Nederlandse samenvatting
Chapter 10
Chapter 10
Nederlandse samenvatting Het menselijk lichaam bestaat uit meer dan 200 verschillende celtypes en elk celtype heeft zijn eigen specifieke functie. De genetische informatie, gecodeerd in het DNA, instrueert de cellen hoe zij hun functie kunnen uitoefenen. De genetische informatie bevat ongeveer 20.000 genen, die coderen voor de functionele eenheden van de cel; de eiwitten. Het eiwitexpressie patroon bepaald welke biologische processen plaats vinden in de cel. Precieze regulatie van deze processen, waaronder groei, differentiatie en proliferatie, waarborgen het normaal functioneren van de cel. Voor het uitoefenen van zijn functie wordt slecht een deel van het totaal aantal genen in de cel afgeschreven tot eiwitten. Het aantal genen dat actief getranslateerd wordt tot eiwitten veranderd voortdurend en wordt gereguleerd door een dynamisch laag bovenop de DNA genaamd "epigenetische laag. Epigenetica is de extra laag erfelijke informatie bovenop de DNA sequentie van het genoom. De twee belangrijkste onderdelen van epigenetische laag zijn DNA-methylatie; de toevoeging van de methylgroep op de C-nucleotiden van het DNA, en posttranslationele histon modificaties. Histoneiwitten zorgen ervoor dat het DNA netjes wordt opgeslagen in de cel en deze eiwitten zijn aftelbaar door hun uitstekende staarten die kunnen worden gewijzigd op vele posities. De modificaties op de histoneiwitten hebben dus invloed op de expressie van genen. De epigenetische componenten van een gen (DNA methylatie en histonmodificaties) hebben dus een belangrijke rol bij de regulatie van genexpressie. Zo zijn de DNA methylatie niveaus in de promotor regio’s van veel genen zeer bepalend voor het wel of niet tot expressie komen van deze genen (Figuur 1). Deregulatie van de epigenetische informatie kan er toe leiden dat genen afwijkend tot expressie komen, wat vervolgens tot ziekte kan leiden. In kanker zijn genen met afwijkende expressie vaak nauw betrokken bij de pathologie van kanker. Genen die belangrijk zijn voor het remmen van celgroei hebben vaak een verlaagde expressie in kanker noemen we tumorsuppressorgenen (TSG), waardoor kankercellen ongeremd kunnen groeien. Genen die celgroei stimuleren hebben vaak een verhoogde expressie in kanker en noemen we oncogenen. De verhoogde expressie van oncogenen zorgt ervoor dat kankercellen een groeivoordeel hebben ten opzichte van gezonde cellen. Het aandan wel uitzetten van zulke genen is een mogelijke therapeutische strategie om kankercellen minder hard te laten groeien. Het specifiek aan- en uitzetten van genen kan bereikt worden met behulp van artificiële transcriptiefactoren (ATFs). Een interessante ontwikkeling binnen de celbiologie heeft het namelijk mogelijk gemaakt om endogene transcriptiefactoren te customizen, waardoor je ze kunt targetten naar bijna iedere gewenste plek in het humane genoom. Hierdoor kan in principe van elk gen de expressie worden gemoduleerd, zowel opwaarts als neerwaarts. In de 220
Nederlandse samenvatting
