De rol van de microbiologie in de vleeswarenindustrie

C.V.I. § M7 Snelle microbiologische technieken

De rol van de microbiologie in de vleeswarenindustrie Zevende deel M7

SNELLE MICROBIOLOGISCHE TECHNIEKEN OP BASIS VAN DNA-TECHNOLOGIE

Auteur : Dr. J.M.B.M. van der Vossen, Mw. W.A.L.M. Havekes en F.K. Stekelenburg TNO Voeding

februari 2001

blad 1 van 11


I NHOUDSOPGAVE

1

INTRODUCTIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2

BESCHIKBARE TECHNIEKEN EN TOEPASSING . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2.1 Detectie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2.1.1 Technieken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2.1.2 Toepassing PCR detectie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2.2 Typering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2.2.1 Technieken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2.2.2 Toepassing Ribotypering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

3

PRINCIPES EN WERKWIJZEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 3.1 Snelle microbiologische detectie op basis van Polymerase Chain Reaction (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 3.1.1 Principe van PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 3.1.2 Implementatie van detectiemethoden op basis van PCR . . . . . . . . . . . . . . . . 8 3.1.3 Commercieel verkrijgbare tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3.2 Ribotypering: een snelle methode voor stam identificatie en opsporen van besmettingsbronnen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 3.2.1 Principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 3.2.2 Identificatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

4

LITERATUUR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

blad 2 van 11


1

INTRODUCTIE

Microbiologisch onderzoek is een belangrijk instrument binnen een goed functionerend HACCP-systeem in de voedingsmiddelenindustrie. Ten eerste kunnen bij de ontwikkeling van het systeem op basis van resultaten van microbiologische analyses punten in het proces worden vastgesteld, waar beheersing van de microbiologische veiligheid noodzakelijk is. Ten tweede kunnen microbiologische analyses helpen bij de verificatie van het HACCP systeem, onder meer door vast te stellen of de gestelde limieten bij microbiologisch kritische punten, de zogenaamde PVA's (punten van aandacht) en CCP's (kritische beheerspunten) worden gehaald. Voor de monitoring van kritische beheerspunten (CCP's) schieten microbiologische methoden vooralsnog te kort, voornamelijk door de traagheid waarmee de analyseresultaten beschikbaar zijn. Tussen de monstername en de uitslag van de microbiologische analyse verstrijkt meestal een aantal dagen. Ook geeft microbiologisch onderzoek van eindproducten, om statistische redenen, geen betrouwbare informatie over de productveiligheid. Desondanks wordt eindproduct-onderzoek vaak toch uitgevoerd om te zien of het product globaal voldoet aan algemene microbiologische specificaties. Bij dit type onderzoek is de snelheid waarmee het resultaat beschikbaar komt van groot belang. Duidelijke afwijkingen moeten in een zo vroeg mogelijk stadium worden geconstateerd, zodat eventueel afwijkende producten nog tijdig kunnen worden onderschept. Daarnaast kan eindproductonderzoek microbiologische trends aangeven. Indien een micro-biologisch probleem in een eindproduct snel wordt opgemerkt, kan een oorzakelijk onderzoek in de lijn nog met voldoende kans op slagen worden gestart. In hoofdstuk M3 van dit handboek worden enkele instrumentele technieken beschreven, waarmee relatief snel een indruk kan worden verkregen over de algemene microbiolo-gische gesteldheid van producten. In sommige gevallen is het echter noodzakelijk om informatie te verzamelen over eventuele aanwezigheid van specifieke micro-organismen, zoals Salmonella, Campylobacter en Listeria monocytogenes. Met de huidige snelle detectiemethoden kunnen deze micro-organismen al binnen 1 tot 3 dagen worden gedetecteerd in plaats van na ongeveer een week bij toepassing van de meer conventionele bepalingstechnieken. De tijdwinst die hiermee geboekt wordt, kan logistieke voordelen bieden. Daarnaast zijn er tegenwoordig snelle typeringsmethoden beschikbaar met een hoog oplossend vermogen, waarmee micro-organismen vrijwel op stamniveau van elkaar kunnen worden onderscheiden. Dit biedt met name mogelijkheden bij het traceren van de bron van microbiologische besmettingen of bij herkenning van toegepaste starterculturen.

