Chapter
12
Nederlandse samenvatting voor niet-ingewijden
Chapter 12
Achtergrond Leverziekten komen bij de hond frequent voor; van alle zieke honden die naar de faculteit diergeneeskunde doorverwezen worden heeft 1-2% een leverziekte. Zoals bij mensen zijn leverziekten in de meeste gevallen chronisch en worden ze veroorzaakt door een aanhoudende ontsteking vanwege celschade door verschillende ziekteverwekkers en/of gifstoffen. In alle gevallen leidt de doorlopende levercelschade tot een verlaging in het aantal functionele levercellen, vaak gecombineerd met een verhoogde aanmaak van bindweefsel (fibrose). Deze twee observaties: verlies van (lever)regeneratie en toegenomen fibrose, zijn de belangrijkste factoren die bijdragen aan een slechte leverfunctie wat uiteindelijk kan leiden tot de dood. De lever is een orgaan dat een grote rol speelt bij het opruimen van schadelijke stoffen in het bloed. De lever zelf is in grote mate dan ook goed bestand tegen bepaalde (gif)stoffen. Bij celschade zal de lever snel het verlies van functionele cellen herstellen door nieuwe cellen te laten groeien. Deze hoge mate van regeneratie of groei na celschade is al langere tijd bekend, maar het verlies van deze regeneratiecapaciteit tijdens chronische leverziekten blijft een bron van onderzoek. Er is groeiend bewijs dat twee elkaar tegenwerkende factoren: Hepatocyte Growth Factor (HGF) en Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1), de uitkomst van leverziekten bepalen. Waar HGF een groeifactor is die levergroei stimuleert en fibrose onderdrukt, verhoogt TGF-β1 de aanmaak van bindweefsel en het ontstaan van celdood. Deze observaties hebben geleid tot het experimentele gebruik van HGF als behandeling bij diermodellen waarbij leverschade is veroorzaakt door gifstoffen. De toevoeging van HGF bij deze modellen leidde tot een volledige regeneratie van de lever, terwijl onbehandelde dieren stierven. Het omzetten van een dergelijke therapie naar een functionele toepassing bij de mens is nog niet gelukt. Het gebruik van nieuwe therapieën bij honden met natuurlijke voorkomende leverziekten zou een veel relevanter diermodel zijn voor het vertalen van een therapie naar een humane klinische toepassing. HGF therapie zou dan ook een enorme impact kunnen hebben in het behandelen van leverziekten bij mens en hond. Samengenomen behandelt dit proefschrift verschillende doelen. Het eerste doel is om de regulerende werking van HGF en TGF-β1 en hun processen tijdens leverziekten in de hond te beschrijven. Het tweede doel is het ontwerpen van therapieën op de hierboven beschreven inzichten welke gebruikt kunnen worden bij het verlies van levercellen of fibrose, door de biochemische werking van HGF en TGF-β1 te beïnvloeden. Uiteindelijk zou dat leiden tot een evaluatie van zulke therapieën bij de hond. 208
Nederlandse Samenvatting
Indeling De indeling van dit proefschrift is gebaseerd op de verschillende vragen die van te voren gesteld zijn of tijdens het onderzoek naar boven kwamen. Opeenvolgend beschrijven we hier de specifieke vragen en resultaten van dit proefschrift. Leverziekten zoals hepatitis zijn biochemisch gezien complex, vele factoren en processen bepalen de uiteindelijke uitkomst van hepatitis. Om de verschillende processen zoals regeneratie te bekijken en beschrijven, is eerst gekozen voor relatief simpele ziekten waarbij maar enkele processen veranderd zijn. In hoofdstuk 2 beschrijven wij de biochemische analyse van regeneratie in aangeboren afwijkingen waarbij de levermassa niet volledig uitgroeit. De eerste, aangeboren portosystemische shunt, is een veelvoorkomende erfelijke ziekte waarbij de toevoer van bloed aan de lever wordt omgeleid en niet, of in veel mindere mate, naar de lever gaat. Hierdoor blijft groei uit maar is er geen sprake van ontsteking of fibrose (bindweefselvorming). Bij de tweede ziekte, primaire vena porta hypoplasie, zijn de laatste kleine vaten in de lever niet aangelegd waardoor de lever ook hier geen goede bloedtoevoer heeft. Bij deze ziekte blijft de groei ook uit, maar er is vaak wel fibrose. De resultaten laten zien dat de biochemische celreacties voor regeneratie in deze ziekten nog steeds functioneel waren en dus