cDNA analyse van DNA repair genen in hoogrisico borstkankerfamilies
Grunewald Anneke
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Kathleen Claes Begeleider: Dr. Kim De Leeneer Vakgroep: Pediatrie en genetica
Academiejaar 2012-2013
Voorwoord Het laatste jaar Gent, het thesisjaar. Een jaar waarbij leuke, grappige momenten zich afwisselden met stress en deadlines. Zonder de hulp van bepaalde personen was het niet mogelijk geweest om deze thesis te schrijven, daarom zou ik graag de mensen willen bedanken die dit mogelijk maakten. In eerste instantie zou ik graag mijn promotor Kathleen en begeleider Kim willen bedanken voor de kans die ze me boden om deel uit te maken van dit onderzoek. Ondanks hun drukke agenda vonden ze steeds de tijd om mij bij te staan met raad en daad. Ik mocht steeds ‘binnenspringen’ in jullie bureau. Dankzij jullie kennis, ervaring, toewijding en goede ondersteuning was dit een bijzonder leerrijke ervaring. Ik zou graag ook alle laboranten, die ik vaak genoeg heb lastig gevallen, hartelijk bedanken. Ondanks jullie eigen werk, mochten we steeds bij jullie aankloppen, waarna jullie ons met plezier hielpen. Ook zou ik graag Lode, Elise, Jolien, Morgane, Jasper, Mattias en Liza willen bedanken voor de (te) leuke momenten die we samen gedeeld hebben. Het was steeds gezellig in onze ‘kast’, deels door plaatsgebrek, maar we hebben niets dan goede momenten beleefd. Jullie zorgden voor de nodige afleiding en koffiepauzes en niet te vergeten de welgemeende steun. Via deze weg zou ik ook graag mijn ouders en zus bedanken, die me in alle keuzes 100% gesteund hebben. Ondanks dat ik dit jaar minder tijd kon doorbrengen met jullie, hoop ik dat jullie trots zijn op dit werk. Mijn diploma zou ik nooit behaald hebben moesten jullie er niet geweest zijn! Ten laatste, maar zeker niet de minst belangrijke, zou ik graag mijn vriend Surcouf bedanken. Hij heeft deze 5 jaar, en voornamelijk dit laatste jaar, van dichtbij meegemaakt. Dit betrof zowel alle goede en leuke momenten als de mindere. Ook al heb ik je het niet altijd even gemakkelijk gemaakt, je bleef me in alles steunen. Dankjewel hiervoor!
Dankjewel !!
Afkortingen 53BP1
p-53 bindend eiwit
AT
ataxia-telangiectasia
ATM
ataxia-telangiectasia mutated
AZ
aminozuur
BAP1
BRCA1-associated protein 1
BARD1
BRCA1-associated RING domain 1
BRCA1
breast cancer susceptibility gene 1
BRCA2
breast cancer susceptibility gene 2
BRCT
BRCA1 carboxyl terminus
BRIP1
BRCA1 interacting protein C-terminal helicase
cDNA
complementair DNA
CHEK2
checkpoint kinase 2
CMGG
centrum medische genetic Gent
DNA
deoxyribonucleic acid
DSB
dubbelstrengbreuken
ddNTP
dideoxyribonucleotides trifosfaat
dNTP
deoxyribonucleotides trifosfaat
DMSO
ditmethylsulfoxide
dsDNA
dubbelstrengig DNA
DTT
dithiothreitol
EBV
Epstein-Barr virus
EF3
elongatiefactor 3
ENIGMA
evidence-based network for the interpretation of germline mutant alleles
EXO-AP
exonuclease I en antartic phosphatase
FA
Fanconi anemia
FA-D1
Fanconi anemia subgroup D1
FANCJ
Fanconi anemia complementation group J
FAT
FRAP, ATM, TRAPP
FHA
fork head-associated
gDNA
genomisch DNA
GITC
guanidine isothiocyanaat
HEAT
Hungtingtin, EF3, PP2A, TOR1
LFS
Li-Fraumeni syndroom
lncRNA
long non-coding RNA
miRNA
microRNA
ncRNA
non-coding RNA
NLS
nucleair lokalisatie signal
NMD
nonsense mediated decay
M-MULV
moloney murine leukemia virus
PALB2
partner and localizer of BRCA2
PCR
polymerase-kettingsreactie
PP2A
phosphatase 2A
Rcf
relatieve centrifugale kracht
RING
really interesting new gene
RNA
ribonucleïnezuur
RNAsin
ribonuclease inhibitor
RR
relatief risico
RT
reverse transcriptase
SBS
substraatbinding
SCD
SQ/TQ cluster domein
SNP
single nucleotide polymorfismes
ssDNA
enkelstrengig DNA
Tm
smelttemperatuur
TSG
tumorsupressorgenen
UV
unclassified variants
UZG
universitair ziekenhuis Gent
Inhoudstabel
1. Samenvatting ........................................................................................................................ 1 2. Inleiding................................................................................................................................. 2 2.1. Kanker......................................................................................................................................................... 2 2.2. Borstkanker ................................................................................................................................................ 4 2.2.1. Algemeen .............................................................................................................................................. 4 2.2.2. Risicofactoren ...................................................................................................................................... 4 2.3. Genetische voorbeschiktheid ..................................................................................................................... 5 2.3.1. Inleiding ............................................................................................................................................... 5 2.3.2. Hoog penetrante borstkankergenen .................................................................................................. 6 2.3.2.1. BRCA1 en BRCA2......................................................................................................................... 6 2.3.2.2. Andere hoog penetrante genen .................................................................................................. 10 2.3.3. Matig penetrante borstkankergenen ............................................................................................... 11 2.3.3.1. ATM ............................................................................................................................................. 11 2.3.3.2. CHEK2 ......................................................................................................................................... 13 2.3.3.3. BRIP1 .......................................................................................................................................... 15 2.3.3.4. PALB2 ......................................................................................................................................... 16 2.3.4. Laag penetrante varianten ............................................................................................................... 18 2.4. Doel- en vraagstelling ............................................................................................................................... 18 2.4.1. Model van borstkankersusceptibiliteit ............................................................................................ 18 2.4.2. Probleemstelling en doelstelling ....................................................................................................... 19 2.4.2.1. cDNA analyse .............................................................................................................................. 19 2.4.2.2. Enigma project ........................................................................................................................... 20
3. Materialen en methoden .................................................................................................... 21 3.1. Gebruikte methoden ................................................................................................................................ 21 3.2. Selectie patiënten ...................................................................................................................................... 21 3.3. RNA extractie ........................................................................................................................................... 22 3.4. cDNA synthese .......................................................................................................................................... 23 3.5. RT-PCR..................................................................................................................................................... 24 3.5.1. Primerdesign ...................................................................................................................................... 25 3.6. Optimalisatie ............................................................................................................................................. 26 3.7. Caliper LabChip GX ................................................................................................................................ 27 3.8. Klonering .................................................................................................................................................. 27 3.9. Sanger sequenering .................................................................................................................................. 28 3.9.1. Principe .............................................................................................................................................. 28
4. Resultaten ............................................................................................................................ 30 4.1. Enigma Project ......................................................................................................................................... 30 4.2. Vergelijking cDNA synthese kits............................................................................................................. 32 4.3. cDNA analyse van BRCA1, BRCA2, ATM, BRIP1, PALB2 en CHEK2 ............................................... 33 4.3.1. Primerdesign en optimalisatie .......................................................................................................... 33 4.3.2. RNA 1300042 ..................................................................................................................................... 34 4.3.3. PCR + sequenering overige patiënten ............................................................................................. 36 4.4. Analyse van 4 varianten op cDNA niveau .............................................................................................. 37
5. Discussie .............................................................................................................................. 40 5.1. Enigma ...................................................................................................................................................... 40 5.1.1. BRCA1 c.671-2A>G ........................................................................................................................... 40 5.1.2. Vergelijking Takara Ex Taq en Kapa2G Robust ........................................................................... 41 5.1.3. Vergelijking 3 cDNA synthese kits ................................................................................................... 42 5.2. cDNA analyse van BRCA1, BRCA2, ATM, BRIP1, PALB2 en CHEK2 ............................................... 43 5.2.1. Primeroptimalisatie ........................................................................................................................... 43 5.2.2. RNA 1300042 ..................................................................................................................................... 44 5.2.3. Overige patiënten .............................................................................................................................. 44 5.3. Analyse van 4 varianten op cDNA niveau .............................................................................................. 45
6. Referenties ........................................................................................................................... 48
1. SAMENVATTING Het doel van deze studie is om met behulp van cDNA analyse na te gaan of germinale mutaties aanwezig zijn BRCA1/2, ATM, BRIP1, PALB2 of CHEK2 in families waarin tot nu toe geen moleculaire verklaring werd gevonden voor de familiale clustering van borstkanker. Voor deze studie werden 25 patiënten uit 24 niet-verwante families geselecteerd die voldeden aan de inclusiecriteria. De beschikbare EBV cellijnen werden opgekweekt voor deze patiënten, waarbij één deel behandeld werd met puromycine. Vervolgens werd hieruit totaal RNA
geëxtraheerd
en
cDNA
gesynthetiseerd.
Gelijktijdig
werden
PCR
en
sequeneringsprimers ontwikkeld en geoptimaliseerd voor bovenvermelde genen. Bij de 25 patiënten waarop cDNA analyse werd uitgevoerd konden 10 varianten geïdentificeerd worden in 3 verschillende genen (BRCA1, BRCA2 en ATM). Deze varianten worden frequent aangetroffen op gDNA niveau en betreffen waarschijnlijk neutrale sequentievarianten. In een tweede deelproject van deze masterproef werd van vier BRCA2 varianten die geïdentificeerd werden op gDNA niveau geëvalueerd wat hun effect op splicing is. Slechts één variant, BRCA2 c.517C>G, leidt tot aberrante splicing en creëerde een aberrant transcript waarbij exon 7 gedeleteerd was. Uit bijkomend onderzoek bleek dat deze variant niet meer in staat was om het full length transcript te genereren en bijgevolg beschouwd kan worden als een pathogene mutatie geassocieerd met een sterk verhoogd risico op borstkanker. In een laatste luik van deze masterproef werd deelgenomen aan een kwaliteitscontroleproject van de splicing werkgroep van het internationale ENIGMA consortium. Hierbij werd de BRCA1 c.671-2A>G variant, waarvoor uit vroeger onderzoek gebleken is dat deze leidt tot een complex patroon van aberrante transcripten, onderzocht op cDNA niveau door verschillende deelnemende labo’s. Na klonering en sequenering van de gekloneerde fragmenten konden 5 (r.671-4096del; r.594-4096del; r.671-3897del; r.671-3881del; r.7874096del) verschillende fragmenten opgepikt worden, terwijl er bij de controle maar 2 (r.6714096del; r.787-4096del) werden geïdentificeerd. Bij dit onderzoek kon men ook besluiten dat zowel de positie van de primers, het gebruikte DNA polymerase en cDNA synthese kit, alsook klonering een rol kunnen spelen in welke transcripten worden opgepikt.
1
2. INLEIDING 2.1. KANKER Kanker is de verzamelnaam voor honderden verschillende soorten ziekten met een gemeenschappelijk kenmerk, namelijk ongecontroleerde celgroei. Normale cellen zullen enkel delen wanneer dit effectief nodig is, bijvoorbeeld bij celhernieuwing of beschadiging van cellen en zullen vervolgens differentiëren waarbij ze hun specifieke vorm verkrijgen. Deze beide processen, celproliferatie en –differentiatie, worden gereguleerd door verschillende factoren die, ofwel celdeling promoten of afremmen. Men kan dus stellen dat kanker ontstaat als gevolg van genetische veranderingen waarbij de celproliferatie verstoord is doordat de celdeling gepromoot wordt en/of celdood geïnhibeerd wordt (1). Deze genetische veranderingen komen voor in genen die de celdeling controleren (2). Deze genen kunnen opgesplitst worden in twee brede klassen: de tumorsupressorgenen (TSG) en de proto-oncogenen. Oncogenen zijn de veranderde vorm van proto-oncogenen en coderen voor eiwitten die de celproliferatie stimuleren. Wanneer hier gain-of–functions mutaties in voorkomen spreken we van oncogenen, deze eiwitten zullen een verhoogde activiteit hebben of zullen in hoeveelheid zijn toegenomen, waardoor er dus een teveel aan cellen zal geproduceerd worden (3). Dit in tegenstelling tot TSG, deze genen coderen eiwitten die de groei van de cellen zullen remmen. Ze spelen een rol in stabilisatie van het genoom (zoals deoxyribonucleic acid (DNA) herstel), induceren van apoptose en reguleren van de celcyclus (3). In tegenstelling tot de proto-oncogenen dienen deze genen geïnactiveerd te worden voor de transformatie tot maligne cellen (2). Het Knudson two-hit model stelt dat kanker ontstaat door accumulatie van mutaties in het DNA en dat inactivatie van beide allelen van een TSG nodig is om het gedrag van cellen te kunnen veranderen. Bij erfelijke kankers is hiervan één mutatie overgeërfd in het DNA, waarna een tweede hit snel kan leiden tot het ontstaan van kanker. In sporadische kankers dienen twee hits in het TSG verzameld te worden, wat de latere leeftijd van het ontstaan van deze kankers verklaard.
2
Figuur 1: Knudson 2 hit hypothese. Normale cellen hebben 2 niet beschadigde chromosomen, 1 afkomstig van de moeder en 1 afkomstig van de vader. Deze chromosomen bevatten duizenden genen. Mensen met een hereditaire susceptibiliteit tot kanker hebben een beschadigd gen overgeërfd op één van hun chromosomen. Dus hun eerste ‘hit’ of mutatie verkrijgen ze bij de conceptie. Andere personen kunnen hun eerste ‘hit’ verkrijgen op een later stadium, voor of na de geboorte. In elk geval, als een cel schade verkrijgt op hetzelfde gen op het tweede chromosoom, dan kan deze cel uitgroeien tot een kankercel. (http://www/fccc.edu.html)
TSG kunnen vervolgens nog eens onderverdeeld worden in gatekeepers, caretakers en landscapers (4). Gatekeeper genen zullen de celproliferatie direct reguleren via het promoten van celdood of het inhiberen van de celgroei en inactivatie van deze genen zal aanleiding geven tot initiatie van tumorvorming (4). Dit in contrast tot caretaker genen waarbij inactivatie niet direct verantwoordelijk is voor tumorontwikkeling, maar zal leiden tot verhoogde accumulatie van genomische mutaties (4). Deze accumulatie van mutaties kan dan op zijn beurt leiden tot inactivatie van de gatekeepers of activatie van de oncogenen (5). De derde groep van TSG, de landscaper genen, coderen voor eiwitten die de micro-omgeving waarin de cellen groeien zullen controleren. Wanneer deze genen mutaties verwerven kunnen deze dus bijdragen tot de groei van cellen door de stromale omgeving te beïnvloeden, waardoor er een milieu ontstaat dat de overleving van kankercellen ter goede komt (6). Kanker is niet het gevolg van één enkele mutatie in een gen. Het effect van de activatie van een proto-oncogen zal niet onmiddellijk leiden tot de ontwikkeling van kanker, doordat het effect kan weerlegd worden door de TSG (door deze cellen te dwingen tot apoptose) en vice versa. Kanker zal dus ontstaan door accumulatie van verschillende mutaties in verschillende genen, waarbij met elke mutatie de kans op nieuwe mutaties zal verhogen.
3
2.2. BORSTKANKER 2.2.1. ALGEMEEN Borstkanker is de meest voorkomende vorm van kanker bij vrouwen. Ongeveer één op tien vrouwen zal borstkanker ontwikkelen gedurende haar leven, maar de incidentie varieert tussen verschillende populaties (7, 8). Jaarlijks krijgen ongeveer 9700 vrouwen de diagnose van borstkanker in België, dit aantal stelt 35.3% voor van alle kankers die worden vastgesteld bij vrouwen. Bij Belgische mannen is de incidentie van borstkanker veel lager (0.3%, 85 gevallen/jaar) (zie tabel 1) (http://www.kankerregister.org). Tabel 1: Borstkanker: incidentie en mortaliteit per geslacht en regio, 2008.
2.2.2. RISICOFACTOREN Borstkanker is een complexe, multifactoriële aandoening, waarbij een sterke interactie verondersteld wordt tussen genetische en omgevingsfactoren. Leeftijd, geslacht, levenswijze en de familiale voorgeschiedenis zijn belangrijke risicofactoren voor het ontwikkelen van borstkanker (7, 8). Hoewel mannen ook borstkanker ontwikkelen is het risico bij vrouwen ongeveer 100 maal hoger. Het verhoogd risico dat men verkrijgt door enkel en alleen vrouw te zijn is te wijten aan het feit dat vrouwen meer borstweefsel hebben in vergelijking met mannen en dat ze gedurende hun leven continu worden blootgesteld aan groeistimulerende hormonen (oestrogeen en progesteron). Zo zijn ook verschillende gynaecologische gebeurtenissen, waarbij een verlengde of verhoogde blootstelling van oestrogeen plaatsvindt, gelinkt met een verhoogd risico op borstkanker: late menopauze, geen of weinig bevallingen of op latere leeftijd en vroege menarche. Daarentegen zou langdurige borstvoeding een beschermende factor zijn. 4
Een ander belangrijk risicofactor is de leeftijd, borstkanker wordt vaak opgesplitst in lateonset en early-onset. Uit verscheidene studies is gebleken dat de incidentie op borstkanker verhoogd met toenemende leeftijd. Dit suggereert dat langdurige accumulatie van genetische afwijkingen noodzakelijk is voor zowel de initiatie als de progressie van (borst)kanker. Daarnaast worden oudere personen gedurende een langere periode blootgesteld aan mogelijke risicoverhogende factoren. Veranderingen in de levenswijze van een persoon kunnen het risico op het ontwikkelen van borstkanker verlagen zoals een dieet met een laag vetgehalte, fysieke activiteit, stoppen met roken en het beperken van de alcoholinname. Het hebben van een familiegeschiedenis met clustering van borstkanker is één van de sterkste risicofactoren. Hierbij stelt men vast dat het individueel risico stijgt met een stijgend aantal verwanten met borstkanker en de dalende leeftijd waarbij het werd vastgesteld (7, 8). 2.3. GENETISCHE VOORBESCHIKTHEID 2.3.1. INLEIDING Ongeveer 5-10% van alle borstkankerpatiënten worden geacht te wijten te zijn aan erfelijke factoren (7-10). Erfelijke borstkanker werd drie decaden geleden voor het eerst beschreven, het komt doorgaans samen voor met een sterk belaste familiegeschiedenis en manifesteert zich vaak bilateraal of op jongere leeftijd (9, 11). Uit deze vaststelling blijkt dat genetische factoren belangrijke determinanten zijn voor het bepalen van het borstkankerrisico (9, 11).
Figuur 2: Indeling in hoog, intermediair en laag penetrante borstkankersusceptibiliteitsgenen. Genotype-fenotype correlatie van heterozygote en homozygote/compound heterozygote mutatiedragers voor borstkankerpredipositiegenen en laagpenetrante borstkankersusceptibiliteit SNPs. Genen zijn alfabetisch geordend in elke groep (10).