2

BESCHIKBARE TECHNIEKEN EN TOEPASSING

2.1

Detectie

2.1.1

Technieken

Nieuwe technologie gebaseerd op immunologische en genetische kennis hebben geleid tot de ontwikkeling van instrumentele methoden voor het aantonen van specifieke microorganismen. Voorbeelden van deze methoden zijn de enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) en de polymerase chain reaction (PCR) techniek. De afgelopen jaren zijn meerdere testkits, gebaseerd op deze technologie, op de markt gekomen en hebben klassieke microbiologische bepalingen al voor een deel verdrongen. Met de komst van PCR detectiemethoden, die zich richten op het karakteriserende genetisch materiaal van micro-organismen, is het mogelijk te detecteren op ieder gewenst niveau van specificiteit. Detectie op geslacht of soort (=species of spp.) niveau is mogelijk, maar ook subsoorten of bijvoorbeeld virulente varianten zijn te onderscheiden.

blad 3 van 11


Met de PCR-detectiemethode is het bijvoorbeeld mogelijk om in één keer alle serologische varianten van Salmonella te detecteren of juist alleen maar Salmonella enteritidis of Salmonella typhimurium. Ook voor de humaan pathogeen Campylobacter bestaan PCRdetectiemethoden die specifiek zijn voor bijvoorbeeld Campylobacter coli en Campylobacter jejuni. PCR tests zijn sneller dan traditioneel microbiologische methoden. Daarnaast zijn ze veelal gevoeliger. DNA vermeerdering in PCR betekent direct de bevestiging dat het te detecteren organisme aanwezig was. ELISA methoden zijn daarentegen minder specifiek dan de PCR detectietechniek. Zoals bij elke methode zijn er factoren waarmee rekening moet worden gehouden en zullen resultaten behaald met verschillende methoden soms wat verschillen. Voornamelijk bij het routinematig verwerken van grote series monsters zijn PCR tests erg praktisch en als snelheid een rol speelt, zijn ze in het voordeel ten opzichte van traditionele methodes. Een traditionele plaatmethode voor de detectie van Salmonella spp. kan 3 tot 7 dagen duren terwijl een PCR test, afhankelijk van de matrix, na 1 tot 2 dagen een resultaat geeft (Figuur 1). Figuur 1 V ergelij king van PCR-methode (TNO) met conventionele methode voor detectie van Salmonella spp. PCR-methode dag 0

conventionele methode

„

„

monster + BPW

monster + BPW

„

„

20 uur, 37 °C dag 1

20 uur, 37 °C

„

„

overenten in RV

overenten in RV

„

„

24 uur, 37 °C dag 2

24 uur, 42,5 °C

„

„

PCR (3 uur)

uitplaten op BGA

detectie d.m.v. gelelektroforese (1 uur)

24 uur, 37 °C

„

dag 3-7

verdachte kolonies reinstrij ken op PCA

„ „

aanenten op TSIA buizen bevestigen BPW RV BGA

2.1.2

= gebufferd peptonwater = Rappaport/Vassiliadis medium = Briljant Groen Agar

PCA = Plate Count Agar TSIA = Trypton Sugar Iron Agar

Toepassing PCR detectie

Zeker als gevoeligheid van belang is, zoals bij het screenen van vlees en vleesproducten op aanwezigheid van Salmonella, is de PCR de methode bij uitstek geschikt. Zo kan de PCR-detectie ingezet worden bij de monitoring van een keten. Doordat bij de Salmonella detectie de algemene ophoping (dag 0; figuur 1) en de selectieve ophoping (dag 1) vaak gecombineerd kan worden uitgevoerd, is voor de PCR meestal slechts 24 uur nodig. De methode kan in dat geval worden ingezet om bijvoorbeeld binnen één dag inzicht te hebben in de effectiviteit van reiniging en desinfectie na een incident met Salmonella . blad 4 van 11


De uitslag van de test is dan aanzienlijk eerder bekend dan met de klassieke Salmonella detectiemethode, die ongeveer een week kost. Alleen als de uitslag van een microbiologische bepaling snel beschikbaar komt, kan het effect van de reinigingsmaatregelen beter worden beoordeeld. Een andere toepassing is de situatie waarbij Salmonella in een eindproduct terecht is gekomen. Het inzetten van de PCR techniek biedt in een dergelijk geval een snelle mogelijkheid om de besmettingsbron op te sporen. Zeker als dit gebeurt in combinatie met een typeringsmethode, waarbij aangetoond kan worden dat de bacteriesoort in de bron hetzelfde is als de soort in het eindproduct (zie § 2.2). Een PCR test kan ook ingezet worden om potentiële toxinevormende micro-organismen te detecteren, terwijl een ELISA-test de aanwezigheid van het toxine zelf aantoont. Beide methoden zijn aanvullend en hebben hun eigen toepassing in de microbiologische beoordeling van voedingsmiddelen.

