CHAPTER 7
Nederlandse samenvatting
Chapter 7 Chemotherapie is naast operatieve verwijdering en/of bestraling van tumoren de meeste toegepaste methode voor de behandeling van kanker bij kinderen. Hoewel chemotherapie voor bepaalde typen kanker de enige of meest effectieve behandelmethode is, kleven er ook ernstige nadelen aan. Ten eerste hebben de meeste chemotherapeutica ernstige bijwerkingen, aangezien ze niet specifiek zijn voor tumorcellen, maar ook gezonde cellen aantasten. Ten tweede kunnen tumorcellen resistent zijn/worden voor chemotherapeutica, hetgeen betekent dat ze niet langer gevoelig zijn voor de medicatie en dus ongehinderd verder kunnen groeien. Een van de mechanismen die een rol spelen bij het ontstaan van resistentie is het verhoogde transport van toxische verbindingen uit de kankercel (efflux). Het transport van deze verbindingen wordt mogelijk gemaakt door zogenaamde ABC transporteiwitten. Deze eiwitten transporteren actief, dat wil zeggen ten koste van een zekere hoeveelheid energie, bepaalde verbindingen over het plasmamembraan. Het plasmamembraan is een dubbele laag van verschillende soorten lipiden met daarin een grote verscheidenheid aan eiwitten. Het probleem van de aanwezigheid van ABC transporteiwitten is dat ze niet alleen de reeds gebruikte chemotherapeutica de cel uit transporteren, maar ook niet eerder gebruikte functioneel en structureel verschillende chemotherapeutica. Dit verschijnsel wordt multidrug resistentie (MDR) genoemd en betekent in de praktijk dat de tumor ongevoelig is geworden voor de meeste chemotherapeutica. In de meeste gevallen zijn de ABC transporteiwitten Pgp (P-glycoproteïne) en MRP1 (multidrug resitentie-gerelateerde proteïne 1) verantwoordelijk voor het transport van chemotherapeutica. Pgp en MRP1 zijn membraaneiwitten en komen met name tot expressie in het plasmamembraan. In tegenstelling tot wat vroeger werd gedacht, is het plasmamembraan geen homogeen statisch geheel. Lipiden en eiwitten blijken in staat te clusteren tot domeinen met een specifieke samenstelling. Uit verscheidene experimenten is gebleken dat vooral cholesterol en een subgroep van lipiden, de sfingolipiden (Fig. 1), zijn geconcentreerd in deze membraandomeinen. Door de aanwezigheid van cholesterol en sfingolipiden hebben membraandomeinen andere fysische eigenschappen dan het omliggende membraan. Dankzij de specifieke fysische eigenschappen vormen membraandomeinen de ideale omgeving voor belangrijke membraaneiwitten, waaronder onder andere receptoreiwitten. De ABC transporteiwitten Pgp en MRP1 blijken ook geconcentreerd te zijn in membraandomeinen, zoals onder meer uit eerder onderzoek in ons laboratorium is gebleken. Om onderzoek te doen naar MDR in kanker hebben verschillende onderzoeksgroepen kankercellen voorzien van extra Pgp of MRP1. Daarvoor hebben ze DNA in cellen geplaatst (transfectie) dat codeert voor Pgp of MRP1. Dit DNA zorgt ervoor dat extra ABC 108
Nederlandse samenvatting
Figuur 1. Schematische weergave van het sfingolipidenmetabolisme