praktijk is echter gebleken dat het aanzetten van epigenetisch uitgezette genen nog steeds erg lastig is. Het DNA-bindende deel van de ATFs gebruikt in deze thesis bestaat uit Zink Vinger eiwitten. Elke zinkvinger kan drie basenparen herkennen, waardoor zes zinkvingers tesamen 18 basenparen herkennen (Figuur 1). Dit maakt het mogelijk om een specifieke locatie in het genoom te targetten. DNA-bindende domeinen kunnen vervolgens worden gefuseerd aan een genactivator (bv VP64) die het gen kunnen aanzetten, of aan een genrepressor (bv SKD) die het gen uit kunnen zetten. Een van de doelen van dit onderzoek was om de afwijkende genexpressieniveaus in kankercellen te herstellen met behulp van ATFs en vervolgens te kijken of er groeiremming plaatsvond. We hebben eerst in eierstokkanker naar de rol van EpCAM (hoofdstuk 2) en ICAM-1 (hoofdstuk 3) gekeken. Voor deze genen waren ATFs beschikbaar die eerder voor andere doeleinden waren gebruikt. We begonnen met het laten zien dat de expressie van deze genen uitstekend kon worden gemoduleerd met deze ATFs in eierstokkanker. Bij aanvang van dit onderzoek was slechts een enkel TSG eerder opgereguleerd mbv ATF technologie (Maspin), en in hoofdstuk 2 en 3 laten we zien dat we nu ook EPCAM en ICAM-1 konden opreguleren. Na opregulatie van deze genen konden we laten zien dat ze inderdaad betrokken zijn bij het remmen van eierstokkanker. Voor een aantal kandidaat TSGs in baarmoederhalskanker zijn we vervolgens zelf ATFs gaan ontwikkelen (CCNA1, C13ORF18, TFPI-2 en EPB41L3). Uit eerder onderzoek in ons lab is gebleken dat deze genen afwijkende DNA methylatie patronen hebben in baarmoederhalskanker en daarom mogelijk een rol van betekenis hebben in dit kankertype. Niet alleen waren we zeer goed in staat om deze genen weer tot expressie te brengen met behulp van onze zelfontworpen ATFs, we konden ook precies uitvinden of deze genen inderdaad een rol spelen bij de pathologie van baarmoederhalskanker. Zo hebben we bijvoorbeeld ontdekt dat C13ORF18, een gen met onbekende functie, groeiremming veroorzaakt in kankercellen als het tot herexpressie wordt gebracht door middel van een ATF (hoofdstuk 4). Maar we hebben ook laten zien dat TFPI2 en EPB41L3 een remmende werking hebben op baarmoederhalskanker celgroei, wat eerder was aangetoond in andere types kanker. Ook andersom hebben we aangetoond dat de kandidaat TSGs Maspin en CCNA1 geen directe groeiremminggeven als ze tot herexpressie worden gebracht, en daarom misschien een minder belangrijke rol spelen in baarmoederhalskanker. Echter, het nadeel van ATFs is dat de effecten maar tijdelijk zijn; zodra de ATF niet meer aanwezig is in de cel, keren genen weer terug naar hun oorspronkelijke expressieniveau, waardoor een ziekte zich weer opnieuw zou kunnen openbaren. Het ultieme doel van dit onderzoek was dan ook om genen blijvend aan- of uit te
221
10
Chapter 10
zetten, wat mogelijk bereikt kan worden door de epigenetische foutjes op de genen te repareren. Hierdoor wordt als het ware de epigenetica van een gen geherprogrammeerd, waardoor er ‘permanente’ verandering van genexpressie plaatsvindt. Het genspecifiek overschrijven van de epigenetica kan gedaan worden door epigenetische enzymen te targetten naar het gen van interesse, waardoor de enzymen lokaal rechtstreeks invloed kunnen uitoefenen op DNA methylatie (hoofdstuk 5, 6 en 8) of histonmodificaties (hoofdstuk 7). We noemen het herschrijven van de epigenetische code van genen ‘Epigenetic Editing’, een strategie die het laatste jaar enorm in opmars is, onder anderen vanwege nieuwe enzymen die zijn ontdekt om DNA te demethyleren in menselijke cellen. Om genen epigenetisch te herprogrammeren hebben we aan de DNAbindende domeinen DNA (de)methylerende en histon methylerende enzymen gekoppeld. Tot nu toe zijn slechts een zeer beperkt aantal genen gemoduleerd door middel van het overschrijven van de epigenetische informatie op het DNA, maar in dit proefschrift laten we zien dat het wel degelijk mogelijk is om ook