5
Genen geassocieerd met een verhoogd risico op borstkanker worden ingedeeld volgens hun penetrantie, we onderscheiden hoog, matig en laag penetrante genen (zie bovenstaande figuur 2) (10). 2.3.2. HOOG PENETRANTE BORSTKANKERGENEN Hoog penetrante genen worden gekarakteriseerd door multipele, individueel zeldzame, lossof-functions mutaties die geassocieerd zijn met een hoog risico op de ontwikkeling van borstkanker (relatief risico (RR) >10) (7, 12). 2.3.2.1. BRCA1 EN BRCA2 A)
BRCA1
In 1990 werd breast cancer susceptibility gene 1 (BRCA1) voor het eerst gelinkt aan de 17q21 chromosomale arm en werd vervolgens in 1994 door middel van positionele clonering geïdentificeerd (13). BRCA1 is een groot gen met 22 coderende exonen (in totaal 24 exonen), waarbij exon 11 ongeveer 50% van de coderende sequentie beslaat (7, 13, 14). Het is een tumorsupressorgen waarbij het ene allel vaak mutaties draagt, waarbij er verlies of reductie van de genfunctie optreedt, en waarbij het overige allel verloren is gegaan in het tumorweefsel (15). De evidentie van een tumorsupressorgen wordt verder ondersteund door volgende observaties: bij inhibitie van BRCA1 expressie zag men groeiacceleratie van zowel de normale als kwaadaardige epitheliale borstcellen. Terwijl na transfectie van het wild-type BRCA1 in borstkankercellijnen inhibitie van groei werd geobserveerd. Hierbij werd vastgesteld dat de waargenomen groei-inhibitie tumorspecifiek is, het kan de groei van andere tumortypes niet inhiberen (15). BRCA1 codeert voor een 1863 aminozuur (AZ) eiwit, waarvan het grootste deel geen similariteit vertoont met andere gekende eiwitten (16-19). Uitzonderingen hierop zijn aan de N-terminus een sterk geconserveerd really interesting new gene (RING) domein (exon 2-5) en in de C-terminus 2 BRCA1 carboxyl terminus (BRCT) repeats (16). RING domeinen zijn zinc-bindende domeinen bestaande uit geconserveerde Cys3-His-Cys4 patronen die eiwit-eiwit en eiwit-DNA interacties mediëren (17). Deze domeinen zijn meestal betrokken bij de ubiquitinilatie pathway, waardoor het BRCA1 RING domein zou kunnen functioneren als een ubiquitine-ligase, om zo eiwitten te merken voor degradatie via proteosomen (18). Het RING vinger domein is ook de regio waar heterodimerisatie plaatsvindt van BRCA1 en BRCA16
associated RING domein 1 (BARD1) en binding met BRCA1-associated protein (BAP1), een de-ubiquitinatie enzyme (18). De BRCT module daarentegen vertoont grote similariteit met de C-terminale regio van een p-53 bindend eiwit (53BP1) en RAD9, die betrokken zijn in DNA herstel (19). ( Zie figuur 3)
Figuur 3: BRCA1 en BRCA2 functionele domeinen (20). B)
BRCA2
Een jaar na de ontdekking van BRCA1 werd een tweede borstkankersusceptibiliteitgen, breast cancer susceptibility gen 2 (BRCA2), geïdentificeerd eveneens dmv positionele klonering (21). Dit gen is gelegen op chromosoom 13q12 (7, 14, 21) en wordt net als BRCA1 beschouwd als een tumorsupressorgen. Dit gen bestaat uit 27 exonen, waarvan 26 coderend zijn (exon 1 niet) en overspant ongeveer een 84 kb regio van het genomische DNA (gDNA) (22). Net zoals bij BRCA1 beslaat het centrale exon 11 meer dan 50% van de coderende sequentie (22). BRCA2 codeert voor een groot eiwit bestaande uit 3418 AZ, waarbij geen sequentie similariteit gevonden werd met andere gekende eiwitten (16, 22). In de regio van het eiwit dat gecodeerd wordt door exon 11 werd een BRC motief bestaande uit 8 kopijen van 30-80 aminozuren geïdentificeerd dat bindt met RAD51 (20, 22). Daarnaast bevat dit eiwit ook nog een DNA-bindend domein dat kan binden met enkelstrenging (ssDNA) en dubbelstrengig DNA (dsDNA) (20). Dit domein is opgebouwd uit 5 componenten: een 190 AZ α-helicaal domein, 3 oligonucleotide bindende-domeinen en een tower domein (20). De C-terminus bevat een nucleair lokalisatie signaal (NLS) en op AZ 3191 een cycline-afhankelijke kinase fosforylatieplaats dat ook kan binden met RAD51 (20). PALB2-binding gebeurt aan de Nterminus via AZ 21-39 (20). (Zie figuur 3)
7
C)
F UNCTIE
BRCA1 en BRCA2 worden geëxpresseerd in een brede waaier van weefsels, waarbij ze een gelijkaardig ruimtelijk en temporeel expressiepatroon vertonen (16). Beide genen coderen voor multifunctionele eiwitten, die een belangrijke rol vervullen in het onderhouden van de genomische
stabiliteit.
Ze
vervullen
deze
functie
door
het
herstel
van
DNA
dubbelstrengbreuken (DSB) te vergemakkelijken en via hun betrokkenheid in homologe recombinatie (7, 14, 18, 20). Dit laatste is een vitaal DNA herstelproces dat gebruik maakt van het niet-beschadigde zusterchromatide om DSB te herstellen (20). Deze vorm van beschadiging van het DNA wordt beschouwd als de meest gevaarlijke vorm van DNA schade, doordat de integriteit van beide strengen van het DNA simultaan aangetast is (20). BRCA1 is betrokken bij verscheidene processen zoals DNA herstel door homologe recombinatie en nucleotide excisie, checkpointcontrole en in de regulatie van de celcyclus (20, 23). In het herstelproces van DSB functioneert BRCA1 als een signaalgeleider, net als CHEK2, en zal helpen bij de rekrutering van RAD51 via interactie met BRCA2 en PALB2 (20). Daarnaast is BRCA1 ook direct betrokken bij het herstel van DSB dmv van wisselwerking met andere eiwitten. De activatie van verschillende (G1/S, S-fase en G2/M) checkpoints wordt gereguleerd door onder andere het BRCA1-BARD1 complex (20). (Zie figuur 4) Net zoals BRCA1 vervult BRCA2 een belangrijke rol in herstel, via homologe recombinatie, door controle uit te oefenen op de RAD51 filament formatie (7, 8, 20). Daarnaast ondersteunt BRCA2 de verplaatsing van het RAD51 recombinase naar de plaats van DSB (23). BRCA2 zal zorgen voor stabilisatie van de RAD51 multimeren, zodanig dat homoloog herstel kan plaatsvinden. Dit proces is niet enkel essentieel voor homologe recombinatie, maar het is ook verantwoordelijk voor de tumorsupressieve functie (20). Een tweede functie van BRCA2 is weggelegd in het beschermen van de replicatievork en voorkomt replicatievork stalling (14).
8
Figuur 4: Model van dubbelstrengbreuk herstel mechanisme en de Fanconi Anemia pathway en de link tussen de twee processen (23). D)
G EASSOCIEERD R ISICO EN MUTATIESPECTRUM
Pathogene mutaties in deze genen komen relatief zelden voor (gecombineerde frequentie van 0.4% in de algemene populatie (7)) en zijn gerelateerd met een 10- tot 20-voudig verhoogd risico op borstkanker (7, 14). Ze verhogen de kans op het ontwikkelen van borstkanker tijdens het leven met 60-85% (BRCA1) en 40-85% (BRCA2) waarbij men een sterk verhoogd RR ziet op jongere leeftijd (<35 jaar) (7). Pathogene mutaties in deze genen zijn ook verantwoordelijk voor een verhoogd risico op ovariumkanker met een levensduur risico van 40-60% voor BRCA1 en tot 30% voor BRCA2 (7). Alhoewel er geen bruikbaar genotype-fenotype correlatie blijkt te bestaan, heeft men vastgesteld dat BRCA1 mutaties in het 5’ deel van het gen en mutaties gelegen in de ovarium cluster regio, gelegen in exon 11 en geflankeerd door nucleotiden 3035-6629, van BRCA2 geassocieerd zijn met een hoger risico op ovariumkanker (7). 9
Mutaties in deze genen worden doorheen de volledig coderende sequentie aangetroffen, hierbij maken mutaties die leiden tot een vervroegd stopcodon (frameshift en nonsense mutaties) het grootste deel uit (7, 14). Missense mutaties zijn verantwoordelijk voor ongeveer 2% van de pathogene mutaties in BRCA1 en deze mutaties komen ook frequent voor in BRCA2 (7). Het probleem bij deze mutaties is dat ze vaak moeilijk te interpreteren en te onderscheiden zijn van neutrale sequentie varianten (7). De frequentie van voorkomen van deze mutaties is verschillend van populatie tot populatie en zowel in BRCA1 als in BRCA2 komen sommige mutaties, founder mutaties genaamd, frequenter voor in bepaalde etnische groepen: bijvoorbeeld c.68_69delAG en c.5266dupC in BRCA1 (1.2% van de populatie) en c.5946delT in BRCA2 in de Ashkenazi Joodse populatie (7, 14, 23). Ondertussen werden reeds honderden verschillende mutaties in de BRCA genen geïdentificeerd. Biallelische mutaties werden tot nu toe nog niet aangetroffen in BRCA1, waarschijnlijk doordat deze lethaal zouden zijn voor het embryo (24). Wel werd reeds aangetoond dat biallelische BRCA2 mutaties een zeldzame subgroep van Fanconi anemia (FA-D1) veroorzaken (24). 2.3.2.2. A NDERE HOOG PENETRANTE GENEN Andere
hoog
penetrante
genen
werden
geïdentificeerd
als
deel
van
erfelijke
kankersyndromen, waarbij ziekte veroorzaakt wordt door mutaties in één enkel allel (dominante aandoening) (25). Mutaties in TP53, PTEN en STK11 worden in tegenstelling tot BRCA1 en BRCA2, in minder dan 1% van de familiale clustering van borstkanker aangetroffen (8). Zo veroorzaken germinale mutaties in het TP53 gen het Li-Fraumeni syndroom, mutaties in het PTEN gen het Cowden syndroom en mutaties in STK11 het PeutzJegher syndroom. Al deze vermelde syndromen zijn geassocieerd met een verhoogd risico op borstkanker (10, 25). (Zie tabel 2) Tabel 2: Borstkanker-geassocieerde kanker predisponerende syndromen (20).
10
Aangezien verscheidene genetische linkage studies faalden om andere hoog penetrante genen te identificeren werd het duidelijk dat de overblijvende clustering van borstkanker niet verklaard zal kunnen worden door overerving van varianten in additionele hoog penetrante borstkankergenen met dezelfde prevalentie als BRCA1/2 (7, 8). Alhoewel gemeenschappelijke omgeving en levensstijl factoren een deel van de familiale clustering van borstkanker zouden kunnen verklaren, blijkt uit tweelingenstudies dat een significant deel van het overblijvende familiaal borstkankerrisico te wijten is aan genetische factoren. Zo stelde men vast bij eeneiige tweelingen, waarvan 1 van deze gediagnosticeerd was met borstkanker, dat het risico voor de niet-aangetaste tweeling hoger is dan in het geval van twee-eiige tweelingen (7). Er wordt verondersteld dat de overblijvende clustering van borstkanker het best verklaard kan worden door uit te gaan van een polygenisch model, waarbij verscheidene matig en laag penetrante allelen samen kunnen leiden tot een verhoogd borstkankerrisico, alhoewel dit het bestaan van andere zeldzame maar hoog penetrante allelen niet volledig uitsluit (7). 2.3.3. MATIG PENETRANTE BORSTKANKERGENEN Matig of intermediair penetrante borstkankersusceptibiliteitsgenen, ATM, CHEK2, BRIP1 en PALB2 zijn gekenmerkt door zeldzame, loss-of-functions mutaties die zorgen voor een bescheiden toename in het borstkankerrisico (RR 2-4) (7, 12). Deze matig penetrante borstkankergenen werden ontdekt door hun gemeenschappelijk voorkomen in de DNA herstelpathway, waarin BRCA1 en BRCA2 ook een rol spelen (7, 8). 2.3.3.1. ATM In 1976 werd er voor het eerst een link gelegd tussen borstkanker en het AtaxiaTelangiectasia mutated (ATM) gen, bijna 2 decaden later werd dit bevestigd (8, 23). Ataxiatelangiectasia (AT) is een zeldzame autosomale recessieve ziekte met predispositie voor kanker, waarbij het ATM gen mutaties draagt (23). Deze ziekte is gekarakteriseerd door progressieve
neuronale
degradatie,
immunologische
deficiënties,
gevoeligheid
aan
ioniserende straling en een verhoogd risico op ontwikkeling van kanker (26). Het merendeel van de AT patiënten zijn compound heterozygoot of homozygoot (beide allelen zijn aangetast) voor mutaties in het ATM gen (8, 27). De link tussen ATM en borstkanker werd gelegd toen men vaststelde dat er meer borstkankerpatiënten voorkwamen dan verwacht bij familieleden van AT patiënten en dit voornamelijk bij de obligaat heterozygoten (één van de allelen draagt een mutatie) (26).
11
Het ATM gen werd gelokaliseerd op chromosoom 11q via genetische linkage analyse in 1988 en geïdentificeerd door positionele clonering in 1995 (27). Dit gen bestaat uit 66 exonen, waarvan 64 coderen voor een 3056 AZ eiwit (27). ATM behoort tot de phosphatidylinositol 3-kinase-gerelateerde kinases (PIKK), deze worden gekarakteriseerd door een domein dat gelijkaardig is aan deze in phosphatidylinositide 3-kinases (PI3K) en zijn actieve serine/threonine kinasen (26, 27). ATM bevat aan zijn C-terminus een FAT domein (FRAP, ATM, TRAPP) met een sterk geconserveerde staart, ook wel gekend als het FATC domein (26, 27). Het ATM FATC domein functioneert als een bindingssite voor het acetyltransferase TIP60, waarbij het lysine op positie 3016 van ATM geacetyleerd wordt. Deze acetylering is belangrijk voor de activatie van dit eiwit (27, 28). Verder bevat
ATM
verscheidene elongatiefactor
aan HEAT 3
zijn
N-terminus (Hungtingtin,
(EF3),
protein
phosphatase 2A (PP2A) en TOR1) domeinen, die interacties met andere
Figuur 5: Schematische weergave van ATM (28).
eiwitten kan beïnvloeden, en een regio essentieel voor substraatbinding (SBS) (26-28). ATM codeert voor een serine/threonine kinase en heeft een centrale rol in het herstel van DSB (20, 27). Het zorgt voor herkenning van beschadigd DNA, rekrutering van DNA herstelgenen, het doorgeven van signalen naar de checkpoints van de celcyclus, transcriptionele regulatie en activatie van gecontroleerde celdood (20, 27). In normale omstandigheden is ATM aanwezig als inerte di- of multimeren, maar bij detectie van DSB zal het dissociëren in actieve monomeren, waarbij het autofosforylatie zal ondergaan van het Serine op positie 1918 (27). Op de plaats van DNA schade zal het zorgen voor de initiatie van een fosforylatiecascade, waarbij verschillende eiwitten downstream geactiveerd worden, zoals BRCA1, CHEK2 en p53 en deze zullen op hun beurt zorgen voor een stop in de celcyclus, DNA herstel of gecontroleerde celdood (26). ATM en CHEK2, dat voor zijn activatie afhankelijk is van ATM, zullen na ioniserende straling zorgen voor stabilisatie van p53 door het plaatsen van een fosfaatgroep op het serine op positie 15 (20, 26). Zoals eerder vermeld wordt BRCA1 ook gereguleerd door ATM via fosforylatie op verschillende plaatsen van het eiwit (Ser-1387, Ser-1423, Ser-1457, Ser-1524) (26). (Zie figuur 5) 12
Verschillende mutaties zijn reeds geïdentificeerd in ATM die geassocieerd zijn met een RR van ongeveer 2 (8). Niet enkel truncerende varianten, maar ook missense varianten, voornamelijk gelegen in het 3’deel van de coderende regio’s (kinase, FATC-domein) zijn gerelateerd met een verhoogd risico op borstkanker (8, 29). Er werd gesuggereerd dat sommige missense varianten in het ATM gen zouden kunnen aanleiding geven tot dominant negatieven, waardoor ze een hoger risico op borstkanker in heterozygote vorm kunnen veroorzaken, terwijl ze een mildere vorm van AT vertonen in homozygote vorm (30). Hieropvolgend werd een missense mutatie in ATM (c.7271T>G, p.Val2424Gly) geïdentificeerd door Chenevix et al. dat geassocieerd is met een 9 tot 13-voudig verhoogd risico op borstkanker en zich als een dominant negatieve zou gedragen (26, 30). 2.3.3.2. CHEK2 Het checkpoint kinase 2 (CHEK2) gen werd in 2002 als eerste matig penetrante borstkankergen herkend (8, 23). Identificatie van dit gen gebeurde via linkage analyse, in een groot BRCA1/2 mutatie negatieve familie, dat verwees naar de chromosomale regio 22q. Deze regio werd later geïdentificeerd als CHEK2 (8). Initieel werd CHEK2 gezien als een LiFraumeni syndroom (LFS) gen, maar na identificatie van de 1100delC mutatie bleek dat de populatiefrequentie van deze mutatie te hoog was om een gen te zijn van dit sterk penetrant en zeer zeldzaam syndroom (8). Het CHEK2 gen overspant ongeveer 50 kb van het genomisch DNA en is opgebouwd uit 14 exonen. Het CHK2 eiwit vertoont drie karakteristieke domeinen: het N-terminale SQ/TQ cluster domein, het fork head-associated (FHA) domein en een katalytisch kinase domein. (31). Het N-terminale SQ/TQ cluster domein (AZ 20-75) is een regulatorisch domein bestaande uit 7 serine of threonine residu’s gevolgd door glutamine. Het wordt ook beschouwd als een mogelijke fosforylatie plaats dat de voorkeur geniet van het ATM eiwit (31, 32). Het tweede domein, FHA domein (AZ 112-175), is betrokken bij de binding van gefosforyleerde eiwitten, gedeeltelijk via herkenning van fosfothreonine residu’s. Deze regio zorgt voor dynamische eiwit-fosfoeiwit interacties met CHK2 gedurende activatie en signalering bij DNA schade (31, 32). Het derde domein is het katalytisch kinase domein (AZ 225-490), die bijna de volledige C-terminus overspant en deze vertoont structurele homologie met andere serine/threonine kinases (31, 32). (zie figuur 6)
13
Figuur 6: Schematische weergave van CHK2. Het CHK2 eiwit bevat 543 aminozuren en heeft drie verschillende functionele domeinen; SQ/TQ cluster domein (SCD); fork-head-associated (FHA) domein en kinase domein met een T-loop. (32)
ATM zal in respons op ioniserende straling en andere genotoxische stresstoestanden, die DSB voortbrengen, CHK2 activeren op de plaats van DNA schade. De activatie van CHK2 gebeurt door fosforylatie van verschillende SQ/TQ domeinen, voornamelijk het threonine 68. Hierdoor vindt homodimerisatie plaats via het FHA domein, wat op zijn beurt zal leiden tot trans-autofosforylatie van CHK2 op threonine 383 en 387 en op serine 516. Deze threonines zijn gelegen in de autoinhibitorische loop van het eiwit en het serine 516 in het kinase domein wat zal leiden tot volledige activatie van het eiwit (33). Het geactiveerde CHK2 eiwit zal zich verplaatsen doorheen het nucleoplasma om zo het signaal van het beschadigde DNA te verspreiden en zijn downstream substraten te activeren (20, 33). De reeds gekende substraten zijn: eiwitten betrokken in de celcyclus controle (CDC25 familie eiwitten, PLK3 kinase en E2F1 TF) en bij DNA herstel (via onderandere fosforylatie van serine 988 van BRCA1) en bij de regulatie van celdood (p53 en PML1) (7, 14, 23, 31, 33). Het CHEK2 gen is een tumorsupressor gen waarbij germinale mutaties geassocieerd zijn met borstkanker in verschillende populaties (33). Het RR voor de germinale mutatie, CHEK2 1100delC, bij homozygote en heterozygote dragers wordt geschat op respectievelijk 101.34 en 4.04 in patiënten die geen BRCA mutatie dragen (34). Deze mutatie is gelegen in exon 10 in het kinase domein en is aanwezig in 0.2-1% van de Europese bevolking en in ongeveer 4.2% van de borstkankerfamilies, alhoewel de mutatiefrequentie varieert tussen verschillende populaties (7, 33). Door de ontdekking van deze mutatie in CHEK2, werd dit gen beschouwd als een borstkanker susceptibiliteitsgen, wat geleid heeft tot verscheidene mutatiescreeningen van het volledige gen (7). Uit deze analyses werden nog 3 additionele varianten in dit gen geïdentificeerd, 2 truncerende mutaties: IVS2+1G>A, del5395 en de missense variatie: I157T geassocieerd met borstkanker in Oost-Europa (35). Hoewel er weinig geweten is over de impact van missense mutaties op de functie van het eiwit, bleek uit de eerste bevindingen dat substituties in het FHA domein en het kinase domein meestal zullen leiden tot verlies van de functie/activiteit van het CHK2 eiwit en dus meestal van pathogene aard zouden zijn (35). Net zoals bij de 14
1100delC blijkt dat deze varianten ook leiden tot een matig verhoogd risico op borstkanker, waarbij de mutatiefrequentie varieert naargelang de populatie (8). Uit verscheidene studies is gebleken dat men een lagere mutatiefrequentie terugvindt van CHEK2 in familieleden van BRCA1/2 mutatie positieve stambomen in vergelijking met familieleden afkomstig van BRCA1/2 mutatie negatieve stambomen (12). De verklaring hiervoor zou functionele redundantie kunnen zijn, waarbij de aanwezigheid van een mutatie in 1 gen (in dit geval BRCA1 of BRCA2) geen of weinig additioneel risico ondervindt door de aanwezigheid van een mutatie in een tweede gen (CHEK2) (12). In tegenstelling tot BRCA1 en BRCA2 mutaties bleek dat mutaties in CHEK2 niet leiden tot een verhoogd risico voor de ontwikkeling van ovariumkanker (31). 2.3.3.3. BRIP1 Het BRCA1 interacting protein C-terminal helicase 1 (BRIP1) wordt ook wel BACH1 of FANCJ (voor Fanconi anemia complementation Group J) genoemd (8, 23, 36, 37). Fanconi anemia (FA) is een zeldzame (prevalentie van ongeveer 1 op 350000 geboortes) genetische aandoening, gekarakteriseerd door multipele congenitale afwijkingen, extreme gevoeligheid aan agentia die DNA interstrand crosslinks induceren, predispositie voor kanker en beenmergfalen (8, 23, 36). Het is een genetisch heterogene aandoening onderverdeeld in 13 subtypes (FANCA-FANCN) (8, 23, 36, 37). Biallelische inactivatie van BRIP1 werd aangetoond en beschreven in patiënten met Fanconi Anemia behorende tot de subtype J, vandaar dat BRIP1 ook wel FANCJ wordt genoemd (36, 38). In 2002 werden BRCA2 mutaties geassocieerd met FA subtype D1 wanneer deze overgeërfd werden in homozygote of compound heterozygote toestand (8). Deze link tussen FA en borstkanker heeft geleid tot mutatie analyse van gekende FA genen als mogelijke borstkanker susceptibiliteitsgenen (8). BRIP1 is gelegen op chromosoom 17q23, naast de BRCA1 locus, en bestaat uit 20 exonen die meer dan 180 kb van het genomisch DNA overspannen (36, 38). Het codeert voor een 1249 AZ eiwit, dat zal binden met de BRCT domeinen in BRCA1, hiervoor ligt in de C-terminus een fosfo-SXXF motief (AZ 990-993) (36, 38). Deze binding is afhankelijk van de celcyclus gereguleerde fosforylatie van BRIP1 op het serine op positie 990 (36, 38). Naast het BRCA1bindend domein (AZ 979-1006) vertoont BRIP1 aan zijn N-terminale zijde sequentie homologie met de katalytische en nucleotide-bindende domeinen van gekende leden van de DEAH helicase familie, wat het helicase domein (AZ 1-888) genoemd wordt (36, 38). Later werd vervolgens aangetoond dat BRIP1 een ATP-afhankelijke 5’-3’ DNA helicase is. In deze 15
N-terminale regio ligt ook een voorspeld NLS, alsook een ijzer-zwavel (Fe-S) cluster domein die essentieel zijn voor de enzymactiviteit (36). (Zie figuur 7)
Figuur 7: Structurele weergave van het humane FANCJ/BRIP1 (39).
