CHIP-TECHNOLÓGIA ALKALMAZÁSA A HUMÁN IN VITRO FERTILIZÁCIÓ EREDMÉNYESSÉGÉNEK JAVÍTÁSÁBAN
MINTACÍM AZSZERKESZTÉSE EMBRIÓ ÉLETKÉPESSÉGÉNEK ÚJ MOLEKULÁRIS INDIKÁTORAI • A legtöbb fejlett országban egyre csökken a születésszám. • Világszerte nő a terméketlen párok száma és ezzel együtt az IVF beavatkozások száma. Európában évi 600.000 beültetés. • A technológiai fejlődés ellenére az IVF sikeressége ma sem több, mint 30-33%. • Csak egyetlen embriót ültess vissza, de az a legjobb legyen! • A beültetendő (“jó”) embriót ma morfológiai jellegzetességek alapján ítélik meg. • A legjobb “kinézetű” embrió sem biztos, hogy megfogan. • Van más lehetőség? Van jobb indikátor?
SZEMÉLYRE SZABOTT DIAGNOSZTIKA IN VITRO FERTILIZÁCIÓ SORÁN
• Fogamzás előtt
• Implantáció előtt – Invazív – Non-invazív
Tápfolyadék
• Születés előtt
• Születés után
ÖSSZEFÜGG AZ EMRIÓ ÉLETKÉPESSÉGE ÉS A METABOLIZMUSA? •
• • Differences in the glucose uptake by day 3 (A) and day five (B) embryos. Gardner et. al. doi:10.1093/humrep/der143
• •
Viability indices using near-infrared spectra of culture media for embryos that implanted (red), and those that did not (blue). Seli et.al. doi:10.1016/j.fertnstert.2007.07.1390
Az inkubációs médium metabolomikus megközelítése. Glukóz, vagy piruvát felvétel. Ellentmondó eredmények (Jones et. al. 2001). Aminosav profil (Sturmey et al. 2008). Totál metabolom mérése infravörös spektroszkópia segítségével (Seli et al. 2007).
AZ EMBRIÓ TENYÉSZTŐFOLYADÉK HPLC-MS ANALÍZISE • Embrió beültetés az édesanyába 3 tenyésztési nap után. • A vizsgálat teljes mértékben non-invazív, az egyébként kidobásra kerülő tenyésztőfolyadékot (20 µl) elemezzük. • Minden mérés retrospektív (és vak) elrendezésben történik. • Peptidek és fehérjék mérése HPLC-MS módszerrel (Brucker microTOF). • Etikai engedély: ETT 5273/2012/HER.
A BIOMARKER-JELÖLT MOLEKULA TÖMEGSPEKTRUMA •
Később megismert, de biztosan azonosítható klinikai kimenetel (terhes, vagy nem terhes).
•
Nem talátunk kvalitatív különbséget (új peptideket).
•
Mennyiségi különbségek: 45 peptid csúcsban is, de különösen szembeszökő a 9186.5 Da molekulatömegű polipeptidben.
•
A sikeresen megtermékenyült embriók folyadék-környezetében ezen peptid mennyisége kisebb.
A 9186.5 Da molekulatömegű polipeptid tömegspektruma (m/z értékek). A csúcsok ugyanazon peptid többszörösen töltött fragmenseinek felelnek meg.
MILYEN FEHÉRJÉK LEHETNEK A TENYÉSZTŐFOLYADÉKBAN? • A legnagyobb mennyiségben humán szérum albumin: vagy tisztított, vagy rekombináns. • A tisztított HSA több, mint 100 féle szennyező fehérjét is tartalmazhat, akár kiszerelésenként eltérő mennyiségben. • A humán haptoglobin is egy ilyen szennyező fehérje (Darcel et. al. 1985).
A HUMÁN HAPTOGLOBIN MOLEKULA a1 b
b a1 a1
b
a2 a2
a2 b
b
b
•
a1
• •
• • •
A haptoglobin hemoglobin-kötő alfa-glikoprotein: magas plazmaszint gyulladásban és daganatokban is. α-1,α-2 és β láncait diszulfid hidak kötik össze. A szabad α1 fragmens molekulatömege 9186,4 Da. Három fenotipus (Hpt 1-1, Hpt 12, Hpt 2-2) ismert. A fenotipus az α-lánctól függ. Szabályozza az anyai immuntoleranciát a reproduktív szervekben. Az anyai haptoglobin fenotipus befolyásolhatja a fertilitási rátát. Az α1α1 fenotipusban magasabb a természetes fertilitás (Herrler et. al. 2002).
