Co-culturen van fibroblasten en endotheel met het oog op endotheel specifieke adhesie op biomaterialen
Astrid Verschueren
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. R. Cornelissen Begeleidster: Karolien Gellynck Vakgroep: Medische basiswetenschappen Dienst histologie 6B3
Academiejaar 2011-2012
! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
!
! !
Co-culturen van fibroblasten en endotheel met het oog op endotheel specifieke adhesie op biomaterialen
Astrid Verschueren
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. R. Cornelissen Begeleidster: Karolien Gellynck Vakgroep: Medische basiswetenschappen Dienst histologie 6B3
Academiejaar 2011-2012
!
TOELATING TOT BRUIKLEEN
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
Datum
Astrid Verschueren
!
Prof. Dr. R. Cornelissen
AFKORTINGEN ! ! AA: Ascorbic Acid (Ascorbinezuur) AL: AntiLichaam BBE: Bovine Brain Extract (with heparin) BSA: Bovine Serum Albumin CaAM: Calceïne- AcetoxyMethyl CTB: Cell Tracker Blue CTR: Cell Tracker Red D: Dopamine DAPI: 4',6-DiAmidino-2-PhenylIndole, kernkleuring DG: Dopamine/gelatine DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO: DiMethylSulfOxide (cryoprotectant) EGM 1/2: Endothelial Growth Medium 1/2 FACS: Fluorescence Activating Cell Sorting F/C: Fase contrast FCS: Foetal Calf Serum FITC:: Fluorescein IsoThioCyanate FITC-TR: Fluorescein IsoThioCyanate-TexassRed GA-1000: Gentamicine, Amphotericin B GFP-HUVEC: Green Fluorescent Protein- Human Umbilical Vein Endothelial Cell (getransfecteerd- geeïmortaliseerd) GFP: Green Fluorescent Protein GlucoSens: Continuous Glucose monitoring using implantable single-chip optical sensors hEGF: human Endothelial Growth Factor HEPES: 4-(2-HydroxyEthyl)-1-PiperazineEthaneSulfonic acid HUVEC: Human Umbilical Vein Endothelial Cell ICAM-1: intercellular adhesion molecule 1 MTT: 3-(4,5-diMeThythiazol- 2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazolium bromide NGS: Normal Goat Serum NRS: Normal Rabbit Serum
NSS: Normal Swine Serum P/S: Peneciline/ Streptavidine PBS: Phosphate buffered Saline PDMS: PolyDiMethylSiloxane PECAM-1/ CD-31: Platelet/ Endothelial cell adhesion molecule-1 PMMA: PolyMethylMetAcrylaat R3-IGF-1: long Recombinant Insuline Growth Factor-1 RPM: Rotations per minute SFM: Serum Free Medium TNS: Trypsine Neutralising Solution VE-cadherine: Vascular Endothelial Cadherine VCAM-1: Vascular Cell Adhesion Molecule 1 VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor VWF: Von Willebrand Vactor WHO: World Health Organisation ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
VOORWOORD Deze masterproef werd geschreven om de titel ‘master in de biomedische wetenschappen’ te bekomen. Graag zou ik daarom enkele mensen willen bedanken. Als eerste wil ik Professor M. Cornelissen bedanken voor de begeleiding en voor het gebruik van het steriele labo en alle toestellen en materialen. Daarnaast wil ik vooral mijn begeleidster Karolien Gellynck bedanken. Bedankt voor de fijne samenwerking en de goede begeleiding gedurende dit jaar. Soms ging het er bij ons wel eens chaotisch aan toe, maar toch slaagden we erin om terug rust en helderheid te creëren! Daarnaast wil ik nog Leen, Johanna, Greet, Sylvia, Heidi, Toke, Elien, Elke en Julie bedanken voor alle hulp en de fijne gesprekken in de keuken! Ook wil ik nog de andere thesisstudenten, Tine, Mattias, Annelies en Eva bedanken voor de fijne momenten in het teaching lab! Ook mijn vriendinnen Lien en Saskia verdienen een dankwoordje. We zijn samen in het 1ste jaar begonnen, en studeren nu ook samen af! We hebben zeer veel leuke momenten gehad, veel gezaagd tegen elkaar, maar ook elkaar gesteund op moeilijke momenten! En kijk, we hebben het zowaar samen gehaald! Vervolgens zou ik graag mijn ouders, en mijn zus Melissa willen bedanken voor hun steun en toeverlaat tijdens mijn 5 jaar durende opleiding. Voornamelijk tijdens de examenperiodes kregen zij het dikwijls zwaar te verduren. Mijn laatste dankwoorden gaan naar mijn vriend, Thijs. Hij is mij blijven steunen en liefhebben ook op momenten dat ik het hem knap lastig maakte. Ook wil ik hem nog bedanken voor zijn extra hulp bij het gebruik van bepaalde computerprogramma’s. Bedankt iedereen, Astrid
INHOUDSTAFEL !"#$%&"''(%)*+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*,! ,+*(%-$(.(%)*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*/! ,+,+*0123-$$#!'$--(%)*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*/! ,+/*42%'(%5$*)-542!$#2%('21(%)*#+3+&+*!$%!21$%*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*/! "#$#"#!%&'()*+!,+-+(-.+/!+&+(-0)(1+2.*(1+!2+-1),+!############################################################!3! "#$#$#!%&'()*+!,+-+(-.+/!)4-.*(1+!2+-1),+!####################################################################################!3! ,+6+*-24"-(!"'($*&"%*.$*!$%!21*+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*7! ,+7+*3$-"%)*&"%*&"!45-"1(!"'($*+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*8! ,+8+*3$-"%)*&"%*9$'*3(2#"'$1(""-*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*:! ,+:+*42;45-'551<*=(3123-"!'$%*$%*$%.2'9$$-*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*:! "#5#"#!6+4+07.8%+8!9:8!+8,)-1++&!########################################################################################################!5! "#5#$#!*+&+(-.+!9:8!1+-!%+4:*-+!2+,.'2!.8!();('&-''0!#########################################################!+*#2.(=(4"'($*&"%*$$%*3(2#"'$1(""-*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*?! "#<#"#!()9:&+8-+!9+0*'*!8.+-;()9:&+8-+!7)44+&.8%!################################################################!=! "#<#$#!)44+09&:7-+!2),.>.(:-.+!-+(18.+7+8!##################################################################################!=! "#<#3#!1+-!6+&:8%!9:8!+8,)-1++&*4+(.>.+7+!&.%:8,+8!9))0!2),.>.(:-.+!###############!?! "#<#@#!7:0:7-+0.*:-.+!9:8!,+!9+0*(1.&&+8,+!(+&-A4+*!.8!();('&-''0!####################!"B! ,+?+*-"3$-$%*&"%*$$%*42;45-'551*+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*,,! "#=#"#!&:6+&+8!2#6#9#!9.:6.&.-+.-*2+07+0*!######################################################################################!""! "#=#$#!&:6+&+8!2#6#9#!%>4;-0:8*>+(-.+!################################################################################################!"$! ,+@+*&("3(-('$('!*"!!"A!*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*,6! "#?#"#!2--!:**:A!###################################################################################################################################################!"3! "#?#$#!40+*-)6&'+!0+:%+8-!#########################################################################################################################!"3! ,+,B+*.2$-*&"%*.$C$*#"!'$1012$=*+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*,7! /+*#"'$1("-$%*D*#$'92.$%*+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*,8! /+,+*)$315(E'$**"00"1"'551F!2='G"1$*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*,8! /+/+*20'(#"-(!"'($*45-'5512#!'"%.()9$.$%*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*,8! $#$#"#!(+&-A4+*!######################################################################################################################################################!"C! $#$#$#!('&-''02+,.:!########################################################################################################################################!"5! $#$#3#!(+&&+8!*4&.-*+8D!&)*2:7+8!#########################################################################################################!"5! $#$#3#"#!-EFGHIJD>(*!###########################################################################################################################################################!"5! $#$#3#$#!&KILM!(NKIJOHPG!0JMQJIO4MPR-2!#################################################################################################################!".60)6&:*-+8!+8!+8,)-1++&!#######################################################!".(++0,+!2:-+0.:&+8!#################################################################!$B! /+7+*-"3$-$%*&"%*$$%*42;45-'551*+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*/,! $#@#"#!7+'S+!9:8!,+!9.:6.&.-+.-*2+07+0!9))0!+&7!(+&-A4+!###############################################!$"! $#@#"#"#!2JO\KVJ!###################################################################################################################################################################!$"! $#@#$#!();('&-''0/!%+&:6+&,+!>.60)6&:*-+8!+8!%+-0:8*>+(-++0,+!)>! %+&:6+&,+!1'9+(!##############################################################################################################################################!$$! $#@#$#"!2JO\KVJ/!9HMYHNHOJHOGUJERJE!(-0!]^HYEKYNMGOJI_!###################################################################################!$$! $#@#$#$#!2JO\KVJ/!9HMYHNHOJHOGUJERJE!(M:2!]JIVKO\JJN_!####################################################################################!$$! $#@#$#3#!2JO\KVJ/!%>4;OEMIG^JPOHJ!################################################################################################################################!$3! $#@#$#@#!(K;PWNOWWE!OWGGJI!(-0!^HYEKYNMGOJI!JI!%>4!QJOEMIG^JPOJJEVJ!1'9+(!########################################!$@!
!
!
!
/+8+*&("3(-('$('!*"!!"A!*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*/7! $#C#"#!2--!:**:A!###################################################################################################################################################!$@! $#C#$#!40+*-)6&'+!0+:%+8-!#########################################################################################################################!$C! $#C#3#!9+0%+&.`7.8%!2--!9*!40+*-)6&'+!#############################################################################################!$C! /+:+*!'"'(!'(!49$*"%"-A!$*+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*/:!
6+*1$!5-'"'$%*D*42%4-5!($!*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*/>! 6+,+*20'(#"-(!"'($*45-'5512#!'"%.()9$.$%*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*/>! 3#"#"#!(+&&+8!*4&.-*+8D&)*2:7+8/!-0A4*.8+!9*!0+:%+8-4:(7!##########################################!$.60)6&:*-+8!+8!+8,)-1++&!################!$=! 6+/+*-"3$-$%*&"%*4$--$%*#+3+&+*&("3(-('$('!#$1E$1!*2=*'1"%!=$4'($*+++++++++++++++++++*/@! 3#$#"#!9+0%+&.`7.8%!9.:6.&.-+.-*2+07+0*!(-0!a!(-6!a!(M:2!#################################################!$?! 3#$#$#!%>4;-0:8*>+(-.+!9:8!+8,)-1++&!#############################################################################################!3B! 3#$#3#!&:6+&.8%!9:8!++8!();('&-''0!####################################################################################################!3"! 3#$#3#"#!(-0!QJNMYJNVJ!^HYEKYNMGOJI!JI!%>4;QJOEMIG^JPOJJEVJ!1'9+(!########################################################!3"! 3#$#3#$#!(-0!QJNMYJNVJ!^HYEKYNMGOJI!JI!(M:2!QJNMYJNVJ!1'9+(!####################################################################!3"! 6+6+*42;45-'551<*=(3123-"!'$%*$%*$%.2'9$$-*+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*6,! 3#3#"#!();('&-''0/!1>>!+8!%>4;%+-0:8*>+(-++0,+!1'9+(!####################################################!3"! 3#3#"#"#!6JZMNHIQ![MI!VJ!ZEKNH^JEMOHJPMZMPHOJHO!#######################################################################################################!3"! 3#3#"#$#!6JZMNHIQ!1>>D!1'9+(![JE\KWVHIQ!##############################################################################################################!3$! 3#3#$#!();('&-''0/!(-0!1>>!+8!(M:2!1'9+(!######################################################################################!3@! 3#3#$#"#!6JZMNHIQ![MI!VJ!ZEKNH^JEMOHJPMZMPHOJHO!#######################################################################################################!3@! 3#3#$#$#!6JZMNHIQ!1>>D!1'9+(![JE\KWVHIQ!##############################################################################################################!3C! 6+7+*#2.(=(4"'($*&"%*$$%*3(2#"'$1(""-*+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*6>! 3#@#"#!7:0:7-+0.*:-.+!9:8!(+&&+8!9.:!.22'8)1.*-)(1+2.*(1!7&+'0+8!##################!3.(++0,!6.)2:-+0.::&!################################################################!3=! 6+8+*&("3(-('$('!*"!!"A!*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*7B! 3#C#"#!9+0%+&.`7.8%!2--!:**:A!9*!40+*-)6&'+!##############################################################################!@B! 3#C#$#!&:6+&.8%!1>>!2+-!,'66+&+!()8(+8-0:-.+!(-0!##############################################################!@"! 7+*3$!01$E(%)*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*76! 8+*"-)$#$$%*3$!-5('*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*78! :+*1$=$1$%'($!*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*7:! >+*3(H-")$%;*=2'21$$E!$%*++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++*!
!
SAMENVATTING ! Diabetes is een ernstige aandoening die in de loop van de tijd steeds meer mensen zal treffen. Een efficiënte behandeling is dan ook van zeer groot belang wil men complicaties zo veel mogelijk onderdrukken. Om dit te kunnen bereiken dient men zo snel mogelijk te reageren op veranderingen van de glucose waarden in het bloed. Het vinden van een methode om aan continue glucose monitoring te doen zou dan ook een belangrijke stap zijn in het ontwikkelen van een efficiëntere behandeling. Deze masterproef handelt in een groter project: Glucosens. Daarbij wil men met behulp van een sensor die is ingebracht in een biomateriaal (PMMA, PDMS) de glucosewaarden meten. Uit de literatuur kon worden afgeleid dat deze sensoren overgroeid werden door een fibreus bindweefselkapsel. Lange termijn metingen werden onmogelijk. De ideale situatie voor deze sensor zou zijn dat we preferentieel endotheelcellen kunnen aantrekken naar het implantaat zodat er zich bloedvaten kunnen gaan vormen rondom het biomateriaal. Een mogelijke oplossing voor dit probleem kan geboden worden door het biomateriaal te gaan modificeren. Op deze manier wil men proberen om specifiek endotheelcellen aan te trekken. Vooraleer die modificatie kan uitgevoerd worden, dient men op zoek te gaan naar specifieke liganden. In een co-cultuur van endotheelcellen en fibroblasten kijkt men dan naar de distributie van beide op het gemodificeerd en ongemodificeerd materiaal. Aangezien men hier te maken heeft met twee celtypes, dienen de cultuuromstandigheden voor zo’n co-cultuur ook geoptimaliseerd te worden. Daarnaast dienen beide celtypes op een efficiënte manier gelabeld te worden om het onderscheid te kunnen maken tussen beide types. Uit de resultaten van deze masterproef blijkt dat PECAM-1 en VE-cadherine specifieke endotheliale liganden zijn die kunnen gebruikt worden voor de modificatie. Daarnaast is ook gebleken dat wanneer men de twee celtypes gaat uitzaaien in een EGM-2 medium, de verhouding in stand blijft. Om endotheelcellen te labelen kan men gebruik maken van twee methodes: transfectie of viabiliteitsmerkers. Een GFP-transfectie is zeer inefficiënt, en de labeling is onvoldoende lang zichtbaar. CaAM is een viabiliteitsmerker dat het meest in aanmerking komt voor de labeling van endotheel. De labeling is namelijk het minst toxisch voor de cellen, en is voldoende lang zichtbaar. Voor fibroblasten maakt men gebruik van CTR als viabiliteitsmerker. Deze is ook het minste toxisch, de zichtbaarheid van de labeling is echter wel minder sterk.
!
!
"!
