassocieerde mesenchymale cellen (TAMC) en

normaal geassocieerde mesenchymale cellen (NAMC) bij CRC achterhalen. Karakterisatie van TAMC en NAMC aan de hand van hun morfologie, multipotente eigenschappen en expressie van

α-SMA. MSC kunnen worden opgespoord aan de hand van hun differentiatie naar adipocyten en chondrocyten. CAF zijn cellen die α-SMA tot expressie brengen en dit is aantoonbaar op Western Blot. 2.

Effect nagaan van de geïsoleerde TAMC op HCT8/E11 kankercellen inzake proliferatie,

metabolische activiteit en invasie. We weten dat MSC uit het beenmerg (BM-MSC) de groei, proliferatie en invasie gaan bevorderen maar gaan de TAMC dit ook doen? TAMC bestaan voor 25% uit MSC maar deze zijn naar de tumorsite gerecruteerd en zijn bezig met de differentiatie naar CAF, pericyten en endotheliale cellen waardoor hun functionele effecten anders kunnen zijn. 3.

Onderzoek van onderliggende mechanismen die de functionele effecten van TAMC op

HCT8/E11 kunnen verklaren. De rol van de NRG1/HER3-loop in tumorprogressie door TAMC bij CRC dient nagegaan te worden.Wat zijn effecten van recombinant neureguline-1 (rNRG1) op HCT8/E11 colonkankercellen. Hierna kunnen we de werking van gangbare en nieuwe HERinhibitoren testen.

     

8. MATERIAAL EN METHODEN  (naar thesis van Pauwels J.)

8.1.

Cellijnen, primaire culturen

TAMC1, TAMC2, TAMC3 Humane Tumor Geassocieerde Mesenchymale Cellen, geïsoleerd uit patiënt nummer 1, 2 en 3. NAMC1, NAMC2 Humane Normale Geassocieerde Mesenchymale Cellen, geïsoleerd uit patiënt nummer 1 en 2.

BM-MSC Beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen.

HCT8/E11 Humane colon carcinoma cellijn gesubcloneerd uit de HCT8 cellijn. Deze cellen hebben een epitheloïde morfologie en zijn nog gedifferentieerd. Deze HCT8/E11 hebben nog een functioneel Ecadherines/catenine (E-cad/ctn) complex en zijn niet invasief in collageen type I.

8.2.

Buffers

“Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) Los de volgende producten op in 900 ml gedestilleerd water voor de bereiding van PBSD-: KCl: 0,2 g

KH2PO4: 0,2 g

NaCl: 8,0 g

Na2HPO4: 1,15 g

Breng de oplossing op pH 7,4 met NaOH (2 M). Om PBSD+ te bekomen, wordt 0,1 g CaCl2 en 0,1 g MgCl2.6H2O toegevoegd. Leng aan tot 1 l met gedestilleerd water. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4°C.

     

Laemmli buffer (1x) Samenstelling van 10 ml laemmli buffer (1x): Gedestilleerd water: 4 ml

Glycerol: 1 ml

SDS: 230 mg

Tris-HCL (0,125 M): 5 ml

8.3.

Antilichamen voor Western Blotting

De gebruikte primaire antilichamen zijn terug te vinden in Tabel 1. De secundaire antilichamen waren gekoppeld aan horseradish peroxidase aankocht bij Sigma Aldrich.

Antilichaam

Firma

Species

Type

Anti-α-tubuline

Sigma Aldrich, Bornem, België

Muis

Monoklonaal

Anti-α-SMA

Sigma Aldrich, Bornem, België

Muis

Monoklonaal

Anti-NRG-α1

R&D Systems

Geit

Polyklonaal

Tabel 1 Overzicht van de gebruikte primaire antilichamen. 

 

8.4.

Groeifactoren

Tabel 2 geeft een samenvatting van de groeifactoren die gebruikt werden. Voor elke groeifactor werden tevens de gebruikte concentraties weergegeven.

Naam

Firma

Concentratie

Transforming Growth Factor-α

Sigma

1 ng/ml – 10 ng/ml – 100 ng/ml

Neureguline (NRG1)

R&D systems

1 ng/ml – 10 ng/ml – 100 ng/ml

Tabel 2 Overzicht van de gebruikte groeifactoren.

     

8.5.

HER-inhibitoren

Tabel 3 geeft een samenvatting van de EGFR-inhibitoren die gebruikt werden met hun specifieke functie. Naam

Firma

Binding

Pertuzumab

Genentech Inc.

HER2-dimerisatie

Lapatinib

GlaxoSmithKline

HER1/HER2

Cetuximab

ImClone Systems Inc.

HER1

Panitumumab

Amgen

HER1

Herceptine

Genentech Inc.

HER2

Tabel 3 Overzicht van de gebruikte EGFR-inhibitoren. 

8.6.

Isolatie van mesenchymale cellen uit colonkanker.

Tumorweefsel werd bekomen van de Pathologische Dienst op 6Blok A, UZ Gent. Het weefsel werd behandeld met 10x antibiotica en door ons verdeeld in stukjes van 1 mm3. Deze verdeelden we danover twaalf plastieken wells, waarin we met een scalpel krassen hadden gemaakt,. Alvorens het weefsel op de well te leggen werd het eerst 5 sec in een alcoholoplossing gelegd om het zo kiemvrij te maken. In de well werd het weefsel bedekt met 100% Foetaal kalfserum (FKS) en geïncubeerd op 37°C gedurende 24h. Na 3 dagen werd het weefsel verder behandeld met het cultuurmedium. Dit cultuurmedium bevat alle voor de overleving en proliferatie nodige nutriënten waaronder eenvoudige suikers, essentiële aminozuren, anorganische zouten en vitaminen. Onder invloed van deze componenten is de overleving van de cel verzekerd, maar in vele gevallen zal de proliferatie zicht slechts minimaal manifesteren. Om dit te verhelpen, wordt het cultuurmedium aangereikt met FKS dat groeifactoren, hormonen en ongedefinieerde componenten bevat die de groei stimuleren. De cultivatie van TAMC/NAMCgebeurde in “Dulbecco’s Modified Eagle Medium”, dat naast de reeds genoemde noodzakelijke componenten ook fenolrood, een pH-indicator, bevat. Een pH van 6,8 of kleiner levert een gele kleur, terwijl bij een pH van 7,4 of hoger een paarse kleur wordt verkregen. Het medium wordt oranje bij de optimale zuurtegraad die tussen 6,8 en 7,4 ligt in een atmosfeer met 5% CO2 op 37°C. Na 7 dagen had het weefsel zich vast gehecht op de groeven en plastiek. Met de microscoop konden we uit het weefsel de mesenchymale cellen zien groeien op de plastiek. Als de mesenchymale cellen een confluente monolaag vormden, waarin contactinhibitie de cellen gebiedt de celcyclus te verlaten, werden de cellen losgemaakt van de plastiek om een celsuspensie te maken. Om verdere groei toe te laten, werden de cellen in een lagere densiteit uitgezaaid over

     

verschillende falcons van 25 cm2. Het verbreken van de cel-cel en cel-matrix contacten gebeurt in twee stappen. In eerste instantie worden de cellen behandeld met moscona, een fysiologische zoutoplossing zonder Ca2+. De integriteit van de extracellulaire domeinen van een aantal belangrijke proteïnen die instaan voor de cel-cel adhesie wordt immer bestendigd door het gebruikt van Ca2+ als cofactor. Behandeling van TAMC/NAMC met moscona zorgt ervoor dat Ca2+ uit deze eiwitten gedreven wordt en dit resulteert bijgevolg tot een verzwakking van de cel-cel adhesie. In de tweede stap wordt een oplossing van trypsine, een protease, en EDTA (Ethyleen Di-amine Tetra-Azijnzuur), een Ca2+- Mg2+ complexator, op de cellen gebracht. Dit heeft als gevolg de terminatie van cel-cel en cel-matrix contacten door afbraak van de extracellulaire domeinen van de adhesieproteïnen. Daar een te lange trypsine behandeling schadelijk is voor de TAMC/NAMC, wordt na maximum 15 minuten serumhoudend medium toegevoegd, waarin Ca2+en intrinsieke factoren aanwezig zijn, die de proteasen inhiberen. De cellen zijn nu nog kortstondig in suspensie en kunnen verdeeld worden over verschillende falcons van 25 cm2 of 75 cm2. MATERIAAL -

-

     

cultuurmedium: Serumhoudend 1g glucose/ml bevat het volgende o

DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, invitrogen, Merelbeke, België)

o

10% FKS

o

2 mM L-glutamine

o

100 IU/ml penicilline

o

100 µg/ml streptomycine

cultuurmedium: Serumvrij 1g glucose/ml bevat het volgende o

DMEM

o

2 mM L-glutamine

o

100 IU/ml penicilline

o

100 µg/ml streptomycine

-

plastieken falcons van 25 cm2 en 75 cm2`

-

Moscona (Gibco)

-

Trypsine/EDTA (Gibco)

-

Microscoop (Leica)

-

Bürker telkamer

-

CO2 incubator (NUAIRETM US AUTOFLOW)

-

Centrifuge

METHODE Bereiden van een celsuspensie -

Laat de cellen groeien tot een confluente monolaag in de plastieken falcons van 25 cm2 gevuld met 5 ml cultuurmedium in een waterdampverzadigde 5% CO2 incubator.

-

Was de cellen 2 maal met 3 ml Moscona en verwijder door aspiratie.

-

Behandel de cultuur 1 maal 10s met 3 ml trypsine/EDTA en verwijder door aspiratie

-

Incubeer de cultuur 10 min bij 37° C.

-

Controleer met de lichtmicroscoop of de cellen zijn losgekomen van de plastiek.

-

Voeg 5 ml serumhoudend cultuurmedium toe.

-

Suspendeer de cellen.

Celtelling -

Breng 2 maal 5 µl celsuspensie (m.b.v. een pasteurpipet) in een Bürker telkamer.

-

Tel het aantal cellen onder de microscoop in 25 telvakjes

-

Vermenigvuldig het aantal getelde cellen met 104 om het aantal cellen per ml te bekomen.

Uitsplitsen van cellen -

Breng 1,0 ml (1:5); 0,5 ml (1:10); 0,25 ml (1:20) van de celsuspensie in een nieuwe cultuurfles van 25 cm2 oppervlakte en leng aan tot 5 ml met serumhoudend cultuurmedium

-

Incubeer en laat de cultuur groeien tot confluentie in een waterverzadigde 5% incubator.

-

Ververs het cultuurmedium om de 3 dagen.

Cultivatie van TAMC11, TAMC13, TAMC14, NAMC11 en NAMC14 -

Breng een hoeveelheid celsuspensie in een plastieken falcon van 75 cm2 en leng dit met cultuurmedium tot 15 ml.

-

Incubeer de mesenchymale cellen bij 37°C in een waterdampverzadigde 5% CO2 incubator.

-

Ververs het cultuurmedium om de 3 dagen.

Serumvrij geconditioneerd medium (CM) -

Zaai de cellen uit in een plastieken falcon van 75 cm2.

-

Laat de cellen bij 37°C in serumhoudend DMEM groeien tot confluentie in een waterdampverzadigde 5% incubator.

     

-

Was de confluente cultuur 4 maal met serumvrij cultuurmedium (1 maal snel, 1 maal met 5 min incubatie gevolgd door 2 snelle wasbeurten).

-

Voeg 15 ml serumvrij cultuurmedium toe en laat gedurende 48 uur incuberen.

-

Oogst het bovenstaande medium en centrifugeer en filtreer het supernatans door een 0,2 µm filter.

-

     

Bewaar het CM bij -20°C.

8.7.

Human Mesenchymal Stem Cell Identification Kit

Om in onze groep mesenchymale cellen de fractie MSC na te gaan hebben we de Human Mesenchymal Stem Cell Identification Kit gebruikt (R&D Systems, Inc. Catalog Number SC006). De stamcellen worden geïdentificeerd door in vitro hun functionele differentiatiecapaciteit na te gaan. Eigenschappen van stamcellen zijn namelijk hun mogelijkheid tot zelf-vernieuwing en hun capaciteit om in een groot aantal progenitorcellen te differentiëren, welke dan geëngageerd zijn voor een verdere maturatie in specifieke cellijnen. Er zijn reeds stamcellen geïsoleerd uit verschillend volwassen weefsel zoals de BM-MSC en MSC. Deze zijn in staat om te differentiëren in adipocyten, osteocyten, chondrocyten, hepatocyten, cardiomyocyten en neuronen (REF). Tijdens de isolatie van stamcellen worden deze dan ook best geëvalueerd door hun differentiatieapaciteit in verschillende cellijnen na te gaan. Op deze manier wouden we ook de status van mogelijke MSC in onze mesenchymale cellen na gaan door te proberen hen te differentiëren tot adipocyten en osteocyten. MATERIAAL -

24-well plaat

-

α Minimum Essential Medium (αMEM) (Invitrogen)

-

Human Mesenchymal Stem Cell Identification Kit met Adipogeen Supplement en Osteogeen Supplement

-

Foetaal Kalfserum (Invitrogen)

-

Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (Invitrogen)

-

Penicilline-streptomycine-glutamine

-

Paraformaldehyde (4%)

-

Oil Red O stock solution (0,5g/100 ml isopropanol)

-

Ethanol (70%)

-

Alizarine Red S stock solution (1,3g (40mM) Alizarine Red S, 100 ml gedistilleerd water, pH aanpassen met 0,5% ammoniumhydroxide tot 4,1-4,3)

-

CO2 incubator

-

Centrifuge

-

Hemocytometer

-

Microscoop

METHODEN Prepareren αMEM basaal medium: bewaren op 2-8°C

     

-

90 ml αMEM

-

10 ml FKS

-

1 ml penicilline-streptomycine-glutamine

Adipogene differentiatie Preparatie Adipogeen Differentiatiemedium: bewaren op 2-8°C: -

Als na het ontdooien zich een neerslag vormt in het Adipogene Supplement warm het op in warm water (37°C) en vortex tot neerslag weg is.

