Cytologie y g Buněčné jádro
Jindřiška Fišerová, Ph.D. Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i
Cíle přednášky Cíle přednášky • Prozkoumat význam jádra • Pochopit principy a mechanismy jaderného fungování
F k jádra Funkce jád • Uchování a přenos p ggenetické informace • Transkripce DNA (syntéza mRNA, tRNA, rRNA) DNA (syntéza mRNA tRNA rRNA) • Sestřih RNA • Oprava poškozené DNA
STRUKTURA, ORGANIZACE, FUNKCE
Periferie
Transport Chromatin a chromosomy
Cíle přednášky Cíle přednášky • Prozkoumat význam jádra • Pochopit principy a mechanismy jaderného f fungování á í • Porozumět vztahu mezi současnými poznatky a metodologií výzkumu t d l ií ý k
1632‐1723
1804‐1881
1849‐1922
1821‐1902
M. Schleiden 30. léta 19. st A. Van Leeuvenhoek
R Wi h R. Wirchow 1866‐1925 1866 1925
1876 O. Hertwig 1822‐1884
50. léta 19. st G. Mendel
1900 T. H. Morgan
1953 Watson and Crick
Metody výzkumu y ý ‐ fotografie ‐ zvýraznění ‐ video ‐ extrakce ‐ fígle a triky fígle a triky
Metody výzkumu Metody výzkumu • Elektronová mikroskopie transmisní ‐ TEM • Elektronová mikroskopie skenovací ‐ SEM • Mikroskopie fluorescenční: FISH, Mikroskopie fluorescenční: FISH imunofluorescence • Super‐rezoluční mikroskopie SIM, STED, PALM, STORM • Imunoprecipitace (ChIP, ChIP‐Chip, ChIP‐seq) • Genové manipulace, DamID fůze G é i l D ID fů
Elektronová mikroskopie – jak f funguje? j ?
TEM a SEM dávají odlišnou informaci 2D projekce tenkého řezu 2D projekce tenkého řezu
Tomografie!!!! – fi !!!! umožňuje žň j 3D rekonstrukci
vždy 3D obraz povrchových vždy 3D obraz povrchových struktur
TEM SEM • • • • •
Fixace Dehydratace Zalití do pryskyřice Zalití do pryskyřice Řezání Zvýraznění kovem
• Fixace • Dehydratace
• Sušení • Pokovení P k í
Cílené značení ‐ Immunogold labelling
CRYO elektronová mikroskopie CRYO elektronová mikroskopie • Vzorek pozorujeme stále hl b hluboce zmrazený! ý! Výhody: • perfektní fixace i rozlišení • zachovány ultrastruktury
Nevýhody: • drahá aparatura, • velmi náročné technicky i velmi náročné technicky i finančně • vzorek málo kontrastní
CRYO TEM
TEM
3D TEM: Trojrozměrné zobrazení pomocí 3D TEM: Trojrozměrné zobrazení pomocí EM neboli elektronová TOMOGRAFIE
Sbírání dat – natáčením 1 objektu • Tloušťka řezů 150‐300 nm – dle možnosti EM ‐ napětí (alespoň 400kV) • Série projekcí řezů otočených +/‐ Série projekcí řezů otočených +/ 60‐80° 60 80°
Tomogram
Tomogram
Segmentace a mapování struktur Segmentace a mapování struktur
Beck et. al 2004, Science
Super resolution‐ superrezoluční mikroskopie • Na principech fluorescenční mikroskopie • Různými způsoby překračuje rozlišení Rů nými působ překrač je ro lišení světelné s ětelné mikroskopie • Rozlišení, Abbe limit, point spread function (PSF) • 4Pi, PALM, STORM, SIM, STED 4Pi PALM STORM SIM STED
Schermelleh et al. 2010, J. Cell Biol. Vol. 190 No. 2 165–175
Schermelleh et al. 2010, J. Cell Biol. Vol. 190 No. 2 165–175
DAPI CENPE TPR
STED images of HeLa STED images of HeLa
Nup62 TPR
Fišerová J, 2015, unpublished