1. INLEIDING
1.1. PROBLEEMSTELLING Diabetes is een chronische ziekte die ontstaat wanneer de pancreas onvoldoende insuline produceert (type 1), of wanneer het lichaam niet in staat is om de insuline op een efficiënte manier op te nemen (type 2). Complicaties bij ongecontroleerde diabetes zijn ketoacidose, nierfalen en hyperglycemie (hoger gehalte van glucose in het bloed). Na een tijd kan dit leiden tot schade aan verschillende lichaamssystemen, voornamelijk ter hoogte van de zenuwen en de bloedvaten. Dit kan vervolgens leiden tot amputaties van ledematen en retinale schade. Volgens de gegevens van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) lijden meer dan 220 miljoen mensen wereldwijd aan diabetes (2009). Dit aantal zal toenemen tot 300 miljoen in 2025 [1,2]. Tot op de dag van vandaag is diabetes nog steeds niet geneesbaar. Een strikte controle van het gehalte aan glucose in het bloed kan de kans op ernstige complicaties sterk doen verminderen. De meest gebruikte techniek is nog steeds de vingerprikmethode. Jammer genoeg zijn de kosten en de pijn geassocieerd met deze huidige techniek remmend voor het aantal metingen per dag. De waarden die gemeten worden op bepaalde tijdstippen zijn dan ook niet representatief voor de hele dag. Daarnaast heb je geen idee over de trend waarnaar de glucose waarde aan het evolueren is. Dit is nadelig voor een efficiënte behandeling. De laatste jaren zijn er veel vorderingen gemaakt met betrekking tot glucose monitoring. Door te gaan werken met continue glucose monitoring (om de paar minuten), kan men de glycemische waarden beter controleren en ingrijpen indien nodig. Dit voorkomt medische complicaties (o.a. microvasculaire complicaties en nierfalen) terwijl te lage bloedglucose concentraties worden vermeden [2].
1.2 CONTINUE GLUCOSEMONITORING M.B.V. SENSOREN Om aan continue glucose monitoring te doen, kan men onder andere gebruik maken van implanteerbare glucose sensoren. De opbouw van zo’n een sensor bestaat typisch uit 3 onderdelen. Eerst en vooral heb je de glucose sensor zelf, deze gaat continue fysiologische glucosewaarden (bloed of interstitieel vocht) gaan meten. Daarnaast is er nog een elektrische verwerkingsunit, deze staat in voor de communicatie met de glucose sensor. Tot slot is er dan
!
$!
nog een data display unit, hierop kan men de gemeten waarden aflezen. De continue glucosemonitoring systemen kan men indelen volgens hun werkingsmechanisme [2].
1.2.1. GLUCOSE DETECTIE: ELECTROCHEMISCHE METHODE Deze categorie kan eigenlijk opgesplitst worden in een enzymatische- en een niet enzymatische methode. Bij een enzymatische sensor gaat een specifiek glucose enzyme (glucose oxidase) instaan voor de oxidatie van glucose naar gluconolactone. De gereduceerde vorm van het enzyme wordt vervolgens terug gebracht naar de geoxideerde vorm, waardoor het gehele proces van voor af aan kan herbeginnen. Eventuele problemen bij lange termijn metingen zijn niet zo zeer te wijten aan het verlies van het enzyme, maar wel aan het feit dat het enzyme kan geïnhibeerd worden door bepaalde metaalionen. Bij een niet-enzymatische sensor wordt het glucose gedetecteerd door een directe elektro-oxidatie van glucose naar gluconolacton met behulp van nanostructurele elektroden (Platinum, lood, palladium) [2]. Deze sensoren zijn zeer stabiel, accuraat en sensitief in vitro. Eenmaal deze geïmplanteerd worden, neemt de werking van de sensor sterk af na een paar dagen. De oorzaak hiervan is grotendeels te wijten aan de vervuiling van het sensoroppervlak. Deze materialen worden omgeven door een kapsel van dens collageen bindweefsel, waardoor een goede integratie met het omliggend weefsel verhinderd wordt. De stabiliteit en betrouwbaarheid daalt dus drastisch bij de implantatie wat ervoor zorgt dat dit geen lange termijn oplossing is [2,3,4].
1.2.2. GLUCOSE DETECTIE: OPTISCHE METHODE In deze categorie kan men het onderscheid maken tussen fluorofoor gebaseerde sensoren en niet-fluorofoor gebaseerde sensoren. Bij de fluorofoor gebaseerde sensoren kunnen zowel glucose als een fluorofoor competitief gaan binden aan een receptor die specifiek is voor beide liganden. Wanneer het fluorofoor gaat binden aan de receptor, zal het signaal zwakker zijn dan wanneer het niet gebonden is. Wanneer dan echter de concentratie aan glucose hoog is, zal er minder fluorofoor kunnen binden waardoor de intensiteit van het signaal sterker is [2]. Het falen van deze techniek kan dikwijls verklaard worden doordat deze fluoroforen gevoelig zijn voor ‘fotobleaching’. Dit doet het gebruik van deze sensor voor het uitvoeren van continue metingen sterk dalen. Hoe hoger de graad van fotobleaching, hoe korter de levensduur van de sensor.
!
3!
Bij de niet-fluorofoor gebaseerde sensoren, maakt men gebruik van licht bij verschillende frequenties om zo veranderingen te detecteren in absorbanties, reflecties of scattering in weefsels die verschillende concentraties glucose bevatten. In het bijzonder de golflengtes die in het nabije infrarood gelegen zijn komen in aanmerking. De reden hiervoor is dat deze stralen het stratum corneum van de epidermis kunnen passeren zonder al te veel absorptie van het weefsel zelf [2]. Daarnaast zijn nabij infrarood spectrometrische analyses niet destructief, simpel, snel en vraagt het geen voorbehandeling. Dit zorgt ervoor dat deze technologie bruikbaar is voor online monitoring en kwaliteitscontroles [5].
Glucose
vertoont
2 >HEGO;!K[JEOKIJ!YMIV!
karakteristieke pieken binnen het
nabije
>HEGO!K[JEOKIJ!YMIV!
infrarood
spectrum. Deze zijn dan ook van belang bij de identificatie van glucose. De eerste piek
(KUYHIMOHKI!YMIV! (KUYHIMOHKI!YMIV!
wordt de ‘first - overtone band’ genoemd ( 6500-5500 cm-1). De tweede piek noemt men de ‘combination band’ (5000 – 4000 cm-1). Door de
Figuur 1: Spectra van bloedstalen met verschillende glucose-concentraties, van onder naar boven: 4.73, 6.05, 9.87, 12.91 mM [6].
aanwezigheid van andere componenten in het bloed kan dit leiden tot overlap tussen de absorptiewaarden van glucose en de absorptiewaarden van de andere bloedcomponenten. Deze overlappen zorgen ervoor dat glucose detectie veel gecompliceerder verloopt. Daarom is het aangeraden om eerder metingen uit te voeren in verscheidene spectrale banden dan te beperken tot een aantal golflengtes [2,5,6].
1.3. LOCALISATIE VAN DE SENSOR De sensor kan op verschillende plaatsen aangebracht worden. Men kan een onderscheid maken op basis van de graad van invasiviteit. Een eerste groep zijn de invasieve sensoren, deze worden subcutaan of intraveneus ingebracht. Deze sensoren communiceren dan via een extern mechanisme. Het voordeel hierbij is dat het makkelijk in te brengen is en dat het over een goed aanpassingsvermogen beschikt. Nadelen kunnen zijn dat het een vreemde
!
@!
lichaamsreactie te weeg brengt, of dat de sensor gaat migreren. Daarnaast bestaan ook minimaal invasieve sensoren, dit wordt gebruikt om te vermijden dat een vreemd object zich continu in het lichaam bevindt. Hierbij bevindt de sensor zich buiten het lichaam. In sommige gevallen heeft men te maken met een open wonde, deze kan leiden tot infecties. Tot slot zijn er nog de niet-invasieve sensoren, hierbij wordt de concentratie glucose gemeten zonder de huid te doordringen. Hierbij wordt gebruik gemaakt van spectroscopische technieken om het glucosegehalte te kunnen bepalen via verschillende lichaamsvochten of gassen (speeksel, tranen, adem). De voordelen hierbij zijn dat dit een pijnvrije en een comfortabele techniek is. Maar ook hier is er een gebrek aan correlatie tussen het bloed glucose gehalte en het glucose gehalte in lichaamsvochten en gassen [2].
1.4. BELANG VAN VASCULARISATIE Nieuwe
bloedvaten
ontstaan vanuit bestaande capillairen (‘budding’ of ‘sprouting’)
(Figuur
opgebouwd
2), uit
endotheelcellen,
omgeven
door een membraan en bindweefsel
[7].
Alle
bloedvaten, van de grootste arteriën en venen tot de kleinste
postcapillaire
>HQWWE!$/!*P\JUMOHGP\J![KKEGOJNNHIQ![MGPWNKQJIJGJ!JI!MIQHKQJIJGJ![<]#!
venules, worden afgelijnd door endotheelcellen [8,9]. Deze cellen hebben multiple functies, en kunnen sterk variëren afhankelijk van de plaats en van de grootte van de corresponderende bloedvaten. Endotheelcellen vormen geen passieve barrière, integendeel ze kunnen op een actieve manier kleine moleculen, hormonen en macromoleculen gaan transporteren. Daarnaast spelen endotheelcellen een strategische rol in de controle van de fysiologische en pathofysiologische condities in het menselijk lichaam (inflammatie, vasculaire lekkage, tumorontwikkeling). Zij zijn integraal betrokken bij bloeddruk regeling, bloed coagulatie, fibrinolyse, adhesie en transmigratie van inflammatoire cellen doorheen het bloedvat en angiogenese [8,10,11]. Door de groeiende interesse in het belang van endotheelcellen bij
!
C!
fysiologische en pathofysiologische condities heeft geleid tot een stijgende vraag naar een representatief model, zowel in vivo als in vitro, om op die manier de onderzoekers de mogelijkheid te geven om deze processen te begrijpen en meer inzicht te krijgen [8].
1.5. BELANG VAN HET BIOMATERIAAL Het biomateriaal waarin sensoren verpakt worden dient aan verschillende voorwaarden te voldoen. Eerst en vooral dient het materiaal biocompatibel te zijn. Dit is het vermogen van een materiaal om met een gepaste reactie van de gastheer te functioneren bij een specifieke toepassing. De plaats waar het in het lichaam wordt aangebracht, is even belangrijk als de samenstelling van het materiaal voor de biocompatibiliteit [3]. Ten tweede dient het materiaal ook transparant te zijn in het ‘Near Infrared’ (700 nm-1400 nm). Dit is namelijk de zone waarin de meting wordt uitgevoerd. We moeten dan ook voorkomen dat het implantaat invloed heeft op de meting. Binnen het infrarood spectrum bevat glucose twee karakteristieke pieken. Deze zijn dan ook van belang bij de identificatie van glucose [2,5,6]. Tot slot dient het biomateriaal ook voldoende hard te zijn. Dit is van belang omdat de afstand tussen de laser en de meetplaats steeds dezelfde dient te zijn. Materialen die aan al deze voorwaarden
voldoen
zijn
PMMA
(polymethylmethacrylaat)
en
PDMS
(polydimethylsiloxane). Preliminaire in vivo experimenten hebben aangetoond dat deze materialen omgeven worden door een kapsel van dens collageen bindweefsel, waardoor een goede integratie met het omgevend weefsel verhinderd wordt [3,4]. De ideale situatie voor deze sensor zou zijn dat we preferentieel endotheelcellen kunnen aantrekken naar het implantaat zodat er zich bloedvaten kunnen gaan vormen rondom het biomateriaal.
1.6. CO-CULTUUR: FIBROBLASTEN EN ENDOTHEEL 1.6.1. BEPERKINGEN VAN ENDOTHEEL In tegenstelling tot fibroblasten is het moeilijker om endotheelcellen in cultuur te houden. De groei gebeurt trager en het aantal passages is beperkt [8,12,13]. Het op zoek gaan naar optimale mediumcondities is dan ook van belang wil men deze cellen langer in cultuur houden [11]. In de literatuur vindt men dat de gemiddelde levensduur van de HUVEC 10 passages bedraagt. Daarna bereiken de cellen een senescentie stadia waarbij de proliferatie stopt, de cellen van vorm veranderen en meerdere kernen bevatten om dan uiteindelijk te !
5!
sterven. Dit zorgt ervoor dat langdurige in vitro experimenten niet kunnen uitgevoerd worden met HUVEC. Daarnaast kan het gedrag van de endotheelcellen ook sterk gaan verschillen afhankelijk van de donor origine. Ook het uitvoeren van een transfectie is niet gemakkelijk [8]. Om deze beperkingen te voorkomen kan men gaan werken met geïmortaliseerde HUVEC. De cellen zijn meer uniform en hebben een stabiel fenotype! Toch is enige voorzichtigheid geboden, cellen die in cultuur gebracht worden over langere periodes kunnen namelijk fenotypische drift ondergaan waardoor deze cellen niet meer representatief zijn aan de primaire cellen [12]. Daarnaast kan de expressie van bepaalde oppervlaktemerkers (CD31, VWF,…) tussen de primaire cellen en de geïmortaliseerde cellen verdwijnen of in andere situaties gaan geëxpresseerd worden [12]. In dit perspectief kan men concluderen dat de primaire endotheliale cellen zoals HUVEC de eerste keuze dient te zijn. Maar door hun beperkte levensduur en lage transfectiegraad is het gebruik van deze cellen soms een probleem, waardoor men toch dient gebruik te maken van deze geïmortaliseerde cellen. Voorafgaand onderzoek van dit type cellen is dan ook nodig!
1.6.2. SELECTIE VAN HET GEPASTE MEDIUM IN CO-CULTUUR Uit vroegere experimenten weet men dat de sensor overgroeid wordt door fibroblasten. Nu wil men eigenlijk endotheelcellen naar de sensor aantrekken. Dit is de reden waarom fibroblasten en endotheelcellen worden gebruikt in co-cultuur. Hierbij is het van groot belang om een optimaal medium te vinden, zodat beide celtypes overleven. Onderzoek hiernaar is nog noodzakelijk. Er zijn verschillende mogelijkheden, zoals een combinatie van de media van de cellen die in co-cultuur gehouden worden. Dit kan bijvoorbeeld via een 1:1 verhouding van de respectievelijke media die in de monocultuur worden gebruikt [14], of via een totaal ander medium (bv: EGM2) [14,15,16]. Dit om ervoor te zorgen dat beide celtypes optimaal kunnen behouden blijven en in gelijke mate groeien. Ook moet men nagaan of er geen functionele en/of morfologische veranderingen van de cellen optreedt. Het is belangrijk dat beide celtypes simultaan groeien. Enkel op deze manier kan men nagaan of een bepaald biomateriaal voldoende specifiek is om endotheelcellen aan te trekken.
!
1.7. MODIFICATIE VAN EEN BIOMATERIAAL De geselecteerde biomaterialen zijn gekenmerkt door hun bioinert karakter, dit is de reden waarom deze materialen een oppervlakte modificatie moeten ondergaan om ervoor te zorgen dat de bioactieve component kan vastgehecht worden.
1.7.1. COVALENTE VERSUS NIET-COVALENTE KOPPELING Zo’n modificatie kan op verschillende manieren gebeuren afhankelijk van het doel dat men wil bereiken. De meest gebruikte methoden om een bioactieve component te doen hechten aan een polymeer oppervlak is adsorptie via elektrostatische interacties, ligand receptor koppeling of via covalente binding. De niet-covalente binding is aan te raden bij bepaalde drug afgifte systemen. Covalente bindingen staan in voor de meest stabiele binding. Dit wordt dan ook dikwijls gebruikt wanneer men halfwaarde tijd van een bepaalde component wil laten toenemen. De keuze van de bioactieve component is afhankelijk van de toepassing waarvoor het zal gebruikt worden. Zo kan men gebruik maken van peptiden bij tissue engineering en voor het creëren van antimircobiële oppervlaktes. Polyethyleenglycol (PEG) wordt dan weer gebruikt om de biocompatibiliteit te doen toenemen [17]. Daarnaast kunnen ook antilichamen gebruikt worden, dit wordt voornamelijk gedaan bij biosensoren [18]. Door gebruik te maken van antilichamen die specifiek zijn voor endotheel, kan men ervoor zorgen dat endotheelcellen worden aangetrokken naar het biomateriaal i.p.v. fibroblasten. [18,19]. Om er voor te zorgen dat de antilichamen ‘gekoppeld’ kunnen worden met het biomateriaal dient dit laatste eerst behandeld te worden.