-

Voeg 50 µl Adipogeen Supplement toe aan 5 ml αMEM basaal medium.

Adipogenese cultuur protocol: -

zaai 2,1 x 104 cellen uit per well in αMEM basaal medium. Vul 10 wellsen laat overnachten in de 5% CO2 incubator op 37°C.

-

Cellen moeten 100% confluent zijn alvorens de differentiatie te beginnen. Als de cellen niet confluent zijn behandel elk 3 dagen met αMEM basaal medium tot ze wel confluent zijn.

-

Als cellen confluent zijn vervang het basale medium dan door 0,5 ml Adipogeen Differentiatiemedium om de adipogenese te induceren.

-

Ververs het Adipogeen Differentiatiemedium (0,5ml/well) elke 3 à 4 dagen.

-

Na 7 à 21 dagen kunnen adipocyten gefixeerd en gekleurd worden met een Oil Red Okleuring.

Oil Red O-kleuring: -

Aspireer het medium uit elke wel.

-

Was de cellen 2 maal met PBS.

-

Fixeer cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.

-

Aspireer de paraformaldehyde en spoel 2 maal met gedistilleerd water.

-

Aspireer, voeg de Oil Red O stock solution toe en laat 1 uur staan op kamertemperatuur.

-

Aspireer de kleurstof en reinig 2 keer met gedistilleerd water.

-

Laat het water in de well staan en maak foto’s.

Osteogene differentiatie Preparatie Osteogene Differentiatiemedium: -

Warm het Osteogene Supplement op in een waterbad van 37°C.

-

Voeg 250 µl Ostegene Supplement toe aan 5 ml αMEM basaal medium.

-

Verdeel de rest van het Osteogene Supplement over aliquots van 250 µl en bewaar op 20°C.

     

Osteogenese cultuur protocol: -

Zaai 4,2 x 103 cellen uit per well in αMEM basaal medium. Vul 10 wells van een 24 wellplaat en laat overnachten in de 5% CO2 incubator.

-

Cellen moeten 50-70% confluent zijn na 1 à 2 dagen. Als cellen 50-70% confluent zijn vervang het basale medium dan door 0,5 ml Osteogeen Differentiatiemedium om de osteogenese te induceren.

-

Ververs het Osteogeen Differentiatiemedium (0,5ml/well) elke 3 à 4 dagen.

-

Na 14 à 21 dagen kunnen de osteocyten gefixeerd worden in 70% ethanol en gekleurd worden met Alizarine Red S.

Alizarine Red Kleuring: -

Aspireer het medium uit elke well.

-

Reinig de cellen met PBS.

-

Fixeer de osteocyten door ze te incuberen in ijskoude 70% ethanol gedurende 1 uur.

-

Aspireer de ethanol en was 2 maal (5-10 minuten elk) met gedistilleerd water.

-

Aspireer het water en voeg voldoende Alizarine Red S Solution toe om de wells te bedekken (0,5 tot 1,0 ml per well in 24 wellplaat) en laat 30 minuten staan op kamertemperatuur.

8.8.

-

Aspireer de kleurstof en was 4 maal met gedistilleerd water.

-

Laat het water in de wells staan en maak foto’s.

Proteïnenniveau

8.8.1. Bereiden van cellysaat Om een analyse op cellulaire proteïnen uit te kunnen voeren, dienen deze uit de cel geëxtraheerd te worden. Dit gebeurt aan de hand van een lysebuffer, die via destabilisatie van het celmembraan ervoor zorgt dat de cellulaire inhoud naar buiten lekt. Dit effect komt tot stand door inwerking van, in de buffer aanwezige, detergenten. De lysebuffer die hier gebruikt wordt, is een Laemmli-oplossing, met als membraandestabiliserende component, sodiumdodecylsulfaat (SDS), een anionisch detergent. SDS is een sterk detergent en zorgt ervoor dat alle eiwit-eiwit interacties verloren gaan. Wil men juist deze interacties bestuderen, bijvoorbeeld via een immunoprecipitatie, dan worden lysebuffers gebruikt waarin veel zwakkere, niet-ionogene detergenten, zoals Triton X-100 of Nodinet P-40 (NP-40), aanwezig zijn. Door het verdwijnen van de membranaire structuren zal de celcompartimentalisatie verloren gaan en dit heeft als gevolg dat proteasen, die normaal gezien enkel in lysozymen voorkomen,

     

op de vrijgekomen proteïnen kunnen inwerken. Dit kan aanleiding geven tot vals negatieve resultaten en om dit te verhinderen, zijn aan de lysebuffers protease-inhibitoren toegevoegd. Bovendien wordt bij lyseren steeds op ijs gewerkt. Om ook de membraangebonden proteïnen vrij te stellen en om de celmembranen verder te fragmenteren, wordt het lysaat gesoniceerd. Dit is het voor een tiental seconden laten inwerken van hoogfrequente geluidsgolven op de lysaten. Eens dit gebeurt is, wordt het cellulaire debris van de proteïnen gescheiden door middel van centrifuge.

MATERIAAL -

IJskoude PBSD+

-

Laemmli buffer (1x)

-

Celschraper uit rubber.

-

Eppendorf tubes van 1,5 ml.

-

Sonicator: Vibracell (Sonics & Materials, Dunburg, CT, USA).

METHODE Totaal extract met sonicatie. -

Laat de cellen groeien tot een confluente monolaag in plastieken cultuurflessen van 75 cm² oppervlakte. (zie supra)

-

Verwijder het medium en was de monolaag 3 maal kort met koude PBSD+ om alle resten medium te verwijderen. Werk vanaf nu op ijs!

-

Aspireer zo droog mogelijk om verdunning van de buffer tegen te gaan.

-

Voeg 200 µl ijskoude Laemmli buffer (1x) toe aan de monolaag.

-

Schraap de cellen los van de plastieken cultuurfles met een celschraper.

-

Breng de visceuze celsuspensie over in een 1,5 ml Eppendorf tube.

-

Soniceer het lysaat gedurende 10 sec bij 20 Hz en centrifugeer gedurende 5 minuten aan 14000 rpm bij 4°C.

-

Breng het supernatans over in een nieuw 1,5 ml Eppendorf tube.

8.8.2. Bepalen eiwitconcentratie Het bepalen van de eiwitconcentratie van de lysaten laat toe om in verdere analyses steeds een gelijke hoeveelheid proteïnen te gebruiken en maakt het dus mogelijk deze kwantitatief met elkaar te vergelijken. De “Bio-Rad Dc Protein Assay”, die hiervoor aangewend wordt, is gebaseerd op de Lowry-methode. In een eerste stap wordt aan de eiwitoplossing een CU2+-zout toegevoegd. Het CU2+ complexeert met de eiwitten en zal zelf gereduceerd worden naar CU+. In de tweede stap wordt het

     

Folin-fenol reagens toegediend, dat door het CU+-proteïnecomplex op zijn beurt gereduceerd wordt en bij pH 10 een blauwe kleur geeft. Na een kwartier wordt de hoogste intensiteit bereikt. De absorbantie hiervan (750 nm) kan gemeten worden met de spectrofotometer en is gecorreleerd aan de hoeveelheid eiwit aanwezig in de oplossing.

MATERIAAL -

Kit voor het bepalen van de eiwitconcentratie: Bio-Rad Dc Protein Assay

Reagens S

Reagens A

Reagens B

-

Vortexmixer.

-

Spectrofotometer: Ultrospec Plus Spectrophotometer. (Pharmacia LKB, Piscataway, USA)

METHODE -

Bereiding van het werkingsreagens A’: voeg 20µl van het reagens S toe per ml van het reagens A en vortex.

-

Bereiding van de stalen: voeg 10µl eiwitoplossing toe aan 40µl gedestilleerd water.

-

Gebruik als blanco oplossing: 50µl gedestilleerd water.

-

Breng de 50 µl van de blanco oplossing en van de stalen in propere, droge proefbuizen.

-

Voeg 250 µl van het reagens A’ toe aan elke proefbuis en vortex.

-

Voeg 2 ml van het reagens B toe aan elke proefbuis en vortex.

-

Laat de proefbuizen gedurende 15 minuten staan.

-

Meet de absorbantie met een spectrofotometer bij een golflengte van 750 nm.

8.8.3. SDS-PAGE SDS-PAGE (sodiumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelectroforese) is een elektroforesetechniek en wordt gebruikt om proteïnen van elkaar te scheiden op basis van hun moleculair gewicht. De techniek berust op het principe dat eiwitten die van elkaar verschillen in grootte, met een verschillende snelheid doorheen een polyacrylamidegel zullen migreren. De migratie gebeurt onder invloed van een elektrisch veld. Gezien het voor kan komen dat een groot eiwit een even grote nettolading draagt als een klein eiwit en de scheiding hier dus niet meer geheel gebeurt op basis van moleculair gewicht, wordt SDS toegevoegd. SDS interageert met de eiwitten in een 1,4/1 verhouding en geeft deze een negatieve oppervlaktelading die de intrinsieke lading van de eiwitten afschermt en er dus voor zorgt dat alle eiwitten, ongeacht hun nettolading, naar de positieve pool zullen migreren met een snelheid die afhankelijk is van hun grootte. Bovendien denatureert SDS de eiwitketens, wat met zich meebrengt dat

     

sterk gecondenseerde, lange eiwitketens gelinealiseerd worden en bijgevolg een grote weerstand in de gel ondervinden. Dus hoe langer de keten, hoe trager deze door de gel migreert. Kleine eiwitten worden dus onderaan de gel gevonden, terwijl de fractie grotere eiwitten zich bovenaan manifesteert. Verder worden de zwavelverbindingen tussen eiwitketens via reductie onder invloed van β-mercaptoethanol verbroken. De denaturatie gebeurt bij 95°C. De radicalen die nodig zijn om acrylamide te polymeriseren, ontstaan door interactie van de radicaaldonor ammoniumpersulfaat en de katalysator, N’-tetramethylethyleendiamine (TEMED). Het acrylamidemonomeer komt steeds samen voor met bisacrylamide (bis), twee acrylamidemonomeren verbonden door een methylgroep. Incorporatie van bis in een polymeriserende acrylamideketen zorgt voor het ontstaan van een vernette structuur. Iedere polyacrylamidegel bestaat uit twee segmenten. Bovenaan, waar de stalen worden aangebracht, bevat de gel grote poriën. In deze “stacking” gel migreren de proteïnen dus met een relatief grote snelheid. Op een bepaald punt zullen deze botsen met de “separating” gel, die veel kleinere poriën bevat en dus voor een tragere migratiesnelheid zorgt. Proteïnen die wat achterlopen en zich dus nog in de stacking gel bevinden, zullen sneller bewegen dan de eiwitten die zich reeds aan het front van de separating gel bevinden. Door deze opconcentratie zullen in de separating gel smalle proteïne bandjes ontstaan en dit komt het oplossend vermogen van de scheiding ten goede.

MATERIAAL -

Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis System. (Bio-Rad, Hercules, USA)

-

Glasplaatjes, kam, dragersysteem.

-

Buffertank, deksel, dragersysteem.

-

Separating gel oplossing (8%). Meng de volgende producten voor de bereiding van 5 ml oplossing: Scheidingsbuffer: 1,3 ml

Acrylamide (30%): 1,3 ml

Gedestilleerd water: 2,4 ml

APS (10%): 25 µl

TEMED: 2,5 µl (Los 1 g APS op in 10 ml gedestilleerd water voor de bereiding van APS (10%).) -

Bereiding van 1L scheidingsbuffer. Los de volgende producten op in 1L gedestilleerd water: SDS: 4,0g

Tris: 181,7g

Breng deze oplossing op pH 8,8 met HCl (6M). -

Stacking gel oplossing. Meng de volgende producten voor de bereiding van 5 ml oplossing:

     

Concentratiebuffer: 1,3 ml

Acrylamide (30%): 0,8 ml

Gedestilleerd water: 3,0 ml

APS (10%): 50 µl

TEMED: 5 µl (Los 1 g APS op in 10 ml gedestilleerd water voor de bereiding van APS (10%).) -

Bereiding van 1L concentratiebuffer. Los de volgende producten op in 1L gedestilleerd water: SDS: 4,0 g

Tris: 61,0 g

Breng deze oplossing op pH 6,8 met HCl (6M). -

Running buffer. Meng de volgende producten voor de bereiding van 1L running buffer (1x): Running buffer (10x): 100 ml

Gedestilleerd water: 900 ml

SDS: 1 g -

Bereiding van 5L running buffer (10x). Los volgende producten op in 5L gedestilleerd water: Glycine: 76 g

Tris: 15 g

SDS: 5 g -

Standaardeiwitoplossing met prestained moleculaire gewichtsmerkers: SDS-PAGE Molecular Weight Standards, High Range (Bio-Rad, Hercules, USA).