BRIP1 zal, via binding met BRCA1, co-lokaliseren naar de plaats van DNA schade, waar het zal bijdragen tot DNA herstel (38). De BRIP1-BRCA1 interactie is nodig voor tijdelijk herstel van DNA DSB en voor DNA schade-geïnduceerde checkpoint controle gedurende de G2-M fase van de celcyclus (38). BRIP1 werd verondersteld, net als de andere genen, een tumorsupressor gen te zijn, waarbij verlies van het wildtype allel en retentie van het mutante allel teruggevonden wordt in tumorcellen. Later werd dit ook bevestigd (36). In verschillende studies werd een beperkt aantal pathogene mutaties in BRIP1 aangetroffen, deze bestonden uit heterozygote truncerende en missense mutaties, die frequenter voorkwamen in borstkankerpatiënten dan in gezonde controles (8). Het merendeel van deze mutaties zijn gelegen dichtbij/in het helicase domein en sommige van deze mutaties waren reeds geïdentificeerd in homozygote of compound heterozygote toestand in FA-J patiënten (8, 36). Men schat dat deze mutaties aanleiding zouden geven tot een tweevoudig verhoogd risico op de ontwikkeling van borstkanker, met een hoger risico voor vrouwen jonger dan 50 jaar (8). 2.3.3.4. PALB2 Partner and localizer of BRCA2 (PALB2) werd voor het eerst klinisch gekarakteriseerd in patiënten met FA subtype N en wordt hierdoor ook wel FANCN genoemd (40, 41). FA-N is geassocieerd met biallelische mutaties in PALB2, maar na de ontdekking van de link tussen FA en borstkanker, werd ook PALB2 onderzocht als een mogelijk borstkankersusceptibiliteitsgen (40). PALB2 is gelegen op chromosoom 16p12.1 waar het een regio van 38.2 kb beslaat (25, 42). Het gen bestaat uit 13 exonen, waarvan exon 4 en exon 5 veel groter zijn dan de andere exonen, en codeert voor een 1186 AZ eiwit (25, 42). Dit eiwit bevat aan zijn C-terminus een zeven-bladig β-propeller WD40-domeinen (AZ 836-1186), deze regio’s zijn vaak betrokken 16
in eiwit-eiwit interacties en uit onderzoek is gebleken dat het kan binden met het N-terminale deel van het BRCA2 eiwit (AZ 21-39) (42, 43). Deze binding is belangrijk voor de lokalisatie van BRCA2 in de nucleaire chromatine structuren. Aan de andere zijde, de N-terminus, bevindt zich een coiled-coil domein (AZ 9-44) dat zal interageren met een regio dat enkele residues voor de BRCT-domeinen gelegen is van het BRCA1 eiwit (AZ 1393-1424) (42, 43). Daarnaast kan PALB2 ook binden met RAD51 via AZ 1-200 en 836-1186 (Zie figuur 8) (42, 43).
Figuur 8: PALB2 exonische structuur en interacties met andere eiwitten
(36).
Via BRCA1 zal er accumulatie gebeuren van PALB2 en BRCA2 in regio’s van de cel waar DNA schade werd gesignaleerd, waarbij deze drie eiwitten samen zullen lokaliseren naar deze omgeving. Hierbij verzorgt PALB2 de fysieke en functionele link tussen BRCA1 en BRCA2 die nodig is in het antwoord op DNA schade. Hierbij is RAD51 eveneens betrokken (44, 45). Heterozygote mutaties in PALB2 werden voor het eerst gedetecteerd in families met hereditaire borstkanker in 2007 (46) en zijn geassocieerd met een 2 tot 6-voudige verhoging van het risico op het ontwikkelen van borstkanker afhankelijk van de variant (8, 40). Pathogene PALB2 mutaties worden teruggevonden over de gehele coderende sequenties en het overgrote deel hiervan zijn truncerende frameshift en stop codon mutaties (8, 42). In Finse en Frans Canadese families werden founder mutaties geïdentificeerd, waarbij de steeds terugkerende Finse c.1592delT mutatie geassocieerd is met een cumulatief risico van 40% bij een leeftijd van 70 jaar (42). Dit risico is vergelijkbaar met het risico gerelateerd aan BRCA2 mutaties (45%) (42, 47). Ook werd een nog andere mutatie geïdentificeerd (c.3113G>A), die nog een groter cumulatief risico opleverde (42). PALB2 mutaties worden ook teruggevonden
17
in ongeveer 1% van de populatie van mannelijke borstkankerpatiënten en werd in 2009 geïdentificeerd in families met pancreas kanker (42). 2.3.4. LAAG PENETRANTE VARIANTEN De nog onverklaarde fractie van familiale clustering van borstkanker zou, voor een deel, kunnen verklaard worden door de interacties van een combinatie van individuele varianten, die geassocieerd zijn met een licht verhoogd risico op borstkanker (RR 1.08-1.26) (12, 25). Deze laag penetrante varianten werden geïdentificeerd dmv genoomwijde associatie studies in heel grote studiepopulaties (12). Het doel van deze studies was om polymorfismes te identificeren die elk maar een klein individueel verhoogd risico gaven op borstkanker. Aangezien dat deze polymorfismes heel frequent voorkomen in de populatie, kunnen ze een significante impact hebben op het borstkankerrisico (10). De lijst van deze laag penetrante varianten blijft aangroeien. 2.4. DOEL- EN VRAAGSTELLING 2.4.1. MODEL VAN BORSTKANKERSUSCEPTIBILITEIT BRCA1 en BRCA2 mutaties, alhoewel ze zeldzaam zijn,verklaren ongeveer 15-20% van de familiale clustering van borstkanker (8). Als verklaring voor de overblijvende familiale clustering van borstkanker zijn er 2 (mutueel niet-exclusieve) hypotheses. Enerzijds gaat men ervan uit dat de ontbrekende familiale clustering te wijten zou kunnen zijn aan het cumulatief effect van frequente allelen geassocieerd met laag tot matig verhoogd risico op borstkanker (polygenisch model). Anderzijds zouden verschillende zeer zeldzame mutaties in hoogpenetrante genen een verklaring voor de familiale vormen van borstkanker kunnen zijn. Evidentie voor beide hypothesen is reeds gevonden : zie figuur 9 en bovenstaande tekst.
Figuur 9: Genetische architectuur van borstkanker ((48, 49); aangepast door Kim De Leeneer). 18
Het ontrafelen van de pathway van het DNA herstel mechanisme heeft bijgedragen tot het identificeren van ‘nieuwe’ borstkankersusceptibiliteitsgenen, alsook tot het ontwikkelen van nieuwe benaderingen voor targeted therapie (38). Hierdoor heeft men een aantal genen kunnen identificeren waarbij mutaties geassocieerd zijn met een matig tot sterk verhoogd risico op de ontwikkeling van borstkanker (ATM, BRIP1, PALB2, CHEK2,…). Hoewel er de laatste decaden veel vooruitgang is geboekt omtrent het definiëren van de genetische susceptibiliteit van borstkanker, blijft er nog veel te onderzoeken. 2.4.2. PROBLEEMSTELLING EN DOELSTELLING 2.4.2.1. C DNA ANALYSE Sinds de start van het mutatie onderzoek in 1997 in het Centrum voor Medische Genetica Gent (CMGG) werden ongeveer 2000 borstkankerpatiënten uit 1700 niet-verwante families onderzocht. Deze families voldoen aan volgende inclusiecriteria: families met 3 eerstegraadsverwanten
met
borstkanker
en/of
ovariumkanker
of
minimum
2
eerstegraadsverwanten met borstkanker en/of ovariumkanker vóór een gemiddelde leeftijd van 50 jaar. De inclusiecriteria die gehanteerd worden voor de selectie van sporadische patiënten: diagnose van borst- of ovariumkanker voor de leeftijd van 38 jaar of diagnose van bilaterale of multipele ipsilaterale borstkanker, waarbij alle tumoren werden vastgesteld vóór een gemiddelde leeftijd van 50 jaar of diagnose van gelijktijdige borst en ovariumkanker, waarbij beide kankers vastgesteld werden vóór een gemiddelde leeftijd van 50 jaar. In minder dan 15% van de families die voldoen aan bovenstaande criteria werd een mutatie gevonden in BRCA1&2. Daarnaast werd volledig mutatie onderzoek uitgevoerd van ATM en PALB2 in 250 niet-verwante families. Er werd in ongeveer 4% van de onderzochte patiënten een mutatie aangetroffen in het ATM gen en in ongeveer 1% in PALB2. In een standaard mutatie onderzoek wordt enkel de volledige coderen regio en splice sites onderzocht op gDNA niveau. Hierdoor kunnen diep-intronische mutaties en mutaties in regulatorische sequenties die leiden tot aberrante splicing niet gedetecteerd worden. Het doel van deze studie is om in de families waarin tot nu toe geen moleculaire verklaring werd gevonden voor de familiale clustering van borstkanker, na te gaan met behulp van cDNA analyse of germinale mutaties aanwezig zijn in BRCA1/2, PALB2, CHEK2, ATM of BRIP1. Het voordeel van een studie op cDNA niveau is dat het aantal te onderzoeken amplicons kleiner is. Bovendien laat dit toe om in deze genen naast de truncerende en missense mutaties, ook mutaties die buiten de coderende regio gelegen (diep-intronische) te 19
detecteren. Andere voordelen van werken op cDNA niveau is het kunnen aantonen van bijvoorbeeld inserties van Alu repeats die leiden tot aberrante splicing. Dit mechanisme is reeds beschreven in het BRCA2 gen en in NF1 (50-52). Hiervoor zullen stalen van patiënten geselecteerd worden, waarin een erfelijke predispositie vermoed wordt, op basis van een familiale voorgeschiedenis van borstkanker en/of jonge leeftijd bij diagnose (=premenopausaal) en waarin mutaties in BRCA1/2 werden uitgesloten met behulp van gDNA screening. Detectie van pathogene mutaties in deze genen laat toe om predictief onderzoek aan te bieden aan familieleden, waardoor aan personen met een germinale mutatie een intensievere followup kan aangeboden worden vanaf jongere leeftijd. Dit laat toe om tumoren te detecteren in een vroeg stadium- met als gevolg grotere overlevingskansen. Dit onderzoekt kadert in de onderzoekslijn naar erfelijke borstkanker die loopt in het CMGG. Een ander deel van dit project zal bestaan uit de evaluatie van het effect op cDNA niveau van 4 potentiële splice varianten in BRCA2. Een effect zoals exon skipping of alternatieve splicing zal na deze studie kunnen bevestigd of uitgesloten worden. Dit draagt bij tot de interpretatie van de klinische betekenis van deze varianten zodat adequate counseling van families waarin deze varianten segregeren mogelijk wordt. De te bestuderen varianten zijn: BRCA2 c.517G>C (1ste base exon 7) (RNA 1300081); BRCA2 c.681+111C>G (RNA 1300073); BRCA2 c.76186G>T (RNA 1200405) en BRCA2 c.3326C>T (RNA 1300007). 2.4.2.2. E NIGMA PROJECT De Evidence-based Network for the Interpretation of Germline Mutant Alleles (ENIGMA) is een international consortium opgericht in 2009 met de bedoeling om zowel data, methoden als bronnen uit te wisselen om de klinische significantie van ongeclassificeerde varianten (UV) te achterhalen. In deze masterproef is er meegewerkt aan een project van de splicing groep, namelijk project 1 dat bestaat uit kwaliteitscontrole. Hiervoor werden er vanuit Australië 20 EBV cellijnen opgestuurd: 11 controles en 9 cellijnen die een bepaalde variant dragen. In de eerste fase van dit project wordt er nagegaan met zelf ontworpen primers welke transcripten opgepikt worden bij patiënten met de BRCA1 c.671-2A>G. Het doel is een vergelijking van de bekomen resultaten door de verschillende deelnemende groepen.
20
3. MATERIALEN EN METHODEN 3.1. GEBRUIKTE METHODEN
Figuur 10: Flowchart van dit onderzoek. In eerste instantie dient de selectie te gebeuren van de patiënten die in dit onderzoek voldeden aan de inclusiecriteria. Hiervan zullen EBV cellijnen worden opgekweekt waaruit vervolgens RNA zal geëxtraheerd worden en in een volgende stap zal hieruit cDNA gesynthetiseerd worden. Gelijktijdig met dit proces zullen primers ontwikkeld worden voor PCR en sequenering en deze zullen ook geoptimaliseerd worden. Op dit cDNA zal sequenering gebeuren voor de 6 geselecteerde genen die vervolgens geanalyseerd zullen worden.
3.2. SELECTIE PATIËNTEN De patiëntenstalen, die opgenomen werden in dit onderzoek zijn afkomstig van vrouwen die in het Universitair Ziekenhuis van Gent (UZG), CMGG geconsulteerd zijn op basis van een vermoeden van een erfelijke vorm van borstkanker. Deze personen werden nog aan extra inclusiecriteria onderworpen: patiënten uit families met 3 eerste of tweedegraadsverwanten met borstkanker of 2 eerste of tweedegraadsverwanten met borstkanker voor een gemiddelde leeftijd van 50 jaar. Bij deze vrouwen werd eerder de coderende regio van BRCA1/2 onderzocht op gDNA niveau, maar er werd geen mutatie gevonden. In totaal zijn 25 vrouwen uit 24 niet-verwante families geselecteerd voor dit onderzoek. Een overzicht van de geselecteerde patiënten (RNA nummer, gDNA nummer en familienummer) is terug te vinden in bijlage 1.
Figuur 11: Schematische weergave inclusie patiënten in onderzoek. 21
3.3. RNA EXTRACTIE Om complementair DNA (cDNA) te synthetiseren dient men in eerste instantie ribonucleïnezuur (RNA) te extraheren. Totaal RNA zal geïsoleerd worden uit Epstein-Barr virus (EBV) cellijnen, die beschikbaar zijn van de bovenvermelde patiënten met behulp van de RNeasy kit (Qiagen). EBV cellijnen zijn culturen van lymfocyten, die geïnfecteerd worden met het Epstein-Barr virus, zodanig dat men een geïmmortaliseerde cellijn verkrijgt en dus een onuitputbare bron van RNA vormen. Vooraleer er gestart wordt met de RNA extractie zal elke cellijn worden opgesplitst in 2 delen; op één van de aliquots gebeurt een behandeling met puromycine. Puromycine is een translatie inhibitor en door het toevoegen van deze stof aan de celcultuur zal de mogelijke degradatie door de nonsense mediated mRNA decay (NMD) gedeeltelijk verhinderd worden (53, 54). NMD is een kwaliteitscontrole mechanisme van de cel, dat zorgt voor de specifieke eliminatie van mRNA’s die premature stopcodons bevattten en beschermt ons tegen de synthese van abnormale eiwitten (55, 56). Door het toevoegen van deze stof wordt het mogelijk om transcripten waarin mutaties voorkomen te detecteren. Na de incubatie kan overgegaan worden tot extractie van totaal RNA. De cellijn wordt overgepipetteerd in een 15ml falcon en afgedraaid (5 minuten, 300 relatieve centrifugale kracht (rcf)). Het supernatans wordt afgegoten en de overblijvende pellet van lymfocyten wordt losgemaakt. De cellen worden gelyseerd en gehomogeniseerd door toevoeging van een RLT-mix (RLT-buffer + β-mercapto). De RLT-buffer bevat guanidine isothiocyanaat (GITC), wat zorgt voor denaturatie, zodanig dat de RNases snel geïnactiveerd worden en men intact RNA kan isoleren. Tijdens de denaturatie zal de celwand en de plasmamembranen van cellen en organellen worden afgebroken zodanig dat het RNA vrijgesteld wordt. In een volgende stap wordt (70%) ethanol toegevoegd om optimale bindingscondities te verzekeren en dit mengels wordt vervolgens op de RNeasy mini kolom aangebracht. Deze kolom bevat een speciaal ontwikkeld silica-gel membraan waaraan het (totaal) RNA kan binden en ervoor zorgt dat alle overige contaminanten kunnen worden weggewassen. De wasstappen worden uitgevoerd met de RPE en RW1 buffers. Elutie van het RNA gebeurt door toevoeging van RNase vrij water (zie flowchart). In een volgende fase zal de concentratie van het geëxtraheerde RNA bepaald worden, alsook de zuiverheid met behulp van de DropSense96 (Trinean).