via Epigenetic Editing efficiënt de expressie van genen te moduleren. Om te beginnen konden we van het welbekende oncogen Her2/neu de expressie verminderen door een histon modificerend enzyme (G9A) naar het Her2/neu gen te targetten. Her2/neu is een oncogen wat tot overexpressie komt in ~20% van de borstkanker gevallen en wordt veel gebruikt als therapeutische target in deze borstkanker subtype. Inderdaad, het op Her2/neu gerichte enzym verminderde de expressie van Her2/neu, wat vervolgens weer resulteerde in verminderde kankergroei. Hoewel de rol van histonmodificaties niet altijd duidelijk is met betrekking tot de regulatie van gene expressie (er zijn vele histonmodificaties), konden we hier ook een direct verband zien tussen het aanbrengen van de histonmodificatie en het afnemen van Her2/neu expressie (hoofdstuk 7). Histonmodificaties kunnen dus van groot belang zijn voor het bepalen van de expressie niveaus van genen. Vaak hangen deze modificaties nauw samen met de mate van DNA methylatie op de genen. Actieve histonmodificaties zijn gelinkt zijn aan ongemethyleerd DNA, en remmende histonmodificaties zijn gelinkt aan gemethyleerd DNA. Crosstalk tussen de histonmodificaties en DNA methylatie zorgen ervoor dat inhiberende histonmodificaties op den duur leidden tot gemethyleerd DNA en visa versa. DNA methylatie wordt vaak beschouwd als de stabiele factor in het bepalen van de expressie niveaus van genen op lange termijn. Geimprinte genen zijn bijvoorbeeld genen die vroeg in de ontwikkeling worden gemethyleerd en kunnen de rest van het leven uit blijven staan. In veel ziektes worden afwijkende genexpressie niveaus veroorzaakt door geleidelijke veranderdingen in DNA methylatie patronen (soms voorafgegaan door afwijkende histonmodificaties), iets wat ook duidelijk het geval is bij de meeste kanker types. Om deze genexpressie-niveaus voorgoed weer onder controle te krijgen is het aanbrengen of verwijderen van DNA methylatie, afhankelijk van het 222
Nederlandse samenvatting
gen en de ziekte, dus zeer belangrijk. De heilige graal om expressieniveaus blijvend te moduleren lijkt daarom dus het customizen va DNA levels op genen te zijn. In dit proefschrift hebben we eerst onderzocht of het mogelijk is om DNA methylatie van TSG in kanker te verwijderen waardoor deze genen weer actief konden worden (Figuur 1). Tot nu toe was dat nog nooit gelukt om via een demethylerend enzym gekoppeld aan een zinkvinger een TSG weer te activeren en daardoor kanker te remmen. Dit komt met name omdat de enzym-family die in staat is DNA te demethyleren nog niet zolang geleden ontdekt is (gedurende het vervaardigen van dit proefschrift: Tet-enzymen). Ook is ontdekt dat het richten Transiente effector domeinen (‘kortdurend’ effect): -gen activatie VP64 -gen repressie SKD Epigenetic Editing domeinen (‘permanent’ effect): - DNA demethylatie (Tet2) - DNA methylatie (M.SssI)
m
m
m
m
gen gemethyleerd: gen komt niet tot expressie
m
TAACGCGGACAGTGAAGTGCTACATGAGTCGGACTCAGACTCCAGGTGAAGCAGCCAGCAGAGGTCAGAGAGAGACAGCTCACGTTCCGGGTAATGTTGCAGGTCGAT
zinkvinger eiwit
gen promoter
target gen
Epigenetic Editing: gen activatie gen gedemethyleerd: gen komt wel tot expressie
transcriptie factoren TAACGCGGACAGTGAAGTGCTACATGAGTCGGACTCAGACTCCAGGTGAAGCAGCCAGCAGAGGTCAGAGAGAGACAGCTCACGTTCCGGGTAATGTTGCAGGTCGAT
zinkvinger eiwit: ontworpen en ge-engineerd om 18 baseparen in de gekozen gen promoter te binden (deze thesis heeft 9 genen als target: EPCAM, ICAM-1, C13ORF18, CCNA1, TFPI2, Maspin, EPB41L3, Her2 en PLOD2).