2.2

2.2.1

Typering

Technieken

De microbiologische vragen die al snel opdoemen als de aanwezigheid van ongewenste micro-organismen geconstateerd wordt, is: Om welke soort gaat het en waar komen ze vandaan? Worden in een product door middel van selectieve ophoping verdachte Salmonella bacteriën aangetroffen, dan kan de identiteit daarvan verder worden bevestigd. Zo kunnen biochemische omzettingen in een API test (BioMerieux) of een agglutinatietest met antilichamen aangeven dat het inderdaad om Salmonella spp. gaat. Deze testen kosten echter veel tijd en geven onvoldoende inzicht in het soort Salmonella. Ribotypering daarentegen kan op DNA niveau de Salmonella soort aangeven. Vaak is dan ook direct bekend om welke serologische variant het gaat. Door matching van het bandenpatroon van een Ribotypering met de database met ribopatronen kan bijvoorbeeld worden aangetoond dat het een Salmonella enteritidis betreft. Ribotyperingen worden op een gestandaardiseerde wijze verricht met een geautomatiseerd systeem, de RiboPrinter®. Dit systeem is vooral ontworpen om bacterie-isolaten snel, in circa 8 uur, te identificeren en te typeren. In dit systeem worden de ribosomale genen, het RNA, gebruikt voor herkenning. Alle micro-organismen bevatten deze genen, vanwege hun rol bij de eiwitsynthese. Tijdens de evolutie zijn er kleine veranderingen opgetreden in deze genen, zodat ze een ideale merker vormen voor het onderscheiden van verschillen microorganismen. De RiboPrinter® maakt een snelle identificatie van micro-organismen mogelijk mede door de aanwezigheid van een database met patronen die bij elke analyse verder wordt uitgebreid. Tegelijkertijd kunnen verschillende stammen van elkaar worden onderscheiden op basis van verschillen in bandenpatronen die ontstaan bij Ribotypering. Figuur 2 laat een clusteranalyse zien van RiboPrint® patronen van Staphylococcus spp. Bij de analyse wordt de mate van overeenkomst tussen de patronen aangegeven in procenten, waarna de meest vergelijkbare patronen worden geclusterd. De verschillen op het niveau van de drie getoonde soorten S. hominis, S. epidermidis en S. aureus zijn goed waarneembaar. Voorts zijn verschillen van de patronen zichtbaar tussen de verschillende stammen van elke soort. Hierin ligt de kracht van het systeem. In een enkele analyse komt informatie beschikbaar over de identiteit en verschillen met andere stammen. Naast geautomatiseerde Ribotypering zijn er ook nog PCR-methoden, zoals PCR-fingerprinting en RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA), waarmee patronen gegenereerd kunnen worden voor typering en identificatie. Deze benaderingen zijn echter bewerkelijker en minder reproduceerbaar.

blad 5 van 11


Figuur 2

C luster-analyse R iboP rint spp.

®

patronen van S taphyl ococcus

Ribo EcoRI

50

60

70

80

90

100

. Staphylococcus hominis . Staphylococcus hominis . Staphylococcus hominis . Staphylococcus hominis . Staphylococcus epidermidis . Staphylococcus epidermidis . Staphylococcus epidermidis . Staphylococcus epidermidis . Staphylococcus epidermidis . Staphylococcus epidermidis . Staphylococcus epidermidis . Staphylococcus epidermidis . Staphylococcus aureus . Staphylococcus aureus . Staphylococcus aureus . Staphylococcus aureus . Staphylococcus aureus . Staphylococcus aureus . Staphylococcus aureus . Staphylococcus aureus . Staphylococcus aureus . Staphylococcus aureus . Staphylococcus aureus . Staphylococcus aureus