22
Figuur 12: Flowchart van RNA extractie met de RNeasy kit (Qiagen) (http://www.qiagen.com).
Het protocol met de gebruikte hoeveelheden kan teruggevonden worden in bijlage 2. 3.4. CDNA SYNTHESE Voor de synthese van cDNA zullen we gebruik maken van de Superscript II cDNA synthesis kit van BioRad. Hierbij zal first-strand cDNA gesynthetiseerd worden met behulp van random primers, vertrekkende van het totaal RNA geëxtraheerd in de vorige stap. Het gebruik van deze random hexameren als primers is de minst specifieke methode en hierbij zullen alle RNAs in de populatie gebruikt worden als template bij de cDNA synthese. Er is gekozen voor superscript, aangezien er gewerkt wordt met longe-range PCR fragmenten, en deze kit in staat is om reverse transcriptase (RT)-producten te genereren tot 12 kb lang. Als eerste stap zal het totaal RNA (2µg, aanvullen met sigma water tot 10 µl) samengevoegd worden met de random primers en deoxyribonucleotide trifosfaten (dNTP’s). Deze dNTP’s zullen gebruikt worden bij de opbouw van de nieuwe gesynthetiseerde cDNA streng. Deze mix wordt vervolgens 5 minuten verhit op 65°C om denaturatie van het dubbelstrengig RNA te verkrijgen, waarna het vervolgens gekoeld wordt op ijs. In een volgende stap wordt een tweede mix samengesteld die zal toegevoegd worden aan de initiële mix. Deze bestaat uit: 5x 23
RT buffer (250 mM Tris pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2), 1M Dithiothreitol (DTT) en een ribonuclease inhibitor (RNAsin (Promega)). DTT is een reducerend agents dat helpt om verbindingen, zoals zwavelverbinding, te verbreken, waardoor het RT enzym zijn functie makkelijker kan uitoefenen. Het RNAsin zal tegelijkertijd eiwitten die het RNA afbreken (RNases) inhiberen, zodanig dat de kwaliteit van het RNA niet zal worden aangetast. Om optimale aanhechting van de random hexameren aan het template RNA te verkrijgen zal dit mengels gedurende 2 minuten op 25°C gebracht worden en na toevoeging van het RT enzym nog eens gedurende 10 minuten. SuperScript® II RT is een DNA polymerase dat de complementaire DNA streng zal synthetiseren vertrekkende van enkelstrengig RNA, die verkregen is uit de RNA extractie. Aangezien dit enzym een optimale activiteit heeft bij 42°C, zal het gedurende 50 minuten geïncubeerd worden op deze temperatuur, zodanig dat extensie kan plaatsvinden en dus de complementaire cDNA strengen gesynthetiseerd kunnen worden. In deze masterproef werden ook twee andere cDNA synthese kits vergeleken met de hierboven besproken kit: GoScript (Promega) en M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-) (BioLabs). Deze twee andere kits hebben een gelijkaardig werkingsmechanisme en een gelijkaardig protocol, maar het gebruikte RT enzym is verschillend. De gedetailleerde protocols van de 3 cDNA synthesis kits zijn terug te vinden in bijlage 3. 3.5. RT-PCR De polymerase-kettingsreactie (PCR) is de gouden standaard om vanuit minimale hoeveelheden (c)DNA specifieke gedeeltes (amplicons) te amplificeren, zodanig dat er genoeg is om hierop analyses uit te voeren. Dit principe bestaat uit verschillende cycli van 3 opeenvolgende stappen: denaturatie, aanhechting en extensie, waarbij elke stap zijn eigen specifieke temperatuur heeft. Tijdens de eerste stap gebeurt de denaturatie waarbij het dubbelstrengig cDNA uit elkaar zal gaan tot enkelstrengig cDNA onder invloed van een hoge temperatuur (92°C -97°C). Vervolgens zal er in de tweede fase aanhechting gebeuren van de primers (forward en reverse) op ssDNA (55°C-65°C). Wanneer de primers gebonden zijn op hun complementair gedeelte van het cDNA kan gestart worden met de 3de fase, de extensie. De synthese van de nieuwe complementaire streng zal gebeuren door toevoeging van dNTP’s, magnesiumchloride (MgCL2) en een hittestabiel DNA polymerase. Deze laatste is een enzym met een 5’->3’ polymerase activiteit, die vanuit de uiteinden van de primers complementaire dNTP’s zal
24
inbouwen, terwijl de doelwitsequentie gelezen wordt van 3’->5’. Hierdoor ontstaat een streng die complementair is aan de sequentie gelegen tussen de twee primers. Deze nieuw gesynthetiseerde strengen kunnen dan in een volgende cyclus dienen als template, waardoor er exponentiële amplificatie gebeurd van de initiële hoeveelheid DNA. In de meeste PCRreactie zal men gebruik maken van 35 opeenvolgende cycli. In dit onderzoek zal men als DNA polymerase gebruik maken van het Takara Ex Taq DNA polymerase. Dit enzym heeft een hoge sensitiviteit vanwege de proofreading capaciteit dat het bevat en is beter geschikt voor amplificaties van langere amplicons. 3.5.1. PRIMERDESIGN Primers zijn korte sequenties van opeenvolgende nucleotiden (enkelstrengig), die complementair zijn aan een specifieke doelwitsequentie. Deze zijn zodanig ontwikkeld dat ze met behulp van PCR de volledige coderende regio van de verschillende genen amplificeren. Het doel is om overlappende PCR fragmenten te generen van ongeveer 2 kb in lengte. Ook dienen er sequeneringsprimers ontwikkeld te worden die ongeveer om de 400-500 bp gelegen zijn in het PCR fragment en die eveneens elkaar overlappen. Voor de PCR fragmenten dient een forward en reverse primer ontwikkeld te worden. Voor de sequenering zullen we in dit onderzoek enkel gebruik maken van forward primers. Voor de ontwikkeling van de primers gaat men uit van de referentiesequentie die men kan afhalen van Ensembl of UCSC, men kiest hier best voor de cDNA sequentie. Vervolgens zullen met behulp van de Primer3Plus en Oligocalc software de primers ontwikkeld worden. Voorwaarden waaraan de primers dienen te voldoen :
Amplicongrootte: PCR primers rond de 2000 basenparen (bp), sequeneringsprimers rond de 400-500 bp.
Het ideale GC-gehalte is 50%.
De optimale grootte van de primers ligt tussen de 18 tot 22 bp.
De smelttemperatuur (Tm), dit is het punt waarbij de twee DNA strengen uit elkaar gaan (denaturatie), bedraagt in optimale omstandigheden 60°C. Hierbij mogen de Tm van de forward en reverse primers niet te ver uit elkaar liggen.
In de primers zijn er best geen single nucleotide polymorfismes (SNP) of repeats gelegen.
25
In een volgende stap van het primerdesign zal de specificiteit van de naar voorgedragen primers worden nagegaan. Via Bisearch, primer-BLAST tool van NCBI en de UCSC in-silico PCR programma kan men nagaan of de primerset nog andere PCR fragmenten zal amplificeren, dan deze die men wenst. Indien uit één van deze tools blijkt dat de voorgestelde primerset niet specifiek is dient het volledige proces van primerontwikkeling voor dit paar opnieuw doorlopen te worden tot men primers ontwikkeld die specifiek zijn. 3.6. OPTIMALISATIE Na het ontwikkelen van de primers dient nog overgegaan te worden tot optimalisatie van de PCR reactie. De PCR primers zullen onderworpen worden aan verschillende PCR programma’s (variabele aanhechtingstemperatuur en extensietijd) en condities om zo tot specifieke fragmenten te komen. Er zal gebruik worden gemaakt van twee verschillende PCR programma’s, waarbij het eerste PCR programma een kortere extensietijd heeft dan het tweede. Het volledig PCR programma is uitgeschreven in figuur 13. Vervolgens zal ook in de aanhechtingstemperatuur gevarieerd worden van 58°C tot 64°C, dit meestal in stappen van 2°C. PCR
Programma 1
PCR
Programma 2
94°C 98°C °C 72°C 72°C
5 min 10 s 30 s 1 min 7 min
94°C 94°C °C 72°C 94°C
4 min 30 sec 30 sec 3 min 30 sec
x20
15°C
10 min
°C
30 sec
x25 increase 10s
x35
72°C 72°C
elke stap
3 min 10 min
Figuur 13: De 2 PCR programma’s gebruikt bij optimalisatie van de PCR. De gekleurde vakjes stellen de aanhechtingstemperatuur voor die kan variëren (58°C -65°C). PCR programma 1 heeft een kortere (1 min) extensietijd in vergelijking met PCR programma 2 (3 min).
Indien dit nog niet tot een bevredigend resultaat leidt zal overgegaan worden tot een gradiënt PCR, waarbij elk laantje van de PCR een specifieke aanhechtingstemperatuur verkrijgt en dit in een bereik van 50°C tot 70°C (dit kan men zelf kiezen). Gelijktijdig zullen we hierbij ook de condities van de PCR reactie aanpassen door toevoeging van dimethylsulfoxide (DMSO). Deze stof zorgt ervoor dat de Tm verlaagd wordt, alsook de aspecifieke binding van de primers aan de (c)DNA template, en vergemakkelijkt de amplificatie van GC-rijke zones. De lengte van het gegenereerde PCR product zal gecontroleerd met fragment electroforese (Caliper LabChip GX). 26
In een volgende stap dienen de sequeneringsprimers geoptimaliseerd te worden. Hierbij wordt gestart vanaf het PCR product en zal nagegaan worden of de ontwikkelde primers aanleiding geven tot interpreteerbare sequenties na Sanger sequenering. Deze sequenties zullen geanalyseerd worden met Seqscape (Applied Biosystems). 3.7. CALIPER LABCHIP GX Er werd gebruik gemaakt van Caliper LabChip om DNA- en/of RNA-fragmenten elektroforetisch te scheiden en vervolgens te visualiseren. Dit toestel vervangt de agarose gel electroforese methode om na te gaan of het PCR product het correcte fragment bevat en of de non template controle niet gecontamineerd is. Hiervoor wordt 17 µl H2O en 3µl van het PCR product gepipetteerd op een 384-well plaat. Vervolgens zal er 150 nanoliter worden opgezogen per well. De verschillende fragmenten uit een well worden elektroforetisch gescheiden en vervolgens gedetecteerd via laser-geïnduceerde fluorescentie. De grootte en concentratie van een specifieke band kunnen bepaald worden door het toevoegen van een ladder en interne merkers. De resultaten worden voorgesteld aan de hand van een virtuele gel, grafiek en samenvattende tabellen. Een printscreen wordt voorgesteld in figuur 14.
Figuur 14 : Weergave van de data van de LabChip.
3.8. KLONERING Klonering zal gebruikt worden om de verschillende verkregen transcripten bij de PCR te kunnen identificeren, aangezien er 1 transcript per kloon verkregen wordt. Er werd een Topo TA cloning (Invitrogen) uitgevoerd in One shot TOP10F’ chemische competente E. Coli. Als 27
selectie werd een ampicilline en Xgal (blauw/wit) screening uitgevoerd. Bij de klonering werd gebruik gemaakt van Taq polymerase geamplificeerde PCR producten. Vervolgens werden de bekomen witte klonen overgeënt in een mastermix en geamplificeerd in een PCR reactie. (De klonering werd uitgevoerd door Kim De Leeneer en zal dus niet verder in detail besproken worden). 3.9. SANGER SEQUENERING Via sequenering zal de volgorde van de nucleotiden in het DNA worden blootgelegd, waarna men op zoek kan gaan naar eventuele veranderingen die aanwezig zijn. 3.9.1. PRINCIPE Eerst dient er een opzuivering te gebeuren van de PCR producten. Dit betreft een enzymatische opzuivering door toevoeging van Exo-AP (antartic phosphatase en exonuclease I). Het exonuclease I enzym zal ssDNA degraderen en zal dus de overblijvende primers van de PCR reactie afbreken, terzelfdertijd zal het antartic phosphatase de 5’ fosfaat groepen van nucleotiden verwijderen, waardoor de dNTP’s van de PCR reacties inert worden. Vervolgens wordt deze Exo-AP mix toegevoegd aan het PCR product dat opgezuiverd dient te worden. De gebruikte enzymen voor de opzuivering dienen geïnactiveerd te worden, zodanig dat deze de sequentiereactie niet verstoren. Na opzuivering kan worden overgegaan tot de sequeneringsreactie. Hiervoor wordt een sequeneringsreactie mix samengesteld uit: ABI-buffer (sequencing buffer (5X)), de gewenste primer, RR-mix (ready reaction mix). Deze sequeneringsreactie is gebaseerd op de dideoxy methode, ook wel Sanger methode genoemd. In de reactiemix zitten naast zowel de 4 deoxynucleotidefosfaten fluorochroom
ook gelabelde
in
ondermaat
4
gemodificeerde
nucleotiden: dideoxyNTP’s (ddNTP’s). Tijdens de synthese van het DNA zal vanaf de primer, aan de 3’OH kant, nucleotide na nucleotide
Figuur 15: Links: deoxyribonucleoside trifosfaat; Rechts: dideoxyribonucleoside trifosfaat (http://core.iddrc.org)
worden aangebouwd, die complementair zijn aan de nucleotides van de DNA-streng. De synthese van het DNA zal doorgaan zolang een dNTP wordt ingebouwd en zal telkens stoppen wanneer een ddNTP wordt ingebouwd, dit doordat er geen vrij 3’OH meer is die nodig is voor de verdere synthese. Zo verkrijgt men DNA fragmenten van alle mogelijke lengtes die allemaal eindigen op een ddNTP. De sequenering zal plaatsvinden tijdens een 28
aantal cycli van hogere temperaturen, die nodig zijn voor de denaturatie en lagere temperaturen, zodanig dat de primer kan hechten en de synthese kan gebeuren. Vooraleer de bekomen fragmenten geanalyseerd kunnen worden, dient er eerst nog opzuivering te gebeuren van deze sequentiereactie,
dit
dmv
magnetische
beads.
Na
toevoeging van de magnetische beads aan het opgezuiverd sequentiemengsel, zullen de DNA fragmenten binden aan deze beads. Na binding kan opzuivering gebeuren door toevoeging van 85% ethanol en het plaatsen van de sequentieproducten op een magnetische plaat. Om de DNA fragmenten van de beads te extraheren wordt water toegevoegd, waarna de DNA fragmenten zullen loskomen van de beads. Door dit opnieuw op een magnetische plaat te plaatsen kunnen deze opgezuiverde DNA fragmenten overgeplaatst worden in een ander epje of plaat. Een schematisch overzicht van de verschillende opvolgende
Figuur 16: Schematische voorstelling van de Sanger methode. http://www.genomebc.ca
stappen zijn neergeschreven in bijlage 4. Voor de uitlezing van de sequenties zullen de sequentieproducten geladen worden op de sequencer van Applied Biosystem (ABI 3730 of ABI 3130). De toegepaste techniek is capillaire elektroforese, waarbij de DNA-fragmenten gescheiden worden op basis van hun lengte door een spanning aan te leggen over de capillairen. Er bevindt zich een laserdetector op het einde van de kolom die het fluorescente signaal. De resultaten worden geanalyseerd met behulp van SeqScape (Applied Biosystems). De SeqScape 2.5 software (Applied Biosystems) maakt het mogelijk om sequenties van controles of patiënten te vergelijken met zelfgekozen referentiesequenties, deze kunnen zelf aangemaakt worden.
29
4. RESULTATEN 4.1. ENIGMA PROJECT De ontwikkelde primers voor de BRCA1 c.671-2A>G variant zijn gelegen in exon 9 (forward) en exon 13 (reverse). Deze primers zullen een full length product amplificeren van 3721 bp (wild-type fragment). De sequentie van de gebruikte primers, alsook hun startplaats zijn opgelijst in tabel 2. Tabel 2: Overzicht van het primerpaar gebruikt bij de amplificatie van het fragment van exon 9 tot exon 13.
c.671-
Sequentie
exon
Forward
GAAGATACCGTTAATAAGGCAAC
exon 9
c.552
23
Reverse
GGGAGCCAGCCTTCTAACA
exon 13
c.4282
19
2A>G
Startplaats lengte primer (bp)
Bisearch full lenght product : 3721 bp
Deze primers gaven een optimaal resultaat bij gebruik van de Takara Ex Taq polymerase bij een aanhechtingstemperatuur van 64°C en bij het gebruik van PCR programma 2 (zie figuur 13). Bij de optimalisatie werd ook gebruik gemaakt van de Kapa2G Robust mix om te vergelijken welke PCR condities het beste resultaat opleverden. De samenstelling van de Takara ex Taq mastermix en Kapa2G Robust mix zijn weergegeven in tabel 3. Tabel 3: Samenstelling mastermix Takara Ex Taq en Kapa2G Robust.
Na vergelijking van de resultaten bekomen met Takara Ex Taq en Kapa2G Robust kon men vaststellen dat de PCR bij het gebruik van de Takara mix veel efficiënter doorging met specifiekere transcripten als gevolg. Niet alleen ging de PCR minder efficiënt door bij gebruik van de Kapa2G Robust mix, maar een aantal fragmenten, voornamelijk de grotere en de alternatieve transcripten die bij de patiënt voorkwamen, werden niet geamplificeerd. Deze verschillen zijn visueel voorgesteld in figuur 17.
30
Figuur 17: Vergelijking Kapa2G Robust en Takara Ex Taq, vergelijking geamplificeerde fragmenten van de patiënt met variant BRCA1 c.671-2A>G en een controle. Takara Ex Taq levert na het uitvoeren van een PCR veel duidelijkere banden dan bij het gebruik van de Kapa 2G Robust mix, alsook mist men een aantal fragmenten (bij de patiënt en de grotere fragmenten). Opgepikte fragmenten bij de patiënt (in bp): 246; 318; 447; 507; 689; 873; 3888; bij de controle (in bp): 448bp ; 495; 691; 888; 3894.