target gen
Figuur 1. Epigenetic Editing. Artificiële transcriptiefactoren zijn fusie-eiwitten die uit een DNA bindend domein bestaan (bijvoorbeeld een zinkvinger) die verbonden is aan een effector domein (VP64, SKD). Het effector domain is specifiek naar het gen van interesse getarget en beïnvloed de expressie van het gen. Door middel van Epigenetic Editing wordt de epigenetische code (bijv DNA methylatie (weergegeven als rode cirkel) overschreven, waardoor van een gen ‘blijvend’ de expressie kan worden gemoduleerd. In het voorbeeld wordt mbv Tet2 de methylatie verwijderd, waardoor transcriptiefactoren die nodig zijn voor het afschrijven van een gen kunnen binden, en vervolgens vind er transcriptie van het gen plaats.
223
10
Chapter 10
van zulke enzymen naar promoter regios zorgt voor lokale DNA demethylatie. In deze thesis beschrijven we een efficiënte methode waarin we ook laten we lokaal de methylatie levels van TSGs kunnen verminderen, met wel ~35% (hoodstuk 5), na het targetten van Tet-enzymen. Van onze doelgenen die praktisch niet tot expressie kwamen, konden we de expressie met een factor 50 verhogen, wat weer leidde tot verminderde tumor groei. Vervolgens hebben we verder onderzocht naar methodes om dit proces nog efficiënter te maken. Zo kwamen we erachter dat we door het toevoegen van een stofje die genen meer bereikbaar maken voor grote enzymen zoals de Tet-enzymen, de opregulatie verder konden verbeteren. Aan de andere kant hebben we gebruik gemaakt van de methylerende enzymen om genen juist uit te zetten, die aan stonden. Deze methylerende enzymen gingen we koppelen aan zinkvingers die we vervolgens gingen targetten naar genen te hard aanstonden. Inderdaad konden we op deze genen DNA methylatie aanbrengen, wat vervolgens tot verminderde expressie van het gen leidde (hoofdstuk 8). Zo hebben we PLOD2 weten te methyleren. Dit gen is een belangrijk target vanwege zijn rol in fibrose en blijvende repressie van dit gen kan op lange termijn misschien vermeerdering van littekenweefsel helpen voorkomen. Door het PLOD2 gen te methyleren konden we de expressie gedurende het hele verloop van het experiment laag houden, ook in afwezigheid van de methylase (10 dagen). Door deze unieke manier van genmodulatie konden we ook andere epigenetische processen bestuderen die tijdens deze tien dagen optraden. Zo hebben we precies onderzocht welke histonmodificaties veranderden naar het aanbrengen van DNA methylatie en konden we op deze manier meer inzicht krijgen in de crosstalk tussen DNA methylatie en histonmodificaties. Maar ook andersom konden we nauwkeurig zien welke histonmodificaties veranderden na het onderdrukken van PLOD2 gebruik makende van SKD-ZFPs. Verder hebben we in dit onderzoek veel aandacht besteed aan het effect van epigenetische medicijnen op de genexpressie van onze target genen. Deze epigenetische medicijnen remmen de werking van epigenetische enzymen, wat vervolgens tot genactivatie leidt. Hoewel deze medicijnen succesvol worden gebruikt om bloedkanker-patiënten mee te behandelen vallen de resultaten voor andere soorten kankers nog tegen, deels door de toxiciteit van deze medicijnen. Deze toxiciteit wordt ondermeer veroorzaakt doordat deze medicijnen op veel genen tegelijkertijd werken, dus ook op genen waarvan de expressie niet veranderd dient te worden. Het gevolg is een scala aan bijeffecten. Mede daarom heeft hebben we met het huidige onderzoek getracht de bijeffecten van zulke epigenetische medicijnen te verminderen door alleen zinkvingers te richten naar genen die een belangrijke rol spelen in het ziekteproces. Hoewel het niet officieel bewezen is dat zinkvingers enkel aan het gen binden waarheen ze worden getarget, hebben we wel een belangrijke stap gezet om de binding van zinkvingers aan het genoom in kaart te brengen. We hebben gevonden dat genen een aantrekkingskracht op zinkvingers uitoefenen vergeleken 224