2.2.2

Toepassing Ribotypering

Geautomatiseerde Ribotypering met de RiboPrinter® maakt een snelle identificatie van bacterie-isolaten uit de voedingsmiddelenindustrie mogelijk. Door het hoge oplossende vermogen kunnen stammen van elkaar onderscheiden worden en stelt het de gebruiker in staat om meer zicht te krijgen in de herkomst, epidemiologie en historie van isolaten. Hierdoor is het systeem bij uitstek geschikt in zaken als tracering bij microbiologische incidenten en authenticiteit als het gaat om starterculturen. Een voorbeeld van de toepassing van Ribotypering is het verrichten van een oorzakelijk onderzoek in de lijn, wanneer bijvoorbeeld Listeria monocytogenes in een eindproduct is gevonden. Met de daarvoor geëigende bemonsteringstechnieken wordt gezocht naar plaatsen in de productielijn en -omgeving waar L. monocytogenes zich zouden kunnen bevinden. De isolaten, die zo beschikbaar komen, kunnen vervolgens in circa 8 uur worden getypeerd met de RiboPrinter®. Overeenkomst van één of meer patronen van de isolaten uit de productielijn of -omgeving met het patroon van het isolaat uit het eindproduct geeft informatie over de herkomst. Dit gerichte bronnenonderzoek maakt het mogelijk gerichte beheersmaatregelen te treffen om herhaling van microbiologische problemen te voorkomen. Het resultaat van de Ribotypering kan bijvoorbeeld aangeven dat het nodig is om de afvulzone van een apparaat te reinigen en te desinfecteren. Ribotypering kan op deze wijze een rol spelen in zaken aangaande productaansprakelijkheid. De ongewenste aanwezigheid van Salmonella enteritidis in een eindproduct kan met behulp van Ribotypering herleid worden tot de bron. Ook ingeval van nuttige bacteriën, zoals starterculturen, kan Ribotypering zijn dienst bewijzen. Ribotypering is uitermate geschikt om toe te passen bij de kwaliteitscontrole van starterculturen bij de bereiding van droge worstsoorten.

blad 6 van 11


Afwijkende patronen vertellen al snel dat er een verandering is opgetreden in de samenstelling van deze culturen. Daarnaast kunnen op basis van patronen geschillen over authenticiteit en industrieel eigendom van stammen opgelost worden.

3

PRINCIPES EN WERKWIJZEN

3.1

Snelle microbiologische detectie op ba sis van Polymerase Chain Reaction (PCR)

3.1.1

Principe van PCR

Bij toepassing van de PCR-techniek, waarbij een specifiek stukje DNA van het te detecteren micro-organisme in vitro wordt vermeerderd, worden twee zogenaamde DNA primers gebruikt. Dit zijn korte stukjes DNA die enkelstrengs zijn en ongeveer 20 basen lang. Deze primers hebben een basenvolgorde die specifiek is voor het te detecteren micro-organisme. De primers zijn complementair aan de basenvolgorden die het doelwit DNA insluiten. Na ophoping van monstermateriaal in geschikte (selectieve) media, worden de daarin tot ontwikkeling gekomen micro-organismen gelyseerd, waarbij DNA vrijkomt. Vervolgens wordt de PCR analyse gericht op een specifiek micro-organisme gestart. PCR is een cyclisch proces dat begint met het uitsmelten van al het in het monstermateriaal aanwezige (dubbelstrengs) DNA bij een hoge temperatuur van 94 °C. Vervolgens vindt bij relatief lage temperatuur van 50 à 60 °C binding plaats van de primers aan het eventueel aanwezige DNA van het te detecteren micro-organisme. Het enzym Taq DNA polymerase, een thermostabiel DNA polymerase, synthetiseert vervolgens bij 72 °C een nieuwe DNA-streng vanaf elke primer. Na opnieuw uitsmelten bij 94 °C van zowel de oorspronkelijke als nieuw gevormde DNA-ketens wordt dit proces herhaald . Na 25-30 herhalingen, uitgevoerd met behulp van een ‘thermocycler‘, is er zoveel nieuw DNA gevormd dat het gedetecteerd kan worden (zie Figuur 3). Detectie van het geamplificeerde DNA-fragment gebeurt na elektroforese in een agarose gel, waarbij het DNA gekleurd wordt met ethidiumbromide. Onder UV-licht is vervolgens het DNA visueel zichtbaar. Ook kan detectie plaatsvinden door middel van een enzymatisch kleurreactie. Hierbij wordt het in de PCR gevormde DNA gebonden in een cupje van een microtiterplaat. Vervolgens wordt een korte DNA-probe toegevoegd die specifiek is voor het te detecteren DNA-fragment. De probe, waaraan bijvoorbeeld het enzym peroxidase is gekoppeld, zal binden aan het DNA fragment. Na een aantal wasstappen en een kleuromzetting door de peroxidase zullen monsters, die het juiste PCR-product bevatten, spectrofotometrisch te detecteren zijn. Hoewel deze laatste detectiemethode iets omslachtiger lijkt, is hij gemakkelijker te automatiseren. Een bijkomend voordeel is de extra selectiviteit door toepassing van de DNA-probe. De nieuwste methode van detectie is ‘on line’ meting van de vorming van een PCR-product met behulp van fluorescente labeling. Met een speciaal PCR-apparaat, zoals de ‘Taqman’ van Perkin Elmer of de ‘Lightcycler’ van LaRoche, kan de vorming van een fluorescerend PCR-product gevolgd worden en is kwantificering mogelijk. Bij deze PCR-protocollen is het niet nodig om het geamplificeerde DNA van de reactiemengsels over te brengen naar een agarose gel of microtiterplaat. Dit voorkomt ongewenste contaminatie van nieuw in te zetten PCR-reacties. De gevoeligheid en selectiviteit van de PCR-bepaling hangen voor een belangrijk deel af van de juiste primer basenvolgorden. Daarnaast kunnen onverwachte kruisreacties met andere kiemen waarvoor de test niet is gescreend het resultaat beïnvloeden. Het is daarom van belang om voldoende verschillende micro-organismen, waarop de primer gericht is, te testen. Maar minstens net zo belangrijk is het testen van te verwachten stoorflora om zodoende vals positieve reacties uit te sluiten.