Na optimalisatie van de primers werd de PCR uitgevoerd op 3 controles en op de patiënt, waaruit vastgesteld kon worden dat de patiënt 7 transcripten (grootte in bp: 246; 318; 447; 507; 689; 873; 3888) vertoonde en de controle 5 transcripten (grootte in bp: 448 ; 495; 691; 888; 3894). De groottes van de fragmenten werden bepaald aan de hand van de Labchip en deze kunnen afwijken van de werkelijke waarde. Aangezien zowel bij de patiënt als bij de controle meerdere alternatieve transcripten werden vastgesteld werd een klonering uitgevoerd, zodanig dat er maar 1 transcript per kloon verkregen werd. Klonering gebeurde op het PCR product afkomstig van de patiënt (RNA 1200398) en van één controle (RNA 1200363). Dit leverde slechts 24 kolonies op van de patiënt en 27 kolonies van de controle. Vervolgens werden deze kolonies overgeënt in de mastermix voor de PCR reactie, en werd deze opnieuw uitgevoerd om het specifiek transcript van de kloon te amplificeren. De visualisatie van de PCR reactie van de gekloneerde producten kan teruggevonden worden in bijlage 5. Na visualisatie konden op basis van de grootte van de fragmenten 5 verschillende transcripten (305, 422, 859, 975, 1276 (bp)) vastgesteld worden bij de controle, hierbij kwam in het merendeel van de klonen het transcript met een grootte van ongeveer 422 bp voor. 6 verschillende transcripten konden onderscheiden worden op de labchip resultaten bij de patiënt (140, 228, 305, 422, 504, 520, 2379 in bp). Hierbij viel op dat voornamelijk de kleinere fragmenten (228, 305 (bp)) geamplificeerd werden na PCR van de gekloneerde producten. 31
Sequenering werd uitgevoerd op alle PCR producten verkregen uit de klonering, hiervoor werd gebruik gemaakt van de forward en reverse primer van de PCR reactie. Na analyse van de sequenties werden er twee verschillende transcripten geïdentificeerd bij de controle en vijf transcripten bij de patiënt, deze zijn weergegeven in tabel 4. Tabel 4: Overzicht van de opgepikte transcripten bij patiënt (BRCA1 c.671-2A>G) en controle. 5 verschillende transcripten werden opgepikt bij de patiënt: r.671-4096del; r.594-4096del; r.671-3897del; r.6713881del; r.787-4096del, terwijl er slechts twee verschillende transcripten werden geïdentificeerd bij de controle: c.671-4096del; r.787-4096del.
controle
patiënt
RNA niveau
grootte fragment
deletie exon 11
1 kloon
4 klonen
r.671-4096del
295 bp
deletie exon 10 en 11
/
7 klonen
r.594-4096del
218 bp
deletie 5' deel exon 11
/
2 klonen
r.671-3897del
494 bp
deletie 5' deel exon 11
/
3 klonen
r.671-3881del
510 bp
deletie 3' deel exon 11
10 klonen
1 kloon
r.787-4096del
411 bp
Hierbij dient ook vermeld te worden dat de sequenering van sommige PCR producten geen interpreteerbaar resultaat opleverde, waardoor er waarschijnlijk nog een aantal transcripten ontbreken, waaronder het wild-type fragment (3721 bp). In bijlage 6 wordt een overzicht van welke kloon welk transcript opleverde en van welke klonen hun bekomen sequentie niet interpreteerbaar was. 4.2. VERGELIJKING C DNA SYNTHESE KITS Er werd cDNA gesynthetiseerd met drie verschillende kits (M-MULV RNase
H-
; Superscript
II, GoScript) van drie verschillende controles en van de patiënt met BRCA1 c.671-2A>G (RNA 1200398). Deze werden vervolgens gebruikt in eenzelfde PCR reactie met bovenvermelde primers en condities. Hierbij stelde men vast dat SuperScript II, in vergelijking met de andere kits, veel beter in staat is om de grotere PCR producten te amplificeren. Deze werden bijna niet (GoScript) of veel minder sterk (M-MULV) geamplificeerd, terwijl er sterke banden aanwezig waren bij gebruik van SuperScript II. De kleinere fragmenten werden na PCR geamplificeerd bij gebruik van de drie kits, maar ook hier met verschillende efficiëntie. De kleinere transcripten gaven een specifieker resultaat bij gebruik van de SuperScript kit in vergelijking met de twee andere kits, waarbij de gegenereerde banden moeilijker te onderscheiden waren van elkaar. Het resultaat van deze vergelijking is samengevat in onderstaande figuur (figuur 18).
32
Figuur 18: Vergelijking drie cDNA kits.
4.3. CDNA ANALYSE VAN BRCA1, BRCA2, ATM, BRIP1, PALB2 EN CHEK2 4.3.1. PRIMERDESIGN EN OPTIMALISATIE Primers voor BRCA1, BRCA2, en PALB2 waren reeds ontwikkeld voor de start van deze masterproef, alsook de optimale PCR condities voor BRCA1 en BRCA2 waren reeds gekend. Voor alle andere genen (BRIP1, CHEK2, ATM) werden de primers zelf ontwikkeld (zie bijlage 7 voor een overzicht van de ontwikkelde primers). Een aantal amplicons gaven na een eerste optimalisatie geen specifiek resultaat. Deze primers werden getest bij een aanhechtingstemperatuur van 62°C en 65°C bij gebruik van PCR programma 1 (zie figuur 13) waarna vervolgens een gradiënt (50°C-70°C) werd uitgevoerd bij gebruik van hetzelfde PCR programma. In deze gradiënt PCR werd er gebruik gemaakt van twee verschillende mastermixen: met 5% DMSO en zonder. De samenstelling van de mastermix met en zonder DMSO kan nagelezen worden in bijlage 8. Aangezien deze gradiënt nog steeds geen specifiek resultaat gaf werd een nieuwe primerset ontwikkeld, die na verschillende optimalisatiestappen het gewenste resultaat gaf. De chronologische volgorde van de optimalisatiestappen kan nagekeken worden in bijlage 8. Voor CHEK2 was het onmogelijk om 2 nieuwe primersets te ontwikkelen die specifiek genoeg waren, deze leverden namelijk bij de in silico predictie software veel alternatieve fragmenten op, daarom werd overgegaan tot de ontwikkeling van 3 primersets voor het CHEK2 gen. (Volledige optimalisatieprocedure van CHEK2 is ingesloten in bijlage 8.)
33
Alle andere primersets van de verschillende genen gaven na een aantal optimalisatiestappen een specifiek resultaat. Een overzicht van de PCR condities voor de verschillende ontwikkelde primerset zijn weergegeven in de onderstaande tabel. Tabel 5: Overzicht PCR condities per ontwikkeld primerpaar.
Gen BRCA1
BRCA2
ATM
PALB2 BRIP1
CHEK2
PCR fragment PCR1 PCR2 PCR3 PCR1 PCR2 PCR3 PCR1 PCR2 PCR3 PCR4 PCR5 PCR6 PCR1 PCR2 PCR1 PCR2 PCR3 PCR1 PCR2 PCR3
DMSO / / / / / / / / / / / / / / / / / / 5% /
PCR programma 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Aanhechtingstemperatuur 58 °C 58 °C 58 °C 58 °C 58 °C 58 °C 64°C 58 °C 58 °C 58 °C 58 °C 58 °C 60 °C 64 °C 60 °C 60°C 64 °C 68 °C 65 °C 65°C
In een volgende stap werden de sequeneringprimers ontwikkeld voor de verschillende genen en geoptimaliseerd. Na optimalisatie bleek dat bepaalde primers (PALB2 PCR1F; BRIP1 PCR1F; ATM 3FB; ATM 5FC) aanleiding gaven tot sequenties die niet interpreteerbaar waren of waarbij de sequeneringsreactie faalde. Hiervoor werden nieuwe ontwikkeld. Een overzicht van de ontwikkelde sequeneringsprimers kunnnen teruggevonden worden in bijlage 7. 4.3.2. RNA 1300042 Na het uitvoeren van de PCR reactie op cDNA van een patiënt (RNA 1300042) zag men dat deze alternatieve fragmenten opleverde bij verschillende genen, zoals kon vastgesteld worden in figuur 19.
34
Figuur 19: Alternatieve fragmenten patiënt RNA 1300042. De eerste figuur is het resultaat van PCR met primerset ATM PCR1, de tweede met PALB2 PCR1 en de derde met BRIP1 PCR2. Op alle drie de figuren vertoont 1300042 (2de resultaat op elke figuur) andere fragmenten dan de andere stalen die geamplificeerd werden.
Deze PCRs werden gesequeneerd. Na analyse van de sequentie van een aantal fragmenten (BRCA1 fragment 1 en ATM fragment 2-5) van de patiënt met RNA 1300042 werd een groot aantal homozygote veranderingen geïdentificeerd. Een voorbeeld van deze homozygote varianten in BRCA1 en ATM zijn weergegeven in figuur 20. Hierdoor werd er beslist om exon 7 (grootst aantal homozygote veranderingen) van BRCA1 en exon 14 van ATM op gDNA niveau, geëxtraheerd uit bloed, te sequeneren en na te gaan als deze veranderingen ook hierin aanwezig waren.
Figuur 20: Homozygote varianten in patiënt (RNA 1300042). De bovenste sequenties zijn afkomstig van een gezonde controle, de onderste van de patiënt met RNA 1300042. De linkse sequenties zijn afkomstig van het BRCA1 gen, de rechtse van het ATM gen. Als men de controle vergelijkt met de patiënt dan ziet men 3 homozygote varianten in de sequentie afkomstig van het BRCA,1 5 bij de sequentie afkomstig van het ATM.
Op gDNA niveau vertoonde deze patiënt geen alternatieve fragmenten na de PCR reactie en werden geen homozygote veranderingen vastgesteld na analyse van de sequenties. De vergelijking tussen de sequentie bekomen voor varianten in ATM op cDNA en gDNA niveau is weergegeven in figuur 21. 35
Figuur 21: Vergelijking sequenties afkomstig van cDNA en gDNA (ATM). Beide sequenties zijn afkomstig van RNA 1300042 patiënt. De bovenste sequentie is afkomstig van gDNA, de onderste van cDNA. De homozygote varianten die geïdentificeerd werden in het cDNA, zijn niet aanwezig in het gDNA.
4.3.3. PCR + SEQUENERING OVERIGE PATIËNTEN De PCRs voor de verschillende fragmenten werden voor alle patiënten uitgevoerd, behalve voor CHEK2 en BRIP1 PCR3. Deze primersets konden niet tijdig geoptimaliseerd worden. Er werd slechts één afwijkend resultaat (exclusief patiënt met RNA 1300042) geïdentificeerd, dit voor het tweede PCR fragment van PALB2 (PALB2 PCR2). Deze werd vervolgens nog een tweede maal uitgevoerd met vers bereid cDNA, waarbij het verwachtte resultaat werd vastgesteld. Het resultaat van de eerst uitgevoerde PCR en de tweede PCR voor patiënt met RNA 1300042 zijn weergegeven in figuur 22.
Figuur 22: Resultaat PALB2 PCR2 patiënt RNA 1300044. Het rode kader duidt de patiënt met RNA 1300044 aan. Op de linkse figuur ziet men een donkere band die duidelijk lager gelegen is in vergelijking met de andere patiënten. De rechtse figuur is het resultaat bij een tweede uitvoering van de PALB2 PCR2 amplificatie. Bij vergelijking van de twee bekomen resultaten kan men vaststellen dat op de linkse figuur veel meer alternatieve fragmenten (lichter) aanwezig zijn dan bij de tweede uitgevoerde PCR.
Na sequenering van de bekomen fragmenten van de verschillende patiënten konden 10 varianten in 3 verschillende genen (BRCA1, BRCA2, ATM) geïdentificeerd worden. Overzicht van de geïdentificeerde varianten per patiënt in onderstaande tabel.
36
Tabel 6: Overzicht geïdentificeerde varianten per patiënt.
Patiënt
gen
variant
1200304 1200308 1200347 1200349 1200353 1300040
ATM ATM BRCA2 BRCA2 BRCA1 BRCA2 ATM ATM BRCA2 BRCA2 BRCA2 ATM ATM BRCA2 BRCA2 BRCA1 BRCA2 BRCA2 BRCA2 ATM
c.5557G>A c.2572T>C c.7242A>G c.7242A>G c.4837A>G c.7242A>G c.4578C>T c.5557G>A c.1365A>G c.1818G>A c.7242A>G c.2805G>C c.5557G>A c.7242A>G c.7242A>G c.4837A>G c.1114A>C c.865A>C c.1365A>G c.5557G>A
1300044
1300050 1200047 1200049 1200068 1200071
eiwitniveau p.Asp1853Asn p.Phe858Leu p. Ser2414Ser p. Ser2414Ser p.Ser1613Gly p. Ser2414Ser p.Pro1526Pro p.Asp1853Asn p.Ser455Ser p.Pro606Pro p. Ser2414Ser p.Thr935Thr p.Asp1853Asn p. Ser2414Ser p. Ser2414Ser p.Ser1613Gly p.Asn372His p.Asn289His p.Ser455Ser p.Asp1853Asn
status heterozygoot heterozygoot heterozygoot heterozygoot heterozygoot heterozygoot heterozygoot heterozygoot heterozygoot heterozygoot heterozygoot heterozygoot homozygoot heterozygoot heterozygoot homozygoot homozygoot homozygoot homozygoot heterozygoot
RS RS 1801516 RS 1800056 RS 1799955 RS 1799955 RS 1799966 RS 1799955 RS 18000889 RS 1801516 RS 1801439 RS 76844014 RS 1799955 RS 55934812 RS 1801516 RS 1799955 RS 1799955 RS 1799966 RS 144848 RS 766173 RS 1801439 RS 1801516
Soort variant missense variant missense variant synonieme variant synonieme variant missense variant missense variant synonieme variant missense variant synonieme variant synonieme variant synonieme variant synonieme variant missense variant synonieme variant synonieme variant missense variant missense variant missense variant synonieme variant missense variant
4.4. ANALYSE VAN 4 VARIANTEN OP C DNA NIVEAU Bij de analyse van de BRCA1/2 genen in patiënten met een vermoedelijke erfelijke predispositie voor borstkanker worden in 5% van de patiënten varianten aangetroffen waarvan de klinische betekenis niet duidelijk is. Een aantal hiervan liggen in regio’s die belangrijk zijn voor correcte splicing. Door middel van cDNA onderzoek kan nagegaan worden wat het effect van deze varianten is op cDNA niveau om op die manier adequate counseling te kunnen doen van de families waarin deze varianten worden aangetroffen. Vooraleer over te gaan tot PCR gevolgd door sequenering werd gebruik gemaakt van in silico predictie softwares, via Alamut. Dit kan kunnen een eerste aanwijzing van het mogelijk effect op splicing veroorzaakt door een bepaalde variant. Voor BRCA2 c.517G>C en de BRCA2 c.7618-6G>T werd slechts een heel klein verschil voorspeld in de sterkte van de acceptor splice site. De predictie voor de BRCA2 c.3326C>T variant is de aanwezigheid van mogelijks een nieuwe donor splice site op de positie van de variant. Alamut voorspelde voor de BRCA2 c.681+111C>G een nieuwe (SpliceSiteFinder-like 37
en NNSPLICE) of de versterking van een reeds bestaande (MaxEntScan en Human Splicing Finder) acceptor splice site, de eerst volgende mogelijke donor splice site is gelegen op positie c.681+390. Resultaten van de predicties door Alamut kunnen nagekeken worden in bijlage 9. Voor de varianten BRCA2 c.517G>C en BRCA2 c.681+111C>G werd een PCR uitgevoerd met de primers van BRCA2 PCR1. Deze primerset overspant het gebied waarin de varianten gelegen zijn. Voor de variant BRCA2 c.7618-6G>T werd gebruik gemaakt van de primerset BRCA2 PCR2. Een primerset voor de vierde variant, BRCA2 c.3326C>T, werd niet ontwikkeld in deze masterproef, aangezien exon 11 (het grootste exon) in deze masterproef niet overspannen werd. Om deze variant te analyseren werd gebruik gemaakt van primers die exon 10-13 zullen overspannen en reeds aanwezig waren in het labo. Na analyse van de gegenereerde fragmenten bleek dat de BRCA2 c.517G>C variant een transcript amplificeerde dat ongeveer 90 bp korter was dan deze van de gezonde controles. Bij de drie andere varianten werden fragmenten geamplificeerd die dezelfde grootte hadden als de gegenereerde controle fragmenten. Resultaten van deze PCR zijn weergegeven in figuur 23 en 24.
Figuur 23: PCR resultaat c.517G>C, c.681+111C>G en c.7618-6G>T. Resultaat labchip van de PCR uitgevoerd op cDNA; het geamplificeerde fragment van de variant c.517G>C is ongeveer 90 bp korter dan de controles. De andere varianten c.681+111C>G en c.76186G>T geven na PCR fragmenten met dezelfde grootte als de controles.
Figuur 24: Resultaat labchip PCR van patiënt met c.3326 C>T. De variant leverde na PCR amplificatie dezelfde grootte fragmenten als deze van de controles.
38
Vervolgens werden deze PCR producten gesequeneerd met dezelfde sequeneringsprimers als gebruikt bij de cDNA analyse. Voor de c.3326 C>T variant werden primers gebruikt die de exon-exon overgangen zullen overspannen en twee primers die gebruikt zullen worden om de sequenties gelegen in de nabijheid van de variant te analyseren. Een schematische voorstelling wordt gegeven in figuur 25.
Figuur 25: Overzicht ligging sequeneringsprimers c.3326 C>T. De figuur stelt de exonen 10-13 voor, waarbij de pijlen de positie en richting van de sequeneringsprimers weergeven en het rode kruis de variant. De bovenste pijlen duiden de primers aan die gebruikt zullen worden bij de analyse van de exon-exon boundaries/overgangen, de onderste pijltjes stellen de primers voor die gebruikt zullen worden bij de analyse van de variant.
Er werd geen aberrante splicing geïnduceerd tengevolge van de aanwezigheid van de BRCA2 c.3326C>T, c.681+111C>G en c.7618-6G>T varianten. Bij de c.517G>C variant kon men na sequenering een frameshift vaststellen, beginnende na de laatste base van exon 6. Deze frameshift werd veroorzaakt door deletie van het volledige zevende exon en wordt aangeduid in figuur 26.
Figuur 26: Sequentie variant c.517G>C. Net na de laatste base van exon 6 (c.516) ziet men een frameshift (overlappende sequenties), deze werd veroorzaakt door de volledige deletie van exon 7, terwijl ook het wild-type fragment werd aangetroffen.
Vervolgens werd nog een tweede PCR uitgevoerd om na te gaan of het full length fragment ook de variant C bevatte op positie 517 of enkel de G base. De PCR werd uitgevoerd met dezelfde forward primer en een reverse primer gelegen in exon 7 (deze was reeds aanwezig in het labo). Bij de sequenering werd gebruik van dezelfde primers als bij de eerste uitgevoerde PCR.
39
Men stelde vast dat enkel het wild-type nucleotide, G, aanwezig was in het full length fragment op positie c.517, zoals weergeven in figuur 27.
Figuur 27: Resultaat sequenering full length product. Het oranje kader geeft de positie BRCA2 c.517 aan, hierbij stelt men vast dat enkel de G base aanwezig is, de base C van de variant komt in het full length fragment niet voor.