transporteiwitten worden gemaakt. In andere studies zijn kankercellen resistent gemaakt door ze over een lange periode bloot te stellen aan een steeds hogere concentratie van een chemotherapeuticum. Op deze manier verkrijgt men door selectie kankercellen die resistent zijn en waarin vaak meer Pgp of MRP1 tot expressie komt. Een opvallende waarneming in MDR kankercellen is dat het sfingolipide glucosylceramide verhoogd aanwezig is. Verklaringen voor dit verschijnsel worden onder meer gezocht in: • het feit dat zowel glucosylceramide als ABC transporteiwitten verrijkt zijn in membraandomeinen. • de beschermende werking van de omzetting van ceramide – een sfingolipide dat celdood kan bewerkstelligen - tot glucosylceramide door glucosylceramide synthase. De gelijktijdige toename in expressie van ABC transporteiwitten en glucosylceramide in membraandomeinen kan erop duiden dat er een relatie bestaat tussen deze eiwitten en dit sfingolipid. Mogelijkerwijs zorgt de aanwezigheid van een bepaalde hoeveelheid glucosylceramide voor de juiste omstandigheden voor de lokalisatie en/of activiteit van ABC transporteiwitten in membraandomeinen. Aan de andere kant heeft de synthese van glucosylceramide tevens een gunstig effect op de ceramide niveaus in de cel. Ceramide is het meest eenvoudige sfingolipide en verhoogde niveaus van dit molecuul zijn geassocieerd met een toename van geprogrammeerde celdood (apoptose). Stress situaties, zoals de aanwezigheid van chemotherapeutica, kunnen ervoor zorgen dat de ceramide niveaus in een cel toenemen. De omzetting van ceramide tot glucosylceramide kan dus gunstig zijn voor de overlevingskansen van een kankercel, aangezien ceramide niveaus laag blijven en meer glucosylceramide beschikbaar is voor ABC transporteiwitten in membraandomeinen. 109
Chapter 7 Omgekeerd zou het remmen van glucosylceramide synthase dus een manier kunnen zijn om kankercellen gevoeliger te maken voor stress/chemotherapie. Het centrale thema van het onderzoek dat staat beschreven in de hoofdstukken 2 tot en met 5 van dit proefschrift, is het gevoeliger maken van kankercellen voor chemotherapie door middel van modulatie van het sfingolipidenmetabolisme. Dat wil zeggen dat de synthese van bepaalde sfingolipiden werd geremd of juist verhoogd om te onderzoeken of: • dit de activiteit van ABC transporter eiwitten kon beïnvloeden (hoofdstukken 2-4). • dit kon leiden tot ceramide-geïnduceerde geprogrammeerde celdood (hoofdstuk 5). Alle experimenten werden verricht in humane en muize-neuroblastoomcellen die geschikt zijn gemaakt om in een kweekschaaltje te groeien (in vitro, cellijnen). Het neuroblastoom is na hersentumoren de meest voorkomende solide tumor bij kinderen. Het overgrote deel van de kinderen met een neuroblastoom is niet ouder dan 5 jaar en het neuroblastoom komt zelden voor bij kinderen ouder dan 10 jaar. Het neuroblastoom is een kwaadaardige tumor dat ontstaat uit cellen van het autonome zenuwstelsel. Hoewel het neuroblastoom op elke willekeurige plaats van het autonome zenuwstelsel kan ontstaan, ontwikkelt deze tumor zich vaak in de bijnierregio. De prognose en de daarop gebaseerde behandeling is sterk afhankelijk van de leeftijd van de patiënt en de uitgebreidheid (stadium) van de ziekte. Met name kinderen ouder dan 1 jaar en met een ziekte in een vergevorderd stadium (met metastasen op afstand) hebben een slechte prognose, ondanks een intensieve behandeling. Een van de oorzaken van het falen van intensieve chemotherapie bij deze patiënten is MDR. De expressie van de MDR eiwitten Pgp en MRP1 is daarom een van de negatieve prognostische factoren, evenals enkele tumorbiologische kenmerken (o.a. histologische differentiatie en amplificatie van het N-myc oncogen). Het neuroblastoom wordt verder gekenmerkt door een specifieke sfingolipidensamenstelling, wat aangeeft dat deze
moleculen
mogelijk
een
rol
spelen
in
deze
ziekte.