1.7.2. OPPERVLAKTE MODIFICATIE TECHNIEKEN Een eerste mogelijkheid die kan gebruikt worden is ‘wet chemical modification’, hierbij wordt het oppervlak behandeld met vloeibare reagentia die ervoor zorgen dat functionele groepen gegenereerd worden op het oppervlak [18]. Een voorbeeld van zo’n reagens is gelatine of dopamine Het voordeel aan deze methode is dat men hiervoor geen speciale
DOPAMINE/ GELATINE
apparatuur nodig heeft, het kan dus uitgevoerd worden in de meeste laboratoria (Figuur 3) [17]. Na !
Figuur 3: Voorstelling modificatie met antilichaam van een biomateriaal.
!
=!
toevoeging van het gepaste antilichaam aan dopamine zou dit leiden tot specifieke adhesie. Een polydopamine coating op het biomateriaal gaat ervoor zorgen dat er proteïne adsorptie mogelijk is. Wanneer antilichamen worden toegevoegd zullen deze op een chemische manier met elkaar gebonden worden. Bij een gelatine coating ziet men vaker ook niet specifieke adhesie optreden. Wanneer hierbij de antilichamen worden toegevoegd, gebeurt de binding eerder via fysisorptie. Een tweede methode is via plasmabehandeling, hierbij wordt de modificatie uitgevoerd zonder het gebruik van solventen. Daarnaast is er ook minder degradatie van het materiaal. ‘Oxygen plasma’ kan gebruikt worden wanneer men zuustof bevattende functionele groepen wil aanbrengen, ‘carbon dioxide plasma’ kan dan weer gebruikt worden wanneer men carboxyl bevattende functionele groepen wil aanbrengen [17,18]. Daarnaast kan een modificatie ook uitgevoerd worden met behulp van UV straling. Wanneer het polymeer oppervlak wordt blootgesteld aan UV, ontstaan er reactieve plaatsen. Deze kunnen het ontstaan van functionele groepen veroorzaken. Dit type modificatie wordt ondermeer gebruikt om carbonzuur bevattende functionele groepen te introduceren op PMMA [17,18]. Wel moet men zich er bewust van zijn dat de binding van de antilichamen aan het substraat willekeurig gebeurt. Het is natuurlijk het beste wanneer de variabele regio van het antilichaam zou binden met het substraat, want dan zijn de twee antigen-specifieke pockets nog vrij. Op deze manier is een betere binding mogelijk en krijgt men ook een verbetering van de resultaten. Maar de meeste methoden inclusief passieve adsorptie en covalente binding gaan daar niet voor zorgen [20]. In een verdere fase kan onderzocht worden of het modificeren met peptiden een beter resultaat oplevert. Om dit proces van preferentiële celadhesie te kunnen volgen, is voorbereidend onderzoek noodzakelijk.
!"#"$$%&'()&$"*"+,-.%&(
1.7.3. HET BELANG VAN ENDOTHEELSPECIFIEKE LIGANDEN VOOR MODIFICATIE Om de modificatie van een biomateriaal (PMMA,PDMS) te kunnen uitvoeren dienen we op zoek te gaan naar een specifieke oppervlakte ligand van het endotheel [10,16]. Door antilichamen te gaan koppelen aan een biomateriaal die
!
Figuur 4: ‘Koppeling’ tussen endotheelcellen en antilichamen m.b.v. endotheel specifieke liganden.
?!
specifiek de ligand(en) van endotheelcellen gaan herkennen, zullen deze endotheelcellen gekoppeld worden aan het antilichaam wat ervoor zorgt dat er zich een zone met voornamelijk endotheelcellen zal vormen omheen het biomateriaal. Endotheelcellen worden gekarakteriseerd door een constitutief expressiepatroon van verschillende endotheliale merkers/liganden zoals CD 31, CD 105, VE-cadherine en VWF (Figuur 4). Daarnaast zijn er ook nog andere merkers die enkel geïnduceerd worden bij inflammatie zoals ICAM-1 en VCAM-1. Mogelijke merkers voor endotheelcellen worden nog eens opgesomd in tabel I [12,21]. Uit deze reeks dient men nu nog de beste liganden te selecteren die kunnen gebruikt worden voor de modificatie van het biomateriaal. Daarnaast kunnen deze liganden ook gebruikt worden als merker om na te gaan of bepaalde behandelingen al dan niet een fenotypische veranderingen met zich meebrengen (karakterisatie). Continu geëxpresseerde oppervlaktemerkers bij endotheelcellen VEGFR-2 (Flk-1) Tie-2 CD34 PECAM-1 (CD 31) ICAM-2 VE-cadherine Endoglin MECA-32 antigen !v"3-integrin
Pro-inflammatoire cytokine-geïnduceerde oppervlakte merkers bij endotheelcellen ICAM-1 VCAM-1 E-selectin P-selectin
Tabel I: cel oppervlaktemerkers bruikbaar voor de karakterisatie van endotheliale cellen bij FACS analyse [21].
De merkers die worden opgesomd in de tweede kolom van de tabel zijn minder interessant. Dit omdat deze enkel geëxpresseerd worden bij inflammatie, een niet fysiologisch proces dat tijdens de experimenten dient vermeden te worden [12,21].
1.7.4. KARAKTERISATIE VAN DE VERSCHILLENDE CELTYPES IN CO-CULTUUR Om de celtypes te kunnen karakteriseren, maken we gebruik van oppervlaktemerkers. Voor de karakterisatie mogen deze merkers zowel intra- als extracellulair gelegen zijn. Wanneer we deze oppervlaktemerkers gaan gebruiken voor de modificatie (liganden) dienen we te kiezen voor diegene die enkel extracellulair aanwezig zijn. Tijdens dit onderzoek gaan we verschillende van deze merkers/liganden gaan onderzoeken. Voor endotheel zal dit PECAM1, VE-cadherine en VonWillebrand Factor (VWF) zijn. Voor de fibroblasten gebruiken we AS02 en 5B5. PECAM-1 (of CD31) is en overvloedig geexpresseerde merker aanwezig op endotheel, het is een lid van de immunoglobuline superfamilie. Het is meer bepaald een 130 !
"B!
kDa transmembranair glycoproteïne dat een belangrijke rol speelt tijdens de angiogenese. Deze merker kan zowel gebruikt worden voor karakterisatie als modificatie. Deze merker kent een homogene expressie onafhankelijk van de origine. Von Willebrand Factor (vWF) is een exclusieve merker voor endotheel. Nochtans kent het een heterogeen expressiepatroon op endotheelcellen afhankelijk van de origine. Het is een glycoproteïne dat plaatjesadhesie medieert na verwondingen, daarnaast stabiliseert het factor VIII in de bloedstollingscascade. Dit is wel een intracellulaire merker en kan dus enkel gebruikt worden voor karakterisatie [8,12,22]. VE-cadherine is een glycoproteïne dat bestaat uit 5 extracellulaire herhalingen, een transmembranair gedeelte en een compacte staart. Het is dus een geschikte merker voor zowel karakterisatie als modificatie. Het speelt een belangrijke rol bij het vormen van junctiecomplexen tussen de endotheelcellen, het wordt dan ook voornamelijk daar geëxpresseerd [8,22]. Daarnaast is het ook de meest specifieke merker voor endotheel tot nu toe gelocaliseerd. AS02 is een fibroblast specifieke merker die gebruik wordt om fibroblasten te detecteren [23].
1.8. LABELEN VAN EEN CO-CULTUUR Om de verschillende processen (co-cultuur, immunokleuring,..) te kunnen volgen tijdens het onderzoek moeten de endotheelcellen en/of de fibroblasten specifiek gekleurd of getransfecteerd worden. Deze kleuring moet tenminste 7 dagen zichtbaar blijven. De reden daarvoor is dat we de verschillende celtypes kunnen volgen en/of onderscheiden van elkaar gedurende het verloop van het experiment. Daarnaast mogen enkel de dochtercellen aangekleurd worden, en mag de kleuring/ transfectie geen invloed hebben op de morfologie van de cellen. Tot slot dienen de cellen metabolisch actief te blijven, of met andere woorden: de labeling mag niet toxisch zijn voor de cellen.
1.8.1. LABELEN M.B.V. VIABILITEITSMERKERS Om cellen te labelen kan men gebruik maken van verschillende viabiliteitsmerkers [15,24]. Deze merkers zijn niet celspecifiek, dit wil zeggen dat eender welk celtype hiermee kan aangekleurd worden. Het is van belang dat we hierbij kunnen aantonen dat de dochtercellen worden aangekleurd, maar dat er geen overdracht is naar een ander celtype in de co-cultuur. Dit zou immers leiden tot verkeerde interpretaties van de resultaten. Een eerste type van viabiliteitsmerkers zijn CellTracker Red [15] ! en Blue [15,24]. Deze fluorescente probes
!
""!
worden doorgegeven aan de dochtercellen na celdeling, maar worden niet getransfereerd naar omliggende cellen in de populatie![25]. Een tweede type van merker dat kan gebruik worden is Calceïne-AM (Acetoxymethyl). In levende cellen wordt het niet fluorescente calceïne AM omgezet naar het groen-fluorescent calceïne. Om te kunnen nagaan of het werkelijk de endotheelcellen zijn die worden aangetrokken door het polymeer is de viabiliteitskleuring specifiek voor de gebruikte celtypes van groot belang.
1.8.2. LABELEN M.B.V. GFP-TRANSFECTIE Daarnaast kan men ook gebruik maken van een transfectie om cellen te labelen. Hierbij gaat men trachten de cellen te transfecteren met een reporter (GFP), dit gebeurt met behulp van een plasmide DNA [13]. Cellen kunnen op verschillende manieren getransfecteerd worden. Er zijn namelijk fysische, chemische en virale methoden voorhanden. Een voorbeeld van een fysische methode is electroporatie. Deze methode kent afwisselend succes. Factoren zoals celtype, celpassage en celsuspensie zijn van belang. Hernandez et al. beschrijven dat de efficientie van de transfectie via deze methode kan verbeterd worden door de gebruikte spanning, aantal cellen in cultuur of het celmedium te optimaliseren. Op deze manier zou de transfectie efficiëntie toenemen van minder dan 40% naar 65 tot 85% [26]. De virale methode wordt voornamelijk gebruik in vivo. Maar afhankelijk van de virale vector, kan het gebruik daarvan leiden tot mutaties of replicatie-geïnduceerde infecties. Sterke veiligheidsmaatregelen zijn dan ook noodzakelijk [13]. In de literatuur vindt men daaromtrent wel terug dat er lange termijn stabiliteit van de retrovirale expressie in vitro wordt bekomen over meer dan 25 verdere passages. Dit werd bevestigd door gebruik te maken van fluorescentie microscopie en FACS. Deze bevindingen zorgen ervoor dat het uitvoeren van een transfectie van de primaire cellen vooraleer ze worden uitgezaaid, een bruikbaar hulpmiddel kan zijn voor lange termijn observatie. Wel wordt daarbij vermeld dat er een tijdsafhankelijk verlies is aan cellen. Volgens het artikel behouden de retrovirale getransduceerde cellen hun fenotype en transgene expressie na 6 maanden of langer in een in vitro cultuur. Het is dus een efficiënte methode om uitgezaaide celtypes te identificeren [27,28]. Een nadeel aan deze methode is de lage efficientie van de transfectie. In de literatuur vinden we waarden terug rond de 30 à 40% [13,27,28]. Tot slot is er nog de chemische methode. Deze methode is redelijk eenvoudig, goedkoop en veilig. Er zijn verschillende reagentia voor handen. Nadelig aan deze techniek blijft de lage !
"$!
transfectiegraad. 48 uur na de transfectie wordt een hoger expressieniveau gedetecteerd dan na 24 uur. Maar men zag ook dat er na 48 uur meer dode cellen waren in vergelijking met na 24 uur. Chemische transfectie reagentia leiden dus tot dalende delingscapaciteit en verminderde viabiliteit [13]. Tijdens de experimenten zal er gebruikt gemaakt worden van TransPass V reagent (chemisch) voor het uitvoeren van de transfecties. Dit is namelijk een reagens specifiek ontworpen voor het transfecteren van endotheelcellen (HUVEC- HMVEC-human aortic endothelial cells). Volgens de gegevens van de firma (Biolabs) bekomt men hiermee een optimale efficiëntie. Voor de HUVEC spreekt men over waarden tussen de 70% en 90% [29].
1.9. VIABILITEITS ASSAYS Na het uitvoeren van de kleuring of transfectie dienen de cellen ook metabolisch actief te blijven. Om dit na te gaan kan men gebruik maken van verschillende technieken. Wij hebben gekozen om een klassieke MTT assay te gebruiken en een PrestoBlue Reagent.
1.9.1. MTT ASSAY De meest gebruikte test is de MTT assay. De MTT assay is ontwikkeld om via een indirecte weg een idee te krijgen over het aantal levende cellen in een cultuur. Tetrazolium zout MTT (geel) wordt toegevoegd aan de cultuur en wordt door mitochondriale dehydrogenase activiteit aanwezig in levende cellen omgezet tot een gekleurd formazan product (paars). De hoeveelheid dehydrogenase is vrij constant in cellen van eenzelfde type. De hoeveelheid gevormd formazan is bijgevolg proportioneel met het aantal viabele cellen. Dit formazan is impermeabel voor de celmembranen wat leidt tot een accumulatie van een paarse kleur in viabele cellen, zodat het lyseren van de cellen nodig zal zijn om de hoeveelheid formazan te bepalen [30].
1.9.2. PRESTOBLUE REAGENT Daarnaast kan men ook gebuik maken van PrestoBlueTM, celviabiliteit reagens. Het bevat een celpermeabele component die blauw is en vrijwel niet fluorescent. Wanneer dit product bij de cellen wordt gevoegd, wordt de component rood en sterk fluorescent. De resultaten zijn hoog
!
"3!
kwalitatief en betrouwbaar. Daarnaast is het ook een gevoelige detectie methode voor de celviabiliteit [31]. Deze laatste techniek heeft een aantal voordelen t.o.v. de MTT assay. Je bekomt veel sneller je resultaten en er zijn minder stappen in het protocol nodig. De techniek heeft ook de capaciteit om de cellen levend te houden voor verdere assays en het is een veiliger en onmiddellijk bruikbaar reagens. Beide technieken zullen gedurende het onderzoek aan bod komen [31].
1.10. DOEL VAN DEZE MASTERPROEF Door gebruik te maken van een spectrometrische sensor ingekapseld in een transparant en biocompatibel materiaal (GlucoSens, Continuous Glucose monitoring using implantable single-chip optical sensors), zou men lange termijn implantatie van glucose sensoren kunnen bereiken. Het doel van het GlucoSens project is om de nodige technologie te ontwikkelen die nodig is bij glucose controle door gebruik te maken van een implanteerbare één-chip optische sensor. Ons onderzoek kadert in dit brede project. Een ideale situatie voor deze sensor zou zijn dat we bloedvaten kunnen aantrekken naar het implantaat zodat er zich bloedvaten kunnen gaan vormen in de directe omgeving van het biomateriaal. Wij zullen ons voornamelijk richten op het verkrijgen van een co-cultuur tussen fibroblasten en endotheel met het oog op endotheel specifieke adhesie op biomaterialen. Eerst en vooral moeten we trachten de cultuuromstandigheden te verbeteren en waar mogelijk te optimaliseren. Dit met als doel om optimale co-culturen te bekomen waarbij geen overheersing van één celtype waar te nemen is. Om een onderscheid te maken tussen de gebruikte celtypes tijdens de verschillende experimenten dienen deze gelabeld te worden. De cellen dienen langdurig aangekleurd te worden (minimaal 7 dagen): dit kan met behulp van viabiliteitsmerkers of door het uitvoeren van een transfectie [13,15,24]. Hierdoor kunnen we de verschillende celtypes aanwezig in een co-cultuur aankleuren en onderscheiden van elkaar. Daarnaast dient het biomateriaal ‘behandeld’ te worden (gemodificeerd) om zo preferentieel endotheelcellen te gaan aantrekken, op deze manier wordt de vorming van zo’n bloedvat mogelijk gemaakt, de vascularisatie wordt gestimuleerd. Om dit mogelijk te maken moeten we eerst op zoek gaan naar een specifieke endotheliale extracellulaire ligand. Het is namelijk van belang dat enkel endotheelcellen worden aangetrokken en daarnaast niet allerlei andere celtypes.