-

Verwarmtoestel: Thermomixer 5436 (Eppendorf, Hamburg, Duitsland).

-

Voedingsbron: MULTI-DRIVE XL / 2303 (Pharmacia LKB, Piscataway, USA).

METHODE Bereiden van de stalen -

Breng het volume eiwitoplossing dat overeenkomt met de hoeveelheid eiwit dat je wilt laden in een Eppendorf tube.

-

Voeg ‘sample’ buffer toe in verhouding 1/3 ten opzichte van de eiwitoplossing.

-

Verwarm gedurende 5 minuten bij 95°C in de thermomixer.

-

De stalen kunnen onmiddellijk gebruikt worden of bewaard worden bij -20°C.

Gieten van de gel -

Monteer de glasplaten in het dragersysteem.

-

Bereid de separating gel oplossing. Zodra APS en TEMED zijn toegevoegd, zal de polymerisatie starten. De oplossing dient dus zo snel mogelijk tussen de platen gegoten te worden.

-

Breng de separating gel oplossing aan tussen de gemonteerde glasplaten tot ongeveer 0,5 cm onder de kam. Per gel is er ongeveer 5 ml separating gel oplossing nodig. Vermijd de vorming van luchtbellen.

-

Breng gedestilleerd water aan boven de separating gel oplossing. Zuurstof inhibeert immers de polymerisatie.

-

     

Laat de gel gedurende 1 uur polymeriseren.

-

Bereid de stacking gel oplossing. Zodra APS en TEMED zijn toegevoegd, zal de polymerisatie starten. De oplossing dient dus zo snel mogelijk tussen de platen gegoten te worden.

-

Verwijder het gedestilleerd water aan de hand van een filtratiepapiertje eenmaal de separating gel gepolymeriseerd is.

-

Breng de stacking gel oplossing aan boven de separating gel. Plaats de kam in de geconcentreerde gel oplossing. Vermijd de vorming van luchtbellen.

-

Laat de geconcentreerde gel gedurende 1 uur polymeriseren.

-

Verwijder de glasplaatjes met de gepolymeriseerde gel ertussen uit het dragersysteem.

-

De gel kan onmiddellijk gebruikt worden of bewaard worden bij 4°C.

Laden en lopen van de gel -

Bereid running buffer (1x).

-

Monteer de glasplaten met de gel ertussen in een buffertank. Vul de buffertank met running buffer. Verwijder de kam. Zorg ervoor dat de slotjes gevuld zijn met running buffer.

-

Laad de stalen en de standaardeiwitoplossing met moleculaire gewichtsmerkers in de slotjes.

-

Breng het deksel aan op de buffertank en sluit deze aan op de voedingsbron en stel in op een spanning van 150 V en een stroom van 40mA per gel.

-

Laat de gel gedurende 1 uur lopen tot het blauwe front, afkomstig van het bromofenolblauw dat aan de stalen werd toegevoegd, zich op ongeveer 1 mm van de onderkant van de gel bevindt.

-

Schakel de voedingsbron uit.

-

Verwijder de glasplaten uit de buffertank en verwijder voorzichtig de bovenste plaat.

-

Snij de stacking gel van de separating gel af. Snij linksonder een hoekje af als merkteken.

-

Verwijder de gel van de onderste glasplaat en breng hem in de blotbuffer.

-

Was de glasplaten met detergent, spoel af met gedestilleerd water en ontvet met methanol.

8.8.4. Western Blot Bij “Western Blot” worden de eiwitten, die gescheiden zijn met behulp van SDS-PAGE, overgebracht vanuit de polyacrylamidegel naar een nitrocellulosemembraan, waarop dan later een immunokleuring kan gebeuren. Dit gebeurt onder invloed van een elektrisch veld. De eiwitten hebben immers een negatieve oppervlaktelading door het gebruik van SDS bij de gelelectroforese en zullen dus naar de positieve pool migreren. Het nitrocellulosemembraan wordt met behulp van een klemsysteem tussen de gel en de positieve pool geplaatst en door het feit dat eiwitten preferentieel binden met het nitrocellulose, zal het proteïnepatroon van de polyacrylamidegel op het membraan gekopieerd worden. De polyacrylamidegel en het nitrocellulosemembraan worden loodrecht op het elektrisch veld geplaatst, zodat een relatief grote weerstand ontstaat. Dit gaat gepaard met warmteontwikkeling en om oververhitting te voorkomen, dient het systeem met ijs gekoeld te worden. Bovendien is in de

     

blotbuffer ook methanol aanwezig, dat naast het zorgen voor een verbeterde proteïnetransfer door verdamping, warmte van het systeem zal onttrekken. Om te zien of de blot gelukt is en om het membraan volgens de juiste moleculaire gewichten te kunnen verknippen voor een latere immunokleuring, wordt na het blotten het membraan ondergedompeld in een “Ponceau S”-oplossing. “Ponceau S” is een natriumzout van een diazokleurstof dat snel en omkeerbaar met eiwitten bindt en deze rood kleurt. Op die manier worden alle proteïnen, die in voldoende grote hoeveelheid op het membraan aanwezig zijn, alsook de ladder, zichtbaar. Wassen met gedestilleerd water is voldoende om binding met de eiwitten te verbreken.

MATERIAAL -

Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell. (Bio-Rad, Hercules, USA)

-

Blotraam, spons, buffertank, deksel, dragersysteem, koelelement.

-

Blotbuffer 1x. Meng de volgende producten voor de bereiding van 1l blotbuffer (1x):

-

Blotbuffer (10x): 100 ml

Methanol: 200 ml

Gedestilleerd water: 700 ml

SDS: 50 mg.

Bereiding van 5 l blotbuffer (10x). Los de volgende producten op in 4 l gedestilleerd water: Glycine: 76gr

Tris: 15 gr.

Voeg 1 l MeOH toe en homogeniseer. -

Hybond ECL nitrocellulosemembraan.

-

Whatman 3 MM Chr papier.

-

Voedingsbron: E502.

-

Ponceau kleurstof: Ponceau S solution.

METHODE Western Blot -

Bereid blotbuffer (1x).

-

Verwijder de stacking gel.

-

Breng de gel in de blotbuffer gedurende 15 min, alsook het nitrocellulosemembraan waarnaar de eiwitten zullen getransfereerd worden. Dompel eveneens 6 vellen Whatman papier, gesneden op 10 x 8 cm en 2 sponsen onder in de blotbuffer.

-

Monteren: Leg het klemsysteem met de zwarte kant naar onder in een met blotbuffer gevuld recipiënt. Plaats hierop een spons, 3 Whatman papiertjes, de gel, het nitrocellulosemembraan, 3 Whatman papiertjes en een spons. Tussen de verschillende lagen mogen geen luchtbellen aanwezig zijn, daar dit het

     

blotten kan verstoren. Sluit het klemsysteem en monteer dit in de buffertank zodanig dat de zwarte kant van het klemsysteem gericht is naar de zwarte kant van de buffertank. -

Vul de buffertank met blotbuffer, breng een koelelement aan en een magnetische roerder.

-

Plaats het deksel op de buffertank en sluit de tank aan op een voedingsbron.

-

Laat gedurende minstens 1 uur blotten bij 100 V en 260 mA.

-

Demonteer de opstelling en voer een Ponceau kleuring uit.

Ponceau S kleuring. -

Breng het blotmembraan met een pincet in een recipiënt gevuld met Ponceau kleurstof.

-

Incubeer het membraan in de Ponceau kleurstof gedurende enkele min op een schudtoestel.

-

Recupereer de Ponceau kleurstof.

-

Was het membraan 3 maal met gedestilleerd water.

-

Laat het membraan drogen tussen twee vellen Whatman papier.

8.8.5. Immunokleuring` Immunokleuring op het nitrocellulosemembraan heeft een lagere detectielimiet in vergelijking met kleuringen die rechtstreeks op de polyacrylamidegel gebeuren. De reden hiervoor is dat het antigen op het membraan makkelijker beschikbaar is voor het primaire antilichaam. De hier gebruikte kleuring is indirect, wat wil zeggen dat gebruik gemaakt wordt van een antigenherkennend primair antilichaam en een secundair kleurend antilichaam dat het primair antilichaam als antigen herkent. De kleuring komt tot stand via het secundaire antilichaam dat gekoppeld is met “Horse Radish Peroxidase” (HRP). Dit enzym in combinatie met de “Enhanced Chemo Luminuscence kit” (ECL), produceert een substraat dat licht geeft en gedetecteerd kan worden met een lichtgevoelige film. Het nitrocellulosemembraan bindt aspecifiek proteïnen. Om te verhinderen dat dit ook met het primair antilichaam gebeurt, dienen de niet eiwitgebonden secties van het membraan eerst geblokkeerd te worden. Dit kan met een oplossing van melkpoeder, indien het primair antilichaam geen gefosforyleerde eiwitten herkent. Is dit wel het geval, dan wordt geblokkeerd met een “Bovine Serum Albumine”-oplossing (BSA). Het primair antilichaam, dat wordt toegevoegd na het blokkeren, dient gerecupereerd te worden. Vervolgens wordt het membraan 3x gewassen met een oplossing van melkpoeder en wordt het secundair antilichaam voor ongeveer een uur aangebracht. Het secundair antilichaam wordt niet gerecupereerd. Na afloop wordt het membraan opnieuw 3x gewassen en kan de ECL-oplossing worden toegediend. De twee hoofdcomponenten van de ECL-kit zijn H2O2 en Luminol. Het HRP op het secundair antilichaam reduceert H2O2 tot H2O en dit gaat gepaard met een oxidatie van het Luminol, dat zich op die manier in een geëxciteerde toestand bevindt. Deze extra energie komt vrij onder de vorm van licht (430 nm). Naast Luminol en H2O zijn ook andere componenten, waaronder fenolen, aan de ECLoplossingen toegevoegd, die voor een hogere efficiëntie van de reactie zorgen.

     

MATERIAAL -

Blokkeerbuffer: melkoplossing: Maak een oplossing bestaande uit 5% (w/v) mager melkpoeder en 0,5% (w/v) Tween-20 opgelost in PBSD- (zie 2.1.5.1.).

-

Wasoplossing: Maak een oplossing van 0,5% (w/v) Tween-20 in PBSD-.

-

Schudtoestel: Wave Polymax 2040. (Heidolph Instruments, Schwabach, Duitsland)

-

Primair antilichaam. (zie Tabel 4)

-

Secundair antilichaam. (zie Tabel 5)

-

Detectieoplossing: commerciële kit: ECL Western Blotting Detection Reagents. (Amersham Biosciences, Uppsala, Zweden)

-

Detectiereagens 1 en detectiereagens 2.

-

Transparant: 3M Transparency Film for Copies.

-

Cassette.

-

Autoradiografische film: Hyperfilm ECL.

-

Ontwikkelingsmachine. (Kodak)

-

Wasoplossing: Maak een oplossing van 0,5% (w/v) Tween-20 in 500 ml PBSD-.

-

Warmwaterbad.

METHODE Kleuring -

Snij het blotmembraan in strips van de gewenste breedte en breng een merkteken aan om de oriëntatie niet te verliezen tijdens de volgende stappen.

-

Incubeer de strips in blokkeerbuffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een schudtoestel.

-

Verwijder de blokkeerbuffer.

-

Voeg het primair antilichaam, verdund in blokkeerbuffer, toe aan de strips en incubeer gedurende 60 à 90 minuten bij kamertemperatuur op een schudtoestel.

     

-

Verwijder het primair antilichaam.

-

Was de strips 3x met wasbuffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een schudtoestel.

-

Voeg het HRP gemerkt secundair antilichaam, verdund in blokkeerbuffer, toe aan de strips en incubeer gedurende 60 à 90 minuten bij kamertemperatuur op een schudtoestel.

     

-

Verwijder het secundair antilichaam.

-

Was de strips 3x met wasbuffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een schudtoestel.

ECL reactie -

Breng een transparant aan in een cassette.

-

Bereid de detectieoplossing: Voeg een hoeveelheid van detectiereagens 1 toe aan eenzelfde hoeveelheid van detectiereagens 2.

-

Voorzie 100 µl detectieoplossing per strip.

-

Leg de strips op een transparant.

-

Breng de detectieoplossing aan op de strips.

-

Dek de strips af met een tweede transparant. Vermijd hierbij de vorming van luchtbellen en zorg ervoor dat er geen vloeistof in contact kan komen met de film.