“BOTTOM-UP” PROTEOMIKA ÉS SZEKVENÁLÁS
A HAPTOGLOBIN FRAGMENS MENNYISÉGE A TÁPFOLYADÉKBAN KORRELLÁL AZ EMBRIÓ ÉLETBEN MARADÁSÁVAL • 123 minta. • A haptoglobin fragmens mennyisége szignifikánsan magasabb az életképtelen embriók tenyésztőfolyadékában (p<0.001). • Cut-off érték: Youden index (22.5%) • Nincs szignifikáns korreláció a morfológiai elemzéssel (p=0.118).
AZ EMBRIÓ ÉLETKÉPESSÉGÉNEK MEGITÉLÉSE BIOKÉMIAI (MS/MS) MÓDSZERREL •
•
•
•
A morfológiai jelek alapján (u.n. “Istanbul score”), mind a 90 vizsgált embrió beültethető, életképes. Ugyanezen embriók tenyésztőfolyadékának MS/MS analízisével (“biokémiai diagnózis”) 53 embrió életképes volt, 37 pedig nem volt életképes. A 37 biokémialiag életképtelennek, de morfológiailag életképesnek itélt embriókból egyetlen teherbe esés sem történt. A biokémiailag életképesnek itélt embriók 55%-a megszületett.
HIPOTÉZIS A PROGRAMOZOTT SEJTHALÁL (APOPTOSIS) ÉS A NECROSIS KORAI KÖVETKEZMÉNYEIT ÉSZLELJÜK AZ ÉLETKÉPTELEN EMBRIÓK TENYÉSZTŐ FOLYADÉKÁBAN •
•
•
Az alacsonyabb életképességű embriókban magasabb az apoptotikus sejtek aránya, magasabb a necrosis mértéke is, fokozott a membrán permeabilitása. Az apoptosis során – más enzimek mellett - proteázok is aktiválódnak és a membrán dezintegráció miatt a folyadékkörnyezetbe jutnak. A kijutott enzimek elbontják a haptoglobint és szabad α1 fragmens keletkezik.
SZABADALMI BEJELENTÉS
EUROPEAN FEDERATION OF LABORATORY MEDICINE – ABBOTT DIAGNOSTICS DÍJA “EXCELLENCE IN OUTCOMES RESEARCH IN LABORATORY MEDICINE " PÁRIZS, 2015
A GYAKORLATBAN HASZNÁLHATÓ TERMÉK: CHIP
Tömegspektrum: a haptoglobin fragmens mennyisége a tápfolyadékban korrelál az embrió megtermékenyülési esélyével. A terhesség predikciója új, személyre szabott laboratóriumi módszerrel. A megtermékenyülés esélye: 30 %-ról 50-ra % növelhető.
KIVÁLÓSÁGI MŰHELY • GINOP-2.3.2-15 - Stratégiai K+F műhelyek kiválósága: „Chip-technológia alkalmazása a humán in vitro fertilizáció eredményességének javításában.” • 2016-2019 • 2 milliárd Ft • Partnerek: 77 Elektronika Kft, Semmelweis Egyetem, Szegedi Tudományegyetem, MTA Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Intézete, Budapesti Műszaki Egyetem
GINOP-2.3.2-15-2016-00021
Fő kedvezményezett: Pécsi Tudományegyetem A projekt összköltsége: 1 975 947 500,- Ft
Támogatás intenzitás: 100%
GINOP-2.3.2-15-2016-00021 Megvalósítási időszak: 2016.10.01. – 2019.09.30. Előzmények: TÁMOP-4.2.2.A-11/1/KONV-2012-0053 Támogatás: 755 399 318,- Ft
TÁMOP 4.2.2.D-15/1/KONV-2015-0004 Támogatás: 299 204 398,- Ft
GINOP-2.3.2-15-2016-00021 A projekt szakmai vezetője: Prof. Dr. Kovács L. Gábor 1. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika kutatócsoportja Vezető kutatók: Prof. Dr. Bódis József és Dr. Várnagy Ákos 2. SZKK Lab-on-a-Chip kutatócsoportja Vezető kutató: Prof. Dr. Kovács L. Gábor 3. Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet kutatócsoportja Vezető kutató: Prof. Dr. Szekeres Júlia 4. Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézet kutatócsoport Vezető kutatók: Dr. Márk László
GINOP-2.3.2-15-2016-00021 Szakmai együttműködés külső intézményekkel 1. 2. 3. 4. 5.
77 Elektronika Kft Budapesti Műszaki Egyetem Semmelweis Egyetem Magyar Tudományos Akadémia CPS Cortex Kft.
INDIKÁTOROK Kutatók száma teljes munkaidőre számítva Hazai kutatási, vállalkozói együttműködések száma Nemzetközi kutatási, vállalkozói együttműködések száma A kutatóhelyre eső kiemelkedő minőségű publikációk száma A projekt témájához köthető értekezéssel, tudományos fokozatot szerző kutatók száma Új kutatók száma teljes munkaidőben
14 fő
8 db 3 db 23 db 7 db 5 db
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!