!
"@!
2. MATERIALEN & METHODEN
2.1. GEBRUIKTE APPARATUUR/SOFTWARE 1) Fluorescente invert microscoop ! Olympus IX81, filters: OLYMPUS ! Software: Xcellence Pro Filter Excitatie licht Excitatie Filter Emissie Filter Dicromatische Filter DAPI UV BP360-370 BA420-460 DM400 (U-MNUA2) GFP Blauw BP460-495 BA510-550 DM505 (U-MWIBA3) TXRED Geel BP545-580 BA610IF DM600 (U-MWIY2) Tabel II: excitatie en emissie gegevens van de filters van de fluorescente invert microscoop.
2) Absorbantie-metingen, Steriele kamer (MTT-assay) ! Universal Microplate Reader EL800, BIO-TEK Instruments Inc. Absorbanties: 580,490,450,750,405 ! Software: KcJunior 3) Spectrofotometer (fluorescentie) (Blok B) (PrestoBlue) ! Victor3 1420 multilabel counter, Perker Elmer ! Software: Wallac1420 Workstation Protocol
Excitatie Filter
Emissie Filter
Presto Blue
535-560
590-615
Tabel III: Excitatie en emissie gegevens van de spectrofotometer voor PrestoBlue protocol.
2.2. OPTIMALISATIE CULTUUROMSTANDIGHEDEN 2.2.1. CELTYPES Gedurende het onderzoek zal gewerkt worden met 2 types van endotheelcellen: 1) HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) !
"C!
2) HUVEC - GFP (green fluorescent protein- geïmortaliseerd) Voor de fibroblasten zullen we gebruikt maken van: 1) HFF (human foreskin fibroblasts)
2.2.2. CULTUURMEDIA 1)Standaard HUVEC medium (EGM bulletkit) LonzaClonetics! + Groeifactoren LonzaClonetics!EGMTMSingle Quots! Endothelial Cell Basal Medium, 2% foetaal kalfsserum (FCS), 0,4% bovine brain extract met heparine (BBE), 0,1% humaan epidermale groeifactor (hEGF), 0,1% hydrocortisone en 0,1% GA-1000 (Aqueous solution of Gentamicin Sulfate and Amphotericin-B). ! Dit medium wordt gebruikt voor het in cultuur brengen van endotheelcellen (HUVEC). 2)EGM-2-MV
bulletkit
medium
(HUVEC)
LonzaClonetics!
+
Groeifactoren
LonzaClonetics!EGMTM2 Single Quots! Endothelial Cell Basal Medium 2, 5% FBS, 0,04% Hydrocortisone, 0,4% hFGF-B, 0,1% VEGF, 0,1% R3-IGF-3, 0,1% Ascorbic acid, 0,1% hEGF, 0,1% GA-1000, 0,1% Heparine ! Dit medium wordt gebruikt voor het in cultuur brengen van HUVEC-GFP en voor een co-cultuur tussen fibroblasten en endotheel. 3) Standaard HFF medium DMEM glutamax (Life TechnologiesTM), 18% FCS, 0,12% NaPyruvaat, 2,5% L-glutamine en 0,12% Penicilline/Streptomycine. ! Dit medium wordt gebruikt voor het in cultuur brengen van fibroblasten.
2.2.3. CELLEN SPLITSEN/ LOSMAKEN 2.2.3.1. Trysine/FCS Voor een T25 falcon: Medium verwijderen, spoelen met PBS (1ml), PBS verwijderen, 4ml Trypsine toevoegen (5min), 1ml FCS toevoegen. Mengsel overbrengen naar proefbuis en centrifugeren (5min, 1100rpm). Resuspenderen met normaal medium (2ml). Tellen m.b.v. Bürkercelteller volgens verdunning # (90 µl trypaanblauw (Invitrogen!), 30 µl celsuspensie). !
"5!
2.2.3.2. Lonza Clonetics! ReagentPackTM Voor een T25 falcon: spoelen met 5 ml HEPES buffered saline solution (en verwijderen), toevoegen van 2 ml Trypsine/EDTA (5min), toevoegen 4 ml trypsine neutralizing solution. Overbrengen in proefbuis en centrifugeren (5min, 1100 tpm), resuspenderen met normaal medium (2ml). Tellen m.b.v. Butkercelteller volgens verdunning # (90 µl trypaanblauw, 30 µl celsuspensie).
2.2.4. CELLEN ONTDOOIEN EN INVRIEZEN Om cellen te ontdooien, worden deze uit de vloeibare stikstof gehaald. De vials worden vervolgens in een warm waterbad van 37°C gebracht om zo langzaam te ontdooien. Wanneer ze volledig ontdooid zijn, kunnen de cellen overgebracht worden in de falcons met gepaste hoeveelheid medium. Om cellen in te vriezen, dienen deze na het centrifugeren geresuspendeerd te worden met 900 µl FCS, dit wordt vervolgens overgebracht naar een vial, waaraan dan nog eens 100 µl DMSO (cryoprotectans) wordt toegevoegd. Op de vial dienen de juiste gegevens (type cellen, hoeveelheid, datum) vermeld te worden. Vooraleer we de vials in de stikstofvaten overbrengen, dienen deze eerst gedurende een uur in een apart vat te verblijven. Dit vat is tot de helft gevuld met vloeibare stikstof en voor de andere helft met stikstofdampen; dit om een geleidelijke temperatuursovergang te bewerkstelligen.
2.2.5. CO-CULTUUR TUSSEN FIBROBLASTEN EN ENDOTHEEL 2.2.5.1. Vergelijking medium in co-cultuur + bepaling ideale verhouding Fibroblasten en GFP getransfecteerde endotheelcellen worden in een co-cultuur gebracht volgens verschillende verhoudingen en in verschillende media. Verhoudingen: 100:0, 80:20, 50:50, 20:80, 0:100 Media: Medium 1: HFF:EGM-1 (50%:50%) Medium 2: EGM-2 Cellen worden uitgezaaid in de gepaste verhoudingen, 1ml gepast medium wordt toegevoegd. Gedurende 5 dagen wordt er op hetzelfde tijdstip een foto genomen van de cellen bij vergroting 10x. Daarna worden de cellen losgemaakt en geteld, NIET de controles!
!
"
(§ 2.2.3.1. opmerking: 500 µl trypsine, 200 µl FCS.) Op dag 3 dient het medium van de nog resterende cellen ververst te worden.
2.3. MODIFICATIE VAN EEN BIOMATERIAAL 2.3.1. KARAKTERISATIE VAN CELLEN VIA IMMUNOHISTOCHEMISCH KLEUREN Om een modificatie te kunnen uitvoeren moeten we op zoek gaan naar celspecifieke oppervlaktemerkers. Deze zijn geschikt voor zowel de karakterisatie van het endotheel als voor de modificatie van het biomateriaal. Een intracellulaire merker kan gebruikt worden voor de karakterisatie maar niet voor de modificatie! 2.3.1.1. Geselecteerde merkers
PECAM-1 (endotheel)
1ste Antilichaam (AL 1) Goat anti PECAM-1
2de Antilichaam (AL 2) Biotin- Rabbit anti Goat
Fluorescent signaal Streptavidin/FITC
VE-cadherine (endotheel)
Santa Cruz 8306 Mouse anti VEcadherine
DAKO E0466 Biotin- Rabbit anti Mouse
DAKO F0422 Streptavidin/FITC
Santa Cruz 5275 Rabbit anti VWF
DAKO E0413 Biotin- Swine anti Rabbit
DAKO F0422 Streptavidin/FITC
DAKO A082 Mouse anti AS02
DAKO E0431 Biotin- Goat anti Mouse
DAKO F0422 Streptavidin/TR of FITC
Dianova Mouse anti 5B5
Sc-3797 Biotin-Rabbit anti mouse
Sc-3797 Streptavidin/FITC
Merker
VWF (endotheel)
AS02 (fibroblast)
5B5 (fibroblast)
Verdunningen AL 1: 1/100 AL 2: 1/300 FITC: 1/300 AL 1: 1/100 AL 2: 1/300 FITC: 1/300 AL 1: 1/200 AL 2: 1/200 FITC: 1/300 AL 1: 1/200 AL 2: 1/300 FITC: 1/300 AL 1: 1/100 AL 2: 1/300 FITC: 1/300
DAKO M877 DAKO EO413 DAKO F0422 Tabel IV: Gebruikte antilichamen voor immunohistochemische kleuring van endotheel en fibroblasten.
2.3.1.2. Methode Cellen worden volgens het gewenste aantal uitgezaaid op coverslips. Vervolgens wordt er voor minstens 24u gewacht.
!
"=!
Benodigdheden Blokkingsserum 5% NRS (normal rabbit serum)
hoeveelheid
Verdunningsbuffer
hoeveelheid
0,5 ml
Blokkingsserum
1 ml
0,1 g
PBS
9 ml
(DAKO X0902) 5% NSS (normal swine serum) (DAKO X0901) 5% NGS (normal goat serum) (DAKO X0907) !keuze afhankelijk van 2de AL 1% BSA (bovine serum albumin) (Roche Cat. No. 10 735 086 001) PBS (phosphate buffered saline)
10 ml
0,2% Tween 20 (polysorbaat)
200 µl
Tabel V: Samenstelling blokkingsserum en verdunningsbuffer voor het uitvoeren van immunohistochemische kleuring.
Principe ! !!!
!
Oppervlaktemerker O??t:1\ VLM::T! HE:Rt£l\
y y ......
ste
-1c.. 1 ~nantilichaam UC\iAI\'1 2de antilichaam
1(.. ANT, UGHr..t\", Fluorescente probe (FITC/TR) FWORECicrtJTE
(fITG
r~OBt
ITR)
Figuur 5: Schets omtrent koppeling van antilichamen aan oppervlaktemerker.
Protocol De coverslips dienen eerst gefixeerd te worden met aceton gedurende 5 minuten. Vervolgens dient men 2 keer te spoelen met PBS gedurende 5 minuten. Nu kan men aan de eigenlijke immuunkleuring beginnen. Gedurende 30 minuten wordt er blokkingsserum toegevoegd (tabel V) en vervolgens terug 2 maal te spoelen met PBS gedurende 5 minuten. Nu kan het 1ste antilichaam toegevoegd worden in de verdunningsbuffer volgens de juiste verhouding (tabel IV). Dit 1ste antilichaam heeft een incubatietijd van 2 uur. Vervolgens dient men terug 2 maal te spoelen met PBS. Nu kan het 2de antilichaam toegevoegd worden, dit heeft een incubatietijd van 30 minuten en dient ook in de verdunningsbuffer volgens de juiste !
"?!
verhouding toegevoegd te worden (tabel IV). Vervolgens teug 2x spoelen met PBS. Tot slot moeten we nog het streptavidin/FITC-TR toevoegen, dit gedurende 30 minuten en ook volgens de gepaste verdunning (tabel IV). Vanaf nu moet alles in het donker gebeuren. Daarna terug spoelen met PBS gedurende 5 minuten. Tot slot moet men nog tegenkleuren en monteren. Een druppel Vectashield (met DAPI) wat zorgt voor kernkleuringen wordt aangebracht op een draagglas. Plaats de draagglaasjes in een map en plaats in koelkast gedurende 10 minuten. Nu kan men de fluorescentie bekijken.
2.3.2. CO-CULTUUR OP GEMODIFICEERDE MATERIALEN De volgende stap in het proces is het uitzaaien van de co-cultuur op het biomateriaal (PMMA, PDMS) met de gepaste modificatie (dopamine, gelatine). Op deze manier kan worden nagegaan onder welke conditie de beste resultaten bekomen worden. Opstelling PMMA (C)
PMMA D
PMMA DG
PMMA (CO)
PDMS (C)
PDMS D
PDMS DG
PDMS (C0)
Follow
+
+
+
-
+
+
+
-
D1
+
+
+
-
+
+
+
-
D3
+
+
+
-
+
+
+
-
D5
+
+
+
-
+
+
+
-
D7
+
+
+
-
+
+
+
-
Tabel VI:Schets van de 48well plaat voor het experiment: co-cultuur op gemodificeerd biomateriaal. D = dopamine DG = dopamine-gelatine
C= (-mod + Ab) CO= (-mod – Ab)
+ = behandeld met VE-cadherine - = geen behandeling met VE-cadherine
Protocol Op dag 1 dienen de verschillende celtypes gelabeld te worden (§ 2.4.). Daarnaast worden de verschillende biomaterialen overgebracht in een 48 niet adherente well plaat en worden deze behandeld met VE-cadherine. Hiervoor voegt men per well 2 µl anti-VE-cadh samen met 198 µl PBS toe. Dit laat men overnachten bij 37°C op een shaker. Op dag 2 dient het biomateriaal gespoeld te worden met PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De biomaterialen worden overgebracht naar een 24 adherente well plaat waarop de cellen volgens de gewenste verhouding vervolgens worden uitgezaaid in een gepaste hoeveelheid EGM-2 medium. Schud tot slot de plaat voorzichtig heen en weer, let !
$B!
erop dat de biomaterialen niet zweven in het medium. Na 1 uur tijd kan men de cellen bekijken. Op dag 1, 3, 5, 7 worden de cellen opnieuw bekeken. Er worden zowel foto’s genomen van de cellen op het biomateriaal zelf, als van de cellen naast het biomateriaal. Alvorens de cellen los te maken m.b.v. trypsine, wordt het biomateriaal overgebracht naar een andere cultuurplaat. Op deze manier kan men bepalen wat de celverhouding is op het biomateriaal zelf en de celverhouding naast het biomateriaal.
2.4. LABELEN VAN EEN CO-CULTUUR 2.4.1. KEUZE VAN DE VIABILITEITSMERKER VOOR ELK CELTYPE 2.4.1.1. Methode Er zijn 3 verschillende viabiliteitsmerkers voor handen: CTR, CTB, CaAM. Om na te gaan welke kleuring men best gebruikt voor welk celtype, werden deze 3 merkers getest op viabiliteit. Protocol De HUVEC en HFF worden uitgezaaid in een 96 well plaat (20.000 cellen/well). De volgende dag worden de cellen gelabeld (§ 2.4.2.1.) volgens onderstaande verhoudingen (tabel VII). Probes (Life Technologies Concentratie
TM
CTR
CTB
CaAM
1 µM
10 µM
2 µM
(0,5 µl in 5 ml)
(5 µl in 5 ml)
(10 µl in 5 ml)
)
Tabel VII: gebruikte probes en hun bijhorende gebruikte concentraties.
Na overnachting in incubator, wordt de volgende dag een MTT-assay uitgevoerd (§ 2.5.1.) om een idee te krijgen over de viabiliteit van de cellen na behandeling ten opzichte van niet behandelde cellen.
!
$"!