-

Leg een autoradiografische film op de strips gedurende de noodzakelijke tijd. Verhinder dat de film in contact komt met licht.

-

Ontwikkel de film in een ontwikkelingsmachine.

8.9.

Type I collageen invasie test

Het kenmerk voor kwaadaardige tumoren is invasie en metastasering. Bij het verlaten van de weefselgrenzen dienen de tumorcellen de barrière van de extracellulaire matrix te overbruggen. Invasie kan in vitro bestudeerd worden door gesuspendeerde cellen in te bedden in een matrix van collageen type I, een belangrijke component van de ECM. Bij 4°C is de collageenmatrix vloeibaar, zodat we deze homogeen in een well kunnen leggen. Dit laat men stollen bij 37°C en vervolgens worden de gesuspendeerde cellen uitgeplaat op deze collageengel in hun medium, dat aangerijkt is met verschillende componenten (chemotherapeutica, groeifactoren en/of EGFR inhibitoren) waarvan het effect op de cellen bestudeerd wordt (Figuur 12).

FIGUUR 12. Single cell invasie test. Overgenomen van De Wever et al. (2010).

     

MATERIAAL -

Gyrotoryshaker.

-

Erlenmeyers (100ml).

-

Groeimedium: DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) 4,5 g/ml glucose aangevuld met o

10% foetaal kalfserum.

o

2 mM L-glutamine.

o

100 IU/ml penicilline.

o

100 µg/ml streptomycine.

-

6-well platen.

-

incubator

-

Collageen type I (1 mg/ml) oplossing. Bereiding voor 1 gel (1250µl): Collageen type I: 360 µl

CMF-HBBS: 445 µl

MEM (10x): 90 µl

0.25 M NaHCO3: 90 µl

1 M NaOH: 25 µl

Groeimedium: 250 µl

METHODE -

Maak een collageenoplossing van 1 mg/ml aan voor het aantal benodigde wells van de 6-well plaat en bewaar op ijs of bij 4°C om stolling te verhinderen.

-

Voeg per well van de 6-well plaat 1,25 ml collageenoplossing toe. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan in de collageen I oplossing.

-

Plaats de 6-well plaat voor 1u bij 37°C zodat de collageenoplossing kan stollen.

-

Incubeer 100 000 HCT8/E11 cellen in 1 ml DMEM cultuurmedium, al dan niet aangerijkt met groeifactoren en/of EGFR inhibitoren, bovenop de gestolde collageenoplossing.

-

Incubeer voor 24 uur bij 37°C in een waterdamverzadigde 10% CO2 incubator.

-

Fasecontrast visualisatie.

8.10.

MTT-assay

De MTT-toxiciteitstest is een gevoelige en betrouwbare assay, die de metabole activiteit van cellen meet. De test is gebaseerd op de capaciteit van het mitochondriaal dehydrogenase in levende cellen, dat het geelgekleurde, wateroplosbare substraat 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromide (MTT) omzet tot paarse formazankristallen die vervolgens neerslaan. Permeabilisering van het celmembraan met dimethylsulfoxide (DMSO) laat toe de kristallen op te lossen, waardoor de op de cellen aanwezige MTT-oplossing paars wordt. De intensiteit van de ontstane kleur staat in lineair

     

verband met de metabole activiteit van de TAMC11en wordt gemeten met de Paradigm multiwell spectrofotometer bij 570 nm.

MATERIAAL -

96-well platen.

-

Groeimedium: DMEM aangevuld met o

10% foetaal kalfserum (FCS).

o

2 mM L-glutamine.

o

100 IU/ml penicilline.

o

100 µg/ml streptomycine.

-

MTT-substraat 5 µg/ml.

-

DMSO.

-

Multiwell scanning spectrophotometer (Paradigm).

METHODE -

Bereid een celsuspensie en breng de HCT8/E11 colonkankercellenover in serumhoudend groeimedium. (zie supra)

-

Zaai ongeveer 2500 cellen/100 µl/well uit in een 96-well plaat. Van iedere conditie worden vijf herhalingen in de test meegenomen.

-

Incubeer de 96-well plaat 24 uur bij 37°C in een waterdampverzadigde 10% CO2 incubator.

-

Aspireer het medium en voeg 200 µl nieuw medium (controle met 100% serumvrije DMEM of 50% serumvrije DMEM met 50% CM) toe, al dan niet aangerijkt met groeifactoren en/of HER inhibitoren.

-

Incubeer de 96-well plaat 96u bij 37°C in een waterdampverzadigde 10% CO2 incubator.

-

Voeg aan iedere well 40 µl MTT-substraat toe. Incubeer de 96-well plaat, gewikkeld in aluminiumfolie, gedurende 2 uur bij 37°C in een waterdampverzadigde 10% CO2 incubator.

-

Aspireer de vloeistof en voeg 200 µl DMSO toe aan iedere well. Suspendeer totdat de neergeslagen kristallen in oplossing gaan.

-

Meet de absorbantie bij 570 nm met de multiwell scanning spectrofotometer en verwerk de gegevens statistisch met Excel.

     

8.11.

Proliferatietest

Aan de hand van een proliferatietest gaan we de invloed na van bepaalde factoren op de delingssnelheid van een celcultuur. We gaan de cellen tellen na 3, 6 en 9 dagen en kijken zo naar evolutie in de proliferatie. MATERIAAL -

Groeimedium: DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) aangevuld met o

10% foetaal kalfserum.

o

2 mM L-glutamine.

o

100 IU/ml penicilline.

o

100 µg/ml streptomycine.

-

6-well platen.

-

Invitrogen, Countess automated cell counter (Eugene, Oregon, USA)

-

Countess cell counting chamber slides (Eugene, Oregon, USA)

-

Moscona

-

Trypsine/EDTA

METHODE -

Bereid een celsuspensie en breng de HCT8/E11 colonkankercellenover in serumhoudend groeimedium. (zie supra)

-

Zaai ongeveer 10 000 cellen/2ml/well uit in een 6-well plaat.

-

Incubeer de 96-well plaat 24 uur bij 37°C in een waterdampverzadigde 10% CO2 incubator.

-

Aspireer het medium en voeg 2 ml nieuw medium toe: controle met 100% serumvrije DMEM, behandelde groep met 80% serumvrije DMEM en 20% CM), al dan niet aangerijkt met groeifactoren of HER inhibitoren.

-

Incubeer de 6-well plaat bij 37°C in een waterdampverzadigde 10% CO2 incubator.

-

Per cultuur hebben we drie wells nodig om te gaan tellen op dag 3, 6 en 9.

-

Na dag 3, 6 en 9 cellen losweken met Moscona en Trypsine/EDTA.

-

Maak een mengeling met 10 µl celsuspensie en 10 µl trypaanblauw en leg op invitrogen cell counting chamber slide.

     

-

Voer de cell counting chamber slide in in de Countess automated cell counter.

-

Verwerk gegevens met Exel.

8.12.

Receptoor Tyrosin ne Kinasee Array

De Recepptor Tyrosinee Kinase arraay is een maanier waarop p de fosforyllatie van 42 verschillend de RTK simultaan in duplicaatt kunnen gettest worden.. In een bepaald celtype zullen er beepaalde RTK K actief zijn en duus gefosforyleeerd zijn. Oook wanneer van v deze celllen een cellyysaat gemaakkt wordt zullen deze receptorenn gefosforylleerd blijvenn. Wanneerr met het cellysaat c enn het array--cellulosemeembraan samenbrenngt zullen allle aanwezigge RTK wordden gecapteeerd door antiilichamen diie gebonden zijn op de celluloosemembraann. Daarna kuunnen de geffosforyleerdee RTK aangetoond worrden met een n N-(4hydroxyphhenyl)retinam mide

(HP PR)-geconjuugeerd

paan

fosfo--tyrosine

antilichaam m

en

chemilum minescentie.(F Figuur 13) 

FIGUU UR 13. Princcipe van RTK K Array. (RTK TK Array Prin nciple/Protocol – R&D SSystems) MATERIA AAL -

Humann Phospho-R Receptor Tyroosine Kinasee Array nitroccellulose meembraan (R& &D systems).

-

Anti-phhospho-tyrossine-HPR detectie d anntilichaam (700µg/ml). ( Verdun

m met

(conceentratie 2) tott werkconcenntratie van 700 ng/ml. -

Array buffer b (concentratie 1), zoals z verpaktt.

-

Array buffer b (concentratie 2), verdun v 2 ml van v concentrratie 1 in 8 ml m aqua dest.

-

Wash buffer, b verduun 20 ml mett 480 ml aquua dest.

-

4-well Multi-dish.

-

Shake--plaat.

METHOD DE

     

-

Breng de reagentiaa op kamertem mperatuur enn bereid de reeagentia.

-

1 ml Arrayy buffer (coneeentratie 1) toe t aan elke well w van de 4-well 4 Multi-dish. Voeg 1,5

array buffer

-

Vewijder het beschermingslaagje van de array en plaats die in elke well met de nummering naar boven.

-

Incubeer 1u op de shake-plaat.

-

Verdun het cellysaat tot 1,5 ml met array buffer (concentratie 1).

-

Aspireer de array buffer (concentratie 1) van de 4-well Multi-dish en voeg het verdunde lysaat toe.

-

Incubeer overnacht op 2-8° C.

-

Haal voorzichtig de arrays uit de well en plaats hen in een individuele container met 20 ml wash buffer. Kuis de 4-well Multi-disk met aqua dest en droog grondig.

-

Was de arrays 3 keer 10 min met wash buffer op de shake-plaat.

-

Voeg 1,5 ml verdund detectie antilichaam toe aan elke well van de 4-well Multi-dish.

-

Haal elke array voorzichtig uit zijn was-container en leg ze in de 4-well Multi-dish.

-

Incubeer 2u op kamertemperatuur op de shake-plaat

-

Was elke array opnieuw in de was-container zoals hierboven beschreven.

-

Haal de arrays uit de container en plaats ze op een plastiek en stel ze bloot aan een chemiluminescent reagens.

-

Bedek met plastiek en stel de array bloot aan een X-straal gevoelige film gedurende 1 – 10 minuten.

8.13.

Statistiek

Al de bekomen gegevens werden verwerkt met Exel en SPSS. Statistische testen, zoals T-testen, werden gedaan met SPSS. Grafieken werden gemaakt met Exel.

     

9. RESULTATEN    9.1.Morfologie van de geïsoleerde mesenchymale cellen Morfologische waren de cellen langgerekt en spoelvormig en konden aanhechten op plastiek. Omdat de geïsoleerde cellen van het tumorstroma een mix zijn van MSC, CAF en mogelijks nog andere cellen noemen we ze samen tumor geassocieerde mesenchymale cellen (TAMC). Onder fenotypisch normale omstandigheden gaan we deze cellen normaal geassocieerde mesenchymale cellen noemen (NAMC). De naam van de primaire culturen waarmee wij gewerkt hebben is NAMC1 (niet afgebeeld), NAMC2, TAMC1, TAMC2 (niet afgebeeld) en TAMC3 (niet afgebeeld). (Figuur 14)

NAMC2 (1:3,0x10-2)TAMC1 (1:3,0x10-2) FIGUUR 14. De TAMC-primaire cultuur en NAMC-primaire cultuur.

9.2.Multipotente eigenschappen van de geïsoleerde mesenchymale cellen Na de morfologische karakterisatie met microscopie zijn we de multipotente eigenschappen van de TAMC en NAMC nagegaan. Dit zou dan een maat zijn voor de aanwezigheid van MSC omdat zij multipotente cellen zijn die kunnen differentiëren naar onder andere adipocyten en osteocyten. 9.2.1.

Adipogene differentiatie Een adipogene differentiatie bleek niet meer volledig mogelijk met NAMC1, NAMC2, TAMC1, TAMC2 en TAMC3. Dit is te verklaren omdat de MSC die gerecruteerd worden naar de tumorsite mogelijks al gedifferentieerd zijn naar CAF en/of andere cellen. De cellen werden 2 weken behandeld met adipogeen differentiatie-medium. In NAMC1 en NAMC2 bleek

     

eveeneens geenn adipogenee differentiattie mogelijk k. BM-MSC Cwerden gebbruikt als po ositieve conntrole.Om addipocyten aaan te kleuren hebben we de d Oil Red O kleuring geebruikt. Enkeel in de BM M-MSC groeep was de kleeuring positiief. In figuurr 15 worden BM-MSC, B T TAMC1 en NAMC2 N weeergeven. Dee resultaten voor v TAMC22, TAMC3, en e NAMC1 waren w vergellijkbaar.(Figu uur 15)

BM‐M MSC adipo 1 13d (1:7,5x10‐3) 

      BM‐MSC adipo 13d,, Oil Red (1:7,5x10‐3) 

         

   TAMC C1 adipo 13 3d (1:1,5x1 10‐2) 

      TAMC1 aadipo 13d, O Oil Red (1:1 1,5x10‐2) 

          NAMC C2 adipo 18 8d (1:1,5x1 10‐2)   FIGUU UR 15. Adipoogene differeentiatie.