FISH: fluorescence in situ hybridisation FISH: fluorescence in situ hybridisation Zjišťuje přítomnost a polohu DNA sekvence na chromosomu. Fluorescenční barvička + specificka barvička + specificka sekvence oligonukleotidu. Naváže se specificky k DNA chromosomu Používa se při detekci chromosomálních přestaveb a zlomů, druhové identifikaci, expresní profil buněk a tkání. buněk a tkání
Chromatin immunoprecipitation, ChIP
Identifikace DNA vazebních míst pro konkrétní proteiny
Mapa interakcí DNA‐protein
IN VIVO
ChIP chip ChIP seq ChIP‐chip, ChIP‐seq
Procesy interfázních jader
http://www.dnalc.org/resources/3d/DNARepliationBasic_w_FX.html
F k jádra Funkce jád • Uchování a přenos p ggenetické informace • Transkripce DNA (syntéza mRNA, tRNA, rRNA) DNA (syntéza mRNA tRNA rRNA) • Sestřih RNA • Oprava poškozené DNA
C‐value a C‐paradox p • C‐value: kompletní množství DNA v haploidním genomu • Zvyšující se komplexita organismu nutně neznamená větší genom! • • • • •
Sc: 12,495,682bp Dm: 122,653,977 At 115,409,949 At: 115 409 949 Rýže 3.9 x 108 9 Hs: 3.3 x 10 3 3 x 109
5770 genů 13,379 28 000 28,000 37,544 20 500 20,500
2n = 32 chromosomů 8 10 10 24 46
• Tulipán, pšenice, žito Tulipán pšenice žito ‐ 10x více DNA než člověk. Zvyšování 10x více DNA než člověk Zvyšování ploidie!! Tabák – 4n = 48 Pšenice, žito, ‐ 6n Pšenice, žito, 6n = 42 42
Organisace g ggenomu Gen – kompletní sekvence nukleové kyseliny Gen kompletní sekvence nukleové kyseliny nezbytná k syntéze funkčního produktu Lineární molekula DNA, 100x delší než buňka Lineární molekula DNA 100x delší než buňka – sbalování !!! sbalování !!!
1. Jakým způsobem je organisována DNA 2 Jakým způsobem je jádro organisováno 2. Jakým způsobem je jádro organisováno
Struktura a organisace g b. jádra j Interfáze: Chromatin ‐ DNA + protein Euchromatin ‐ aktivní Heterochromatin – „nečinný Heterochromatin „nečinný“,, konstitutivní, fakultativní Silencing – při diferenciaci Mitoza: chromosomy J d á Jaderná matrix (nukleoplasma) – t i ( kl l ) skelet? k l t? Jaderná obálka + jaderné póry 1 μM 6‐10 μM 6 10 M Asi 10% buněčného objemu
Vnitřní kompartmentalizace jádra!!! Kompartmenty bez membrány: jadérko
Chromatin, chromosomy
http://www.dnalc.org/resources/3d/DNAWrapAdvanced06.html
Chromatin
Extrakce pomocí solí – korálky na niti: Linker DNA + nukleosomy
Nukleosom • • • •
Základní strukturní a funkční jednotka chromatinu DNA kol oktamerového jádra histonů DNA kol oktamerového jádra histonů 10 nm, 1 2/3 otáčky Histony: rodina malých bazických proteinů, hlavní typy H1, H2A, H2B, H3, H4
Shama et al. 2007., Biophys J. Luger et al. 1997, Nature
Histone code ‐ Zašifrované konce
H3K4me2, Ac aktivní chromatin H3K9me2+3 neaktivní chromatin H3K27me3 H3K27me3 neaktivní chromatin, neaktivní chromatin, inaktivace X‐chromosomu H3K36me3 H3K36me3 neaktivní chromatin neaktivní chromatin
Histone acetyltransferáza
Histone deacetyláza Histone deacetyláza Histone metyltransferáza Chromodoména Chromoshadow doména
Hraniční elementy!