2.4.2. CO-CULTUUR: GELABELDE FIBROBLASTEN EN GETRANSFECTEERDE OF GELABELDE HUVEC 2.4.2.1 Methode: Viabiliteitsmerker CTR (fibroblasten) Benodigheden Serumvrij medium (fibroblasten)
Hoeveelheid (10 ml)
DMEM Glutamax
9,726 ml
NaPyruvaat
12 µl
L-Glutamine
250 µl
P/S
12 µl
Tabel VIII: Samenstelling serumvrij medium voor het uitvoeren van een HFF labeling met CTR
Protocol Nadat de cellen eerst werden uitgezaaid in een T25 falcon en overnacht hebben, wordt het medium verwijderd. Daarna dient men te spoelen met PBS. Vervolgens wordt er 5 ml serumvrij medium (tabel VIII) toegevoegd aan de cellen gedurende 1 uur. Vervolgens maken we het CTR mengsel, hiervoor wordt 0,5 µl CTR gemengd met 5 ml serumvrij medium (in donker). Dit wordt op de cellen gebracht en in de incubator geplaatst gedurende 20 minuten (vorige serumvrij medium verwijderen!). Daarna wordt het serumvrije medium vervangen door normaal medium en dienen we een uur te wachten vooraleer men de fluorescentie kan gaan bekijken. 2.4.2.2. Methode: Viabiliteitsmerker CaAM (endotheel) Benodigdheden Serumvrij medium (endotheel) Endothelial cell basal Medium
Hoeveelheid (10 ml) 9,970 ml
hEGF
10 µl
GA-1000
10 µl
Hydrocortisone
10 µl
Tabel IX: Samenstelling van serumvrij medium voor het uitvoeren van een HUVEC labeling met CaAM.
!
$$!
Protocol (zie § 2.4.2.1.), als uitzonderingen hierop dient wel vermeld te worden dat het CaAM mengsel bestaat uit 5 ml SFM en 10 µl CaAM en dat het serumvrij medium nu specifiek is voor HUVEC zoals weergegeven in tabel IX. 2.4.2.3. Methode: GFP-transfectie Naast het kleuren van HUVEC cellen kan men ook opteren voor een andere manier van labelen van endotheelcellen (HUVEC), men kan namelijk ook kiezen voor een GFPtransfectie. Benodigdheden Serumvrij medium (endotheel)
Hoeveelheid (±10 ml)
(-BBE, - G.A., + 20% FCS) Endothelial cell basal Medium
10 ml
hEGF
2 ml
GA-1000
10 µl
Hydrocortisone
10 µl
Tabel X: Samenstelling van serumvrij medium voor het uitvoeren van GFP-transfectie
Principe Voor de transfectie van HUVEC cellen kiezen we voor TranspassTMHUVEC Transfection Reagent omdat deze specifiek ontwikkeld is voor de transfectie van endotheelcellen. Het TranspassTMHUVEC Transfection Reagent bestaat uit 2 componenten: De HUVEC Reagent component, een non-lipide kationisch transfectie reagent en Transpass V, een adenovirus afgeleide component. Protocol Voor het uitvoeren van de transfectie, maken wij gebruik van een 6 well plaat. Na het verwijderen van het medium aanwezig in de 6 well plaat, wordt er een gepaste hoeveelheid van het hierboven staande medium (Tabel X) toegevoegd (2ml/well). Dit blijft er gedurende 1uur op, en wordt in de incubator geplaatst. Na dit uur wordt er een foto gemaakt (fase/contrast) van de cellen. Vervolgens wordt de Transpass V mix gemaakt. Dit bestaat uit 3 componenten: DNA, Reagent Component, Transpass V. Per well dient men 3 µg DNA toe te voegen in 250 µl
!
$3!
DMEM (serumvrij) en te vortexen. Vervolgens voegt men hieraan 6 µl Reagent component toe (niet vortexen) en tot slot 12 µl Transpass V (Deze component dient volledig op ijs ontdooid te worden). Dit mengsel wordt vervolgens voorzichtig gemengd, door het proefbuisje zachtjes te draaien. Dit laat men dan vervolgens zo’n 20 à 30 minuten staan onder de flow. Daarna voegt men per well 250 µl van dit mengsel toe druppelgewijs. De plaat wordt terug in de incubator geplaatst. Dit ten minste gedurende 24 tot 48 uur vooraleer te analyseren. Wel wordt er aangeraden om 24 uur na de transfectie het medium te verversen. 2.4.2.4. Co-cultuur tussen CTR fibroblasten en GFP getransfecteerde HUVEC Wanneer beide celtypes gelabeled zijn, dienen deze losgemaakt te worden met Trypsine/FCS (§ 2.2.3.1.). Vervolgens worden de cellen geteld en uitgezaaid volgens een welbepaalde verhouding. Op dag 1,2,5 en 7 wordt de fluorescentie bekeken. Het is van belang dat deze zichtbaar blijft gedurende 7 dagen en dat de verhouding waarin de celtypes werden uitgezaaid min of meer blijft behouden.
2.5. VIABILITEITS ASSAYS 2.5.1. MTT ASSAY Benodigheden MTT mengsel MTT poeder
Hoeveelheid ( 20 ml) 10 mg
(Calbiochem, N°475989)
Lysebuffer Triton X-100
Hoeveelheid (5ml) 50 µl
(Fluka Analytical, reduced form)
Steriel aqua
2 ml
Steriel aqua
450 µl
Cultuurmedium
18 ml
Isopropanol/HCl
4,5 ml
Tabel XI: Samenstelling van MTT mengsel en lysebuffer nodig voor het uitvoeren van een MTTassay.
Protocol Voor een 96 wellplaat, wordt 200 µl MTT mengsel toegevoegd per well (tabel XI). De plaat wordt afgedekt met parafilm en laat men gedurende 4 uur incuberen op een shaker in de warme kamer. Daarna wordt het MTT mengsel verwijderd en wordt er per well 200 µl lysebuffer toegevoegd (tabel XI), opnieuw wordt de plaat met parafilm afgedekt en in de
!
$@!
warme kamer geplaatst. Dit laat men nu incuberen gedurende 30 minuten. Vervolgens kan men de absorbantie gaan meten bij 570 nm.
2.5.2. PRESTOBLUE REAGENT Benodigdheden Life TechnologiesTM PrestoBlueTM Reagent EGM-2 en/of HFF medium Protocol PrestoBlueTM reagens wordt verdund met het gepaste medium volgens een 1/9 verdunning (mix medium), dit gebeurt in het donker. Het medium dat op de cellen aanwezig is, wordt verwijderd en vervangen door het mix medium. Dit moet er gedurende 20 minuten opblijven en wordt geplaatst in de incubator. Vervolgens wordt het mix medium verwijderd en overgebracht naar een nieuwe wellplaat. Op de cellen wordt er vers medium aangebracht. Tot slot dient men de absorbantie onmiddellijk meten.
!
4EJGOK6NWJ-2!!!!!!!!!"_!-KJ[KJQJI![MI!!!!!!!!!!!!$_!.IPWYJEJI!!!!!! !!!3_!>NWKEJGPJIOHJ!GHQIMMN!!!!!@_!,MOM![JEbJERJI! EJMQJIO! !!EJMQJIOHM!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!NJLJI! ! !!!!!!!!! Figuur 7: Protocolvoorstelling PrestoBlueTM [31].
2.5.3. VERGELIJKING MTT VS PRESTOBLUE Om te achterhalen welk van deze twee assays nu het best werkt voor onze testen, dienen we beide technieken met elkaar te vergelijken. Benodigdheden Zie § 2.5.1. - 2.5.2.
!
$C!
Protocol Een welbepaald aantal (bv. 10.000) HUVEC of HFF cellen (niet in co-cultuur!) worden uitgezaaid in een 24 wellplaat. Dit wordt gedaan op 2 wellplaten, de ene plaat wordt gebruikt om PrestoBlue op uit te voeren, de andere voor MTT. Op dag 1,2,5 en 7 wordt er een PrestoBlue assay uitgevoerd (zie § 2.5.2.). Op dag 1,5 en 7 wordt er een MTT uitgevoerd (zie § 2.5.1.)
2.6. STATISTISCHE ANALYSE Om de bekomen resultaten te kunnen analyseren, dienen deze onderworpen te worden aan een statistische analyse. Hiervoor dient eerst worden na te gaan of de resultaten al dan niet normaal verdeeld zijn. Afhankelijk van het resultaat wordt het type test geselecteerd. Wanneer de resultaten normaal verdeeld zijn (parametrisch), wat meestal zo is, wordt afhankelijk van de situatie gekozen voor een one-sample t-test, independent sample t-test, paired sample t-test of ANOVA-test. Wanneer de resultaten daarentegen niet normaal verdeeld zijn (nietparametrisch) wordt gekozen - afhankelijk van de situatie - voor een normaliteitstest, Wilcoxon matched-pairs signed-ranks test of een Mann-Whitney U test. Afhankelijk van deze testen worden de bijbehorende P-waarden berekend. Bij een P< 0,05 spreekt men van significant verschillend en kan de nulhypothese verworpen worden. De nulhypothese in deze analyses veronderstelt een gelijk gemiddelde. Wanneer de nulhypothese niet verworpen kan worden, wil dit zeggen dat men te maken heeft met gelijke populaties. De waarden die significant verschillend zijn worden in de grafieken aangeduid met een asterix (*).
!
$5!
3. RESULTATEN & CONCLUSIES
3.1. OPTIMALISATIE CULTUUROMSTANDIGHEDEN 3.1.1. CELLEN SPLITSEN/LOSMAKEN: TRYPSINE VS REAGENTPACK Volgens de firma LonzaClonetics!, zou een behandeling met ReagentPack efficiënter zijn dan een behandeling met Trypsine/FCS. Dit werd nagegaan voor getransfecteerde HUVEC, oorspronkelijk werden er 100.000 cellen uitgezaaid in een T25 falcon, en na 4 dagen werden de cellen losgemaakt en geteld. Daarnaast werden ook foto’s genomen op verschillende tijdstippen, zodat de morfologie van de cellen kon gevolgd worden (7. Bijlage, fotoreeks 1). Uit de foto’s kan besloten worden dat de cellen voor beide behandelingen identiek zijn! De behandeling heeft dus geen invloed op de morfologie. Dit experiment werd 8 keer herhaald, de resultaten die verwerkt werden in figuur 8 zijn het gemiddelde daarvan. 'NOPQRLI*SQ+*1IKTILM0KUV* $cCB+XB5!
4IJKKLMKJ*
$cBB+XB5! "cCB+XB5! %JUHVVJNVJ!
"cBB+XB5! CcBB+XBC! BcBB+XBB! -EFZGHIJ!
0JMQJIO4MPR!
Figuur 8: Weergave van absolute cel aantal voor Trypsine en ReagentPack behandeling
Alhoewel het verschil tussen beide behandelingen niet significant is, kan men wel duidelijk een trend waarnemen. De behandeling met ReagentPack heeft geen betere resultaten.
!
$
3.1.2. GESCHIKT MEDIUM VOOR CO-CULTUUR FIBROBLASTEN EN ENDOTHEEL Het in cultuur houden van 2 verschillende celtypes samen is niet zo eenvoudig. Daarom is het belangrijk om te zoeken naar een medium waarin de cellen blijven prolifereren en waarbij de verhouding waarin de celtypes uitgezaaid zijn behouden blijft (§ 3.3.1.2.). Om de optimale cultuuromstandigheden in co-cultuur (HFF en getransfecteerde HUVEC) na te gaan, hebben we 2 media met elkaar vergeleken. Medium 1 (M1) bestaat uit 50% HFF medium en 50% EGM-1 medium. Medium 2 (M2) is een specifiek endotheliaal medium EGM-2 (zie § 2.2.2.). Gedurende 5 dagen werden de cellen voor beide condities geteld. De verhoudingen 100:0, 80:20, 50:50, 20:80 en 0:100 komen overeen met de initieel uitgezaaide verhouding tussen de fibroblasten: HUVEC. Dit experiment werd 3x herhaald, de resultaten die verwerkt werden in figuur 9-13 zijn het gemiddelde daarvan.
@BBBBB! 3CBBBB! 3BBBBB! $CBBBB! $BBBBB! "CBBBB! "BBBBB! CBBBB! B!
Verhouding 80:20
$CBBBB!
d
"BB/B! 2"! "BB/B! 2$!
UIJKKLMKJ*
UIJKKLMKJ**
Verhouding 100:0
$BBBBB! "CBBBB!
d!!!!!!!d!
=B/$B! 2"!
"BBBBB!
=B/$B! 2$!
CBBBB! B!
,"! ,$! ,3! ,@! ,C!
,"! ,$! ,3! ,@! ,C!
W*XKTIL**
W*XKTIL*
Verhouding 50:50
Verhouding 20:80
$BBBBB!
$BBBBB!
"CBBBB!
CB/CB! 2"!
"BBBBB!
CB/CB! 2$!
CBBBB! B!
!d!
UIJKKLMKJ*
$CBBBB!
UIJKKLMKJ*
$CBBBB!
"CBBBB!
$B/=B! 2"!
"BBBBB!
$B/=B! 2$!
CBBBB! B!
,"! ,$! ,3! ,@! ,C!
,"! ,$! ,3! ,@! ,C!
W*UIJJIL*
W*XKTIL**
Verhouding 0:100
!
$=!
$CBBBB! UIJKKLMKJ*
$BBBBB! "CBBBB!
B/"BB! 2"! B/"BB! 2$!!
"BBBBB! CBBBB! B! ,"! ,$! ,3! ,@! ,C! W*XKTIL**
Figuur 9-13: Weergave cel aantal in functie van het aantal dagen voor verschillende verhoudingen (100:0 – 80:20 – 50:50 – 20:80 – 0:100) binnen een co-cultuur én voor verschillend cultuurmedia (M1 – M2).
Voor de verschillende verhoudingen is de proliferatiecapaciteit van de cellen in medium 2 groter dan bij cellen in medium 1. De eerste 2 dagen verloopt dit nog gelijkaardig, maar vanaf dag 3 wordt het verschil echt duidelijk. Hieruit kan geconcludeerd worden dat medium 2 beter geschikt is voor een co-cultuur. Uit de statistische analyse blijkt dat er voor de meeste waarden geen statistisch verschil was (P>0,05). Ondanks dit feit, kan er uit de grafieken wel afgeleid worden dat medium 2 het beter doet dan medium 1. Aangezien deze trend bij alle verhoudingen kan waargenomen worden, werd er dan toch besloten om met dit medium 2 verder te gaan in de loop van de volgende experimenten.
3.2. LABELEN VAN CELLEN M.B.V. VIABILITEITSMERKERS OF TRANSFECTIE 3.2.1. VERGELIJKING VIABILITEITSMERKERS CTR – CTB – CaAM Om te kunnen bepalen welke viabiliteitsmerkers voor ons het beste zijn, werden de verschillende mogelijkheden (CaAM, CTR, CTB) met elkaar vergeleken. Het experiment werd zowel voor HUVEC als HFF uitgevoerd. Om de viabiliteit na behandeling te kunnen nagaan, werd een MTT-assay uitgevoerd. Vooraleer de MTT-assay werd uitgevoerd, werden er foto’s genomen om na te gaan of de labeling gelukt was (7. Bijlage, fotoreeks 2 & 3). Uit de resultaten bleek dat de toevoeging van de merkers geen negatieve invloed heeft op de viabiliteit van de cellen in vergelijking met de controles. CTB heeft de beste resultaten voor zowel de HFF als de HUVEC. Wanneer deze merker wordt gebruikt, wordt er al vanaf dag 2
!