5. DISCUSSIE 5.1. ENIGMA 5.1.1. BRCA1 C.671-2A>G De BRCA1 c.671-2A>G variant is gelegen in intron 10, twee basenparen voor de start van exon 11. Deze basen spelen een belangrijke rol bij het splicing mechanisme, waarbij de intronen (niet-coderende delen) weggeknipt worden, zodanig dat enkel het coderende deel (exonen) van het DNA overblijft. Veranderingen in de basen, die instaan voor de herkenning door het spliceosoom, kunnen leiden tot alternatieve splicing met intron retentie ((deel van het) intron wordt weerhouden) of exon skipping ((deel van het) exon wordt verwijderd) als gevolg. De BRCA1 c.671-2A>G variant was reeds gekend verantwoordelijk te zijn voor alternatieve splicing en zowel de procedure als de opgepikte transcripten zullen vergeleken worden tussen de deelnemende labo’s. Bij vergelijking van het Labchip resultaat verkregen na PCR met dit van de gekloneerde producten kon men vaststellen dat een aantal fragmenten, waaronder het wild-type fragment, niet geïdentificeerd werd bij de gekloneerde producten. Het wild-type fragment werd waarschijnlijk door de lage prevalentie niet ingebouwd in de vectoren gebruikt bij klonering of door preferentiële inbouw van kleinere fragmenten. Na sequenering van de gekloonde PCR producten werden 5 verschillende transcripten geïdentificeerd bij de patiënt met de variant en slechts 2 verschillende transcripten bij de gezonde controle. De 2 alternatieve fragmenten: r.671_4096del (deletie exon 11) en r.591_4096del (deletie exon 10 en 11) kunnen beiden verklaard worden door het wegvallen van de acceptor splice site (zie bijlage 10 voorspelling Alamut). Bij zowel het r.671_3897del en r.671_3881del transcript verwacht men de aanwezigheid van een acceptor splice site, terwijl bij het r.787_4096del fragment de aanwezigheid van een donor splice site verwacht wordt. (Deze werden voorspeld op deze
40
posities door Alamut en deze resultaten zijn samengevat in bijlage 10.) Alhoewel deze acceptor splice sites zwakkere scores hebben (vnl op positie 3881) kunnen deze toch geactiveerd worden bij het wegvallen van de sterkere acceptor splice site op positie 671. In BRCA1 werden reeds verscheidene alternatieve splicing transcripten vastgesteld, waaronder bepaalde natuurlijk voorkomende isovormen (Δ9/10, Δ9/10/11 en Δ9/10/11q) (57). Aangezien de ontwikkelde forward primer gelegen was in exon 9, was het onmogelijk om deze te amplificeren en te identificeren. Dit geldt eveneens voor mogelijke onbekende variantgeassocieerde alternatieve transcripten, waarin (een deel van) exon 9 eruit geknipt zou zijn. In een volgende stap zou via Western blots kunnen nagegaan worden of deze geïdentificeerde transcripten kunnen vertaald worden naar eiwitten. Een eerste indicatie kan verkregen worden door na te gaan of deze transcripten afgebroken worden via nonsense mediated decay (NMD). Out of frame transcripten leiden tot een vervroegd stopcodon en hebben meer kans om NMD te ondergaan. De transcripten r.671_4096del en r.591_4096del zijn in frame deleties en kunnen mogelijks leiden tot translatie naar aberrante proteïnen. Er werd reeds gesuggereerd in muizen dat getrunceerde eiwitten via een dominant negatief effect kunnen leiden tot verlies van de tumorsupressor functie van BRCA1 (58). We slaagden er niet in om voor alle gekloneerde producten een interpreteerbaar resultaat te bekomen; voornamelijk bij de grotere fragmenten. Hiervoor werd tot nu toe nog geen verklaring gevonden, sequenering met de aangrenzende sequenties van de gebruikte vector zou hiervoor een oplossing kunnen bieden. 5.1.2. VERGELIJKING T AKARA E X TAQ EN KAPA2G ROBUST Verschillende Taq polymerases worden aangeboden door verscheidene bedrijven. De keuze van deze twee DNA polymerases berustte op het feit dat deze veelvuldig gebruikt worden in het labo en hier reeds goede resultaten mee bekomen waren. Takara Ex Taq wordt gebruikt voor de amplificatie van longe-range PCR producten, terwijl de Kapa2G robust een brede waaier aankan van verschillende soorten (GC- en AT-rijke) templates met het gebruik van eenzelfde kort PCR programma. Hoewel de Kapa2G Robust kit niet specifiek bedoeld is voor longe-range PCR producten werden reeds bevredigende resultaten bekomen bij de amplificatie van 6kb fragmenten. Bij de vergelijking van deze twee types Taq polymerases ging men na of het volledig spectrum van fragmenten geamplificeerd werd en de sterkte. Men zag hierbij dat de 41
amplificatie bij het gebruik van Takara Ex Taq veel efficiënter doorging en dat alle mogelijke fragmenten aanwezig waren, iets wat men niet vaststelde bij het gebruik van Kapa2G Robust, deze kon maar een beperkt aantal fragmenten (licht) amplificeren. Hierbij werd een duidelijk verschil vastgesteld bij het wild-type fragment (3721 bp). Deze was sterk geamplificeerd (duidelijke banden) bij het gebruik van Takara Ex Taq terwijl deze afwezig was bij Kapa2G Robust. Voor dit experiment bleek het gebruik van Takara Ex Taq de beste optie. Studies waarin verschillende DNA polymerases vergeleken werden zijn eerder zeldzaam, dit komt waarschijnlijk doordat ieder labo werkt met een bepaalde DNA polymerases waarmee goede resultaten bekomen werden en waarmee ze vertrouwd geraakt zijn. In het artikel van Purzycka et al (59) werden 7 verschillende DNA polymerases vergeleken. Ook hier kon een verschil in efficiëntie vastgesteld worden bij vergelijking van de amplificatie tussen de verschillende DNA polymerases. De vaststelling die uit deze resultaten voortvloeit is dat de keuze van DNA polymerase een effect kan hebben op de efficiëntie waarmee amplificatie van bepaalde templates doorgaat. Bijkomend onderzoek dringt zich op, zodanig dat de gebruikers van deze DNA polymerases een weloverwogen keuze kunnen maken die het best aanleunt bij hun onderzoek. 5.1.3. VERGELIJKING 3 CDNA SYNTHESE KITS Aangezien de PCR een spectrum van verschillende transcripten opleverde werd een vergelijkende studie opgezet van verschillende cDNA synthese kits. In het CMGG wordt gebruik gemaakt van SuperScript II voor longe-range RT-PCR en hiervoor dus grotere cDNA fragmenten nodig zijn als template. De twee andere kits werden ons aangeboden door de desbetreffende bedrijven. Bij de drie kits wordt als reverse transcriptase enzym gebruik gemaakt van een genetisch gemodificeerd Moloney Murine Leukemia Virus (M-MULV) en alle drie de kits zijn zodanig ontwikkeld om grote fragmenten cDNA te synthetiseren, die nadien gebruikt kunnen worden in een longe-range PCR. cDNA synthese gebeurde conform de protocols die bij de kits geleverd werden en om de variabelen zo constant mogelijk te houden werd gebruik gemaakt van dezelfde drie controles en hetzelfde patiënt RNA. Na PCR amplificatie werd een duidelijk verschil in efficiëntie waargenomen tussen de drie gebruikte cDNA synthese kits, waarbij vastgesteld werd dat SuperScript II de meest aangewezen kit is voor het uitvoeren van (deze) longe-range RT-PCR. Dit resultaat komt overeen met twee andere studies waarin verschillende RT kits uitgetest en vergeleken werden (60, 61). Hoewel deze studies gebruik maakten van andere cDNA synthese kit ondersteunen 42
deze beide studies de hypothese dat er een verschil in efficiënt van de RT reactie bestaat tussen de verschillende cDNA synthese kits. In de studie van Stahlberg et al (60) werd waargenomen dat deze variatie genafhankelijk is, maar bijkomend onderzoek is nodig om deze hypothese te bevestigen. Hierbij dient vermeld te worden dat het gebruikte template RNA bij SuperScript II 2 µg en bij de M-MULV en GoScript 1 µg bedroeg. Maar dit biedt geen verklaring waarom de grotere fragmenten (GoScript) of bepaalde alternatieve fragmenten (M-MULV) niet geamplificeerd werden. Samenvattend kan men dus stellen dat zowel de positie van de primers, het gebruikte DNA polymerase en cDNA synthesis kit, alsook klonering een invloed kunnen hebben in welke fragmenten preferentieel geamplificeerd en vervolgens geïdentificeerd zullen worden. Het is belangrijk om met deze factoren rekening te houden vooraleer men start met het onderzoek, zodanig dat men er zich van bewust is dat de mogelijkheid bestaat dat sommige transcripten niet zullen worden opgepikt. In deze kwaliteitscontrole georganiseerd door ENIGMA waaraan meer dan 20 labs deelnamen, werd heel wat variatie vastgesteld bij de analyse op cDNA niveau van een BRCA1 variant in de acceptor site van exon 11. Het doel van deze internationale studie was om richtlijnen te formuleren voor cDNA analyse wat zou kunnen bijdragen tot uniformiteit van de resultaten in verschillende labs. Dit is belangrijk om clinici en patiënten correcte informatie te bezorgen omtrent het risico op borstkanker in de familie. 5.2. CDNA ANALYSE VAN BRCA1, BRCA2, ATM, BRIP1, PALB2 EN CHEK2 5.2.1. PRIMEROPTIMALISATIE Alle ontworpen primers voor de verschillende genen werden geoptimaliseerd. Het merendeel van de primers (behalve de primers van BRCA1 en BRCA2) gaven een specifiekere amplificatie bij gebruik van programma 2, waarbij een extensietijd gebruikt werd van 3 minuten ten opzichte van 1 minuut die gebruikt werd bij programma 1. Hiervoor is een logische verklaring: aangezien de primers als doel hebben om een groot (>1000 bp) amplicon te amplificeren zal deze meer tijd nodig hebben om gesynthetiseerd te worden (extensie).
43
5.2.2. RNA 1300042 De patiënt met RNA 1300042 viel op door de vele alternatieve fragmenten die geamplificeerd werden bij de PCR van verschillende genen. Normaal verwacht men dat er alternatieve fragmenten vastgesteld worden bij een bepaalde PCR van een bepaald gen. Deze vaststelling leidde tot het vermoeden dat er waarschijnlijk degradatie van de EBV cellijn had plaatsgevonden, waarschijnlijk door de ouderdom (15 jaar) van deze. Na sequenering van deze fragmenten werd dit vermoeden versterkt door de vele homozygote veranderingen die eveneens in verschillende genen werden geïdentificeerd. Om deze veronderstelling te ondersteunen werd overgegaan tot sequenering van exon 14 van het ATM gen en exon 7 van het BRCA1 gen op gDNA niveau. Deze fragmenten bevatten een groot aantal homozygote veranderingen op cDNA niveau. De gegenereerde fragmenten na PCR vertoonden geen afwijkend beeld in vergelijking met controles, alsook in de sequenties bekomen na sequenering van het gDNA, konden geen homozygote veranderingen geïdentificeerd worden. Deze resultaten bevestigden het vermoeden dat de EBV cellijn van patiënt met RNA 1300042 gedegradeerd is, en deze zal niet meer opgenomen worden in toekomstige analyses. 5.2.3. OVERIGE PATIËNTEN Het hoofddoel van deze studie was om in 25 geselecteerde patiënten mogelijke (diepintronische) varianten te identificeren die aanleiding gaven tot alternatieve splicing. Tezelfdertijd konden de coderende regio’s van PALB2, CHEK2, ATM en BRIP1 op puntmutaties gescreend worden (BRCA1/2 werden hierop reeds gescreend). Meerdere pathogene mutaties die aanleiding gaven tot alternatieve splicing (intronisch en exonisch) werden reeds geïdentificeerd in deze genen (62-65). Deze mutaties komen veel zeldzamer voor dan exonische puntmutaties, maar dit zou voor een deel verklaard kunnen worden doordat deze in de meeste studies over het hoofd worden gezien. Enkel bij de patiënt met RNA 1300044 werd een alternatief bandje op de Labchip vastgesteld na amplificatie met de PALB2 PCR2 primers. Deze PCR werd een tweede maal uitgevoerd voor deze patiënt en hierbij was dit alternatief fragment niet aanwezig. Na sequenering van deze fragmenten kon men geen veranderingen identificeren. Een mogelijke verklaring hiervoor zou kunnen zijn dat het cDNA gebruikt in de eerste PCR reactie mogelijks gedegradeerd zou zijn, anderzijds zou het een artefact kunnen zijn van de Labchip. Wetende dat bij de tweede uitgevoerde PCR reactie gebruik werd gemaakt van vers bereid cDNA en bij 44
vergelijking van de bekomen alternatieve fragmenten bij alle patiënten meegenomen in deze PCR reactie (lichtere banden op de Labchip) werd het vermoeden versterkt dat dit sterk geamplificeerd kleiner fragment mogelijks het gevolg was van degradatie van het gebruikte cDNA. In de geanalyseerde sequenties werden 10 varianten geïdentificeerd, hiervan zijn er 5 synonieme en 5 missense varianten. Deze varianten werden reeds frequent geïdentificeerd waardoor dat deze varianten waarschijnlijk sequentie varianten zijn zonder (gekend) pathogeen effect. De mogelijkheid bestaat dat mogelijke varianten aanwezig in deze patiënten niet werden gedetecteerd. Enerzijds zou dit kunnen komen doordat deze over het hoofd werden gezien door de aanwezige achtergrond, anderzijds zouden deze kunnen liggen in de fragmenten die nog dienen gesequeneerd te worden of in deze die faalden tijdens de sequeneringsreactie. Het falen van deze sequeneringsreacties zou mogelijks kunnen komen doordat de interne primers, gebruikt bij de sequenering, gelegen zouden zijn in een gedeleteerde deel, maar deze kans is relatief klein aangezien men in eerste instantie een verschil zou merken bij de lengte van het geamplificeerde fragment en vanwege het gebruik van overlappende sequeneringsprimers. Aangezien de zeldzaamheid van mutaties die aanleiding geven tot alternatieve splicing en de frequentie waarmee mutaties in de coderende regio voorkomen in families met clustering van borstkanker, ATM, BRIP1, PALB2, CHEK2 mutaties verklaren ongeveer 4-8% van de familiale clustering van borstkanker, is het niet verwonderlijk dat er geen mutaties geïdentificeerd werden in dit onderzoek gezien de grootte van de gescreende patiëntenpopulatie (25 patiënten). 5.3. ANALYSE VAN 4 VARIANTEN OP C DNA NIVEAU In een ander deel van deze masterproef werd het mogelijke effect op splicing van vier varianten nagegaan op cDNA niveau. Deze varianten werden geïdentificeerd op gDNA niveau en zijn gelegen in exon-intron grenzen (c.517G>C), intronisch (c.681+111C>G; c.7618-6G>T) of in het exon (c.3326C>T) van het BRCA2 gen. Na analyse van de Labchip resultaten van de PCR reactie kon men bij de patiënt die drager was van de c.517G>C variant een aberrant fragment vaststellen dat kleiner was dan het full length transcript. Dit kortere fragment was afwezig bij controles. Dit wees op de mogelijkheid dat er aberrante splicing had plaatsgevonden tengevolge van deze variant. Na sequenering van 45
het geamplificeerde fragment van de patiënt met c.517G>C kon men een transcript, naast het wild-type fragment, identificeren met een deletie van exon 7. Deze deletie betrof een in-frame deletie, waarbij het oorspronkelijk open leesraam nog steeds aanwezig was, van positie r.517r.631. Via een tweede PCR, waarbij enkel het wild-type fragment werd geamplificeerd, stelde men vast dat enkel de G base aanwezig was op positie c.517. Dit leidde tot de veronderstelling dat deze variant niet meer in staat is om het full length transcript te produceren en dus zeer waarschijnlijk een pathogeen effect heeft door verlies van het wildtype product. De bekomen resultaten van de c.517G>C variant zijn vergelijkbaar als deze beschreven in Gaildrat et al (66), hoewel hier onderzoek verricht werd naar de c.517G>T variant. Deze varianten zijn gelegen op dezelfde positie in het BRCA2 gen, enkel het mutant allel is verschillend. Bij deze mutant werd eveneens skipping van exon 7 gedetecteerd, terwijl in controles dit alternatief fragment niet geïdentificeerd kon worden. Dit leidde tot een gelijkaardige hypothese: daling van het functioneel BRCA2 eiwit kan een pathogeen effect tot gevolg hebben, doordat het zijn functie in DSB herstel en de bescherming die dit eiwit biedt tegen tumorontwikkeling niet meer zou kunnen vervullen. Om deze hypothese te bevestigen dient men te onderzoeken welke hoeveelheid BRCA2 eiwit nodig is voor het correct uitvoeren van zijn functie en indien, alhoewel er skipping van exon 7 is plaatsgevonden, dit alternatief fragment toch geen functioneel eiwit kan produceren. Een mogelijke volgende stap is om een allelic imbalance studie uit te voeren voor de c.517G>C variant. Indien het fragment, die de exon 7 deletie draagt, niet geamplificeerd wordt bij gebruik van RNA, geëxtraheerd uit cellen die niet behandeld werden met puromycine, zal het aberrante fragment waarschijnlijk afgebroken geweest zijn door het NMD mechanisme en niet functioneel geweest zijn. De sequenering van de andere varianten vertoonden allen een normaal beeld, en hierin kon geen aberrante splicing vastgesteld worden. De hypothese die uit deze resultaten volgde was dat de varianten c.681+111C>G, c.7618-6G>T en c.3326C>T waarschijnlijk neutrale sequentie veranderingen zijn zonder pathogeen effect. Deze resultaten konden niet vergeleken worden met andere studies, aangezien het effect van deze varianten op splicing nog niet werd beschreven. Dit zou mogelijks het bekomen resultaat kunnen ondersteunen, aangezien er bij deze varianten geen effect op splicing kon worden vastgesteld en negatieve resultaten minder frequent beschreven worden in de literatuur. 46
In silico predictie softwares kunnen een nuttige tool zijn om het mogelijke effect van varianten op splicing te voorspellen, maar zoals uit de resultaten van dit onderzoek blijkt, dient men hier héél voorzichtig mee om te gaan. Daar waar de in silico predictie softwares een effect voorspelden, kon na sequenering geen alternatieve splicing gedetecteerd worden. Bij de c.517 G>C variant werd slecht een heel kleine verzwakking voorspeld van de acceptor splice site, maar men stelde vast dat deze variant toch leidde tot aberrante splicing. Een correcte voorspelling van mogelijke splicing werd gesteld voor de c.7618-6G>T variant. Om met zekerheid het effect van varianten op splicing te bepalen een cDNA analyse nodig. 5.4. Toekomstperspectieven Deze cDNA analyse zou nog voortgezet kunnen worden naar CHEK2 en BRIP1 PCR3. Deze sequeneringreacties dienen nog uitgevoerd te worden, alsook ontbreken er nog bepaalde sequenties van andere genen voor alle patiënten. Zodanig dat mutaties in deze genen kunnen worden uitgesloten voor deze patiënten. In een volgende stap kunnen de geïdentificeerde heterozygote SNP’s als basis dienen voor allelic imbalance studies. In deze studie zal er onderzocht worden of er een verschil in expressie van een gen heeft plaatsgevonden. Deze studie zal uitgevoerd worden op cDNA afkomstig uit cellen die niet werden behandeld met puromycine. De expressie van een bepaald allel kan opgereguleerd of neergereguleerd worden via verschillend mechanismes. Indien er allelic imbalance gedetecteerd wordt dient er verder onderzoek te gebeuren van de niet-coderende regio’s (UTR, promotor/enhancer regio). De expressie van bepaalde genen kan gewijzigd worden onder invloed van bijvoorbeeld noncoding RNAs (ncRNAs). NcRNAs kunnen ingedeeld worden in twee groepen op basis van hun grootte in long-non-coding RNA (lncRNA) (>200 nucleotiden) en small non-coding RNA (sncRNA) waartoe de microRNAs (miRNA) behoren. Deze laatste kunnen binden op de 3’untranslated region (UTR) van het mRNA van een gen met wijzigingen (meestal daling) van het mRNA niveau tot gevolg (via blokkering van translatie, degradatie of gene silencing) (67). Zo kunnen mutaties in de 3’UTR van een gen leiden tot het ontstaan van een nieuwe bindingsplaats voor een bepaald miRNA, waarna zijn expressie onderdruk zal worden, of een bestaande bindingsplaats verstoren met upregulatie van de expressie. In tegenstelling tot de reeds veelvuldig bestudeerde miRNAs, zijn de lncRNA een recent opkomend onderzoek. lncRNA kunnen genexpressie wijzigen via regulatie van de transcriptie in cis (bv binding op een transcriptiefactor (TF) bindingsplaats) of in trans (bv betrokkenheid bij transport van TF), 47