blad 7 van 11


Figuur 3

3.1.2

S c hem a t i sc he vo o r st e l l i ng va n d e P C R reactie

Implementatie van detectiemethoden op basis van PCR

DNA vermeerdering door PCR heeft een revolutie op wetenschappelijk gebied veroorzaakt. Echter, implementatie in de voedingsmiddelenmicrobiologie blijkt niet zo simpel als in eerste instantie werd gedacht. PCR is een methode die zeer specifiek en gevoelig is. In theorie hoeft een monster slechts één DNA-molecule, ofwel één micro-organisme te bevatten, om tot een positief resultaat te komen. In de praktijk zijn vaak toch 100 of 1000 moleculen DNA nodig om tot een positieve PCR-reactie te komen. Reden hiervoor is dat de enzymatische DNA-amplificatie sterk beïnvloed wordt door componenten uit het voedingsmiddel waarin detectie plaats moet vinden. Vaak zijn daarom zuiveringsstappen noodzakelijk om remmende factoren, zoals galzouten en hemoglobine, te elimineren. Het is daarom van belang de test te valideren per matrix of soort product, voordat deze in de praktijk wordt ingezet. Daarnaast is het kleine volume waarin de PCR-reactie plaatsvindt (50-100 µl) een beperkende factor. Om lage besmettingsniveaus aan te tonen is het noodzakelijk het monster te concentreren om er zeker van te zijn dat het DNA van het te bepalen micro-organisme in het PCR-reactievaatje terechtkomt. Vaak gaat dit samen met eerder genoemde zuiveringen, waarbij in veel gevallen ook een voorophoping noodzakelijk is. Hierbij worden de eventueel aanwezige remmende factoren uit de matrix verdund en het te bepalen micro-organisme tot aantoonbare hoeveelheden vermeerderd. Aan de voorophoping voor een PCR-reactie worden minder eisen gesteld dan bij klassieke microbiologische methoden.

blad 8 van 11


De aanwezigheid van een overmaat aan stoorflora is geen probleem, zolang het te bepalen micro-organisme niet wordt geremd in de groei. Tenslotte is het van belang dat er zeer zorgvuldig gewerkt wordt bij de uitvoering van een PCR-test. Omdat bij PCR het doelwit DNA exponentieel vermeerderd wordt, is de gevoeligheid voor DNA besmetting groot. Om vals positieve reacties te voorkomen is het van belang dat monstervoorbewerking en analyse van het vermeerderde DNA in een gescheiden ruimte plaatsvinden. Tevens is gebruik van handschoenen en ‘filtertips’ op pipetten noodzakelijk om kruisbesmetting te voorkomen. De protocollen voor Taqman en Lightcycler PCR zijn al zodanig, dat de reactiemengsels niet geopend hoeven te worden, waardoor besmetting van nog in te zetten PCR-reacties en daarmee vals positieve PCR signalen worden voorkomen.