$?!
problemen waargenomen met de zichtbaarheid van de kleuring. Vooral bij de HUVEC zien we vertroebeling/vervaging van de labeling. Dat is dan de reden waarom er voor HFF CTR wordt gekozen, en CaAM voor de HUVEC. Op deze manier zullen in de experimenten de HFF altijd rood gekeurd zijn (CTR) en de HUVEC altijd groen. Deze groene kleur kan dus bekomen worden door ofwel een labeling (CaAM) of een transfectie (GFP; Green Fluorescent Protein). Op deze manier kan er dus geen verwarring ontstaan omtrent de kleurcodes. ! 3.2.2. GFP-TRANSFECTIE VAN ENDOTHEEL Een andere manier van labelen is mogelijk m.b.v. een transfectie. Er zijn verschillende reagentia voorhanden. Hier werd gekozen voor Transpass V omdat deze specifiek is voor endotheel. 24u en 48u na de transfectie werden er foto’s genomen om het percentage getransfecteerde cellen te kunnen bepalen. Wanneer men de resultaten bekijkt (Figuur 15) ziet men dat de transfectie efficiëntie zeer laag is. Na 24u zit men aan 10%, na 48u is dit nog maar een goede 7% meer. Dit maakt dat deze methode zeer inefficiënt is om de cellen te labelen én daarbij komt nog eens dat de labeling onvoldoende lang aanwezig blijft! (7. Bijlage, fotoreeks 4A-4B). Dit experiment werd 3x herhaald, de resultaten die verwerkt werden in figuur 14 zijn het gemiddelde daarvan.
0INUILMKTI**
'NKLQZIUMRI*IZ[RUR\LMRI* "=! "5! "@! "$! "B! =! 5! @! $! B!
4JEPJIOMQJ! QJNWROJ! OEMIG^JPOHJ!
$@W!
@=W! 'RYX*
Figuur 14: Weergave van het percentage getransfecteerde HUVEC in functie van de tijd.
!
3B!
3.2.3. LABELING VAN EEN CO-CULTUUR 3.2.3.1. CTR gelabelde fibroblasten en GFP-getransfecteerde HUVEC Om de verschillende celtypes tijdens het experiment te kunnen volgen, dienen deze gekleurd te worden. Hiervoor kunnen viabiliteitsmerkers gebruikt worden, of een transfectie uitgevoerd worden. In dit geval, maken we gebruik van getransfecteerde HUVEC, hierbij blijft het signaal aanwezig omdat we te maken hebben met geïmmortaliseerde cellen. Bij de viabiliteitsmerkers is dit wel anders. Het signaal verzwakt namelijk na verloop van tijd. Toch is het van belang dat de kleuring gedurende 7 dagen zichtbaar blijft, dit om ervoor te zorgen dat er gedurende het experiment toch nog onderscheid kan gemaakt worden tussen de verschillende celtypes. Tot en met dag 7 werden er foto’s genomen (7. Bijlage, fotoreeks 5). De aankleuring van HFF (CTR) gedurende het verloop van het experiment verminderd. Tot en met dag 5 is de kleuring duidelijk, maar vanaf dag 7 is het onderscheid moeilijker te maken. 3.2.3.2. CTR gelabelde fibroblasten en CaAM gelabelde HUVEC Uit vorige experimenten weet men dat de labeling van de fibroblasten m.b.v. CTR redelijk goed stand houdt. Wanneer men niet met de geïmortaliseerde cellijn kan werken, dienen ook de HUVEC aangekleurd te worden, er werd gekozen voor CaAM (§ 3.2.1.). Uit de foto’s (7. Bijlage, fotoreeks 6) kan besloten worden dat de CaAM kleuring goed stand houdt tot en met dag 7. De aankleuring is zelfs duidelijker dan de CTR behandeling voor de fibroblasten! We kunnen dus concluderen dat op het vlak van labeling er geen probleem is wanneer we de geïmortaliseerde cellen niet kunnen gebruiken. De CaAM labeling blijft voldoende lang zichtbaar.
3.3. CO-CULTUUR: FIBROBLASTEN EN ENDOTHEEL 3.3.1. CO-CULTUUR: HFF EN GFP-GETRANSFECTEERDE HUVEC 3.3.1.1. Bepaling van de proliferatiecapaciteit Na het in cultuur brengen van de celtypes bij de verschillende verhoudingen, kan nagegaan worden hoe de proliferatie binnen de verschillende verhoudingen daarbij verloopt. Op deze manier wordt een idee bekomen over de onderlinge verschillen tussen de verhoudingen. Dit experiment werd 3x herhaald, de resultaten die verwerkt werden in figuur 15 zijn het gemiddelde daarvan.
!
3"!
&INTIJRYVRLT*UIJKKLMKJ*S]]N*SINQU^RJJILXI* SIN^]_XRLTIL*
4IJKKLMKJ*
$CBBBB! $BBBBB! "CBBBB!
=B/$B!2$!
!!!d!
"BBBBB!
CB/CB!2$!
CBBBB!
$B/=B!2$!
B! ,"!
,$!
,3!
,@!
,C!
W*XKTIL*
Figuur 15: Absolute cel aantal in functie van het aantal dagen weergegeven voor verschillende verhoudingen bij medium 2.
Via de grafiek in figuur 15 kan afgeleid worden dat de verhouding 80:20 de grootste proliferatiecapaciteit heeft, er kan dus gezegd worden dat de HFF cellen (die hierbij in grotere concentratie aanwezig zijn), sneller gaan delen dan de getransfecteerde HUVEC. Dit verschil is echter wel beperkt, het uiteindelijke verschil tussen de 3 verhoudingen is miniem waardoor we wel kunnen stellen dat de delingssnelheid voor de beide celtypes praktisch hetzelfde is. Wanneer er wordt gekeken naar de statistische verwerking, kunnen er een aantal zaken geconcludeerd worden. Met behulp van de ANOVA-test, waarbij de drie verhoudingen ter zelfder tijd met elkaar vergeleken worden, is er geen significant verschil uitgezonderd voor dag 3 (*). Wanneer er daarentegen gewerkt wordt met een T-test, zijn de verhoudingen 80:20 en 20:80 grotendeels significant (D2,D3,D4). Als deze twee verhoudingen apart vergeleken worden met 50:50 zijn er in beide gevallen geen significante verschillen (uitzondering voor 80:20 vs. 50:50 op dag 3). Dit maakt dat de verhouding 50:50 een goede keuze is. 3.3.1.2. Bepaling HFF/ HUVEC verhouding Daarnaast wordt ook nog nagegaan of de verhoudingen waarin de cellen in co-cultuur werden uitgezaaid, ook behouden blijft. Vooraleer de trypsine behandeling werd uitgevoerd, werden er foto’s genomen (Fase/contrast, GFP). Door te werken met een speciaal telprogramma (Image J64) – waarbij de cellen manueel worden aangeduid - kan het percentage HUVEC nagaan worden in de cultuur. (# GFP/ # Fase/contrast) Dit experiment werd 3x herhaald, de resultaten die verwerkt werden in figuur 16-18 zijn het gemiddelde daarvan.
!
3$!
Verhouding 80:20
0INUILMKTI*95&$4*
/B`*95&$4* "BBcBB! ?BcBB! =BcBB!
2JVHWU!"! 2JVHWU!$!
,"!
,$!
,3!
,@!
Fase/contrast - GFP 80:20 M1,10x, D3
,C!!
W*XKTIL*
Verhouding 50:50 8B`*95&$4** 0INUILMKTI*95&$4*
"BBcBB! =BcBB! 5BcBB! 2JVHWU!"!
@BcBB!
2JVHWU!$!
$BcBB! BcBB! ,"!
,$!
,3!
,@!
,C!!
W*XKTIL*
Fase/contrast - GFP 50:50 M2, 10x, D3 Verhouding 20:80
?B`*95&$4* 0INUILMKTI*95&$4*
"$BcBB! "BBcBB! =BcBB! 5BcBB!
2JVHWU!"!
@BcBB!
2JVHWU!$!
$BcBB! BcBB! ,"!
,$!
,3! W*XKTIL*
,@!
,C!!
Fase/contrast - GFP 20:80 M1, 10x, D3
Figuur 16-18: Weergave percentage HUVEC-GFP in co-cultuur in functie van het aantal dagen voor verschillende verhoudingen (80:20 – 50:50 – 20:80) en voor verschillend cultuurmedia (M1 – M2). Weergave van fase contrast en GFP-foto’s om verhouding te kunnen nagaan.
!
33!
De verschillende verhoudingen blijven gedurende het experiment goed bewaard, dit is zeer positief. Op deze manier kan besloten worden dat het ene celtype het andere niet gaat overgroeien of domineren. Vanaf nu kiezen wij dan ook om cellen uit te zaaien volgens een 50%-50% verhouding in co-cultuur. Uit de statistische analyse blijkt dat er bij geen enkele condities significante verschillen kan worden waargenomen tussen beide media over de verschillende dagen heen. Men kan dan ook concluderen dat voor beide media de verhouding goed behouden blijft. Aangezien men uit voorafgaande experimenten al besloten had om EGM-2 (M2) te gebruiken in een co-cultuur, kiest men ook in deze situatie voor EGM-2 (§ 3.1.2.). 3.3.2. CO-CULTUUR: CTR HFF EN CaAM HUVEC 3.3.2.1. Bepaling van de proliferatiecapaciteit Het vorige experiment werd herhaald, maar nu met CaAM gelabelde cellen i.p.v. de geïmortaliseerde HUVEC-GFP. Dit wordt gedaan om na te gaan of die transfectie geen invloed hebben op de proliferatie. Hiervoor werden eerst beide celtypes gelabeled, en vervolgens in co-cultuur gebracht. Elke dag werden er foto’s (GFP/TxRed, 10x) genomen. Hierdoor kan nagaan worden of de verhoudingen gerespecteerd blijven gedurende het experiment, en of de kleuring (vnl CaAM) voldoende lang zichtbaar bleef. Vervolgens werden de cellen los gemaakt en geteld om zo een idee te krijgen over de proliferatiecapaciteit binnen de verschillende verhoudingen. Dit experiment werd 3x herhaald, de resultaten die verwerkt werden in figuur 19 zijn het gemiddelde daarvan.
UIJKKLMKJ*
&INTIJRYVRLT*UIJKKLMKJ*S]]N*SINQU^RJJILXI* SIN^]_XRLTIL* d
@CBBBB! @BBBBB! 3CBBBB! 3BBBBB! $CBBBB! $BBBBB! "CBBBB! "BBBBB! CBBBB! B!
=BD$B! CBDCB! $BD=B!
,"!
,$!
,3!
,@!
,C!
W*XKTIL**
Figuur 19: Absolute cel aantal in functie van het aantal dagen weergegeven voor verschillende verhoudingen bij medium 2.
!
3@!
In figuur 19 wordt het totale celaantal weergegeven voor iedere dag. Het celaantal neemt toe naarmate we verder in de tijd gaan. Vanaf dag 3 is er een duidelijk verschil tussen de drie verhoudingen. Daar waar het meest HFF cellen in co-cultuur waren gebracht, neemt ook het celaantal het meest toe. Er kan gezegd worden dat de HFF cellen sneller delen, de proliferatiecapaciteit ligt dus hoger dan voor de HUVEC. Dit resultaat werd ook gezien bij de geïmortaliseerde HUVEC (§ 3.3.1.) maar wanneer beide grafieken vergeleken worden (figuur 15 en figuur 19), is het wel duidelijk dat het verschil tussen de drie verhoudingen (t.h.v. dag 5) groter is bij de CaAM gelabelde cellen. Mogelijks kennen de geïmortaliseerde HUVEC een betere proliferatie dan de gewone HUVEC. Uit de statistische analyse blijkt dat er een statistisch verschil kan waargenomen worden vanaf dag 5 tussen de verhoudingen 80:20 – 20:80 en 50:50 – 20:80. Hieruit kan men afleiden dat de delingscapaciteit van HFF hoger is dan deze van HUVEC. Aangezien we uit vorige experimenten hadden besloten dat de CaAM labeling van HUVEC geen negatieve invloed had op de viabiliteit (§ 3.2.1), vermoedt men hier dat de verminderde delingscapaciteit het gevolg is van het gebruik van een oudere passage. 3.3.2.2. Bepaling HFF/ HUVEC verhouding Voor de verhouding te bepalen, werd dezelfde methode gehanteerd als in § 3.3.1.2. Percentage HFF bekomt men door het aantal rode cellen te delen door het aantal Fase/contrast cellen, of men kan het percentage HUVEC bepalen door het aantal groene cellen te delen door het aantal Fase/contrast cellen. Dit experiment werd 3x herhaald, de resultaten die verwerkt werden in figuur 20-22 zijn het gemiddelde daarvan. Verhouding 80:20
0INUILMKTI*95&$4*
/B`*95&$4* "BBcBB! ?BcBB! =BcBB!
$Be! 1'9+(!
VMQ!"! VMQ!$!
VMQ3! VMQ!@! VMQ!C! W*XKTIL**
!
Fase/contrast-GFP/TxRed, 80:20, 10x,D3
3C!
Verhouding 50:50
0INUILMKTI*95&$4*
8B`*95&$4* "BBcBB! ?BcBB! =BcBB!
CBe! 1'9+(!
VMQ!"!
VMQ!$!
VMQ!3!
VMQ!@!
VMQ!C!
Fase/contrast-GFP/TxRed, 50:50, 10x, D3
W*XKTIL*
Verhouding 20:80
0INUILMKTI*95&$4*
?B`*95&$4* "BBcBB! ?BcBB! =BcBB!
=Be! 1'9+(!
VMQ!"!
VMQ!$!
VMQ!3! W*XKTIL*
VMQ!@!
VMQ!C!
B
Br
Fase/contrast-GFP/TxRed,20:80,10x, D3
Figuur 20-22: Weergave percentage HUVEC-CaAM in co-cultuur in functie van het aantal dagen voor verschillende verhoudingen (80:20 – 50:50 – 20:80) in medium 2. Weergave van fase contrast, GFP en TxRed foto’s om verhouding te kunnen nagaan.
Wanneer deze resultaten vergeleken worden met de resultaten van een co-cultuur tussen HFF (CTR) en HUVEC-GFP (§ 3.3.1.2.) ziet men dat in dit geval, de resultaten meer gaan afwijken van de initiële uitzaaiverhoudingen. De 20% HUVEC kent het minste uitschieters in vergelijking met de andere uitzaaicondities. Daarnaast vertoont de 20% verhouding de meeste gelijkenissen met deze van de co-cultuur HFF (CTR) en HUVEC-GFP (§ 3.2.1.2.). Toch ziet men dat voor alle condities (20% - 50% - 80%), de bekomen waarden zich steeds onder de uitzaaiverhoudingen bevindt. Vooral bij de 80% HUVEC valt dit op. Ook hier kan dit mogelijks verklaard worden door het werken met een oudere HUVEC passage (P8).
!
35!
3.4. MODIFICATIE VAN EEN BIOMATERIAAL 3.4.1. KARAKTERISATIE VAN CELLEN VIA IMMUNOHISTOCHEMISCH KLEUREN 3.4.1.1. Geselecteerde merkers voor endotheel Om een modificatie van een biomateriaal uit te voeren, moeten er specifieke liganden gaan geselecteerd worden. Daarbij moet er een onderscheid gemaakt worden tussen merkers die kunnen gebruikt worden voor de karakterisatie, en liganden die kunnen gebruikt worden voor de modificatie zelf. Het grootste verschil tussen deze beide is dat liganden die gebruikt worden voor de modificatie zich extracellulair moeten bevinden. Voor de karakterisatie is dit niet van belang. 3.4.1.1.1. Endotheliale merkers geschikt voor karakterisatie Wanneer de interactie tussen de cellen en het biomateriaal wordt onderzocht, worden de cellen gelabeld (CaAM, CTR) om te kunnen nagaan of het wel degelijk het gewenste celtype is dat wordt aangetrokken (in dit geval endotheelcellen). Om te kunnen nagaan of de cellen fenotypisch hetzelfde blijven en dus ook hun endotheliale functies behouden dient er gezocht te worden naar specifieke merkers. Aangezien er gewerkt wordt met geïmortaliseerde HUVEC, dient er worden nagegaan of de merkers die kunnen gebruikt worden bij normale HUVEC, ook voor dit celtype kunnen gebruikt worden. Wij hebben de 3 belangrijkste merkers getest: PECAM-1, VWF, VEcadherine (7. Bijlage, fotoreeks 7). Zowel PECAM-1 als VWF geven een duidelijke aankleuring weer. Bij PECAM-1 is er een duidelijke membraangebonden aankleuring. Dit maakt dat deze merker ook gebruikt kan worden voor de modificatie. Bij VWF wordt waargenomen dat de aankleuring zich ook over het cytoplasma (intracellulair) verspreid. De aankleuring van VE-cadherine is hier minder duidelijk, maar toch nog voldoende om gebruikt te worden als merker. Er kan dus geconcludeeerd worden dat dezelfde merkers geëxpresseerd worden als bij normale HUVEC, dit is positief omdat er nu bij volgende experimenten omtrent modificatie/ karakterisatie deze geïmortaliseerde cellen kan gebruikt worden. 3.4.1.1.2. Endotheliale liganden geschikt voor modificatie In tweede instantie wordt er gezocht naar liganden die kunnen gebruikt worden voor een modificatie. Een voorwaarde hierbij is dat deze liganden zich extracellulair bevinden. PECAM-1 en VE-cadherine voldoen hieraan. VE-cadherine is de meest specifieke liganden
!
