Chapter VII: Samenvatting
VII.Samenvatting De huidige wereldwijde dreiging van malaria, gecombineerd met de resistentieproblematiek en de moeizame vordering in de ontwikkeling van een vaccin vormen een sterke motivatie voor de ontwikkeling van nieuwe antimalariamiddelen. De non-mevalonaat pathway voor de biosynthese van isoprenoiden, welke levensbelangrijk is voor de pathogene Plasmodium parasiet maar afwezig in de mens, is een interessant en gevalideerd doel voor de ontwikkeling van nieuwe antimalariamiddelen. Fosmidomycine en zijn acetyl-analoog FR900098 inhiberen DXR, het tweede enzym in de nonmevalonaat pathway en fosmidomycine bleek reeds een veilig en effectief antimalariamiddel in combinatie met clindamycine of artesunaat in Fase III klinische studies. De voornaamste nadelen van fosmidomycine zijn zijn hoge polariteit en matige sterkte, die hoge dagelijkse dosissen nodig maken in de behandeling van malaria. Gedurende de voorbije tien jaar is een veelvoud aan fosmidomycinegebaseerd DXR-inhibitoren gesynthetiseerd en gepubliceerd, met het oog op de studie van het mechanisme van DXR en het ontwikkelen van krachtiger antimalariamiddelen. Een overzicht hiervan wordt gegeven in Hoofdstuk I, samen met een poging structuur-activiteitsrelaties bloot te leggen. In dit doctoraatswerk wordt de synthese beschreven van fosmidomycine-analogen waarvan, gebaseerd op deze gegevens, een sterke DXR inhibitie wordt verwacht. Hiertoe werden drie modificatiestrategieën van fosmidomycine/FR900098 uitgetest:
Eerst werd de α-halogenering van FR900098 verkend als strategie om de zuursterkte van de fosfonaatgroep te verhogen en een beter fosfaat-analoog te bekomen, wat moet leiden tot een sterkere inhibitie van DXR (Hoofdstuk III). Diëthyl butenylfosfonaat 1 werd daartoe omgezet in de veelzijdige bouwstenen 2a en 2b (Figuur VII.1) door middel van een literatuurgebaseerde procedure voor de elektrofiele α-halogenering van alkylfosfonaten. Deze bouwstenen dienden voor de synthese van α-monochloro en α-monofluoro FR900098 analogen 3a en 3b, en ook voor synthese van α-monofluoro omgekeerd hydroxamaat 4.
VII.1
Chapter VII: Samenvatting
O NH4O P NH4O O EtO P EtO
X 3a X = Cl 3b X = F
O EtO P EtO O NH4O P NH4O
X 2a X = Cl 2b X = F
1
OH N O
O N
OH
F 4 O O O O
O O P O
OH N O F
5 O O O O O
O
O O P O
OH N O F
6
O EtO P EtO F F
OH N O 7
O HO P HO F F
OH N O 8
Figuur VI.1: Ontwikkeling van α-gehalogeneerde analogen van FR900098
Veel aandacht werd besteed aan de synthese van α,α-difluoro FR900098 (8), maar finale ontscherming van precursor 7 leidde steevast tot snelle hydrolyse van de retrohydroxamaatfunctionaliteit, mogelijks onder invloed van (of versneld door) de zure α,α-difluorofosfonaatgroep. De veronderstelde daling in pKa2 van de fosfonaatgroep in de α-monogehalogeneerde analogen werd aangetoond met behulp van een zuur-base titratie opgevolgd mbv 31P-NMR . In biologische VII.2
Chapter VII: Samenvatting testen vertoonden alledrie de gehalogeneerde vrije fosfonzuren een verhoogde DXR inhibitie en een sterker antimalaria effect dan moedermolecule fosmidomycine. Gevolg gevend aan deze hoopvolle resultaten werd een synthesestrategie op punt gesteld voor twee prodrugs van α-fluoro FR900098 (3b): de bis-POM ester (5) en bis-carbonaat 6. Deze moleculen vertoonden de sterkste in vitro antimalaria activiteit totnogtoe voor fosmidomycine-gebaseerde DXR inhibitoren. Opschaling van deze analogen voor in vivo tests is nu zeer wenselijk.
De retrohydroxamaatgroep van fosmidomycine/FR900098 draagt in belangrijke mate bij tot de algemene bindingsaffiniteit voor DXR, en modificatie van deze functionaliteit leidde totnogtoe in quasi alle gevallen tot grote verliezen in DXR inhibitie. Nochtans zou het incorporeren van de (retro)hydroxamaatgroep in een vierledige ringstructuur (een N-hydroxyazetidinon, NHA) ervoor zorgen dat het (retro)hydroxamaat wordt vastgezet in zijn actieve (metaalbindende) conformatie. Dit zou moeten leiden tot een hogere activiteit voor zulk analoog terwijl de sterische hinder veroorzaakt door de modificatie eerder beperkt is. In Hoofdstuk IV wordt de ontwikkeling beschreven van een syntheseroute voor het 4-(ω-fosfonoethyl)-NHA (of ‘retrohydroxamaat N-hydroxybetalactam’) analoog, gekenmerkt door één finale ontschermingsstap onder milde condities (Figuur VII.2).