3.1.3

Commercieel verkrijgbare tests

Een aantal PCR tests is commercieel verkrijgbaar in de vorm van kits. Qualicon, Perkin Elmer en Sanofi hebben een kit voor Salmonella spp. Daarnaast brengt Qualicon kits voor E. coli 0157:H7, Listeria spp. en Listeria monocytogenes op de markt. Bij TNO Voeding zijn PCR-tests ontwikkeld voor onder andere Salmonellaspp. en Campylobacter coli en jejuni en men ontwikkelt verder ‘custom made’ PCR-tests voor specifieke micro-organismen in specifieke matrices. AOAC International (Association of Analytical Chemists, USA) validatie is tot nu toe echter alleen afgegeven voor Qualicon’s BAX Salmonella kit en die van Perkin Elmer. De Probelia kit van Sanofi is AFNOR (Frans normalisatie instituut) gevalideerd. Dit garandeert echter niet altijd een hoge betrouwbaarheid van de test. Het is van belang vóór gebruik te controleren of de methode is gevalideerd voor het te testen voedingsmiddel en of de specificiteit getest is aan de hand van voldoende verschillende species. Figuur 4

Stappen in de Salmonella test van Qualicon

1. Homogeniseer 25 g monster in 225 ml ophopingsm edium. Incubeer 20 uur bij 37 °C. 2. V oeg 1 ml ophopingsmedium toe aan 9 ml BHI m edium . Incubeer 3 uur bij 37° C. 3. Voeg 5 µl BHI medium toe aan 200 µl lysis reagent. Incubeer 20 minuten bij 37 °C en vervolgens 10 minuten bij 95 °C. 4. Voeg 50 µl van het lysaat toe aan in de kit geleverde P C R r e a c t i e va a t j e s m e t d a a r i n g e d r o o g d e r e a g e n t i a . Voeg ook 50 µl toe aan het reactievaatj e m et de positieve controle. 5. Voer de PCR reactie uit in een thermocycler. 6. Voeg kleurstof toe en breng 10 µl van iedere reactie op een van te voren gegoten agarose gel. 7. Electroforeer gedurende 25 minuten bij 100 volt. 8. Fotografeer de gel en analyseer de resultaten.

De tests voor Salmonella verschillen in de werkwijze vóór de PCR-reactie niet veel van elkaar. Detectie van het gevormde PCR-product verschilt echter bij de verschillende kits. Detectie van PCR-product bij de Qualicon kit gebeurt op ‘standaard moleculair biologische manier’ door elektroforese in een agarose gel en kleuring van DNA met ethidiumbromide (zie Figuur 4). De Probelia kit van Sanofi gebruikt daarentegen een DNA-probe ter bevestiging van het gevormde PCR-product en detecteert deze met een kleurreactie.

blad 9 van 11


3.2

3.2.1

Ribotypering: een snelle methode voor stam identificatie en opsporen van besmettingsbronnen

Principe

Ribotypering is een DNA-typeringsmethode waarbij stamspecifieke DNA-patronen worden gegenereerd met behulp van een specifiek fragment van de ribosomale RNA-genen als merker, de zogenaamde probe. Hiertoe wordt het genoom van de bacterie met een DNAknip enzym in stukken geknipt. De ontstane fragmenten worden gescheiden op een elektroforese gel en vervolgens overgebracht op een filter. Na toevoeging van een universele ribosomale probe zal een binding ontstaan met de op de filter aanwezige specifieke fragmenten. Deze methode is universeel toepasbaar, omdat het ribosomale genetische materiaal in alle bacteriën aanwezig is. Veelal komt dit genetische materiaal in meerdere kopieën (2-10) voor in de bacteriecel. De geproduceerde patronen geven informatie over de identiteit van de bacterie. Naast de stam-specifieke fragmenten worden vaak ook banden aangetroffen die kenmerkend zijn voor geslacht en soort (zie Figuur 2). De methode heeft een goede resolutie nabij stamniveau en kan eenvoudig op grote aantallen bacterie-isolaten worden toegepast (160-200 per week). In circa acht uur kunnen patronen worden gegenereerd voor 8 isolaten. De methode is goed reproduceerbaar. Bij herhaalde analyse van een stam, zijn de patronen voor meer dan 95% identiek. Dit maakt een vergelijking van patronen van verschillende isolaten verzameld in de tijd mogelijk.