gebruikt kunnen worden voor groeifactor therapie zoals HGF behandeling. Analyse van fibrose laat zien dat de eiwitten verantwoordelijk voor de aanmaak van (te veel) bindweefsel (o.a. TGF-β1) erg sterk geactiveerd zijn. De volgende stap is het beschrijven van dezelfde biochemische processen in complexere ziekten zoals hepatitis. In hoofdstuk 3 is gekozen voor verschillende vormen van hepatitis zoals acute hepatitis en chronische hepatitis. Bij deze analyse zijn ook cirrose en lobular dissecting hepatitis (LDH) meegenomen. Cirrose beschrijft het eindstadium van chronische hepatitis waarbij de leverarchitectuur volledig is omgebouwd door bindweefsel. LDH beschrijft een speciale vorm van cirrose die een snelle (ziekte) verloop heeft, en waarbij een excessieve mate van fibrosering en verstoring van de normale lobulaire architectuur optreedt. Vergelijkbaar met aangeboren portosystemische shunts en vena porta hypoplasie, is ook bij deze complexere leverziekten geen defecte regeneratie gevonden. De belangrijkste biochemische paden die bij regeneratie actief zijn, worden zelfs geactiveerd tijdens hepatitis. Humane monsters van leverziekten laten bovendien zien dat bij de mens een zeer vergelijkbaar beeld bestaat, wat het potentiële belang van natuurlijk voorkomende leverziekten bij de hond als model voor de mens alleen maar groter maakt. Concluderend, een over-stimulatie van deze regeneratie biochemische paden, bijvoorbeeld door HGF, 209
Chapter 12 zou een goede manier kunnen zijn om de balans door te laten slaan van afbraak (fibrosering) naar regeneratie. In dezelfde ziekten als beschreven in hoofdstuk 3 hebben wij ook gekeken naar de (mate van) fibrosering. Fibrosering wordt omschreven als de aanmaak van te veel bindweefsel dat de werking van de lever remt. In chronische hepatitis is dit nog gering maar het zal geleidelijk voortschrijden tot het eindstadium waarbij niet alleen abnormaal veel bindweefsel is gevormd, maar ook cirrose waarbij een totaal verstoorde weefselopbouw ontstaat. In hoofdstuk 4 laten wij zien dat de bekende veroorzaker van fibrose bij de mens, TGF-β1, in alle leverziekten van de hond waar te veel fibrose gevonden wordt, is verhoogd. Ook hierin vertoonden humane monsters van leverziekten een reactiepatroon dat volkomen overeenkomt met de bevindingen bij de hond. Concluderend kunnen we stellen dat het biochemische proces van fibrose bij honden identiek is aan dat bij de mens. Vanwege het belang van een goed model voor fibrose in (grote) zoogdieren, is dit van grote waarde. Samenvattend over de eerste hoofdstukken kunnen we concluderen dat HGF therapie een mogelijke toepassing is om leverziekten bij de hond te behandelen, zowel wat betreft de regeneratie als de fibrosering. Hierop anticiperend is een synthetisch (recombinant) honden HGF eiwit gemaakt en getest op zijn regenererend vermogen (hoofdstuk 5). Resultaten laten zien dat honden-HGF levercellen in kweek sterk laat vermenigvuldigen. Bovendien activeert het honden-HGF alle benodigde eiwitten voor regeneratie en de afbraak van fibrose. Koperstapeling komt vaak voor bij verschillende hondenrassen en leidt in de meeste gevallen tot chronische hepatitis. Koper zelf is een essentieel metaal en is nodig in veel belangrijke processen in het lichaam. Echter een teveel aan koper kan leiden tot oxidatieve schade en celdood. Een overmaat wordt daarom via de gal uitgescheiden. Om te bepalen of de koperstapeling bij de hondenrassen met een predispositie voor koperstapeling wordt veroorzaakt door een celdefect of als gevolg van een leverziekte met verminderde galafvoer is het kopermetabolisme van de lever onderzocht (hoofdstuk 6). Resultaten laten zien dat in honden met chronische hepatitis door onbekende oorzaak en met extra-hepatische totale cholestase (galstuwing) geen koperstapeling plaatsvindt. Concluderend kunnen we stellen dat, als er opeenstapeling plaatsvindt, er gesproken kan worden van een primaire genetische aandoening en niet een secundaire verandering door o.a. galstuwing of ontsteking. Onderzoek naar de effecten van koperstapeling laat in de koper gerelateerde hepatitis zien dat de afweer tegen oxidatieve stress sterk afneemt bij een stapeling van koper.