     

      NAMC2 aadipo 18d, O Oil Red (1:1,5x10‐2) 

     

9.2.2.

Osteogene differentiatie De osteogene differentiatie gedurende 8 dagen was succesvol in alle TAMC- en NAMCprimaire celculturen. De cellen begonnen zich te concentreren en zich als osteocyten te ordenen zoals we dit ook zagen bij de positieve controle met BM-MSC.Met de Alizarinekleuringen kunnen we de aanwezigheid van calcium in de cellen aantonen. In figuur 16 is BMMSC, TAMC1 en NAMC1 weergegeven, de resultaten voor TAMC2, TAMC3 en NAMC3 waren vergelijkbaar. De Alizarine-kleuringen waren voor al deze culturen positief (Figuur 16)

     BM‐MSC osteo 8d (1:3,0x10‐2)             BM‐MSC osteo 8d, Alizarine (1:6,0x10‐2)     

       TAMC1 osteo 8d (1:3,0x10‐2) 

          TAMC1 osteo 8d, Alizarine (1:6,0x10‐2) 

         

     NAMC1 osteo 8d (1:3,0x10‐2)   FIGUUR 16. Osteogene differentiatie.

     

          NAMC1 osteo 8d, Alizarine (1:6,0x10‐2) 

 

9.3.α-SMA aanwezigheid in de geïsoleerde mesenchymale cellen α-SMA is een myobibroblasten/CAF merker. Om de aanwezigheid van myofibroblasten (in NAMC) of CAF (in TAMC) na te gaan hebben we α-SMA gebruikt. Aanwezigheid van α-SMA zijn we nagegaan met Western Blot. We hebben TAMC1-celcultuur en TAMC2-celcultuur getest alsook de NAMC1-celcultuur. Tubuline is een huishoudproteïne dat aangeeft dat er in elke laan evenveel proteïne geladen is. We zien een aankleuring van α-SMA wat de aanwezigheid van myofibroblasten/CAF in NAMC/TAMC bevestigd. We zien ook dat α-SMA meer aankleurt bij de TAMC1 en TAMC2 dan bij NAMC1.Dit kan wijzen op de hogere aanwezigheid van CAF in tumorweefsel omdat deze gerekruteerd worden door de tumor. (Figuur 17)

NAMC1   TAMC1  TAMC2

Tubuline α‐SMA

FIGUUR 17. Western Blot toont aanwezigheid van α-SMA in NAMC1, TAMC1 en TAMC2.

     

9.4.Functionele effecten van het geconditioneerde medium van TAMC1: Proliferatie Met het CM van TAMC1 zijn we het effect op de proliferatie nagegaan. We hebben dit gedaan aan de had van een proliferatietest met HCT8/E11 colonkankercellen. Vanaf dag 6 konden we een significante

groeitoename

aantonen

tussen

de controle

groep

en

de

groep

HCT8/E11

colonkankercellen die behandeld was met het CM van TAMC1 (P<0.05, P=0.029). Een duidelijk effect was zichtbaar, na 6 dagen was het aantalcellen in de groep behandeld met CM van TAMC1 2.34 maal hoger dan in controleomstandigheden.(Grafiek 1)

600000

Aantal cellen

500000 400000 controle

300000

TAMC1

200000 100000 0 D0

D3

D6

Dagen

GRAFIEK 1. Proliferatie test met CM van TAMC1 op HCT8/E11 colonkankercellen.

     

9.5.Functionele effecten van het geconditioneerde medium van TAMC1: Metabole activiteit Metabole activiteit werd gemeten aan de hand van een MTT-test met HCT8/E11 colonkankercellen. De absorbantie die gemeten wordt met Paradigm multiwell spectrofotometer bij 570 nmis een lineaire maat voor de metabole activiteit van de HCT8/E11 colonkankercellen. De MTT toonde een 98.0% hogere waarde voor de cellen behandeld met CM van TAMC1 (P<0.05, P=0.004). (Grafiek 2)

Absorbantie op 570nm tov controle (%)

250

200

150

100

50

0 Controle

GRAFIEK 2. MTT met CM van TAMC1 op HCT8/E11 colonkankercellen

     

TAMC1

9.6.Functionele effecten van het geconditioneerde medium van TAMC1: Invasie Voor de invasie te testen hebben we het collageen invasie test-model gebruikt met de HCT8/E11 colonkankercellen. Na 24h incubatie hebben we geteld hoeveel cellen invasief werden.Onder controle opstandigheden waren 0.7% van de HCT8/E11 kankercellen invasief terwijl het CM van TAMC1 16.0% van de HCT8/E11 kankercellen invasief maakte (P<0.05, P=0.0001). De positieve controle werd gedaan met TGF-α, dit maakte 17.9% van de HCT8/E11 kankercellen invasief. (Figuur 18)

            Negatieve controle 

 

            TAMC1   

 

 

Positieve controle 

FIGUUR 18. Single Cell invasie-test met CM van TAMC1 op HCT8/E11 colonkankercellen.

Op deze foto’s zien we duidelijk dat het CM van TAMC1 een invloed heeft op het invasieve gedrag van de HCT8/E11 colonkankercellen. In de negatieve controle zijn de cellen rond en zien we geen uitlopers. In de behandelde cultuur zien we dat de cellen een meer onregelmatige vorm aannemen en uitlopers vertonen die de collageen gaan invaderen.

9.7. Receptor Tyrosine Kinase Array Na deze bevindingen dat onze TAMC de groei, metabolische activiteit en invasie dermate beïnvloeden moest gezocht worden naar het betrokken mechanisme. We hadden reeds bewezen dat onze TAMC uit een aanzienlijk deel CAF bestond. En in het GM van de TAMC zitten gesecreteerde factoren die groei, metabolische activiteit en invasie bevorderen. Omdat Tyrosine Kinase Receptoren een belangrijke rol spelen in de signalisatie van extracellulaire signalen die de celgroei en overleving controleren waren zij zeker een kandidaat. Ook vanwege de rol die zijn spelen in tumorprogressie door MSC, bewezen

     

door De Boeck B en collega’s. Een manier om hierop antw woord te krijggen was dooor het uitvoerren van een Recepptor Tyrosine Kinase (R RTK) array. Deze D array detecteert d dee activatie vaan 42 versch hillende Tyrosine Kinase K Recepptoren. (Figuuur 19)

FIGUU UR 19. RTK arrray.

Op de 1e array zien we w onder conntroleomstanndigheden eeen continue activatie vann HER 1 en HER2. k De 2e array toont dat d CM van MSC in staaat zijn om HE ER3 te activeeren. Een bevinding (blauwe kader) uit onderzzoek van De Boeck en collega’s. c Opp de 3e array y zien we daan welke receptoren geacctiveerd worden dooor factoren gesecreteerdd door CAF,, waarvan we w vermoeddeen dat het eeen hoofdcom mponent was van onze o TAMC C. De Weverr en collega’s hebben reeeds Tenasciine C/HGF aantoond alss factor gesecreteeerd door CA AF die de HG GF Receptor zal activereen en zo de kanker k invassief zal makeen. Wat voor ons onderzoek o belangrijk waas is de activvering van dee HER3 door CM van C CAF. Activerring van de HER3 receptor opp de HCT8//E11 colonkkankercellen zou de funnctionele efffecten van ons o CM R3 nog maarr enkele ligannden bekend d die de kunnen veerklaren. Tott de dag vann vandaag zijjn voor HER receptor kunnen k activeeren, namelijjk NRG1 en NRG2, waarrvan NRG1 HER3 H het beest gaat activ veren.

     

9.8.Neureguline-1 Nu zijn we nagegaan als onze TAMC NRG1 tot expressie brengen. We zoeken naar een transmembranair deel van het NRG omdat dit eenvoudig op te sporen is in een cellysaat aan de hand van Western Blot.We hebben in het cellysaat een hoge aankleuring van tNRG1 gezien. Verder onderzoek is nodig om te bevestigen dat deze TAMC effectief ook NRG1 gaan secreteren maar onze vermoedens zijn van wel.Tubuline is weer het huishoudproteïne om te controleren dat de eiwitconcentraties in elke laan even hoog zijn. (Figuur 20)

FIGUUR 20. Western Blot met cellysaat van TAMC uit de 3 verschillende colonkanker cellijnen (1, 2 en 3). N=NAMC. T=TAMC.

     

9.9.Effect van rNRG1 op HCT8/E11 colonkankercellen

We zijn het effect van recombinant neureguline-1 (rNRG1) onrechtstreeks nagegaan door HCT8/E11 colonkankercellen deels te behandelen met CM van TAMC11 en deels met oplopende concentratie van recombinant NRG1. We zagen dat rNRG1 de metabole activiteit van de HCT8 cellen flink deed toenemen op MTT ten opzichte van de controle groep. In oplopende concentraties rNRG1 van 0,1 ng/ml, 1 ng/ml en 10 ng/ml zagen we respectievelijk een groei van 5.5% (P=0.567), 7.0% (P=0.502) en 12.9% (P=0.108). Bij 100ng/ml zagen we een afname van de metabole activiteit met 1.98% waarschijnlijk door een te hoge activiteit. (Grafiek 3)

Absorbantie op 570nm tov controle (%)

140

120

100

80

60

40

20

0 Controle

rNRG1 0,1 ng/ml rNRG1 1,0 ng/ml rNRG1 10 ng/ml rNRG1 100 ng/ml

GRAFIEK 3. MTT met effect van recombinant neureguline-1 (rNRG1) in verschillende concentraties op HCT8/E11 colonkankercellen.

     

5.10. Effect van HER-inhibitoren op functionele effecten van CM van TAMC1 We zijn de effecten nagegaan van HER1-inhibitoren cetuximab en panitunumab, HER2-inhibitoren herceptine en ook de HER2/HER3-dimerisatie-inhibitor pertuzumab. We zijn nagegaan of deze inhibitoren de functionele effecten van het CM van TAMC1 kondenteniet doen. Dit opnieuw via MTT, invasietest en proliferatietest. (Grafiek 4) A. MTT

Absorbantie op 570nm tov controle (%)

160 140 120 100 80 60 40 20

co nt ro le +h er ce p TA M C 1+ he rc ep t co nt ro le +c et ux TA M C 1+ ce tu xi

1+ pe rt M C TA

TA

M C

1 co nt ro le +p er t

CO

NT RO LE

0

GRAFIEK 4. MTT met effect van HER-inhibitoren op CM van TAMC1 bij HCT8/E11 colonkankercellen.

Op deze MTT zien we in de eerste twee lanen de metabole activiteit van HCT8/E11 colonkankercellen onder controle omstandigheden en behandeld met CM van TAMC1. We hebben pertuzumab, herceptine en cetuximab getest. Het eerste wat opvalt is dat de controle omstandigheden plus herceptine en cetuximab lager zijn dan de controle omstandigheden. Controle + herceptine is 24.9% lager dan de controle groep (P<0.05, P=0.042). Controle + cetuximab is 45.9% lager dan de controle groep (P<0.05, P=0.005).De HER3-inhibitor, pertuzumab kon de metabole activiteit in controle groep niet significant doen dalen (P=0.156). Het tweede wat opvalt is dat na toevoeging van het CM van TAMC1 aan de groepen met inhibitie door herceptine en cetuximab deze inhibitie teniet gedaan wordt. In de ‘herceptine + TAMC1’ groep gaat de metabole activiteit 38.9% hoger zijn dan in de ‘controle + herceptine’ groep (P<0.05, P=0.014). Bij de cetuximab groepen gaat de metabole activiteit na toevoeging van het CM van TAMC1 zelfs 52.9% hoger worden dan de controle + cetuximab groep

     

(P<0.05, P=0.001). Toevoeging van het CM van TAMC1 aan de pertuzumab groep kon de metabole activiteit niet significant doen stijgen tegenover de controle + pertuzumab groep (4.54%, P=0.156).

B. Invasietest We hebben ook de invasietest opnieuw gedaan. Hier zien we dat pertuzumab de cellen minder invasief maakt terwijl cetuximab, een HER1-inhibitor, daar niet in slaagt.Onder controle opstandigheden waren 0.7% van de HCT8/E11 kankercellen invasief terwijl het CM van TAMC1 16.0% van de HCT8/E11 kankercellen invasief maakte (P<0.05, P=0.0001). TGF-α maakte 17.9% van de HCT8/E11 kankercellen invasief. Herceptine en cetuximab kon een klein deel van het aantal invasieve cellen reduceren, respectievelijk naar 8.3% en 11.1% maar enkel pertuzumab maakte de, met CM van TAMC1, behandelde HCT8/E11 colonkankercellen minder invasief (4.3% invasieve cellen, P<0.05, P=0.015). (Figuur 21)             Negatieve controle 

TAMC1 + heceptine

     

 

            TAMC1   

 

TAMC1 + cetuximab

 

TGF-α

TAMC1 + pertuzumab

FIGUUR 21. Single Cell invasie test met CM van TAMC1

op HCT8/E11 colonkankercellen. Het effect van

herceptine, cetuximab en pertuzumab op het CM van TAMC1 werden getest.