Cik‐Cak model šroubovice
Woodcock et al. 1984, JCB
Solenoid
Robinson et al. 2006, PNAS
Vyšší struktury chromatinu y y Nehistonové proteiny – lešení + integrita DNA SARs/MARs (Scafold associated regions/Matrix associated regions) ‐ úseky mezi transkripčně aktivními smyčkami ‐ pomocí in situ hybridizace pomocí in situ hybridizace ‐ smyčky 1‐4 Mb dlouhé
Insulátory – isolují od sebe jednotlivé transkripční jednotky, SARs/MARs mohou fungovat jako insulátory
Chromosomální teritoria – chromosom není volně „rozprsknut“ skrz jádro
SMC proteiny (structure maintenance of chromosome proteins)
mohou svázat 2 30nm vlákna dohromady Asociují s chromatinem mezi geny Asociují s chromatinem mezi geny Struktura chromosomů!
Chromosom • 2 chromatidy spojené centromerou • telomery • Pro replikaci musí každý chromosom obsahovat: origin, centromera, telomery origin, centromera, telomery • U vyšších eukaryot se na centromeře tvoří kinetochor • Po mitose chromosomy dekondensují jen částečně Po mitose chromosom dekondens jí jen částečně • Jen velmi malá frakce dekondensuje na 10‐30nm vlákno • Chromosomální teritoria
Buněčný cyklus Buněčný cyklus
Chromosomal territories (CT) Chromosomal territories (CT) • Jednotlivé chromosomy v jádře zaujímají konkrétní polohu – CT • Chromocentrum (heterochromatin) organisuje CT • CT velmi dynamická, mezi buňkami si neodpovídají, nepřekrývají se
Cremer and Cremmer 2001, Nat. Rev. Genet.
Gene rich Gene poor
Lymfocyt člověka
Cremer and Cremmer 2001, Nat. Rev. Genet.
Model organisace chromatinu v rámci chromosomálních teritorií chromosomálních teritorií
Nenáhodná poloha genů uvnitř jádra!!!
P. Fransz
Arabidopsis p Heterochromatin Chromocentrum
Exner and Hennig 2008, Curr. Opin. Plant Biol.
pšenice 100x větší genom!!
Shaw et al. 2002, J. Struct. Biol
• Jaderné kompartmenty • Jaderná periferie • Jaderný transport
Jadérko – továrna na ribosomy továrna na ribosomy
Sirri et al. 2008, Histochem. Cell Biol
700 proteinů, 150 sno RNAs, 2 RNP ů Tvořeno rDNA několika chromosomů Podléhá buněčnému cyklu Podléhá buněčnému cyklu
FC Fibrilar component DFC dense fibrilar component GC Granular component p
Arabidopsis nucleoli
Tobacco BY 2 nucleoli Tobacco BY‐2 nucleoli
Cajal bodies coilin
Clastosome
Cleavage body Cleavage body Nuclear speckles SC35, SF/ASF
OPT doména OPT doména Paraspeckles Perinucleolar compartment PML tělíska PML
Stresová tělíska
Polycomb Spector 2006, Cell
Periferie jádra j
• Velmi Velmi heterogení heterogení • Mikrodomény různé funkce a složení • Oblasti heterochromatinu, ztišených genů – radiální organisace jádra á
Periferní mikrodomény
DamID fuze – odhalila lamin associated domains (LADs) LADs: cca 500 kb dlouhé úseky DNA, genově chudé Telomery a subtelomery blízko jaderné periferie Telomery a subtelomery blízko jaderné periferie Represivní podmínky k expresi x i zde permisivní domény
KASH domain proteins: KASH doména cca 30 AA, role při umístění jádra v buňce, ONM SUN domain proteins, INM. Nalezeny i u rostlin!!!!! Přemosťují jadernou obálku – LINC (linker of nucleoskeleton and cytoskeleton) Přemosťují jadernou obálku – LINC (linker of nucleoskeleton and cytoskeleton)
Jaderná lamina
• Intermediární filamenta typu V • V těsné vazbě na INM (inner nuclear membrane)
Laminy • ~ 66 kDa • Laminy typu B B – ve všech buňkách ve všech buňkách • Laminy typu A – v diferencovaných buňkách
Nuclear envelope structure and function
Funkce laminy Funkce laminy
•Kotví proteiny INM a ONM •Kotví telomery •Organisuje chromatin •Regulace transkripce, umlčování g p , •Kotví jaderné póry •Organisuje Organisuje cytoskelet cytoskelet Starr et al. 2007
Laminy u rostlin? y • 80th ‐ 90th: • Jádra cibule Jád ib l
Yu et al. Exp. Cell Res. 1999 p
• Imunolokalizace: lamin‐like proteiny v jádrech cibule a hrachu Anti‐chicken lamin in onion
Anti‐human lamin B in pea
Minguez et al., JCS 1993
McNaulty and Saunders, JCS 1993
Lamin‐like proteiny u rostlin: NMCP1 alias LINC Bioinformatika: • NE lamin‐kódující geny, ale: • NMCP1 z mrkve, LITTLE NUCLEI (LINC) v Arabidopsis 134 kDa protein matrix
Arabidopsis mutanty wt
linc1 linc2
Dittmer et al. 2007, Plant Cell
Plant lamina – PLAMINA?