Gezien
de
unieke
sfingolipidensamenstelling van het neuroblastoom en de ogenschijnlijke relatie tussen sfingolipiden en ABC transporteiwitten, zou modulatie van het sfingolipidenmetabolisme juist in dit type tumoren kunnen leiden tot een nieuwe of verbeterde therapie. Hieronder volgt per hoofdstuk een korte samenvatting van de opzet en resultaten van de uitgevoerde studies. Hoofdstuk 2 beschrijft de karakterisering van de sfingolipidensamenstelling en MDR status van drie humane neuroblastoom cellijnen met verschillende Pgp en MRP1 expressie niveaus. Deze cellijnen zijn afkomstig uit patiënten en hebben in vivo hun MDR eiwit 110
Nederlandse samenvatting expressie niveaus verkregen. De hoogste Pgp en MRP1 expressie en effluxactiviteit werden gevonden in respectievelijk de SK-N-FI cellijn en de SK-N-AS cellijn. In vergelijking tot de SK-N-DZ cellijn brachten deze twee cellijnen ook de hoogste sfingolipiden niveaus tot expressie, waarbij vooral de SK-N-AS cellijn rijk was aan sfingomyeline. Alledrie de cellijnen waren relatief rijk aan gangliosiden (complexe sfingolipiden), waarbij de cellijnen SK-N-FI en SK-N-AS voornamelijk a-serie gangliosiden tot expressie brachten en de SK-NDZ cellijn b-serie gangliosiden. Door deze eigenschappen bieden zij een goed modelsysteem om verbanden tussen het sfingolipidmetabolisme en de activiteit van ABC transporteiwitten te bestuderen, in aanvulling op modelsystemen waarin Pgp of MRP1 tot overexpressie zijn gebracht met behulp van transfectie of selectie met een cytostaticum in vitro. De vraagstelling van de studie beschreven in hoofdstuk 3 was: ‘Welke bijdrage leveren gangliosiden ten aanzien van de werking van de ABC transporteiwitten Pgp en MRP1 in neuroblastoomcellen?’. Om deze vraag te beantwoorden verlaagden we de hoeveelheid gangliosiden in de humane neuroblastoomcellen SK-N-FI en SK-N-AS door gebruik te maken van de glucosylceramide synthaseremmers t-PPPP en NB-dNJ. De totale hoeveelheid gangliosiden in de cellen, en tevens de hoeveelheid in membraandomeinen, daalde hierdoor met minimaal 80%. Deze sterke afname resulteerde echter in marginale effecten op de Pgp en MRP1 activiteit, zeker in vergelijking met de effecten gevestigde remmers van Pgp en MRP1, zoals respectievelijk cyclosporine A en MK571. Bovendien waren de effecten van de afname van de hoeveelheid gangliosiden op de celoverleving zeer klein en deze vielen niet samen met de effecten op de effluxactiviteit. Deze resultaten kwamen overeen met de waarnemingen dat: • lokalisatie van MRP1 in membraandomeinen niet werd beïnvloed door de afname van de hoeveelheid gangliosiden. • MRP1 en gangliosiden in verschillende subsets van membraandomeinen leken te zitten. Deze resultaten zijn in tegenspraak met eerder gepubliceerde resultaten van Plo et al. (2002), die aantoonden dat specifieke gangliosiden, GM3 en GD3, de Pgp activiteit stimuleren in acute myeloïde leukemie cellen. Onze studie toont aan dat interacties tussen gangliosiden en ABC transporteiwitten celtype-afhankelijk lijken te zijn en vanuit therapeutisch oogpunt geen interessant aangrijpingspunt vormen MDR tegen te gaan. Zoals eerder is aangegeven zijn cholesterol en sfingolipiden geconcentreerd in membraandomeinen. Deze bevindingen zijn het resultaat van experimenten waarin met behulp van detergentia membraandomeinen uit cellen zijn geïsoleerd en vervolgens zijn geanalyseerd. Er bestaat enige discussie over deze isolatiemethode en het staat niet vast of de geïsoleerde membraandomeinen dezelfde samenstelling hebben als die in de cel. Vandaar dat 111