via epigenetische veranderingen of via post-transcriptionele en post-translationele regulatie (67, 68). Zo kunnen mutaties in de promotorregio of UTR bindingsplaatsen van een TF verstoren met als gevolg een wijziging in de genexpressie. In dit onderzoek werd slechts gebruik gemaakt van een patiëntenpopulatie bestaande uit 25 personen. In een volgende fase zou dit onderzoek kunnen worden toegepast op een grotere patiëntenpopulatie om zo de kans te vergroten om alternatieve splicing of mutaties in deze genen te identificeren. Er bestaat natuurlijk ook de kans dat de clustering van borstkanker in deze families mogelijks te wijten zou kunnen zijn aan mutaties in andere (nog te identificeren) hoog penetrante borstkankerpredispositiegenen of via het cumulatief effect van frequent voorkomende laag penetrante allelen. In dit geval is exoom sequenering een mogelijke optie. 6. REFERENTIES 1. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100(1):57-70. Epub 2000/01/27. 2. Levitt NC, Hickson ID. Caretaker tumour suppressor genes that defend genome integrity. Trends in molecular medicine. 2002;8(4):179-86. Epub 2002/04/03. 3. Hinds PW, Weinberg RA. Tumor suppressor genes. Current opinion in genetics & development. 1994;4(1):135-41. Epub 1994/02/01. 4. Kinzler KW, Vogelstein B. Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers. Nature. 1997;386(6627):761, 3. Epub 1997/04/24. 5. Oliveira AM, Ross JS, Fletcher JA. Tumor suppressor genes in breast cancer: the gatekeepers and the caretakers. American journal of clinical pathology. 2005;124 Suppl:S16-28. Epub 2006/02/14. 6. Macleod K. Tumor suppressor genes. Current opinion in genetics & development. 2000;10(1):81-93. 7. Lalloo F, Evans DG. Familial Breast Cancer. Clin Genet. 2012;82(2):105-14. 8. Hollestelle A, Wasielewski M, Martens JW, Schutte M. Discovering moderate-risk breast cancer susceptibility genes. Current opinion in genetics & development. 2010;20(3):268-76. Epub 2010/03/30. 9. Foulkes WD. Inherited susceptibility to common cancers. The New England journal of medicine. 2008;359(20):2143-53. Epub 2008/11/14. 10. Ripperger T, Gadzicki D, Meindl A, Schlegelberger B. Breast cancer susceptibility: current knowledge and implications for genetic counselling. Eur J Hum Genet. 2009;17(6):722-31. 11. Wong MW, Nordfors C, Mossman D, Pecenpetelovska G, Avery-Kiejda KA, Talseth-Palmer B, et al. BRIP1, PALB2, and RAD51C mutation analysis reveals their relative importance as genetic susceptibility factors for breast cancer. Breast cancer research and treatment. 2011;127(3):853-9. 12. Turnbull C, Seal S, Renwick A, Warren-Perry M, Hughes D, Elliott A, et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human molecular genetics. 2012;21(4):958-62. Epub 2011/11/11. 13. Miki Y, Swensen J, Shattuck-Eidens D, Futreal PA, Harshman K, Tavtigian S, et al. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1. Science. 1994;266(5182):66-71. Epub 1994/10/07. 14. Turnbull C, Rahman N. Genetic predisposition to breast cancer: past, present, and future. Annual review of genomics and human genetics. 2008;9:321-45. Epub 2008/06/12. 15. Callebaut I, Mornon JP. From BRCA1 to RAP1: A widespread BRCT module closely associated with DNA repair. FEBS letters. 1997;400(1):25-30. 16. Rahman N, Stratton MR. The genetics of breast cancer susceptibility. Annual review of genetics. 1998;32:95-121. Epub 1999/02/03. 17. Thakur S, Zhang HB, Peng Y, Le H, Carroll B, Ward T, et al. Localization of BRCA1 and a splice variant identifies the nuclear localization signal. Mol Cell Biol. 1997;17(1):444-52. 18. Welcsh PL, Owens KN, King MC. Insights into the functions of BRCA1 and BRCA2. Trends in Genetics. 2000;16(2):69-74. 19. Koonin EV, Altschul SF, Bork P. BRCA1 protein products ... Functional motifs. Nature genetics. 1996;13(3):266-8. Epub 1996/07/01. 48
20. Roy R, Chun J, Powell SN. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature reviews Cancer. 2012;12(1):68-78. Epub 2011/12/24. 21. Wooster R, Bignell G, Lancaster J, Swift S, Seal S, Mangion J, et al. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2. Nature. 1995;378(6559):789-92. Epub 1995/12/21. 22. Raicevic-Maravic L, Radulovic S. Breast cancer susceptibility gene 2 -BRCA2.Archive of Oncology. 2001;9(2):3. 23. Shuen AY, Foulkes WD. Inherited Mutations in Breast Cancer Genes-Risk and Response. J Mammary Gland Biol. 2011;16(1):3-15. 24. Stratton MR, Rahman N. The emerging landscape of breast cancer susceptibility. Nature genetics. 2008;40(1):17-22. Epub 2007/12/29. 25. Mavaddat N, Antoniou AC, Easton DF, Garcia-Closas M. Genetic susceptibility to breast cancer. Molecular oncology. 2010;4(3):174-91. Epub 2010/06/15. 26. Chenevix-Trench G, Spurdle AB, Gatei M, Kelly H, Marsh A, Chen X, et al. Dominant negative ATM mutations in breast cancer families. Journal of the National Cancer Institute. 2002;94(3):205-15. 27. Ahmed M, Rahman N. ATM and breast cancer susceptibility. Oncogene. 2006;25(43):5906-11. Epub 2006/09/26. 28. Lavin MF. Ataxia-telangiectasia: from a rare disorder to a paradigm for cell signalling and cancer. Nature reviews Molecular cell biology. 2008;9(10):759-69. Epub 2008/09/25. 29. Tavtigian SV, Oefner PJ, Babikyan D, Hartmann A, Healey S, Le Calvez-Kelm F, et al. Rare, evolutionarily unlikely missense substitutions in ATM confer increased risk of breast cancer. American journal of human genetics. 2009;85(4):427-46. Epub 2009/09/29. 30. Goldgar DE, Healey S, Dowty JG, Da Silva L, Chen X, Spurdle AB, et al. Rare variants in the ATM gene and risk of breast cancer. Breast cancer research : BCR. 2011;13(4):R73. Epub 2011/07/27. 31. Nevanlinna H, Bartek J. The CHEK2 gene and inherited breast cancer susceptibility. Oncogene. 2006;25(43):5912-9. Epub 2006/09/26. 32. Berge EO, Staalesen V, Straume AH, Lillehaug JR, Lonning PE. Chk2 splice variants express a dominantnegative effect on the wild-type Chk2 kinase activity. Biochimica et biophysica acta. 2010;1803(3):386-95. 33. Desrichard A, Bidet Y, Uhrhammer N, Bignon YJ. CHEK2 contribution to hereditary breast cancer in non-BRCA families. Breast cancer research : BCR. 2011;13(6):R119. Epub 2011/11/26. 34. Adank MA, Jonker MA, Kluijt I, Van Mil SE, Oldenburg R, Mooi WJ, et al. Risk of breast cancer in women with a CHEK2 mutation with and without familie history of breast cancer. Journal of Clinical oncology. 2011;29(28):8. 35. Cybulski C, Wokolorczyk D, Jakubowska A, Huzarski T, Byrski T, Gronwald J, et al. Risk of breast cancer in women with a CHEK2 mutation with and without a family history of breast cancer. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2011;29(28):3747-52. Epub 2011/08/31. 36. Cantor SB, Guillemette S. Hereditary breast cancer and the BRCA1-associated FANCJ/BACH1/BRIP1. Future Oncol. 2011;7(2):253-61. Epub 2011/02/25. 37. Vahteristo P, Yliannala K, Tamminen A, Eerola H, Blomqvist C, Nevanlinna H. BACH1 Ser919Pro variant and breast cancer risk. BMC cancer. 2006;6:19. Epub 2006/01/25. 38. De Nicolo A, Tancredi M, Lombardi G, Flemma CC, Barbuti S, Di Cristofano C, et al. A novel breast cancer-associated BRIP1 (FANCJ/BACH1) germ-line mutation impairs protein stability and function. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2008;14(14):4672-80. 39. Ali AM, Singh TR, Meetei AR. FANCM-FAAP24 and FANCJ: FA proteins that metabolize DNA. Mutat ResFund Mol M. 2009;668(1-2):20-6. 40. Casadei S, Norquist BM, Walsh T, Stray S, Mandell JB, Lee MK, et al. Contribution of Inherited Mutations in the BRCA2-Interacting Protein PALB2 to Familial Breast Cancer. Cancer research. 2011;71(6):22229. 41. Tischkowitz M, Xia B, Sabbaghian N, Reis-Filho JS, Hamel N, Li G, et al. Analysis of PALB2/FANCNassociated breast cancer families. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(16):6788-93. Epub 2007/04/11. 42. Poumpouridou N, Kroupis C. Hereditary breast cancer: beyond BRCA genetic analysis; PALB2 emerges. Clin Chem Lab Med. 2012;50(3):423-34. 43. Oliver AW, Swift S, Lord CJ, Ashworth A, Pearl LH. Structural basis for recruitment of BRCA2 by PALB2. EMBO reports. 2009;10(9):990-6. 44. Zhang F, Ma JL, Wu JX, Ye L, Cai H, Xia B, et al. PALB2 Links BRCA1 and BRCA2 in the DNA-Damage Response. Curr Biol. 2009;19(6):524-9. 45. Zhang F, Fan Q, Ren KQ, Andreassen PR. PALB2 Functionally Connects the Breast Cancer Susceptibility Proteins BRCA1 and BRCA2. Molecular Cancer Research. 2009;7(7):1110-8. 49
46. Rahman N, Seal S, Thompson D, Kelly P, Renwick A, Elliott A, et al. PALB2, which encodes a BRCA2interacting protein, is a breast cancer susceptibility gene. Nature genetics. 2007;39(2):165-7. Epub 2007/01/04. 47. Erkko H, Dowty JG, Nikkila J, Syrjakoski K, Mannermaa A, Pylkas K, et al. Penetrance analysis of the PALB2 c.1592delT founder mutation. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2008;14(14):4667-71. Epub 2008/07/17. 48. McClellan J, King MC. Genetic Heterogeneity in Human Disease. Cell. 2010;141(2):210-7. 49. Zhang B, Beeghly-Fadiel A, Long JR, Zheng W. Genetic variants associated with breast-cancer risk: comprehensive research synopsis, meta-analysis, and epidemiological evidence. Lancet Oncology. 2011;12(5):477-88. 50. Wimmer K, Callens T, Wernstedt A, Messiaen L. The NF1 gene contains hotspots for L1 endonucleasedependent de novo insertion. PLoS genetics. 2011;7(11):e1002371. Epub 2011/11/30. 51. Teugels E, De Brakeleer S, Goelen G, Lissens W, Sermijn E, De Greve J. De novo Alu element insertions targeted to a sequence common to the BRCA1 and BRCA2 genes. Human mutation. 2005;26(3):284. 52. Teugels E, De Greve J. About the c.156_157insAlu BRCA2 breast cancer predisposing mutation. Breast cancer research and treatment. 2009;116(3):621-2. Epub 2008/09/23. 53. Chen X, Truong TT, Weaver J, Bove BA, Cattie K, Armstrong BA, et al. Intronic alterations in BRCA1 and BRCA2: effect on mRNA splicing fidelity and expression. Human mutation. 2006;27(5):427-35. 54. Chen X, Weaver J, Bove BA, Vanderveer LA, Weil SC, Miron A, et al. Allelic imbalance in BRCA1 and BRCA2 gene expression is associated with an increased breast cancer risk. Human molecular genetics. 2008;17(9):1336-48. Epub 2008/01/22. 55. Holbrook JA, Neu-Yilik G, Hentze MW, Kulozik AE. Nonsense-mediated decay approaches the clinic. Nature genetics. 2004;36(8):801-8. 56. Chang YF, Imam JS, Wilkinson ME. The nonsense-mediated decay RNA surveillance pathway. Annu Rev Biochem. 2007;76:51-74. 57. Lixia M, Zhijian C, Chao S, Chaojiang G, Congyi Z. Alternative splicing of breast cancer associated gene BRCA1 from breast cancer cell line. Journal of biochemistry and molecular biology. 2007;40(1):15-21. 58. Sylvain V, Lafarge S, Bignon YJ. Dominant-negative activity of a Brca1 truncation mutant: effects on proliferation, tumorigenicity in vivo, and chemosensitivity in a mouse ovarian cancer cell line. International journal of oncology. 2002;20(4):845-53. Epub 2002/03/15. 59. Purzycka J, I. O, I. S, W. P, J J. Efficiency comparison of seven different Taq polymerases used in hemogenetics. International Congress series 1288. 2006:3. 60. Stahlberg A, Kubista M, Pfaffl M. Comparison of reverse transcriptases in gene expression analysis. Clinical chemistry. 2004;50(9):1678-80. 61. Franca A, Freitas AI, Henriques AF, Cerca N. Optimizing a qPCR Gene Expression Quantification Assay for S. epidermidis Biofilms: A Comparison between Commercial Kits and a Customized Protocol. PloS one. 2012;7(5). 62. Coutinho G, Xie J, Du L, Brusco A, Krainer AR, Gatti RA. Functional significance of a deep intronic mutation in the ATM gene and evidence for an alternative exon 28a. Human mutation. 2005;25(2):118-24. 63. Baralle D, Baralle M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of medical genetics. 2005;42(10):737-48. Epub 2005/10/04. 64. Rutter JL, Smith AM, Davila MR, Sigurdson AJ, Giusti RM, Pineda MA, et al. Mutational analysis of the BRCA1-interacting genes ZNF350/ZBRK1 and BRIP1/BACH1 among BRCA1 and BRCA2-negative probands from breast-ovarian cancer families and among early-onset breast cancer cases and reference individuals. Human mutation. 2003;22(2):121-8. Epub 2003/07/23. 65. Sanz DJ, Acedo A, Infante M, Duran M, Perez-Cabornero L, Esteban-Cardenosa E, et al. A high proportion of DNA variants of BRCA1 and BRCA2 is associated with aberrant splicing in breast/ovarian cancer patients. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2010;16(6):1957-67. Epub 2010/03/11. 66. Gaildrat P, Krieger S, Di Giacomo D, Abdat J, Revillion F, Caputo S, et al. Multiple sequence variants of BRCA2 exon 7 alter splicing regulation. Journal of medical genetics. 2012;49(10):609-17. Epub 2012/09/11. 67. Mattick JS, Makunin IV. Non-coding RNA. Human molecular genetics. 2006;15 Spec No 1:R17-29. 68. Tufarelli C, Stanley JA, Garrick D, Sharpe JA, Ayyub H, Wood WG, et al. Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease. Nature genetics. 2003;34(2):157-65. Epub 2003/05/06.
50
BIJLAGE 1: Patiëntentabel
1
EBV nummer E10-21
RNA nummer (P+) 1200300
DNA nummer D1014173
BR-32-0698
Manchester score 19
2
172
1200302
5192
BR-32-0005
20
3
531
1200304
6286
BR-32-0007
24
4
718
1200306
D0811251
BR-32-0076
20
5
727
1200308
M9903340
BR-32-0095
18
6
730
1200310
M0000107
BR-32-0093
24
7
755
1200312
M0000666
BR-32-0071
26
8
675
1200327
11023
BR-32-0039
24
9
593
1200347
M9900890
BR-32-0066
32
10
517
1200349
11285
BR-32-0041
16
11
758
1200351
M0000709
BR-32-0102
32
12
445
1200353
10600
BR-32-0020
40
13
420
1200355
10259
BR-32-0027
48
14
673
1300002
10712
BR-32-0029
26
15
529
1300040
11503
BR-32-0050
/
16
485
1300042
11100
BR-32-0010
/
17
767
1300044
M0000821
BR-32-0109
12
18
743
1300046
M0000341
BR-32-0099
12
19
571
1300048
M9900570
BR-32-0063
18
20
383
1300050
9787
BR-32-0024
24
21
191
1300052
05198A
BR-32-0004
17
22
G1100019
1200047
/
/
33
23
G1100020
1200049
/
/
36
24
G1100021
1200068
/
/
47
25
220
1200071
6729
BR-32-0007
14
Familienummer
BIJLAGE 2: PROTOCOL: RNA extractie (RNeasy kit)
Volume bepalen van de T75 cultuurflessen, waarin de EBV cellijn werd opgekweekt
Cellijn splitsen in twee T25 cultuurflessen
Aan één T25 wordt puromycine toegevoegd => 200 µg puromycine/ ml milieu op te lossen in 200 µl RPMI per staal (1 volume meer rekenen)
4-6 uur incuberen (37°C, 5% CO2)
Alles uit de T25 cultuurflessen overpipetteren in 15ml falcons (voorzien van RNA nummer en naam van de patiënt)
5 minuten centrifugeren bij 300 rcf
Supernatans afgieten
Flickn’ the tube (pellet losmaken)
RLT-mix maken : 600 µl RLT-buffer per staal + 10 µl β-mercapto per ml RLT-buffer
600 µl RLT-mix in falcon brengen
30 “ vortexen
600 µl 70% ethanol in falcon brengen (dit goed mengen door op en neer te pipetteren)
Breng 700 µl per falcon over op de RNeasy mini spin kolommen (roze)
15” centrifugeren op volle kracht
Filtraat weggieten
De overblijvende rest van in de falcons wordt overgebracht op de kolom
15” centrifugeren op volle kracht
Filtraat weggieten
700 µl wasbuffer (RW1) op kolom aanbrengen
15” centrifugeren op volle kracht
Filtraat weggieten en collection tube wegsmijten
De mini spin kolom wordt vervolgens in een nieuwe collection tube geplaatst
500 µl RPE op kolom aanbrengen (Bij eerste gebruik: ethanol toevoegen)
15” centrifugeren op volle kracht
Filtraat weggieten
500 µl RPE op kolom
2 minuten afdraaien op volle kracht
Filtraat weggieten en collection tube wegsmijten
De kolom wordt vervolgens in een 1.5ml RNase-vrij epje geplaatst
50 µl RNase-vrij water centraal pipetteren op de kolom
1 minuut laten staan en vervolgens 1 minuut afdraaien op volle snelheid
Kolom wegsmijten en vervolgens onmiddellijk het RNA op ijs plaatsen
Vervolgens kan men een RNA-meting uitvoeren om de kwaliteit en concentratie te achterhalen
BIJLAGE 3: Protocol van de 3 verschillende cDNA synthese kit’s PROTOCOL: cDNA synthese SuperScript II
Voeg 2 µg RNA in een epje (200 µl)
Aanvullen met HPLC H2O tot 10 µl
Voeg 2 µl per epje toe van mix 1 mix 1
per reactie
random primers (50ng/µl)
1 µl
dNTP's (10mM)
1 µl
Incubeer gedurende 5 minuten bij 65°C
Onmiddellijk afkoelen op ijs en centrifugeren
Voeg 7 µl per epje toe van mix 2 mix 2
per reactie
5x First strand buffer
4 µl
0,1M DTT
2 µl
RNAsin (40U/ µl)
1 µl
Incubeer gedurende 2 minuten bij 25°C
Voeg 1 µl superscript II RT toe per epje
Plaats in PCR-machine met volgend programma: 25 °C 42 °C 70 °C 4 °C
10 min 50 min 15 min Oneindig
PROTOCOL: cDNA synthese M-MULV RT (RNase H-)
Voeg 1 µg RNA in een epje (200 µl)
Aanvullen met HPLC H2O tot 9 µl
Voeg 3 µl per epje toe van mix 1 mix 1
per reactie
random primers (50ng/µl)
2 µl
dNTP's (10mM)
1 µl
Incubeer gedurende 5 minuten bij 65°C
Onmiddellijk afkoelen op ijs en centrifugeren
Voeg 8 µl per epje toe van mix 2 mix 2 5x reaction buffer 0,1M DTT RNAsin (40U/µl) M-MULV RT (200U/µl)
per reactie 4 µl 2 µl 1 µl 1 µl
Plaats in PCR-machine bij volgend programma: 25 °C 42 °C 80 °C 4 °C
10 min 50 min 5 min Oneindig
PROTOCOL: cDNA synthese GoScript
Voeg 1 µg RNA in een epje (200 µl)
Aanvullen met HPLC H2O tot 4 µl
Voeg 1 µl random primers (500 ng/µl) toe
Incubeer gedurende 5 minuten bij 70°C
Onmiddellijk afkoelen op ijs en centrifugeren
Voeg 15 µl per epje toe van mix 1 mix 1 GoScript 5x Reaction Buffer MgCl2 (25mM) RNAsin (40U/µl) Go Script RT dNTP's (0,5mM) sigma H2O
per reactie 4 µl 2,4 µl 0,5 µl 1 µl 1 µl 6,1 µl
Plaats in PCR-machine bij volgend programma: 25 °C 42 °C 70 °C 4 °C
5 min 60 min 15 min Oneindig
BIJLAGE 4: PROTOCOL: Sanger Sequering 1. Opzuivering
Voeg 1 µl toe van mix 1 Handelsnaam New England BioLabs New England BioLabs VWR
Mix 1 Exonuclease I Antarctic phosphatase H2O
Voeg hieraan 5 µl PCR product toe
Plaats in PCR machine bij volgend programma: 15 min 20 min
µl per reactie 0,05 0,20 0,75
37°C 80°C
Na opzuivering toevoegen van 20 µl H2O om te verdunnen
2. Sequencing reactie
Voeg 8,5 µl toe van mix 2 (in nieuw epje) Mix 2 RR-mix ABI buffer primer (1/50 verd. van 50µM) H2O
Handelsnaam Applied Biosystems eigen bereiding Life technologies
µl per reactie 0,50 2,00 3,00
VWR
3,00
Voeg 1,5 µl toe van het verdund opgezuiverd PCR product
Plaats in PCR machine bij volgend programma:
5 min 10 sec 5 sec 4 min 10 sec
95 °C 95 °C 55 °C 60 °C 15 °C
25 cycli
3. Precipitatie met beads
Resuspendeer de magnetische beads, maak een homogene oplossing Voeg 10 µl beads toe bij elk sequentieproduct Voeg 45 µl 85% EtOH en mix door 7 maal op en neer te pipetteren Plaats de sequentieproducten gedurende 3 minuten op een magnetische plaat Verwijder het supernatans Voeg 100 µl 85% EtOH toe en incubeer gedurende 30 seconden op een magnetische plaat Verwijder opnieuw het supernatans Laat de sequentieproducten gedurende 10 minuten drogen (op kamertemperatuur of 37°C ) Voeg 40 µl H2O toe en wacht gedurende 3 minuten Mix het mengels door op en neer te pippeteren Plaats het op een magnetische plaat en wacht tenminste 30 seconden Breng 30 µl zuiver sequentieproduct over in een vers epje of plaat
BIJLAGE 5: Resultaat Labchip gekloneerde producten Controles
Patiënten
Figuur: Resultaat labchip: PCR van gekloneerde producten.