C. Proliferatietest Ook aan de hand van een proliferatietest hebben we pertuzumab (HER2/HER3)en panitumumab (HER1) getest. Ook deze lag in de lijn van de verwachtingen. Pertuzumab deed het effect van het CM van TAMC voor een deel teniet. Panitumumab deed onder controleomstandigheden de proliferatie significant dalen ten opzichte van de controle groep met 53.1% (P<0.05, P=0.001). In de groep van panitumumab met CM van TAMC1 zagen we wel een 3.06 grotere toename van de proliferatie. Om dat de groep ‘Controle’ en ‘Controle + pertuzumab’ tot op dag 6 correleren met elkaar (P<0.05, P=0.001) kunnen we goed het effect van pertuzumab bestuderen op de colonkankercellen. Pertuzumab doet significant de effecten van het CM van TAMC1 teniet (P<0.05, P=0.008). De groei van de colonkankercellen onder invloed van CM van TAMC1 bedraagt 234% terwijl deze voor de groep met pertuzumab maar 163% is onder invloed van CM van TAMC1. Deze signifant mindere toename in groei is te wijten door de inhibitie van HER3. (Grafiek 5)

Controle

Aantal cellen

Controle + pertuzumab Controle + panitumumab TAMC1 TAMC1 + pertuzumab TAMC1 + panitumumab

Dagen

GRAFIEK 5. Proliferatietest met HCT8/E11 colonkankercellen. De cellen werden behandeld met CM van TAMC met of zonder pertuzumab of panitumumab. Er werd ook een controle genomen met of zonder pertuzumab of panitumumab.

     

10. DISCUSSIE 

Tumorinvasie en metastasering worden gedirigeerd door een wederzijdse kruissignalisatie tussen kankercellen en stromale cellen. Tumor geassocieerde stromale cellen (TAMC) omvatten onder meer mesenchymale stamcellen (MSC) en carcinoma geassocieerde fibroblasten (CAF). Het is reeds aangetoond dat MSC vanuit het beenmerg (BM) naar de tumorsite worden gerekruteerd onder invloed van factoren die door de kankercel gesecreteerd worden(22).Ter plaatse kunnen MSC differentiëren naar CAF (34), welke op hun beurt tumorprogressei en invasie gaan bevorderen(27, 32, 33). Het doel van deze thesis was na te gaan wat de rol is van TAMC bij de progressie van colonkanker. Vooreerst werden TAMC geïsoleerd uit primaire colon tumoren van drie patiënten, alsook normaal geassocieerde mesenchymale cellen (NAMC) uit fenotypisch normaal weefsel op een afstand van de primaire tumor. Vervolgens werd nagegaan wat de fractie MSC en CAF in de primaire culturen was, aan de hand multipotent differentiatievermogen en α-SMA expressie. BM-MSCwerden meegenomen als positieve controle voor de multipotente differentiatietesten. TAMC en NAMC bleken niet in staat te zijn een adipogene differentiatie te ondergaan. Dit kan erop wijzen dat de TAMC grotendeels afkomstig zijn van MSC, welke hun adipogene differentiatiecapaciteit verloren hebben, maar nog steeds in staat zijn om een osteogene differentiatie te ondergaan. Om na te gaan of de TAMC CAFeigenschappen vertoonden werd de expressie van α-SMA nagegaan. De TAMC vertoonden een grotere α-SMA expressie in tegenstelling tot NAMC uit dezelfde patiënt, wat erop wijst dat er mogelijks een CAF differentiatie is opgetreden van MSC of residentiële fibroblasten in de tumor aanwezig zijn. Om na te gaan wat de functionele effecten waren van TAMC op colonkankercellen in vitro werden invasietesten, proliferatietesten en testen om de metabolische activiteit na te gaan uitgevoerd. De resultaten toonden aan dat geconditioneerd medium (CM) van TAMC zowel invasie, proliferatie als metabolische activiteit van colonkankercellen in vitro stimuleerde. Verscheidene andere studies tonen eveneens aan dat geïsoleerde mesenchymale stromale cellen uit bijvoorbeeld borstkanker en colonkanker de migratie, proliferatie en invasie gaan stimuleren door secretie van oplosbare factoren. (36, 39) Om na te gaan welke factoren mogelijks betrokken zijn bij onze geobserveerde functionele effecten werd een receptor tyrosine kinase array uitgevoerd om de activatiestatus van 42 verschillende RTK in colonkankercellen onder invloed van CM van TAMC na te gaan. Ongepubliceerde data van De Boeck et al. (2011) tonen immers aan dat BM-MSC gemedieerde activatie van HER3 betrokken is bij invasie, survival en tumorigeniciteit van colonkankercellen. De resultaten van onze RTK array tonen aan dat

     

HER3 en c-MET, de hepatocyte growth factor (HGF) receptor, geactiveerd werden in colonkankercellen na behandeling met CM van TAMC. De Wever et al. toonde reeds het belang aan van HGF en bijhorende c-MET receptor in tumorprogressie van colonkanker. In het onderzoek werden twee pro-invasieve agentia geïdentificieerd die gesecreteerd werden door CAF: scatter factor/hepatocyt groeifactor (SF/HGF) en de TGF-β-geüpreguleerde extracellullaire matrix glycoproteïne tenascin-C (TNC). Beide factoren gingen ervoor zorgen dat kankercellen gingen invaderen in collageen type I en Matrigel. NRG1 en NRG2 zijn de enige gekende liganden van HER3. Om na te gaan of NRG1 mogelijks betrokken is bij deze paracriene HER3 activatie werd de expressie van transmembranair NRG1 (tNRG1) in TAMC nagegaan via Western Blot. TAMC bracht tNRG1 tot expressie in grotere mate dan NAMC, suggurerende dat oplosbaar NRG1 afkomstig van TAMC verantwoordelijk is voor activatie van HER3 in colonkankercellen. Verder onderzoek zou moeten aanwijzen of NRG1 eveneens gesecreteerd wordt door TAMC. Om verder te onderzoeken of de paracriene NRG1/HER3 activatie betrokken is bij onze geobserveerde functionele effecten werd gebruik gemaakt van recombinant NRG1 (rNRG1) en klinische HER-inhibitoren en -antilichamen. Op MTT zagen we in oplopende concentraties van 0.1 ng/ml tot 10 ng/ml rNRG1 een verhoogde metabolisch activiteit van 5.5% tot 12.9% ten opzichte van de controle groep. Pertuzumab, een HER2/HER3-dimerisatie-inhibitor, kon op MTT de effecten van het CM van TAMC op colonkankercellen terugbrengen naar controle-omstandigheden. De effecten van het CM van TAMC konden daarentegen niet door herceptine of cetuximab teruggebracht worden naar controle-omstandigheden. De metabolische activiteit van de colonkankercellen bleef respectievelijk 38.9% en 52.9% hoger dan de controle-omstandigheden.Wel zagen we dat herceptine en cetuximab de metabole activiteit onder controle-omstandigheden deed verminderen. Dit is omdat de constitutief actieve HER1- en HER2-receptoren, die dus ook actief zijn in de controle groep, geïnhibeerd worden. Deze constitutieve activatie was tevens zichtbaar op de RTK array. We zien wel dat de colonkankercellen metabolisch zeer actief zijn in de groep behandeld met CM van TAMC en herceptine of cetuximab. Dit is vermoedelijk onder invloed van HER3 activatie door NRG1 uit het CM van TAMC. Het CM van TAMC maakt colonkankercellen ook invasief (P<0.05). Op invasietest kon pertuzumab, als enigste van de drie gebruikte inhibitoren, de colonkankercellen minder invasief maken door het effect van het CM van TAMC te gaan inhiberen (P<0.05). Het feit dat noch herceptine, noch cetuximab hierin slaagden pleit ook voor een rol voor HER3 en NRG1. Ook op de proliferatietest zagen we dat panitumumab onder controle-omstandigheden de celgroei remde. Maar in de met CM van TAMC behandelde groep nam de groei toe met 306% ondanks HER1-inhibitie. Ook dit effect kunnen we toeschrijven aan HER3 activatie door NRG1 uit het CM van TAMC. Verder

     

werd significant aangetoond dat pertuzumab de effecten van het CM van TAMC op de groei deels kon inhiberen (P<0.05; P=0.008). De constitutieve activatie van de HER1- en HER2-receptor bij colonkanker werd aangetoond op de RTK Array. De kankercellen slagen erin om de receptoractivatie gedurende het verloop van de carcinogenese te omzeilen door de ligand geïnduceerde activatie te vervangen door een autocriene activatie.Een K-ras mutatie of verlies van het Phosphatase en Tensine (PTEN) homoloog tumor suppressorgen kunnen redenen zijn van een downstream HER-receptor activatie.Dit is één van de mechanismen waardoor cetuximab/panitumumab resistentie optreedt(69). Het volledige mechanisme achter resistentie tegen HER-inhibitoren is nog niet volledig begrepen. Verschillende verklaringen zijn hiervoor mogelijk. 1) De antilichamen gaan de heterodimerisatie niet efficient gaan blokkeren(70). 2) De PI3K en IGF-I receptor signalisatie gaan toenemen(71-73). 3) Na verloop van tijd komt er een variante, resistente vorm van de getargette HER-receptor (74). 4) De signalisatie gaat gewoon door via ander leden van de HER-familie die niet getarget worden door de antilichamen(75). Zo kan een verandering in de activiteit van één HER-receptor functioneel gecompenseerd worden door een andere HER-receptor waardoor de efficiëntie van een single-target HER-inhibitor aanzienlijk kan dalen(76). Op onze proliferatietesten en MTT konden we zien dat cetuximab/panitumumab er in slaagden de groei-stimulerende en metabole activiteit te doen dalen bij de HCT8/E11 colonkankercellen onder controle-omstandigheden. Evenwel zagen we dat na toevoeging van het CM van TAMC deze daling deels teniet gedaan werd. Mogelijks gaat het hier om een nieuwe vorm van resistentie waarbij de HER1/HER2-inhibitie door de HER-inhibitoren gebypassed wordt door de activatie van HER3 door NRG1 gesecreteerd door de TAMC. Dit komt overeen met de literatuur waarin beschreven is dat NRG1 de downstream HER-signalisatie doet toenemen nadat HER2 geïnhibeerd werd met een HER2inhibitor, herceptine(63, 70).Momenteel worden er twee klassen van RTK-inhibitoren gebruikt in de kliniek: de monoklonale antilichamen (mABs) en tyrosine kinase inhibitoren. Er zijn reeds veel successen geboekt met deze inhibitoren maar tot grote spijt moet men constanteren dat de efficiëntie van deze producten zeker geen 100% is en vele patiënten recidiveren. Bij vele patiënten wordt de kanker resistent door activatie van alternatieve RTK-pathways. Daarom kunnen we ter conclusie van deze thesis stellen dat naast MSC ook de CAF in TAMC de tumorgoei en invasie gaan promoten door de loslating van NRG1. NRG1 gaat hierbij de HER3receptor activeren waardoor huidige monoclonale antilichamen cetuximab en panitumumab, die enke HER1 en HER2 inhiberen, insufficient worden. Dit is mogelijks een nieuwe vorm van resistentie tegen cetuximab en panitumumab. De toevoeging van een HER3-inhibitor aan de adjuvante behandeling van CRC moet daarvoor zeker onderzocht worden.

     

Naar de toekomst toe lijkt de oorspronkelijke energie die werd gestoken in de ontwikkeling van een zeer specifieke inhibitor van één RTK tevergeefs aangezien inhibitie van één receptor de kanker niet zal genezen omwille van activatie van alternatieve pathways. Daarom zullen we geen single-target maar multi-target inhibitoren moeten ontwikkelen die niet specifiek gaan inhiberen maar aspecifiek. Zo zullen niet één pathway maar meerdere pathways simultaan geïnhibeerd moetenworden met de nieuwe generatie anti-tumorale drugs(77).