3
van de twee. Daarnaast is deze ligand ook vernieuwend en wordt deze continu geëxpresseerd. Tot slot staat deze ook in voor de cel-cel contacten. Dit is van groot belang tijdens de angiogenese. De endotheelcellen die worden aangetrokken naar het materiaal dienen daarna echter aan elkaar ‘gekoppeld’ te worden om zo een bloedvatstructuur te vormen. Deze redenen hebben ervoor gezorgd dat VE-cadherine voorrang krijgen op PECAM-1 gedurende het experimenteel onderzoek. 3.4.1.2. Geselecteerde merkers voor fibroblasten De merkers die geselecteerd worden voor fibroblasten, dienen enkel gebruikt te worden voor karakterisatie. Wanneer er dan gewerkt wordt in een co-cultuur kan men de verschillende celtypes van elkaar onderscheiden. Er werd gekozen voor 2 merkers: AS02 en 5B5. Uit de foto’s kan afgeleid worden dat de fibroblasten positief zijn voor beide merkers (7. Bijlage, fotoreeks 8). Ze zijn dan ook allebei bruikbaar voor de karakterisatie. Voor de experimenten in co-cultuur wordt gekozen om te werken met AS02. 3.4.1.3. Merkers gebruikt in een co-cultuur De resultaten van de merkers besproken in bovenstaande paragrafen (§ 3.4.1.1. - § 3.4.1.2.) gelden voor een monocultuur. Daarom werden de geselecteerde merkers voor karakterisatie (VWF-AS02) opnieuw getest maar nu in een co-cultuur. Uit de foto’s blijkt dat het onderscheid tussen de celtypes kan gemaakt worden op basis van de geselecteerde merkers (7. Bijlage, fotoreeks 9). Dus het samen in co-cultuur brengen heeft geen invloed op de expressie van de oppervlaktemerkers die gebruikt worden voor karakterisatie.
3.4.2. CO-CULTUUR OP GEMODIFICEERD BIOMATERIAAL Nu dat de oppervlaktemerkers getest zijn, en men weet dat zowel VE-cadherine als PECAM-1 geschikt zijn voor zowel modificatie als karakterisatie, kan men van start gaan met de experimenten op het biomateriaal zelf. In de eerste fase van dit experiment werd gekozen voor VE-cadherine als antilichaam. In de inleiding werd besproken dat er 2 materialen in aanmerking komen: PMMA en PDMS (§1.4.). Beide materialen werden onder verschillende condities (C - CO - COO - D - DG) onderzocht, dit door foto’s te nemen gedurende zeven dagen. Wanneer men de foto’s bekijkt !
3=!
tussen de verschillende condities ziet men al duidelijk verschillen. Maar dit niet alleen, er zijn ook verschillen waar te nemen tussen de gebruikte materialen (7. Bijlage, fotoreeks 10A-F). Voor beide materialen merkt men dat er het meeste cellen groeien bij de COO conditie (-biomateriaal, -modificatie, -AB), de cellen worden gewoon uitgezaaid in een lege well zonder (bio)materiaal in, hier valt op dat voor dag 1 de verdeling tussen de celtypes nog gelijkaardig is, maar vanaf dag 3 ziet men meer groene cellen. Een reden hiervoor kan zijn dat HUVEC mogelijks over de fibroblasten heen groeien, waardoor het signaal van de fibroblasten niet meer wordt opgenomen. Een andere mogelijkheid is dat de labeling van de HFF niet voldoende lang stand houdt gedurende het experiment. Het minst aantal cellen vindt men dan weer terug bij de CO conditie ( +biomateriaal, -modificatie, -AB). De reden hiervoor is dat onbehandeld PMMA/PMDS inert is. Bij de C conditie (+biomateriaal, -modificatie, +AB) wil men nagaan of de toevoeging van antilichamen op zich invloed heeft op de aantrekking van cellen. Bij PDMS ziet men dat elk celtype ongeveer even veel vertegenwoordigd is. Dus zowel HUVEC als HFF worden aangetrokken door dit materiaal. Bij PMMA ziet men wel dat er minder cellen aanwezig zijn op het materiaal en daarnaast daalt het aantal cellen ook nog eens naarmate men verder gaat in de tijd. Ook is er een lichte overmacht van HFF in de co-cultuur. Wanneer men vervolgens naar de D en DG conditie kijkt (PDMS), ziet men dat er op de dopamine behandelde materialen meer groene cellen aanwezig zijn. Maar wanneer we de Fase/contrast foto op dag 5 voor PDMS vergelijken met de GFP/TxRed, dan ziet men wel dat er ook nog fibroblasten aanwezig zijn! Op de GFP/TxRed zijn deze echter nog weinig waar te nemen aangezien het lichtsignaal van de fibroblasten nog maar zeer zwak is. Aangezien de hoeveelheid fibroblasten nog redelijk hoog is, zou men bij deze situatie nog last hebben van een fibreus bindweefselkapsel. Dit is geen goede zaak aangezien men dit absoluut wil vermijden! Bij de dopamine-gelatine materialen zijn zowel rode als groene cellen aanwezig, dit toont dus aan dat gelatine zelf ook andere celtypes aantrekt onafhankelijk van de aan- of afwezigheid van VE-cadherine. Voor PMMA werd een probleem vastgesteld met de zichtbaarheid van de cellen. Het materiaal vertoont namelijk toch reflecties/ absorpties na modificatie. Hierdoor kan men voor dit materiaal geen uitspraken doen over de cel verdeling. Tot slot moet toch nog eens vermeld worden dat dit experiment slecht 1 maal werd uitgevoerd. Verder onderzoek en vergelijking van de foto’s zal nodig zijn om definitieve besluiten te kunnen trekken voor de verschillende condities bij de verschillende biomaterialen. !
3?!
3.5. VIABILITEITS ASSAYS 3.5.1. VERGELIJKING MTT ASSAY VS PRESTOBLUE De meest gebruikte manier om de viabiliteit van cellen na te gaan is via een MTT. Naast het feit dat deze techniek veel tijd in beslag neemt, worden de cellen ook gelyseerd en kunnen ze dus niet meer gebruikt worden. PrestoBlue is ook een techniek om de viabiliteit na te gaan en kent deze problematiek niet. Daarom leek het interessant om de 2 technieken met elkaar te vergelijken en na te gaan of ze even betrouwbaar zijn. Het zou namelijk een groot pluspunt zijn mocht men kunnen overschakelen op PrestoBlue. MTT
PrestoBlue 5cB+XB@!
$!
"c5! "aQ]NaKLMRI*
"c@! 1>>!
"c$! "!
1W[JP!
Bc=!
1W[JP; %>4!
Bc5! Bc@! Bc$! B! ,MQ!"!
,MQ!$!
,MQ!C!
W*XKTIL**
,MQ!
1IJKMRSI*=J_]NIQUILUI*5LRMQ*b1=5c*
"c=! CcB+XB@! @cB+XB@!
1>>!
3cB+XB@!
1W[JP!
$cB+XB@!
1W[JP; %>4!
"cB+XB@! BcB+XBB! ,MQ!"! ;"cB+XB@!
,MQ!$!
,MQ!C!
,MQ!
W*XKTIL*
Figuur 23: Absorbantie in functie van het aantal dagen voor MTT analyse. Figuur 24: Relatief aantal fluorescentie units in functie van aantal dagen voor PrestoBlue analyse.
Dit experiment werd 3x herhaald, de resultaten die verwerkt werden in figuur 23-24 zijn het gemiddelde daarvan. Een welbepaald aantal cellen van verschillende celtypes werden uitgezaaid in 24 well platen. Op verschillende tijdstippen werd vervolgens eerst een PrestoBlue analyse uitgevoerd, gevolgd door een MTT-assay. Uit beide grafieken kan afgeleid worden dat in de meeste gevallen de resultaten voor zowel PrestoBlue als MTT gelijklopend zijn. In de eerste dagen ziet men dat het verschil tussen de verschillende celtypes niet zo groot zijn bij een MTT in vergelijking met een PrestoBlue, een mogelijke oorzaak hiervoor kan zijn dat een deel van de cellen gedurende de PrestoBlue behandeling weggespoeld waren. Enkel op dag 7 ziet men een
!
@B!
afwijking tussen beide technieken voor de HUVEC cellen. Vermoedelijk heeft men hier te maken met een artefact, of kan het ook te wijten zijn aan het feit dat er mogelijks besmetting was. Bij de resultaten ziet men ook dat de absorbantie- en RFU waarden voor HUVEC-GFP een stuk hoger liggen dan bij HFF en HUVEC. Dit kan mogelijks te wijten zijn aan de aanwezigheid van het groene fluorescente signaal. De aanwezigheid hiervan kan er namelijk voor zorgen dat dit de absorbantie meting beïnvloedt. Indien mogelijk is het aan te raden om te kiezen voor MTT als viabiliteitsassay. Maar wanneer men de viabiliteit gedurende een experiment wil opvolgen kan er gerust geopteerd worden voor een PrestoBlue analyse.
3.5.2. LABELING HFF MET DUBBELE CONCENTRATIE CTR Uit het experiment dat werd uitgevoerd in § 3.2.3.1. kon besloten worden dat de kleuring naarmate men verder in de tijd ging sterk afnam (7. Bijlage, fotoreeks 5) . Daarom werd besloten om de proef nog eens opnieuw uit te voeren maar nu met een dubbele concentratie aan CTR. Dit gebeurde in de hoop dat de kleuring op dag 7 meer zichtbaar zou zijn dan met de oorspronkelijke concentratie. Daarbij is het ook van belang om de viabiliteit van de cellen na te gaan bij deze concentratie, men moet er namelijk zeker van zijn dat deze hoeveelheid niet toxisch is voor de cellen. Daarvoor werd gedurende het experiment op vaste tijdstippen een PrestoBlue analyse uitgevoerd. Er werd voor deze test gekozen omdat de cellen nadien nog kunnen gebruikt worden. Uit de foto’s kan afgeleid worden dat de kleuring in het begin feller was, maar op dag 7 was dit gelijkaardig met het oorspronkelijke experiment. Er kan dus geconcludeerd worden dat de kleuring onafhankelijk van de concentratie vermindert vanaf dag 5. Dit experiment werd 3x herhaald, de resultaten die verwerkt werden in figuur 25 zijn het gemiddelde daarvan.
!
@"!
1IJKMRSI*[J_]NIQUILUI*_LRMQ*b1=5c*
&RKaRJRMIRMQMIQM<*0NIQM]3J_I* "@BBBB! "$BBBB! "BBBBB! =BBBB!
(KIP!(-0!]BcCfND! CUN!*>2_!
5BBBB! @BBBB!
(KIP!(-0!]"fND!CUN! *>2_!
$BBBB! B! ,"!
,$!
,C!
,
W*XKTIL*
Figuur 25: Relatief aantal fluorescentie units in functie van aantal dagen weergegeven voor verschillende CTR-probe concentraties.
De waarden in figuur 25 werden bekomen door de controle waarden af te trekken van de gemeten waarden. De controle waarden zijn practisch altijd dezelfde (rond de 25.000 RFU), de verklaring hiervoor is dat de controle bestaat uit een mengsel van PrestoBlue en medium, zonder in contact te komen met cellen. Uit de statistische analyse blijkt dat er zich geen significante verschillen voordoen tussen de twee condities over de verschillende dagen heen. Hieruit kan men dus besluiten dat een dubbele CTR concentratie geen invloed heeft op de viabiliteit van de cellen. Maar aangezien men via de foto’s kon afleiden dat zo’n dubbele concentratie niet zorgt voor een langere labeling, wordt dit toch niet gebruikt en houdt men zich aan de initiële concentratie.
!
@$!
4. BESPREKING
Volgens de gegevens van de firma (Life TechnologiesTM), zou een behandeling met ReagentPack efficiënter zijn voor het losmaken van primaire cellen dan een normale trypsinisatie. De resultaten die werden bekomen zijn echter tegenstrijdig hiermee. Alhoewel het verschil tussen beide methoden niet significant is, moet er toch opgemerkt worden dat men beter de voorkeur heeft aan de trypsine behandeling. Aangezien we hier met primaire endotheliale cellen werken dient men het verlies zo beperkt mogelijk te houden. Ook in de literatuur opteert men telkens voor de trypsine behandeling bij endotheelcellen [11,13,14,15,16,27]. Aangezien endotheelcellen beperkt zijn in passages, en de delingssnelheid lager is dan fibroblasten, dient goed nagedacht te worden over de keuze van het co-cultuur medium [13]. In de literatuur vinden we 2 opties terug. Als eerste kan er een combinatie van de cultuurmedia gebruiken volgens een 1:1 verhouding [14]. Of men kan kiezen voor EGM-2 medium, dit laatste is een medium gebaseerd op een endotheliaal basaal medium waaraan allerlei groeifactoren zijn toegevoegd [14,15,16]. Uit de resultaten blijkt dat de resultaten voor EGM-2 medium beter zijn, maar echter niet significant beter (Figuur 9-13). Een mogelijke verklaring voor dit verschil kan zijn dat fibroblasten in alle omstandigheden goed groeien [23]. Aangezien het medium meer geschikt is voor endotheelcellen, gaan deze optimaal groeien en differentiëren. De fibroblasten krijgen ook de nodige voedingsstoffen waardoor deze ook voldoende kunnen groeien. Wanneer men de uitzaaiverhoudingen vergelijkt tussen een CTR/CaAM co-cultuur (Figuur 20-22) en een CTR/GFP co-cultuur (Figuur 16-18), dan ziet men dat de verhoudingen in het tweede geval meer stand houden. In een CTR/CaAM co-cultuur, voornamelijk bij 80% HUVEC, zijn de uitzaaiverhoudingen lager. De HUVEC gaan dus minder gaan delen waardoor het moeilijker is om de verhouding in stand te houden. Een mogelijke oorzaak voor dat minder delen kan zijn doordat men met een oudere HUVEC passage heeft gewerkt. Dit maakt dat de bekomen resultaten misschien minder representatief zijn. Een herhaling van dit experiment met een vroegere passage is dan ook een must wil men hieruit definitieve conclusies trekken.
!
@3!