Fiserova et al. (2009), Plant J.
Transport dovnitř a ven z jádra
Based on EM observations
Jaderné p póryy
Struktura póru Struktura póru
Cytoplasmatická vlákna/fibrily y p / y Centrální část ‐ ??? Jaderný košíček Osmičetná symetrie
Nucleoporiny, Nups Nucleoporiny Nups 30 Nups ‐ 450/NPC
FG‐Nups
Alber et al. 2007, Nature
Devos et al. 2003
FG Nups obsahují FG‐domény FG‐Nups obsahují FG domény Tzn. bohaté na Phe a Gly
http://sspatel.googlepages.com/nuclearporecomplex
Transport dovnitř a ven z jádra
Cyklus RanGTPázy y y
Transportní mechanismus? Transportní mechanismus? Jak je udržována permeabilní bariéra? 1. hydrogel, síto
2. „brush‐like“ model ‐ energie
Jaderné póry u rostlin Jaderné póry u rostlin Identifikace Nups: Identifikace Nups: • Mutantní rostliny Arabidopsis ‐ cca 1/3 Nups • Proteomika – většina Nups
Nups rostlin Nups rostlin
Tamura 2010
Plant nuclear pores: What the mutants tell us? What the mutants tell us? Mutantní Arabidopsis • • • • • •
Interakce rostlina‐bakterie Resistence k patogenům Hormonální poruchy (auxin) Tolerance k chladu Množství vývojových vad Defekt mRNA exportu
Parry et al. 2006, Plant Cell
Jacob et al. 2007, Plant Physiol
Buňky tabáku BY 2 Buňky tabáku, BY‐2
Jádra tabákových buněk BY‐2 Skenovací elektronový mikroskop SEM Skenovací elektronový mikroskop SEM
1 m
1 m Fišerová et al. (2009), Plant J.
Jaderné póry v buňkách BY‐2 p y Pohled z jádra Pohled z cytoplasmy hl d l
Fiserova et al. (2009), Plant J.
Xenopus pore Fišerová et al. (2009), Plant J.
NPC organisation over NE in 10‐day‐old cells ll
Fišerová et al. (2009), Plant J.
Jaderné dělení
Prophase
Anaphase A
Prometaphase
Anaphase B Anaphase B
Metaphase
Telophase
Scholey et al. 2003, Nature
Rozpad a obnovení jaderné membrány vyšší eukaryota
y , y nižší eukaryota, houby
rostliny živočichové
S. pombe S. cerevisiae
Drosophilla C. elegans
Aspergillus p g Guttinger et al. 2009, Nat Rev.
NEBD, nuclear envelope break down
HeLa Guttinger et al. 2009,Nat Rev.
Sestavení jaderné membrány
H L HeLa Guttinger et al. 2009, Nat. Rev.
Poruchy, defekty a vývojové vady Poškození laminy • Laminopathie p • Muscle disorders • Peripheral h l neuropathies • Progerias • Tumor progression T i • Předčasné stárnutí