     

REFERENTIES 

1.  Ricci‐Vitiani  L  Fau  ‐  Pagliuca  A,  Pagliuca  A  Fau  ‐  Palio  E,  Palio  E  Fau  ‐  Zeuner  A,  Zeuner A Fau ‐ De Maria R, De Maria R. Colon cancer stem cells.  (2008)  2.  Reya T Fau ‐ Morrison SJ, Morrison Sj Fau ‐ Clarke MF, Clarke Mf Fau ‐ Weissman IL,  Weissman IL. Stem cells, cancer, and cancer stem cells.  (2001)  3.  Saif Mw Fau ‐ Chu E, Chu E. Biology of colorectal cancer.  (2010)  4.  Lin Eh Fau ‐ Jiang Y, Jiang Y Fau ‐ Deng Y, Deng Y Fau ‐ Lapsiwala R, Lapsiwala R Fau ‐  Lin  T,  Lin  T  Fau  ‐  Blau  CA,  Blau  CA.  Cancer  stem  cells,  endothelial  progenitors,  and  mesenchymal stem cells: "seed and soil" theory revisited.  (2009)  5.  Puppa G Fau ‐ Sonzogni A, Sonzogni A Fau ‐ Colombari R, Colombari R Fau ‐ Pelosi G,  Pelosi  G.  TNM  staging  system  of  colorectal  carcinoma:  a  critical  appraisal  of  challenging  issues.  (2010)  6.  Hanahan D Fau ‐ Weinberg RA, Weinberg RA. The hallmarks of cancer.  (2000)  7.  Miyaki M Fau ‐ Konishi M, Konishi M Fau ‐ Kikuchi‐Yanoshita R, Kikuchi‐Yanoshita R  Fau ‐ Enomoto M, Enomoto M Fau ‐ Igari T, Igari T Fau ‐ Tanaka K, Tanaka K Fau ‐ Muraoka  M,  et  al.  Characteristics  of  somatic  mutation  of  the  adenomatous  polyposis  coli  gene  in  colorectal tumors.  (1994)  8.  Takayama T Fau ‐ Miyanishi K, Miyanishi K Fau ‐ Hayashi T, Hayashi T Fau ‐ Sato Y,  Sato  Y  Fau  ‐  Niitsu  Y,  Niitsu  Y.  Colorectal  cancer:  genetics  of  development  and  metastasis.   (2006)  9.  Smith Aj Fau ‐ Stern HS, Stern Hs Fau ‐ Penner M, Penner M Fau ‐ Hay K, Hay K Fau ‐  Mitri A, Mitri A Fau ‐ Bapat BV, Bapat Bv Fau ‐ Gallinger S, et al. Somatic APC and K‐ras codon  12 mutations in aberrant crypt foci from human colons.  (1994)  10.  Sodhi A Fau ‐ Montaner S, Montaner S Fau ‐ Miyazaki H, Miyazaki H Fau ‐ Gutkind JS,  Gutkind JS. MAPK and Akt act cooperatively but independently on hypoxia inducible factor‐ 1alpha in rasV12 upregulation of VEGF.  20010910 DCOM‐ (2001)  11.  Tomlinson  I  Fau  ‐  Ilyas  M,  Ilyas  M  Fau  ‐  Novelli  M,  Novelli  M.  Molecular  genetics  of  colon cancer.  (1997)  12.  Russo A Fau ‐ Bazan V, Bazan V Fau ‐ Iacopetta B, Iacopetta B Fau ‐ Kerr D, Kerr D Fau  ‐  Soussi  T,  Soussi  T  Fau  ‐  Gebbia  N,  Gebbia  N.  The  TP53  colorectal  cancer  international  collaborative study on the prognostic and predictive significance of p53 mutation: influence  of tumor site, type of mutation, and adjuvant treatment.  (2005)  13.  Mareel  M  Fau  ‐  Vermeulen  S,  Vermeulen  S  Fau  ‐  Bracke  M,  Bracke  M.  [Molecular  mechanism  of  cancer  seeding:  adhesion  molecules  and  signal  transduction  networks].   (1998)  14.  Langley Rr Fau ‐ Fidler IJ, Fidler IJ. The seed and soil hypothesis revisited‐The role of  tumor‐stroma interactions in metastasis to different organs.  (2011)  15.  Steeg  Ps  Fau  ‐  Theodorescu  D,  Theodorescu  D.  Metastasis:  a  therapeutic  target  for  cancer.  (2008)  16.  Joyce  Ja  Fau  ‐  Pollard  JW,  Pollard  JW.  Microenvironmental  regulation  of  metastasis.   (2009)  17.  Wiseman Bs Fau ‐ Werb Z, Werb Z. Stromal effects on mammary gland development  and breast cancer.  (2002)       

18.  Tuxhorn Ja Fau ‐ Ayala GE, Ayala Ge Fau ‐ Smith MJ, Smith Mj Fau ‐ Smith VC, Smith Vc  Fau  ‐  Dang  TD,  Dang  Td  Fau  ‐  Rowley  DR,  Rowley  DR.  Reactive  stroma  in  human  prostate  cancer:  induction  of  myofibroblast  phenotype  and  extracellular  matrix  remodeling.   20020916 DCOM‐ (2002)  19.  Menon Lg Fau ‐ Picinich S, Picinich S Fau ‐ Koneru R, Koneru R Fau ‐ Gao H, Gao H Fau  ‐  Lin  SY,  Lin  Sy  Fau  ‐  Koneru  M,  Koneru  M  Fau  ‐  Mayer‐Kuckuk  P,  et  al.  Differential  gene  expression  associated  with  migration  of  mesenchymal  stem  cells  to  conditioned  medium  from tumor cells or bone marrow cells.  (2007)  20.  Shinagawa  K  Fau  ‐  Kitadai  Y,  Kitadai  Y  Fau  ‐  Tanaka  M,  Tanaka  M  Fau  ‐  Sumida  T,  Sumida  T  Fau  ‐  Kodama  M,  Kodama  M  Fau  ‐  Higashi  Y,  Higashi  Y  Fau  ‐  Tanaka  S,  et  al.  Mesenchymal stem cells enhance growth and metastasis of colon cancer.  20100927 DCOM‐  (2010)  21.  Hung Sc Fau ‐ Deng W‐P, Deng Wp Fau ‐ Yang WK, Yang Wk Fau ‐ Liu R‐S, Liu Rs Fau ‐  Lee  C‐C,  Lee  Cc  Fau  ‐ Su  T‐C,  Su  Tc  Fau  ‐  Lin  R‐J,  et al. Mesenchymal  stem  cell  targeting  of  microscopic  tumors  and  tumor  stroma  development  monitored  by  noninvasive  in  vivo  positron emission tomography imaging.  (2005)  22.  De  Boeck  A  Fau  ‐  Narine  K,  Narine  K  Fau  ‐  De  Neve  W,  De  Neve  W  Fau  ‐  Mareel  M,  Mareel  M  Fau  ‐  Bracke  M,  Bracke  M  Fau  ‐  De  Wever  O,  De  Wever  O.  Resident  and  bone  marrow‐derived  mesenchymal  stem  cells  in  head  and  neck  squamous  cell  carcinoma.   (2010)  23.  Direkze Nc Fau ‐ Alison MR, Alison MR. Bone marrow and tumour stroma: an intimate  relationship.  (2006)  24.  Orimo A Fau ‐ Gupta PB, Gupta Pb Fau ‐ Sgroi DC, Sgroi Dc Fau ‐ Arenzana‐Seisdedos  F, Arenzana‐Seisdedos F Fau ‐ Delaunay T, Delaunay T Fau ‐ Naeem R, Naeem R Fau ‐ Carey  VJ,  et  al.  Stromal  fibroblasts  present  in  invasive  human  breast  carcinomas  promote  tumor  growth and angiogenesis through elevated SDF‐1/CXCL12 secretion.  (2005)  25.  Direkze  Nc  Fau  ‐  Hodivala‐Dilke  K,  Hodivala‐Dilke  K  Fau  ‐  Jeffery  R,  Jeffery  R  Fau  ‐  Hunt T, Hunt T Fau ‐ Poulsom R, Poulsom R Fau ‐ Oukrif D, Oukrif D Fau ‐ Alison MR, et al.  Bone marrow contribution to tumor‐associated myofibroblasts and fibroblasts.  (2004)  26.  Kasper G Fau ‐ Dankert N, Dankert N Fau ‐ Tuischer J, Tuischer J Fau ‐ Hoeft M, Hoeft  M Fau ‐ Gaber T, Gaber T Fau ‐ Glaeser JD, Glaeser Jd Fau ‐ Zander D, et al. Mesenchymal stem  cells regulate angiogenesis according to their mechanical environment.  (2007)  27.  De Wever O Fau ‐ Demetter P, Demetter P Fau ‐ Mareel M, Mareel M Fau ‐ Bracke M,  Bracke M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth.  (2008)  28.  Powell  Dw  Fau  ‐  Adegboyega  PA,  Adegboyega  Pa  Fau  ‐  Di  Mari  JF,  Di  Mari  Jf  Fau  ‐  Mifflin RC, Mifflin RC. Epithelial cells and their neighbors I. Role of intestinal myofibroblasts  in development, repair, and cancer.  (2005)  29.  Hinz B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. (2007)  30.  Gabbiani  G.  The  myofibroblast  in  wound  healing  and  fibrocontractive  diseases.   (2003)  31.  Schurch  W  Fau  ‐  Seemayer  TA,  Seemayer  Ta  Fau  ‐  Gabbiani  G,  Gabbiani  G.  The  myofibroblast: a quarter century after its discovery.  (1998)  32.  Desmouliere  A  Fau  ‐  Guyot  C,  Guyot  C  Fau  ‐  Gabbiani  G,  Gabbiani  G.  The  stroma  reaction myofibroblast: a key player in the control of tumor cell behavior.  (2004)  33.  Eyden  B  Fau  ‐  Banerjee  SS,  Banerjee  Ss  Fau  ‐  Shenjere P,  Shenjere  P  Fau  ‐  Fisher  C,  Fisher C. The myofibroblast and its tumours.  (2009)  34.  Mishra Pj Fau ‐ Mishra PJ, Mishra Pj Fau ‐ Humeniuk R, Humeniuk R Fau ‐ Medina DJ,  Medina  Dj  Fau  ‐  Alexe  G,  Alexe  G  Fau  ‐  Mesirov  JP,  Mesirov  Jp  Fau  ‐  Ganesan  S,  et  al.       

Carcinoma‐associated  fibroblast‐like  differentiation  of  human  mesenchymal  stem  cells.   (2008)  35.  De Wever O Fau ‐ Mareel M, Mareel M. Role of tissue stroma  in cancer cell invasion.   (2003)  36.  De Wever O Fau ‐ Nguyen Q‐D, Nguyen Qd Fau ‐ Van Hoorde L,  Van Hoorde L Fau ‐  Bracke M, Bracke M Fau ‐ Bruyneel E, Bruyneel E Fau ‐ Gespach C, Gespach C Fau ‐ Mareel M,  et al. Tenascin‐C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro‐ invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac.  (2004)  37.  Pittenger Mf Fau ‐ Mackay AM, Mackay Am Fau ‐ Beck SC, Beck Sc Fau ‐ Jaiswal RK,  Jaiswal  Rk  Fau  ‐  Douglas  R,  Douglas  R  Fau  ‐  Mosca  JD,  Mosca  Jd  Fau  ‐  Moorman  MA,  et  al.  Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.  (1999)  38.  Dominici  M  Fau  ‐  Le  Blanc  K,  Le  Blanc  K  Fau  ‐  Mueller  I,  Mueller  I  Fau  ‐  Slaper‐ Cortenbach  I,  Slaper‐Cortenbach  I  Fau  ‐  Marini  F,  Marini  F  Fau  ‐  Krause  D,  Krause  D  Fau  ‐  Deans  R,  et  al.  Minimal  criteria  for  defining  multipotent  mesenchymal  stromal  cells.  The  International Society for Cellular Therapy position statement.  (2006)  39.  El‐Haibi  Cp  Fau  ‐  Karnoub  AE,  Karnoub  AE.  Mesenchymal  stem  cells  in  the  pathogenesis and therapy of breast cancer.  (2010)  40.  Duan X Fau ‐ Guan H, Guan H Fau ‐ Cao Y, Cao Y Fau ‐ Kleinerman ES, Kleinerman ES.  Murine  bone  marrow‐derived  mesenchymal  stem  cells  as  vehicles  for  interleukin‐12  gene  delivery into Ewing sarcoma tumors.  (2009)  41.  Khakoo Ay Fau ‐ Pati S, Pati S Fau ‐ Anderson SA, Anderson Sa Fau ‐ Reid W, Reid W  Fau  ‐  Elshal  MF,  Elshal  Mf  Fau  ‐  Rovira  II,  Rovira  Ii  Fau  ‐  Nguyen  AT,  et  al.  Human  mesenchymal stem cells exert potent antitumorigenic effects in a model of Kaposi's sarcoma.   (2006)  42.  Nakamizo A Fau ‐ Marini F, Marini F Fau ‐ Amano T, Amano T Fau ‐ Khan A, Khan A  Fau ‐ Studeny M, Studeny M Fau ‐ Gumin J, Gumin J Fau ‐ Chen J, et al. Human bone marrow‐ derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas.  (2005)  43.  Karnoub Ae Fau ‐ Dash AB, Dash Ab Fau ‐ Vo AP, Vo Ap Fau ‐ Sullivan A, Sullivan A Fau  ‐  Brooks  MW,  Brooks  Mw  Fau  ‐  Bell  GW,  Bell  Gw  Fau  ‐  Richardson  AL,  et al. Mesenchymal  stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis.  (2007)  44.  Studeny M Fau ‐ Marini FC, Marini Fc Fau ‐ Dembinski JL, Dembinski Jl Fau ‐ Zompetta  C, Zompetta C Fau ‐ Cabreira‐Hansen M, Cabreira‐Hansen M Fau ‐ Bekele BN, Bekele Bn Fau ‐  Champlin  RE,  et  al.  Mesenchymal  stem  cells:  potential  precursors  for  tumor  stroma  and  targeted‐delivery vehicles for anticancer agents.  (2004)  45.  Komarova  S  Fau  ‐  Kawakami  Y,  Kawakami  Y  Fau  ‐  Stoff‐Khalili  MA,  Stoff‐Khalili  Ma  Fau ‐ Curiel DT, Curiel Dt Fau ‐ Pereboeva L, Pereboeva L. Mesenchymal progenitor cells as  cellular vehicles for delivery of oncolytic adenoviruses.  (2006)  46.  Coffelt Sb Fau ‐ Marini FC, Marini Fc Fau ‐ Watson K, Watson K Fau ‐ Zwezdaryk KJ,  Zwezdaryk  Kj  Fau  ‐  Dembinski  JL,  Dembinski  Jl  Fau  ‐  LaMarca  HL,  LaMarca  Hl  Fau  ‐  Tomchuck  SL,  et  al.  The  pro‐inflammatory  peptide  LL‐37  promotes  ovarian  tumor  progression through recruitment of multipotent mesenchymal stromal cells.  (2009)  47.  Rattigan Y Fau ‐ Hsu J‐M, Hsu Jm Fau ‐ Mishra PJ, Mishra Pj Fau ‐ Glod J, Glod J Fau ‐  Banerjee  D,  Banerjee  D.  Interleukin  6  mediated  recruitment  of  mesenchymal  stem  cells  to  the hypoxic tumor milieu.  (2010)  48.  Fox  Jm  Fau  ‐  Chamberlain  G,  Chamberlain  G  Fau  ‐  Ashton  BA,  Ashton  Ba  Fau  ‐  Middleton J, Middleton J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell  trafficking.  (2007)  49.  Citri  A  Fau  ‐  Yarden  Y,  Yarden  Y.  EGF‐ERBB  signalling:  towards  the  systems  level.   (2006)       