3.2.2

Identificatie

Voor identificatie en typering is het noodzakelijk reinculturen te verkrijgen uit de praktijkmonsters. Wanneer de bacterie-isolaten in de RiboPrinter® worden geanalyseerd, genereert ieder isolaat een genetische fingerprint, ofwel een RiboPrint ® patroon, dat automatisch wordt vergeleken met alle andere patronen van bacterie-isolaten die in de databank aanwezig zijn. De isolaten die sterk overeenkomstige genetische patronen hebben, worden automatisch in groepen bij elkaar geplaatst door de analyse-software van de RiboPrinter®. Deze groepen van patronen worden aangeduid als Ribogroepen. Voor iedere Ribogroep wordt een representatief patroon geproduceerd door de patronen van alle leden van de ribogroep te middelen. Ribogroepen worden geplaatst in de database, die wordt gebruikt om verschillende Ribogroepen met elkaar te vergelijken. Naarmate er meer bacterie-isolaten de revue passeren, wordt de database uitgebreid. In de huidige database zijn patronen van voedingsrelevante bacteriën, zoals Salmonella, Listeria, Staphylococcus, melkzuurbacteriën, bacilli, clostridia en Campylobacter, rijkelijk vertegenwoordigd. Dit maakt het systeem geschikt voor toepassing bij trouble-shooting in de voedselketen. De resultaten van Ribotypering worden doorgaans op twee verschillende niveaus geanalyseerd. Het eerste niveau wordt karakterisering of fijntypering genoemd en bestaat uit het indelen in en vergelijken van Ribogroepen zoals boven beschreven. Hierbij worden hoge eisen gesteld aan de mate van overeenkomst tussen de RiboPrint® patronen (similariteit) waarbij de grenswaarde is ingesteld op 95%. Deze ‘dynamische’ karakterisering levert doorgaans een indeling op stamniveau op. Het tweede niveau is de identificatie, waarbij de verkregen RiboPrint® patronen worden vergeleken met speciale ‘statistische’ identificatie databases. Identificatie is daarbij doorgaans op soort niveau of iets daaronder. Deze karakteristiek van de analyse is belangrijk voor de kwaliteitscontrole van bijvoorbeeld starterculturen. Maar ook het herhaald opduiken van een bepaald type bederforganisme in het productieproces kan door een match met patronen van eerdere isolaten in de database worden geconstateerd. Door de hoge mate van reproduceerbaarheid kan zo de historie van de aanwezigheid van bepaalde bacteriën in de productieketen duidelijk worden.

blad 10 van 11


4

LITERATUUR

1 Rivas, A.L; R.N. Gonzalez; M. Wiedmann; J.L. Bruce; E.M. Cole; G.J. Bennett; H.F. Schulte; D.J. Wilson; H.O.Mohammed; C.A. Batt. Diversity of Streptococcus agalactiae and Staphylococcus aureus ribotypes recovered from New York dairy herds Am. J. Veterinary Res. 58 (1997) 482-487 2 Skovgaard, N. and M. Jakobsen, M. (eds.) Rapid methods in meat microbiology, Advantages and drawbacks. ECCEAMST, Utrecht, The Netherlands, 1995 3 Wiedmann, M; T. Arvik; J.L. Bruce; J. Neubauer; F. Del Piero; M.C. Smith; J. Hurley; H.O. Mohammed; C. Batt. 1997. Investigationn of listeriosis epizootic in sheep in New York state Am. J. Veterinary Res. 58 (1995) 733-637 4 Wiedmann, M; J.L. Bruce; R. Knorr; M. Bodis; E.M. Cole; C.L. McDowell; P.L. McDonough; C.A. Batt. Ribotype Diversity of Listeria monocytogenes strains associated with outbreaks of listeriosis in ruminants. J. Clin. Microbiol. 34 (1996)1086-1090 5 Web site http://www.qualicon.com/index.html 6 Web site http://www.appliedbiosystems.com/search97cgi/s97_cgi

blad 11 van 11

De rol van de microbiologie in de vleeswarenindustrie

Recommend Documents