Het labelen van cellen m.b.v. viabiliteitsmerkers is niet specifiek. De cellen worden ermee gelabeld om de verschillende celtypes in co-cultuur van elkaar te kunnen onderscheiden. Toch zijn er enige voorwaarden verbonden aan het gebruik van deze merkers. Het mag namelijk geen toxisch effect hebben, en de labeling moet langdurig zichtbaar zijn: " De viabiliteit is voor de gelabelde cellen steeds hoger dan van de controle waarde. Hieruit blijkt ook dat de toename van de viabiliteit voor de CTR behandelde HFF en de CaAM behandelde HUVEC in dezelfde rangorde ligt. Hieruit kunnen we concluderen dat beide celtypes eenzelfde invloed ondervinden van de labeling. " Beide merkers CTR voor HFF en CaAM voor HUVEC zijn gedurende de onderzochte periode van vijf dagen zichtbaar, maar een verzwakking van het rood signaal ten opzichte van het groen signaal werd waargenomen (7. Bijlage, fotoreeks 6). Volgens de gegevens van de firma heeft de CTR labeling een duidelijk fluorescent signaal voor minstens 3 dagen (72 uur). Tot en met dag 3 is er een duidelijk signaal, daarna vermindert dit progressief. Een reden hiervoor is, is dat wanneer cellen delen deze merker deels wordt meegegeven aan de dochtercel. De concentratie daalt, en het signaal verzwakt. De concentratie werd verdubbelt in de hoop langer een signaal te kunnen opvangen. Uit de MTT-assay (Figuur 25) die werd uitgevoerd, blijkt dat deze dubbele concentratie geen invloed heeft op de viabiliteit na 24u. Uit de resultaten (7. Bijlage, fotoreeks 5 & 10) blijkt dat tijdens de eerste dagen het signaal wel sterker is, maar vanaf dag 5 is het dan weer vergelijkbaar met het oorspronkelijke experiment. Aangezien het zelf uitvoeren van een transfectie van endotheelcellen niet efficient is (figuur 14), en de aankleuring beperkt is in tijd, is men op zoek gegaan naar een alternatief. In de literatuur vond men het gebruik van geïmortaliseerde HUVEC terug (Dr.J. Folkman, Children’s Hospital, Boston). Deze cellen expresseren constitutief GFP. Eerst moeten deze cellen aan een aantal experimenten onderworpen worden vooraleer men zeker kan zijn dat ze gebruikt kunnen worden voor de experimenten. Deze cellen kunnen wel fenotypische veranderingen ondergaan en daardoor niet meer represent zijn aan de primaire cellen [8,12]. Uit de immunohistochemische kleuring (7. Bijlage, fotoreeks 7) kan men afleiden dat de het merken van zowel PECAM-1 als VWF als VE-cadherine op GFP-getransfecteerde HUVEC positief is. Het fluorescente signaal voor zowel PECAM-1 als VWF is duidelijk zichtbaar, de reden hiervoor is omdat deze merkers in grote aantallen wordt geëxpresseerd. Voor VEcadherine is het signaal zwakker, maar toch nog voldoende.
!
@@!
In de toekomst zal de nadruk op twee zaken gelegd worden. Eerst en vooral zal de testen op biomaterialen herhaald en verder uitgebouwd worden, ten tweede zullen ook andere antilichamen getest worden alsook andere types van modificaties om endotheelcellen aan te trekken (bv. peptiden). Daarnaast zal men ook verdere experimenten op zetten om de angiogenese of bloedvatvorming te kunnen bestuderen. Tot slot zullen ook in vivo experimenten worden uitgevoerd. Daarbij worden schijfjes biomateriaal (al dan niet gemodificeerd) subcutaan ingebracht bij ratten. Na één maand en drie maanden worden deze verwijderd en kunnen ze histologisch geanalyseerd worden. Op deze manier hoopt men te kunnen waarnemen dat bloedvatvorming gestimuleerd wordt, en dat vorming van een fibreus bindweefselkapsel achterwege blijft.
5. ALGEMEEN BESLUIT
Een co-cultuur van CellTracker Red gelabelde fibroblasten en Calceïne AM ester gelabelde endotheelcellen werd intensief onderzocht. Optimale cultuurcondities werden gevonden waarbij beide celtypes voor langere tijd fluorescent konden gevolgd worden. Hierbij bleef een 50:50 verhouding behouden en zag men geen overdracht van de kleuringen tussen de twee celtypes. Preliminaire experimenten omtrent co-cultuur op gemodificeerde biomaterialen met het oog op endotheel specifieke adhesie werden uitgevoerd.
!
@C!
6. REFERENTIES [1] King H, Aubert R, Herman W (1998). Global burden of diabetes, 1995-2025: Prevalence, numerical estimates, and projections. Diabetes Care 21(9): 1414-1431. [2] Vaddiraju S, Burgess D, Tomazos I, Jain F, Papadimitrakopoulos F (2010). Technologies for continuous glucose monitoring: Current problems and future promises. Journal of diabetes science and technology 4 (6): 1540-1557. [3] Morais J, Papadimitrakopoulos F, Burgess D (2010). Biomaterials/tissue interactions: Possible solutions to overcome foreign body response. The americal association of pharmaceutical scientists journal 12(2): 188-196. [4] Onuki Y, Bhardwai U, Papadimitrakopoulos F, Bergess D (2008). A review of the biocompatibility of implantable divices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of diabetes science and technology 2(6): 1003-1015. [5] Chen J, Arnold M, Small G (2004). Comparison of combination and first overtone spectral regions for near infrared calibration models for glucose and other biomolecules in aqueous solutions. Analytical chemistry 76(18): 5405-5413. [6] Trabelsi A, Boukadoum M, Siaj M (2010). Blood glucose optical bio-implant: preliminary design guidelines.Biomedical Circuits and Systems Conference: 150-153. [7] Llevadot J, Asahara T (2002). Effects of statins on angiogenesis and vasculogenesis. Rev Esp cardiol 55(8): 838-844. [8] Bouïs D, Hospers G, Meijer C, Molema G, Mulder N (2001). Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis 4: 91-102. [9] Davis JM (1994). Basic cell culture: A practical approach. Oxford: IRL press. [10] Richard L, Velasco P, Detmar M (1998). A simple immunomagnetic protocol for the selective isolation and long-term culture of human dermal microvascular endothelial cells. Experimental cell research 240: 1-6. [11] Terramani T, Eton D, Bui P, Wang Y, Weaver F, Yu H (1999). Human macrovascular endothelial cells: optimization of culture conditions. In vitro cell development biology 36: 125-132. [12] Van Beijnum J, Van der Linden E, Griffioen A (2007). Angiogenic profiling and comparison of immortalized endothelial cells for functional genomics. Experimental cell research 314: 264-272. [13] Hunt M, Currie M, Robinson B, Dachs G (2010). Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. Journal of biomolecular techniques 21: 66-72. [14] Choong C, Hutmacher D, Triffitt T (2006). Co-culture of bone marrow fibroblasts and endothelial cells on modified polycaprolactone substrates for enhanced potentials in bone tissue engineering. Tissue engineering 12(9): 2521-2531. [15] Burch M, Pepe G, Dobrian A, Lattanzio F, Albrecht E (2005). Development of a co-culture system and use of confocal fluorescent microscopy to study human microvascular endothelial cell and mural cell interaction. Microvascular research 70: 43-52. [16] Hamid S, Daly C, Campbell S (2003). Visualization of live endothelial cells ex vivo and in vitro. Microvascular research 66: 159-163. [17] Dubruel P (2011). Polymers for biomedical applications. 1ste master Biomedische wetenschappenregeneratie en degeneratie.
!
@5!
[18] Goddard JM, Hotchkiss JH (2007). Polymer surface modification for the attachment of bioactive compounds. Progress in polymer sience 32: 689-725. [19] Ku SH, Ryu J, Hong SK, Lee H, Park CB (2010). General functionalization route for cell adhesion on nonwetting surfaces. Biomaterials 31: 2535-2541. [20] Farris L, McDonald M (2011). AFM imaging of ALYGNSA polymer–protein surfaces: evidence of antibody orientation. Analytical Bioanalytical Chemistry 401:2821–2829. [21] Augustin HG (2004). Methods in endothelial cell biology. Berlin Heidelberg: Springer. [22] Pusztaszeri M, Seelentag W, Bosman F (2006). Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31, CD34, von Willebrand Factor, and Fli-1 in normal human tissues. Journal of histochemistry & cytochemistry 54(4): 385-395. [23] Saalbach A, Aust G, Haustein UF, Herrmann K, Anderegg U (1997). The fibroblast specific Mab AS02: a novel tool for detection and elimination of human fibroblasts. Cell & Tissue research 290: 593-599. [24] King N, Korolchuk S, McGivan JD, Suleiman M (2004). A new method of quantifying glutathione levels in freshly isolated single superfused rat cardiomyocytes. Journal of Pharmaceutical and toxological Methods 50: 215-222. [25] Invitrogen (2008). CellTrackerTM Probes for Long-Term Tracing of Living Cells (pdf-document). http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp02925.pdf. (geraadpleegd op 4/5/2012) [26] Hernandez J, Coll T, Ciudad C (2004). A highly electroporation method for the transfection of endothelial cells. Angiogenesis 7: 235-241. [27] Sales V, Mettler B, Lopez-Ilasaca M, Johnson J, Mayer J (2007). Endothelial progenitor and mesenchymal stem cell-derived cells persist in tissue-engineered patch in vivo: application of green and red fluorescent protein-expressing retroviral vector. Tissue engineering 13(3): 525-535.
[28] Afting M, Stock U, Nasseri B, Pomerantseva I, Seed B, Vacanti J (2003). Efficient and stable retroviral transfection of ovine endothelial cells with green fluorescent protein for cardiovascular tissue engineering. Tissue engineering 9(1): 137-141. [29] New England Biolabs. TransPass™ HUVEC Transfection Reagent. http://www.neb.com/nebecomm/products/productm2558.asp. (geraadpleegd op 4/5/2012) [30] Cornelissen M (2010). Cursus Cel- en weefselcultuur, 3de bachelor Biomedische wetenschappen. [31]!Invitrogen (2011). PrestoBlue™ Cell Viability Reagent. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Molecular-Probes/Key-Molecular-ProbesProducts/PrestoBlue-Cell-Viability-Reagent.html (geraadpleegd op 4/5/2012)
!
@
7. BIJLAGEN- FOTOREEKSEN CELLEN SPLITSEN/LOSMAKEN: TRYPSINE VS REAGENTPACK
Trypsine
ReagentPack
Dag 2
Dag 4
Fotoreeks 1: Foto’s genomen voor trypsine/ ReagentPack behandeling op verschillende tijdstippen. Fase contrast, 4x. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
!
!!"#$%"%&!'#&!(%""%&!)*$*'*!'+#$+"+,%+,-)%./%.-! !
!""#
0!
1!
2!
3!
!
!
CTR labeling a) b) c) d)
F/C CTR CaAM CTB
!
!
!
! ! !
!
CTB labeling a) b) c) d)
F/C CTB CTR CaAM
! !
!
!
!
!
!
CaAM labeling a) b) c) d)
F/C CaAM CTB CTR
!
!
! ! Fotoreeks 2: Verschillende labelingen van HFF. Met behulp van deze foto’s wordt aangetoond of de labeling is gelukt vooraleer MTT assay uit te voeren om de viabiliteit van de cellen na labeling na te gaan. Fase/contrast - GFP- TxRed - DAPI, 10x.
!
!$%&'!
!!!!!!!!!!!!!!!!0!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!1!
!!!!!!!!!!!!!!!!2!
!
!
!!3! !
CTR labeling a) b) c) d)
F/C CTR CaAM CTB
!
!
CTB labeling a) b) c) d)
! ! ! !
! !
F/C CTB CTR CaAM
! !
CaAM labeling a) b) c) d)
! !
!
! !
!
! !
F/C CaAM CTB CTR
!
! ! ! ! ! Fotoreeks 3: Verschillende labelingen van HUVEC. Met behulp van deze foto’s wordt aangetoond of de labeling is gelukt vooraleer MTT assay uit te voeren om de viabiliteit van de cellen na labeling na te gaan. Fase/contrast - GFP- TxRed - DAPI, 10x. !
! "#$%"%&!'#&!(%""%&!)*+&+(,"-,,./!-.#&01%(-2%! ! NA 24u
Fase/contrast
GFP
Controle
Transfectie
!"#"$%%&'()*3!"456789:!;49!<,'%(!;84!=1>?@A49BC6D@86!94!EFGH!14B6IDJ9@A4B@!K!=1>L!FMH!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
!
!
NA 48u
Fase/contrast
GFP
Controle
Transfectie
!"#"$%%&'()+3!"456789:!;49!<,'%(!;84!=1>?@A49BC6D@86!94!FNGH!14B6IDJ9@A4B@!K!=1>L!FMH!! !
! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
"#$%"2&=!'#&!(%""%&!)(+?(,"-,,./! ! Cocultuur Dag 1
FASE/CONTRAST
GFP/TxRed
Dag 2
Dag 5
Dag 7
Fotoreeks 5: Co-cultuur tussen HFF (CTR) en HUVEC-GFP over verschillende tijdstippen. Fase/contrast – TxRed/GFP, 10x. !
Cocultuur Dag 1
FASE/CONTRAST
GFP/TxRed
Dag 2
Dag 5
Dag 7
Fotoreeks 6: Co-cultuur tussen HFF (CTR) en HUVEC (CaAM) over verschillende tijdstippen. Fase/contrast – TxRed/GFP, 10x. ! ! !
KARAKTERISATIE VAN CELLEN VIA IMMUNOHISTOCHEMISCH KLEUREN PECAM 1 (1:100)
VE-Cadherine (1:100)
VWF (1:200)
Fotoreeks 7: immunohistochemische kleuring van HUVEC-GFP met het oog op het selecteren voor merkers/liganden geschikt voor karakterisatie/modificatie. DAPI/GFP, 10x.
!
Fibroblasten AS02 (1:200)
5B5 (1:100)
Fotoreeks 8: immunohistochemische kleuring van HFF met het oog op het selecteren voor merkers geschikt voor karakterisatie. DAPI/GFP, 20x.
Co-cultuur fibroblasten – endotheel AS02 (TR) – VWF (FITC)
AS02- VWF
Fotoreeks 9: immunohistochemische kleuring van HUVEC-GFP en HFF met het oog op het selecteren voor merkers geschikt voor karakterisatie in co-cultuur. DAPI/GFP/TxRed, 10x.
! !
(+?(,"-,,.!+>!=%*+O212(%%.O%!$2+*#-%.2#"%&! !
PDMS – Dag 1 – FASE/CONTRAST C
C0
D
DG
C00
PDMS – Dag 1 – GFP/TxRed C
C0
D
DG
C00
Fotoreeks 10A: Foto’s van PDMS biomateriaal onder verschillende condities op dag 1. Fase/contrast – TxRed/GFP, 4x.
!
PDMS – Dag 3 – FASE/CONTRAST C
C0
D
DG
C00
PDMS – Dag 3 – GFP/TxRed C
C0
D
DG
C00
Fotoreeks 10B: Foto’s van PDMS biomateriaal onder verschillende condities op dag 3. Fase/contrast – TxRed/GFP, 4x.
!
PDMS – Dag 7 – FASE/CONTRAST C
C0
D
DG
C00
PDMS – Dag 7 – GFP/TxRed C
C0
D
DG
C00
Fotoreeks 10C: Foto’s van PDMS biomateriaal onder verschillende condities op dag 7. Fase/contrast – TxRed/GFP, 4x.
!
PMMA – Dag 1 – FASE/CONTRAST C
C0
D
DG
C00
PMMA – Dag 1 - GFP/TxRed C
C0
D
DG
C00
Fotoreeks 10D: Foto’s van PMMA biomateriaal onder verschillende condities op dag 1. Fase/contrast – TxRed/GFP, 4x.
!
PMMA – Dag 3 – FASE/CONTRAST C
C0
D
DG
C00
PMMA- Dag 3 – GFP/TxRed C
C0
D
DG
C00
Fotoreeks 10E: Foto’s van PMMA biomateriaal onder verschillende condities op dag 3. Fase/contrast – TxRed/GFP, 4x.
!
PMMA – Dag 7 – FASE/CONTRAST C
C0
D
DG
C00
PMMA – Dag 7 – GFP/TxRed C
C0
D
DG
C00
Fotoreeks 10F: Foto’s van PMMA biomateriaal onder verschillende condities op dag 7. Fase/contrast – TxRed/GFP, 4x.
!
!
!
!