50.  Kruser  Tj  Fau  ‐  Wheeler  DL,  Wheeler  DL.  Mechanisms  of  resistance  to  HER  family  targeting antibodies.  (2010)  51.  Ng  K  Fau  ‐  Zhu  AX,  Zhu  AX.  Targeting  the  epidermal  growth  factor  receptor  in  metastatic colorectal cancer.  20071211 DCOM‐ 20080403(1040‐8428 (Print)).  52.  Arnold D Fau ‐ Seufferlein T, Seufferlein T. Targeted treatments in colorectal cancer:  state of the art and future perspectives.  (2010)  53.  Jemal A Fau ‐ Siegel R, Siegel R Fau ‐ Ward E, Ward E Fau ‐ Murray T, Murray T Fau ‐  Xu J, Xu J Fau ‐ Smigal C, Smigal C Fau ‐ Thun MJ, et al. Cancer statistics, 2006. (2006)  54.  Stove  C  Fau  ‐  Stove  V,  Stove  V  Fau  ‐  Derycke  L,  Derycke  L  Fau  ‐  Van  Marck  V,  Van  Marck  V  Fau  ‐  Mareel  M,  Mareel  M  Fau  ‐  Bracke  M,  Bracke  M.  The  heregulin/human  epidermal growth factor receptor as a new growth factor system in melanoma with multiple  ways of deregulation.  (2003)  55.  de Alava E Fau ‐ Ocana A, Ocana A Fau ‐ Abad M, Abad M Fau ‐ Montero JC, Montero Jc  Fau ‐ Esparis‐Ogando A, Esparis‐Ogando A Fau ‐ Rodriguez CA, Rodriguez Ca Fau ‐ Otero AP,  et  al.  Neuregulin  expression  modulates  clinical  response  to  trastuzumab  in  patients  with  metastatic breast cancer.  (2007)  56.  Noguchi H Fau ‐ Sakamoto C, Sakamoto C Fau ‐ Wada K, Wada K Fau ‐ Akamatsu T,  Akamatsu T Fau ‐ Uchida T, Uchida T Fau ‐ Tatsuguchi A, Tatsuguchi A Fau ‐ Matsui H, et al.  Expression  of  heregulin  alpha,  erbB2,  and  erbB3  and  their  influences  on  proliferation  of  gastric epithelial cells.  (1999)  57.  Maurer  Ca  Fau  ‐  Friess  H,  Friess  H  Fau  ‐  Kretschmann  B,  Kretschmann  B  Fau  ‐  Zimmermann  A,  Zimmermann  A  Fau  ‐  Stauffer  A,  Stauffer  A  Fau  ‐  Baer  HU,  Baer  Hu  Fau  ‐  Korc  M,  et  al.  Increased  expression  of  erbB3  in  colorectal  cancer  is  associated  with  concomitant increase in the level of erbB2.  (1998)  58.  Pinkas‐Kramarski R Fau ‐ Eilam R, Eilam R Fau ‐ Alroy I, Alroy I Fau ‐ Levkowitz G,  Levkowitz  G  Fau  ‐  Lonai  P,  Lonai  P  Fau  ‐  Yarden  Y,  Yarden  Y.  Differential  expression  of  NDF/neuregulin  receptors  ErbB‐3  and  ErbB‐4  and  involvement  in  inhibition  of  neuronal  differentiation.  (1998)  59.  Plowman Gd Fau ‐ Culouscou JM, Culouscou Jm Fau ‐ Whitney GS, Whitney Gs Fau ‐  Green JM, Green Jm Fau ‐ Carlton GW, Carlton Gw Fau ‐ Foy L, Foy L Fau ‐ Neubauer MG, et al.  Ligand‐specific  activation  of  HER4/p180erbB4,  a  fourth  member  of  the  epidermal  growth  factor receptor family.  (1993)  60.  Prigent  Sa  Fau  ‐  Lemoine  NR,  Lemoine  Nr  Fau  ‐  Hughes  CM,  Hughes  Cm  Fau  ‐  Plowman GD, Plowman Gd Fau ‐ Selden C, Selden C Fau ‐ Gullick WJ, Gullick WJ. Expression  of the c‐erbB‐3 protein in normal human adult and fetal tissues.  (1992)  61.  Lee  Jc  Fau  ‐  Wang  ST,  Wang  St  Fau  ‐  Chow  NH,  Chow  Nh  Fau  ‐  Yang  HB,  Yang  HB.  Investigation of the prognostic value of coexpressed erbB family members for the survival of  colorectal cancer patients after curative surgery.  (2002)  62.  Kountourakis P Fau ‐ Pavlakis K, Pavlakis K Fau ‐ Psyrri A, Psyrri A Fau ‐ Rontogianni  D, Rontogianni D Fau ‐ Xiros N, Xiros N Fau ‐ Patsouris E, Patsouris E Fau ‐ Pectasides D, et al.  Prognostic  significance  of  HER3  and  HER4  protein  expression  in  colorectal  adenocarcinomas.  (2006)  63.  Agus Db Fau ‐ Akita RW, Akita Rw Fau ‐ Fox WD, Fox Wd Fau ‐ Lewis GD, Lewis Gd  Fau  ‐  Higgins  B,  Higgins  B  Fau  ‐  Pisacane  PI,  Pisacane  Pi  Fau  ‐  Lofgren  JA,  et  al.  Targeting  ligand‐activated ErbB2 signaling inhibits breast and prostate tumor growth.  (2002)  64.  Pohl M Fau ‐ Stricker I, Stricker I Fau ‐ Schoeneck A, Schoeneck A Fau ‐ Schulmann K,  Schulmann  K  Fau  ‐  Klein‐Scory  S,  Klein‐Scory  S  Fau  ‐  Schwarte‐Waldhoff  I,  Schwarte‐ Waldhoff  I  Fau  ‐  Hasmann  M,  et  al.  Antitumor  activity  of  the  HER2  dimerization  inhibitor  pertuzumab on human colon cancer cells in vitro and in vivo.  (2009)       

65.  Giannopoulou  E  Fau  ‐  Antonacopoulou  A,  Antonacopoulou  A  Fau  ‐  Floratou  K,  Floratou K Fau ‐ Papavassiliou AG, Papavassiliou Ag Fau ‐ Kalofonos HP, Kalofonos HP. Dual  targeting of EGFR and HER‐2 in colon cancer cell lines.  (2009)  66.  Mann M Fau ‐ Sheng H, Sheng H Fau ‐ Shao J, Shao J Fau ‐ Williams CS, Williams Cs Fau  ‐  Pisacane  PI,  Pisacane  Pi  Fau  ‐  Sliwkowski  MX,  Sliwkowski  Mx  Fau  ‐  DuBois  RN,  et  al.  Targeting cyclooxygenase 2 and HER‐2/neu pathways inhibits colorectal carcinoma growth.   (2001)  67.  Gregory Cw Fau ‐ Whang YE, Whang Ye Fau ‐ McCall W, McCall  W Fau ‐ Fei X, Fei X  Fau  ‐  Liu  Y,  Liu  Y  Fau  ‐  Ponguta  LA,  Ponguta  La  Fau  ‐  French  FS,  et  al.  Heregulin‐induced  activation  of  HER2  and  HER3  increases  androgen  receptor  transactivation  and  CWR‐R1  human recurrent prostate cancer cell growth.  (2005)  68.  Stulik  J  Fau  ‐  Hernychova  L,  Hernychova  L  Fau  ‐  Porkertova  S,  Porkertova  S  Fau  ‐  Knizek  J,  Knizek  J  Fau  ‐  Macela  A,  Macela  A  Fau  ‐  Bures  J,  Bures  J  Fau  ‐  Jandik  P,  et  al.  Proteome study of colorectal carcinogenesis.  (2001)  69.  Frattini M Fau ‐ Saletti P, Saletti P Fau ‐ Romagnani E, Romagnani E Fau ‐ Martin V,  Martin V Fau ‐ Molinari F, Molinari F Fau ‐ Ghisletta M, Ghisletta M Fau ‐ Camponovo A, et al.  PTEN loss of expression predicts cetuximab efficacy in metastatic colorectal cancer patients.   (2007)  70.  Ritter Ca Fau ‐ Perez‐Torres M, Perez‐Torres M Fau ‐ Rinehart C, Rinehart C Fau ‐ Guix  M, Guix M Fau ‐ Dugger T, Dugger T Fau ‐ Engelman JA, Engelman Ja Fau ‐ Arteaga CL, et al.  Human  breast  cancer  cells  selected  for  resistance  to  trastuzumab  in  vivo  overexpress  epidermal  growth  factor  receptor  and  ErbB  ligands  and  remain  dependent  on  the  ErbB  receptor network.  (2007)  71.  Berns  K  Fau  ‐  Horlings  HM,  Horlings  Hm  Fau  ‐  Hennessy  BT,  Hennessy  Bt  Fau  ‐  Madiredjo  M,  Madiredjo  M  Fau  ‐  Hijmans  EM,  Hijmans  Em  Fau  ‐  Beelen  K,  Beelen  K  Fau  ‐  Linn  SC,  et  al.  A  functional  genetic  approach  identifies  the  PI3K  pathway  as  a  major  determinant of trastuzumab resistance in breast cancer.  (2007)  72.  Lu Y Fau ‐ Zi X, Zi X Fau ‐ Pollak M, Pollak M. Molecular mechanisms underlying IGF‐I‐ induced attenuation of the growth‐inhibitory activity of trastuzumab (Herceptin) on SKBR3  breast cancer cells.  (2003)  73.  Lu Y Fau ‐ Zi X, Zi X Fau ‐ Zhao Y, Zhao Y Fau ‐ Mascarenhas D, Mascarenhas D Fau ‐  Pollak  M,  Pollak  M.  Insulin‐like  growth  factor‐I  receptor  signaling  and  resistance  to  trastuzumab (Herceptin).  (2001)  74.  Castiglioni  F  Fau  ‐  Tagliabue  E,  Tagliabue  E  Fau  ‐  Campiglio  M,  Campiglio  M  Fau  ‐  Pupa  SM,  Pupa  Sm  Fau  ‐  Balsari  A,  Balsari  A  Fau  ‐  Menard  S,  Menard  S.  Role  of  exon‐16‐ deleted HER2 in breast carcinomas.  (2006)  75.  Wheeler Dl Fau ‐ Huang S, Huang S Fau ‐ Kruser TJ, Kruser Tj Fau ‐ Nechrebecki MM,  Nechrebecki  Mm  Fau  ‐  Armstrong  EA,  Armstrong  Ea  Fau  ‐  Benavente  S,  Benavente  S  Fau  ‐  Gondi  V,  et  al.  Mechanisms  of  acquired  resistance  to  cetuximab:  role  of  HER  (ErbB)  family  members.  (2008)  76.  Sergina Nv Fau ‐ Rausch M, Rausch M Fau ‐ Wang D, Wang D Fau ‐ Blair J, Blair J Fau ‐  Hann  B,  Hann  B  Fau  ‐  Shokat  KM,  Shokat  Km  Fau  ‐  Moasser  MM,  et  al.  Escape  from  HER‐ family tyrosine kinase inhibitor therapy by the kinase‐inactive HER3.  (2007)  77.  Petrelli A Fau ‐ Giordano S, Giordano S. From single‐ to multi‐target drugs in cancer  therapy: when aspecificity becomes an advantage.  (2008)