Chapter 7 geïsoleerde membraandomeinen vaak met een andere naam worden aangeduid, zoals ‘detergent-resistant membrane domains’ (DRMs) (membraandomeinen onoplosbaar in detergentia). In de studie beschreven in hoofdstuk 3 hebben we gebruik gemaakt van deze detergent isolatiemethode om de effecten van verlaging van de gangliosiden niveaus op de lokalisatie van onder meer Pgp en MRP1 in membraandomeinen, of eigenlijk dus in DRMs, te onderzoeken. Aangezien we voor de verlaging van de gangliosiden niveaus de glucosylceramide synthaseremmers t-PPPP en NB-dNJ hebben gebruikt, werden daardoor tevens de lactosylceramide en glucosylceramide niveaus verlaagd, dus de gehele glycolipiden pool. Ondanks deze gereduceerde sfingolipidensamenstelling konden DRMs nog altijd worden geïsoleerd. Deze bevinding leidde tot de vraag hoe belangrijk sfingolipiden eigenlijk zijn voor de integriteit van membraandomeinen/DRMs en voor de lokalisatie van specifieke eiwitten in die domeinen. Het uitgangspunt van hoofdstuk 4 was om te onderzoeken welke rol
sfingolipiden
en
cholesterol
spelen
met
betrekking
tot
de
integriteit
van
membraandomeinen/DRMs en in hoeverre lokalisatie van eiwitten - in het bijzonder MRP1 in die domeinen afhankelijk is van sfingolipiden en/of cholesterol. In dit hoofdstuk tonen we aan dat verlagen van de totale sfingolipiden hoeveelheid met 80% in Neuro-2a muizeneuroblastoomcellen geen effect heeft op de integriteit van membraandomeinen/DRMs en op de lokalisatie van onder andere MRP1 in die domeinen. Echter, wanneer de hoeveelheid cholesterol drastisch werd verlaagd was een verschuiving zichtbaar van MRP1 uit de fractie waar membraandomeinen/DRMs zich bevinden. Tevens toonde MRP1 een verminderde effluxactiviteit als gevolg van de verlaging van de hoeveelheid cholesterol. De integriteit van membraandomeinen/DRMs leek echter onaangetast door de verlaging van de hoeveelheid cholesterol in de Neuro-2a cellen. Niettegenstaande het resultaat dat cholesterol belangrijk leek te zijn voor de MDR status van kankercellen, kan uit deze resultaten worden opgemaakt dat zowel cholesterol als sfingolipiden niet essentieel zijn voor de integriteit van membraandomeinen/DRMs (of dat DRMs artefacten zijn gecreëerd tijdens en door de detergent isolatiemethode). Tenslotte tonen we in hoofdstuk 5 aan dat verhoging van de ceramide niveaus in een cel niet automatisch leidt tot geprogrammeerde celdood. Hoewel we in een eerdere studie hebben aangetoond dat een behandeling van Neuro-2a cellen met het chemotherapeuticum paclitaxel in combinatie met de glucosylceramide synthaseremmer t-PDMP resulteerde in verhoogde ceramide niveaus enerzijds en een synergistische afname van de celoverleving anderzijds, tonen we in deze studie aan dat het laatste niet het gevolg was van ceramidegeïnduceerde celdood. Wat uit onze resultaten blijkt is dat behandeling van Neuro-2a cellen 112
Nederlandse samenvatting met de combinatie van paclitaxel en t-PDMP leidt tot hyperploïdie. Dat wil zeggen dat tijdens het proces van celdeling wel het DNA wordt verdubbeld, maar dat deling van de moedercel in twee dochtercellen niet plaatsvindt. Hierdoor ontstaan cellen met te veel chromosomaal DNA. In feite was er dus geen afname van de celoverleving, maar in plaats daarvan het uitblijven van toename van de hoeveelheid cellen. Echter, dat onderscheid kon niet worden gemaakt met de gebruikte methode. Verdere experimenten wezen uit dat het ontstaan van hyperploïde cellen het gevolg is van een paclitaxel/t-PDMP specifiek effect op eiwitten die betrokken zijn bij de celdeling, dat onafhankelijk is van het sfingolipidenmetabolisme. Kortom, deze studie toont aan dat verhoogde ceramide niveaus niet als zodanig leiden tot geprogrammeerde celdood en dat resultaten verkregen met behulp van t-PDMP, of andere glucosylceramide synthase remmers, in dit opzicht kritisch moeten worden bekeken. Samenvattend kunnen we concluderen dat sfingolipiden niet essentieel zijn voor het functioneren van Pgp en MRP1 en voor de integriteit van membraandomeinen/DRMs. Verder zijn de getoonde effecten van t-PDMP niet afhankelijk van het sfingolipidenmetabolisme, maar heeft deze remmer effect op de werking van eiwitten die betrokken zijn bij de celdeling.
113