Nederlandse samenvatting
met andere delen van het genoom (slechts 2% van het genoom zijn genen), en dat met name als genen goed bereikbaar zijn, de zinkvingers preferentieel aan het doel-gen bind (hoofdstuk 7). Dit verklaart ook waarom in het verleden onderzoek heeft aangetoond dat genen specifiek gemoduleerd kunnen worden met zinkvingers. Genen die uitstaan, zijn echter iets minder makkelijk te bereiken, wat ten koste gaat van de specificiteit (hoofdstuk 5). Om de binding van de zinkvinger aan deze uitgezette, moeilijk bereikbare genen te vergemakkelijken, laat dit proefschrift ook zien dat lage concentraties van de gebruikte epigenetische medicijnen in de kliniek (voor bloedkanker patienten) het effect van ATFs sterk kunnen verbeteren (hoofdstuk 3 en 6). De bereikbaarheid van de ATF naar het gen wordt verbeterd en we hebben we laten zien dat genen hierdoor voor langere tijd aangezet kunnen worden dan normaal het geval is met ATFs of deze epigenetische medicijnen afzonderlijk. In de toekomst kan een combinatie van epigenetische medicijnen en programmeerbare ATFs misschien een therapeutische oplossing bieden voor kanker. Samenvattend kan gezegd worden dat dit proefschrift een hele mooie en krachtige methode beschrijft hoe genen efficiënt gemoduleerd kunnen worden mbv zinkvingers gelinkt aan een gen-activator (VP64) of een gen-repressors (SKD). We konden op een unieke wijze de functie van bepaalde genen onderzoeken in bepaalde soorten kanker en door modulatie van expressie van bepaalde genen konden we de kankergroei remmen. Echter, de effecten van deze genexpressiemodulatoren lijken van korte duur te zijn. Om de expressie van genen voor lange duur te bewerkstelligen konden we dmv Epigenetic Editing de epigenetica van de doelgenen overschrijven. We konden met een methylerend enzym PLOD2 methyleren en hierdoor bleef de expressie laag voor de gemeten 10 dagen. Andere genen konden we juist activeren door methylatie weg te halen. Of deze genen permanent weer aan staan moet in vervolgstudies blijken. Permanente opregulatie van genen is misschien moeilijker dan het permanent onderdrukken van genen, omdat er constant processen in de cel aanwezig zijn die methylatie weer op de genen wil zetten. Het nog efficiënter verwijderen van methylatie zou hierbij kunnen helpen, alswel het remmen van de processen die de hermethylatie bewerkstelligen. Toekomstige nieuwe inzichten in het DNA demethylatie proces zou er ook toe kunnen leiden dat we nog efficiënter DNA demethylatie kunnen verwijderen. Er is nog steeds een hoop onbekend hoe dit proces precies in zijn werk gaat. De methodes die in deze thesis worden beschreven zijn in principe bruikbaar om de expressie van elk gen in het menselijke genoom te moduleren en dus controle te krijgen over het hele genoom om ziekte te bestrijden. De protocollen voor het reprogrammeren van de epigenetische code van target genen stelt wetenschappers in staat om permanent de expressie van genen aan- of uit te zetten met ‘single gen’ precisie. Ook draagt het overschrijven van epigenetische codes bij om meer te weten te komen over epigenetische mechanismes. 225
10
Chapter 10
226