O
O BnO P BnO
O 9
O BnO P BnO
OH O N H
OBn
OH N
O HO P HO
10
O 11
Figuur VII.2: Ontwikkeling van een conformationeel verstard FR900098 analoog
Helaas bleek 11 bijzonder hydrolysegevoelig te zijn. De lage activiteit die in vitro werd waargenomen is mogelijk het gevolg van een snelle hydrolytische afbraak tijdens de test. Anderzijds is het ook mogelijk dat een goede interactie van 11 met DXR wordt belet door sterische hinder, aangezien eerder werd aangetoond dat γ-methylfosmidomycine geen DXR inhiberende activiteit
VII.3
Chapter VII: Samenvatting bezit. Gezien de inherente, hoge hydrolysegevoeligheid van de NHA-structuur werd besloten de synthese van het 3-(ω-fosfonoethyl)-NHA (of ‘hydroxamaat N-hydroxybetalactam’) te staken.
Het derde grote deel van dit werk, beschreven in Hoofdstuk V, omvat een poging tot uitbreiding van de succesvolle reeks van α-arylfosmidomycines. Divergente α-substitutie werd hier mogelijk gemaakt door invoeren van een hydroxyl- of aminegroep op de α-koolstof van FR900098. Alle voorziene analogen werden gesynthetiseerd in slechts enkele stappen en in goede rendementen uitgaande van gemeenschappelijk aldehyde bouwsteen 12 (Figuur VII.3). Een snelle methode voor de synthese van dit aldehyde in hoog rendement werd eveneens ontwikkeld.
O BnO P BnO
OBn N O
N
O
O HO P HO
O
NH2 13
O HO P HO HN
OBn
OH N O N3
12
OH N O
O BnO P BnO
O
18
OBn N O OH
OH N O
N N N
14
R
O HO P HO
R 17a: R = H 17b: R = tBu 17c: R = Ph
15a: R = Ph 15b: R = NHPh OH N O
O HO P HO O
R 16a: R = H 16b: R = Me 16c: R = Ph
Figuur VII.3: Ontwikkeling van α-heteroatoom gebaseerde analogen van FR900098
De gesynthetiseerde en geteste analogen kunnen worden ingedeeld in vier grote klassen:
VII.4
Chapter VII: Samenvatting 1. Het α-benzamide 15a en α-phenylureumderivaat 15b bleken noch EcDXR te inhiberen, noch de groei van P. falciparum te remmen.
2. Het α-hydroxy analoog van FR900098 (16a) vertoonde behoorlijke EcDXR inhibitie en P. falciparum groei-inhibitie, terwijl de corresponderende methyl en fenyl ethers (16b, 16c) nagenoeg inactief bleken.
3. Tot onze verbazing onderdrukte geen enkele van de α-triazolyl analogen 17a, 17b en 17c de groei van P. falciparum en vertoonde enkel t-butyl triazol 17b inhibitie van EcDXR (zij het eerder zwak). Waarschijnlijk is de triazolfunctionaliteit in deze moleculen te elektronenrijk om de π-π-stapelingsinteractie met Trp211 van het enzym aan te gaan die de binding van voornoemde α-arylanaloga versterkt .
4. Het α-azido FR900098 (18) vertoonde de hoogste activiteit in deze reeks analogen: het verslaat zowel fosmidomycine als FR900098 in EcDXR inhibitie en is bijna even sterk als fosmidomycine in het afremmen van de groei van P. falciparum. Daarenboven is dit het eerste fosmidomycine-analoog dat een rigiede, lineaire, heteroatoom-gebaseerde α-substituent draagt. Mogelijks dankt het zijn verhoogde activiteit aan het halogeennabootsend effect van het azide, nl. de verhoging van de zuursterkte van de fosfonaatgroep. Nieuwe interacties met het enzym zijn evenwel niet uit te sluiten, en X-straal onderzoek zouden hier meer inzicht kunnen verschaffen. De unieke reactiviteit van de azidogroep in deze sterke DXR-inhibitor opent verder ook de deur naar targetguided, in situ click-chemie voor het identificeren van nieuwe bindingspartners voor de flexibele lus van DXR, bv voor interactie met zijketens van de aminozuren naast Trp211. Deze aanpak bestaat erin het DXR/3 complex te incuberen met een reeks acetyleenreagentia en werd reeds met succes toegepast in de ontdekking van acetylcholinesterase (AChE) inhbitoren.
VII.5
Chapter VII: Samenvatting Als besluit kan worden gesteld dat tijdens dit doctoraatswerk nieuwe en potente inhibitoren van DXR werden ontwikkeld die kunnen leiden tot nieuwe antimalariamiddelen. Het invoeren van een halogeen of een azidegroep in α-positie van het fosfonaat van FR900098 leidde tot de meest interessante DXR inhibitoren, en het formuleren van prodrugs versterkte het antimalaria effect van α-fluor FR900098 in belangrijke mate. Verder onderzoek naar zulke fosfonaatprodrugs en de binding van het α-azide analoog aan DXR is wenselijk.
VII.6