210
Nederlandse Samenvatting Vanwege de grote onbekendheid van de rol van koper bij hepatitis hebben we ook naar een specifiek hondenras gekeken met een predispositie voor koperstapeling in de lever, de Doberman (hoofdstuk 7). Omdat koperstapeling over een langere tijd op kan treden zonder dat er negatieve effecten zijn hebben we hier ook gekeken naar monsters met subklinische hepatitis. In deze groep is er al wel koperstapeling maar is de hond nog steeds ‘gezond’. Hoewel het gendefect van de Doberman niet is gevonden, waren specifieke koper uitscheidingseiwitten verlaagd bij de koperstapelingsziekte. Bij de subklinische groep is één eiwit verlaagd, te weten ATP7A, een eiwit dat in de humane ziekte van Menkes defect is. Behalve bij klinische hepatitis, was in de Doberman ook bij subklinische hepatitis al een verlaging in de afweer tegen oxidatieve stress te zien. Analyse van koper toxcicose van de lever bij Bedlington terriërs heeft er toe geleid dat er een nieuw eiwit is ontdekt met een belangrijke rol bij het transporteren van koper door de levercellen naar de gal. Het defect bij deze honden bleek een mutatie te zijn in het COMMD1 gen (ook bekend als MURR1). De genetische analyse van deze mutatie, en specifiek de detectie van dragers, is erg omslachtig. Hiervoor hebben wij in hoofdstuk 8 een eenvoudige test ontwikkeld om dragers, lijders en gezonde Bedlington terriërs te onderscheiden. Met het gebruik van een kwantitatieve PCR methode hebben wij laten zien dat DNA analyse van monsters (bloed of wangslijmvlies) met een hoge nauwkeurigheid dragers van gezond en lijders kan onderscheiden. Vanwege de relatieve onbekendheid hebben we in hoofdstuk 9 gekeken naar de specifieke werking van het COMMD1 eiwit bij kopermetabolisme. In dit hoofdstuk hebben we gebruik gemaakt van een nieuwe techniek, genaamd RNAi of RNA interferentie, om heel specifiek één eiwit uit te schakelen. Hierbij wordt gebruik gemaakt van zeer kleine moleculen die specifiek op het RNA van een eiwit binden en dit afbreken voordat een eiwit wordt gemaakt. Als we deze moleculen gebruiken om COMMD1 uit te schakelen kan het effect op het kopermetabolisme bekeken worden en krijgen we inzicht in de werking van dit eiwit. De kweekresultaten laten zien dat als het COMMD1 eiwit uitgeschakeld is, koper zich opstapelt in de levercellen. Bovendien worden ze hierdoor veel gevoeliger voor koper en gaan ze sneller dood. Hiermee is vastgesteld dat COMMD1 een belangrijke rol speelt in de uitscheiding van koper uit levercellen en is de oorzakelijke rol van dit eiwit in de ontwikkeling van deze vorm van hepatitis, onomstotelijk vastgesteld. Het gebruik van de siRNA techniek in het vorige hoofdstuk, leidde tot het idee om siRNA moleculen te gebruiken als therapie om tumoren gevoeliger te maken voor bestaande chemotherapieën. Onze aandacht ging uit naar x-linked inhibitor of apop211
Chapter 12 tosis (XIAP), een eiwit dat we al eerder hadden bestudeerd bij kopergerelateerde toxcicose van de lever. Een verlies van dit eiwit leidt tot een verhoging in gereguleerde celdood, ook wel apoptose genoemd. In hoofdstuk 10 laten we zien dat een specifieke remming in de productie van XIAP leidt tot een verhoogde gevoeligheid van tumoren (prostaat, galgang en melkklier) voor experimentele (TRAIL) en bestaande chemotherapieën (doxorubicine).
Conclusies In het onderzoeksveld van leverziekten bij de hond hebben we grote vooruitgang geboekt in het begrijpen van biologische mechanismen in leverziekten zoals hepatitis, koper toxcicose van de lever, lever hypoplasie en tumor vorming. In dit proefschrift leggen we de basis voor nieuwe therapieën zoals HGF behandeling. Mogelijk dat een analyse aan individuele cellen kan leiden tot gedetailleerdere beschrijving van hepatitis bij honden en daarmee ook bij mensen. Samenwerking met humane hepatologie (Prof. Roskams, Leuven, België) is de afgelopen jaren sterk geïntensiveerd en zal hopelijk nog vele wetenschappelijke vruchten afwerpen.
212