Bijlage 6: Overzicht sequenering van de gekloonde PCR producten Patiënten 1: c.787_4096del (del 3’deel van exon 11) 2: c.671_4096del (del exon 11) 3: c.594_4096del (del exon 10 +11) 4: c.594_4096del (del exon 10 +11) 5: c.671_3897 del (del 5’deel van exon 11) 6: c.594-4096del (del exon 10 +11) 7: c.671_4096del (del exon 11) 8: mislukt 9: mislukt 10: sequentie uit MFSD6 11: c.594-4096del (del exon 10 +11) 12: c.671_3897 del (del 5’deel van exon 11) 13: c.671_3881del (del 5’deel van exon 11) 14: mislukt 15: mislukt 16: c.594-4096del (del exon 10 +11) 17: mislukt 18: c.671-4096del (del exon 11) 19: c.671-4096del (del exon 11) 20: c.671_3881del (del 5’deel van exon 11) 21: c.671_3881del (del 5’deel van exon 11) 22: c.594-4096del (del exon 10 +11) 23: c.594-4096del (del exon 10 +11) 24: sequenering mislukt
Controles 1: c.787_4096del (del 3’deel van exon 11) 2: c.787_4096del (del 3’deel van exon 11) 3: mislukt 4: mislukt 5: mislukt 6: mislukt 7: c.787_4096del (del 3’deel van exon 11) 8: c.787_4096del (del 3’deel van exon 11) 9: mislukt 10: mislukt 11: sequentie afkomstig van KANSL1-001 12: mislukt 13: c.671-4096del (del exon 11) 14: mislukt 15: mislukt 16: c.787_4096del (del 3’deel van exon 11) 17: mislukt 18: c.787_4096del (del 3’deel van exon 11) 19: mislukt 20: c.787_4096del (del 3’deel van exon 11) 21: mislukt 22: mislukt 23: c.787_4096del (del 3’deel van exon 11) 24: mislukt 25: mislukt 26: c.787_4096del (del 3’deel van exon 11)
27: c.787_4096del (del 3’deel van exon 11)
BIJLAGE 7: Overzicht PCR en sequeneringsprimers Gen
Referentiesequentie
BRCA1
NM_007294.3
BRCA2
NM_000059.3
ATM
NM_000051.3
PALB2
NM_024675.3
BRIP1
NM_032043.2
CHEK2
NM_001005735.1
Gebruikte primers BRCA1 PCR
Sequentie
Startplaats
lengte primer (bp)
Tm (salt) (°C)
GC %
bisearch
PCR1F
CCCTCTGCTCTGGGTAAAG
82
19
59,5
58
9 producten :
PCR1R
GAGTAATAAACTGCTGTTCTCATG
995
24
60,3
38
(5x) 914; 1003; 836; 1030; 225
PCR2F
CTGAAAGCCAGGGAGTTGG
4102
19
59,5
58
6 producten :
PCR2R
GTCAATTCTGGCTTCTCCCTG
5038
21
61,2
52
(4x) 937; 1003; 1000
PCR3F
CATACCATCTTCAACCTCTGC
4895
21
59,5
48
6 producten
PCR3R
GGACTGAAGAGTGAGAGGAG
5807
20
60,5
55
(5x) 913; 839
Sequenering
Sequentie
Startplaats
lengte primer (bp)
Tm (salt) (°C)
GC %
lengte
PCR1F 1FA seq
CCCTCTGCTCTGGGTAAAG GATTTAGTCAACTTGTTGAAGAGC
82 352
19 24
59,5 60,3
58 38
270 643
PCR2F 2FA seq
CTGAAAGCCAGGGAGTTGG GCTGACAAGTTTGAGGTGT
4102 4539
19 19
59,5 55
58 47
437 356
PCR3F
CATACCATCTTCAACCTCTGC
4895
21
59,5
48
BRCA2 PCR
Sequentie
Startplaats
lengte primer (bp)
Tm (salt) (°C)
GC %
bisearch
PCR1F PCR1R
GCGGTTTTGTCAGCTTACTC CCCAAAAGAGCTAGTTAAGGAC
143 2225
20 22
58,4 60,1
50 45
2082
PCR2F PCR2R
CGAAAATGAGGAAATGGTTTTGTC GGCCTCCACATATTTTGCTGC
7004 8784
24 21
60,3 61,2
38 52
1801
PCR3F PCR3R
GGAGCAGAACTGGTGGGC CCTTTACAAGACTTTGAAGTCATC
8496 9997
18 24
60,8 60,3
67 38
1502
Sequenering
Sequentie
startplaats lengte primer (bp)
Tm (salt) (°C)
GC %
lengte (bp)
PCR1F 1FA seq 1FB seq 1FC seq 1FD seq
GCGGTTTTGTCAGCTTACTC GGAAACCATCTTATAATCAGC GGAGTGAGGTGGATCCTG GTGGAACCAAATGATACTGATCC CTTCTCCAGTGGCTTCTTCA
143 433 786 1305 1705
20 21 18 23 20
58,4 55,4 58,4 60,9 58,4
50 38 61 43 50
290 353 519 400 520
PCR2F 2FA seq 2FB seq
CGAAAATGAGGAAATGGTTTTGTC CAGGCAGACCAACCAAAGTC CACACTGAAGATTATTTTGGTAAGG
7004 7429 7920
24 20 25
60,3 60,5 60,9
38 55 36
425 491 576
PCR3F 3FA seq 3FB seq
GGAGCAGAACTGGTGGGC CCTTGAATAATCACAGGCAAATG CCTTAATGAGGACATTATTAAGCC
8496 9016 9557
18 23 24
60,8 59,2 60,3
67 39 38
520 541
ATM PCR
Sequentie
startplaats
lengte
Tm (primer3plus) (°C)
Tm (°C) (salt)
GC (%)
Bisearch
PCR product
PCR1F PCR1R
CCTGCTGCCCAGATATGACT CTGTTGGGGTAGAAGCTGAG
132 1527
20 bp 21 bp
60,2 59,5
60,5 60,5
55 55
1 product
1396 bp
PCR2F PCR2R
GATCACCTTCAGAAGTCACAG ATCCCTTGTGTTCTCAGAGTC
1381 3207
21 bp 21 bp
/ /
59,5 59,5
48 48
3 producten
1848
PCR3F PCR3R
GGAGCTTCCTGGAGAAGAG ATCCTTACAGTAAGTCACGGC
3045 4722
19 bp 21 bp
/ /
59,5 59,5
58 48
2 producten
1678
PCR4F PCR4R
GATCCTGCTCCTAATCCACC AAGTGAGCAGCACAAGACTGA
4306 6044
20 bp 21 bp
58,5 58,5
59,5 59,5
55 48
3
1739
PCR5F PCR5R
GGGATTTTTCACCAGCTGTCT CATCATCTTGGTCCCCATTCT
5790 7785
21 bp 21 bp
60,5 61,1
59,5 59,5
48 48
4
1996
PCR6F
GAAAGAGGATCGTAAACGCTTC
7553
22 bp
59,4
60,1
45
3
2001
PCR6R
GCAGAGATGTTCCTTAAGACCA
9554
22 bp
60,1
60,1
45
Sequenering Sequentie startplaats PCR1F CCTGCTGCCCAGATATGACT 132 1FA seq CTC CAG GCA GAA AAA GAT GCA 453 1FB seq CAT GCT GTT ACC AAA GGA TGC T 763 1FC seq GTC ATA TAG GAA GTA GAG GAA AG 1160
Lengte 20 21 22 23
Tm (°C) (salt) 60,5 59,5 60,1 59,2
GC % 55 48 45 39
lengte 321 bp 310 bp 397 bp 221 bp
PCR2F 2FA seq 2FB seq 2FC seq
GATCACCTTCAGAAGTCACAG GGAAGTTATTTACTGGGTCAGC GGTATAGAAAAGCACCAGTCC GATTGCATCTGGCTTTTTCCTG
1381 1760 2197 2580
21 22 21 22
59,5 60,1 59,5 60,1
48 45 48 45
379 bp 437 bp 383 bp 465 bp
PCR3F 3FA seq 3FB seq
GGAGCTTCCTGGAGAAGAG GAGAACCCTGAAACTTTGGATG CCATTGCTAATCAGATTCAAGAG
3045 3604 3998
19 22 23
59,5 60,1 59.2
58 45 39
559 bp 394 bp 308 bp
PCR4F 4FA seq 4FB seq 4FC seq
GATCCTGCTCCTAATCCACC TGT GTA TGA GCA GGT GGA GG GTT GCA GTT ATC CAA GAT GGC GACTGGACATAGTTTCTGGGA
4306 4770 5152 5421
20 20 21 21
59,5 60,5 59,5 59,5
55 55 48 48
464 bp 382 bp 269 bp 369 bp
PCR5F 5FA seq 5FB seq 5FC seq
GGGATTTTTCACCAGCTGTCT CAATGTGGGGCAAAGCCCTA TCTGTGTATTCGCTCTATCCC GCCCTGAGTATTCTCAAGCAA
5790 6308 6682 7111
21 20 21 21
59,5 60,5 59,5 59.5
48 55 48 48
518 bp 374 bp 429 bp 442 bp
PCR6F 6FA 6FB 6FC 6FD 6FE
GAAAGAGGATCGTAAACGCTTC ACTAAACCAGAGGTAGCCAGA CCAGCAGACCAGCCAATTAC GAACTGTCCCCATTGGTGAAT GGCAAAATCCTTCCTACTCCT GTGCTCAGTGTTGGTGGACA
7553 7906 8130 8504 8878 9262
22 21 20 21 21 20
60,1 59,5 60,5 59,5 59,5 60,5
45 48 55 48 48 55
353 bp 224 bp 374 bp 374 bp 384 bp
PALB2 PCR
Sequentie
startplaats lengte primer (bp)
PCR1F PCR1R
GACGGCTGCTCTTTTCGTTC CTCAAAGGGCTCCACTGGTT
121 2070
PCR2F PCR2R
CGATTGTTAACAGGTCCAAGGAAGAAG GTCTGGACATAAACAAGCAATCATTT
1763 3837
Sequenering
Sequentie
SEQ1F
TTTTCGTTCTGTCGCCTGCC
132
1FA seq
GCCTGAGTCCTTTAACCCTGG
1FB seq
Tm (salt) (°C)
GC %
bisearch
20 20
60,5 60,5
55 55
2 producten 1950; 1933
27 26
66,6 61,7
44 35
2 producten 2075
startplaats lengte primer (bp)
Tm (salt) (°C)
GC %
lengte
20
60,5
55
341
462
21
63,2
57
417
CACCAGGGCGACTACAGTTCC
879
21
65,3
62
405
1FC seq
CCTAAGAGTCTTAGCCTGGAAGCA
1284
24
65,2
50
479
PCR2F
CGATTGTTAACAGGTCCAAGGAAGAAG
1763
27
66,6
44
425
2FAseq
CCAGGAAAATCACATCCCAAAAGGC
2188
25
65,8
48
431
2FB seq
GCTCTGTAGAAACACATGCCAGG
2619
23
64,6
52
441
2FC seq
GCTTGGCCTGACAAAGAG
3060
18
56,3
56
317
2FD seq
GTCATCCCTGTGCCAAAGAGAGTG
3377
24
66,9
54
BRIP1 PCR PCR1F PCR1R
Sequentie GGGCTCCGCTTTATTTGCTC CACAGCTCGTAGGGGTTCAT
Startplaats 145 1591
lengte 20 bp 20 bp
Tm (primer3plus) (°C) 63,2 60,1
Tm (°C) (salt) 60,5 60,5
GC (%) 55 55
Bisearch 1 product
PCR product 1477 bp
PCR2F PCR2R
CACAGCCCGAGAACTAATACA TAGATGACTTGCTGCTTCCAG
1327 3055
21 bp 21 bp
57,9 58,3
59,5 59,5
48 48
2 producten
1729 bp
PCR3F PCR3R
GAGCTCTCCTGGTAGCAGTT AAGGTTGCAGTGAGCCCAGA
2529 4250
20 bp 20 bp
/ /
60.5 60.5
55 55
1 product
1722
Sequenering SEQ1F 1FA SEQ 1FB SEQ
Sequentie GCTCTCAGAAGTCGGTTTCC CCAAGCACACCACCTTCTGA ACAGGGAAATCCAAGATACCC
startplaats 161 599 980
Lengte 20 bp 20 bp 21 bp
Tm (°C) (salt) 60,5 60,5 59,5
GC% 55 55 48
lengte (bp) 438 371 347
PCR2F 2FA SEQ 2FB SEQ 2FC SEQ
CACAGCCCGAGAACTAATACA TCACCACTGCTACTTTTCCCA GTTCACGACAGAAAACTGCAG TGGCTCTCTACTGGTTTATGG
1327 1713 2004 2390
21 bp 21 bp 21 bp 21 bp
59,5 59,5 59,5 59,5
48 48 48 48
386 291 386 382
PCR3F 3FA SEQ 3FB SEQ 3FC SEQ
ACAGAAATGATTGGGGAGCTC CAGATCCACAAGCCCAACTTT CCCTGGATCCAGACATTGAAT CAGAGAAGTGAAAGCTGAGGA
2772 3226 3561 3814
21 bp 21 bp 21 bp 21 bp
59,5 59,5 59,5 59,5
48 48 48 48
454 335 253
CHEK2 PCR
Sequentie
startplaats lengte primer (bp) Tm (primer3plus) (°C) Tm (salt) (°C)
GC %
bisearch
PCR1F PCR1R
AGGTTTAGCGCCACTCTGCT GTGCCTCACACCTCTTATCC
7 499
20 20
/ /
60,5 60,5
55 55
1 Product: 493 bp
PCR2F PCR2R
CCAATCTTGAGACAGAGTCTG ACTACCAACAACTTCTTGACAAG
377 1601
21 23
/ /
59,5 59,2
48 39
1 Product: 1225 bp
PCR3F PCR3R
GAGCATAGGACTCAAGTGTCA AGTTCACAACACAGCAGCACA
1510 1840
21 21
/ /
59,5 59,5
48 48
3 verschillende producten: 351 bp pseudogenen: 350 en 389
BIJLAGE 8: Overzicht optimalisatieprocedure PALB2 PCR1; BRIP1 PCR3; CHEK2 Gebruikte mastermixen Takara Ex Taq:
ExBuffer (10x) dNTP's (2,5mM elk dNTP) H20 (HPLC) Primer F (50 µM) Primer R (50 µM) Ex Taq (5U/µl) cDNA Totaalvolume
Handelsnaam Takara Takara VWR Life Technologies Life Technologies Takara
per reactie (µl) 1,5 1 11,21 0,1 0,1 0,09 1 15
Takara Ex Taq + 5% DMSO:
ExBuffer (10x) dNTP's (2.5 mM elk dNTP) H20 (HPLC) Primer F (50 µM) Primer R (50 µM) DMSO Ex Taq (5U/µl) cDNA totaalvolume
PCR programma 1 en 2 zie figuur 13.
Handelsnaam Takara Takara VWR Life Technologies Life Technologies Takara
per reactie (µl) 1,5 1 10,46 0,1 0,1 0,75 0,09 1 15
PALB2 PCR1 Bestaande primers (1):
PALB2
Sequentie
startplaats
Bisearch
PCR1F PCR1R
GGGTGCGATCCCGGGCT GCATTCCATCCCTATGAAATGGAGCC
78 1992
2 producten 1898, 1915
PCR Programma 1: aanhechtingstemperatuur 62°C en 65°C
Bij dit programma en deze aanhechtingstemperaturen zien we geen geamplificeerd PCR product
PCR programma 1: gradiënt PCR 50°C-70°C
Bij de aanhechtingstemperatuur van 50°C-70°C zien we geen banden
PCR programma1: gradiënt PCR 50°C-70°C met Takara Ex Taq + 5% DMSO
Ook bij toevoeging van 5% DMSO aan de mastermix zien we geen banden. Hier werd er overgegaan tot de ontwikkeling van nieuwe PALB2 PCR1 primers.
Nieuwe PALB2 PCR1 primers (2): PALB2
Sequentie
startplaats
bisearch
PCR1F PCR1R
GACGGCTGCTCTTTTCGTTC CTCAAAGGGCTCCACTGGTT
121 2070
2 producten 1950; 1933
PCR programma 1: aanhechtingstemperatuur 58°C
De fragmenten die in deze PCR werden geamplificeerd zijn van de verkeerde groottes.
PCR programma 2: aanhechtingstemperatuur 58°C, 60°C en 62°C
Labchip resultaten respectievelijk bij 58°C, 60°C en 62°C. De PCR reactie bij 60°C werd weerhouden, alhoewel deze niet specifiek is, is het PCR product van de gewenste grootte sterker aanwezig dan de aspecifieke fragmenten. Er werd geen rekening gehouden met controle 2939 aangezien dit staal tekenen van degradatie vertoond.
CHEK2 Primerparen (1): CHEK2
Sequentie
startplaats
bisearch
PCR1F PCR1R
AGGTTTAGCGCCACTCTGCT GCAGTGGTTCATCAAAGCAATATT
6 593
6 producten (5x) 458; (1x) 587
PCR2F PCR2R
CCTGCTGTCATCTGATCCTC AACACAGCAGCACACACAGC
436 1833
1 product 1398 bp
Programma 2: aanhechtingstemperatuur 58°C
Beide PCR reacties gaan aspecifiek door, waarbij het fragment de gewenste lengte niet aanwezig is.
PCR programma 2: aanhechtingstemperatuur 60°C
Idem als bij 58°C.
PCR programma 2: aanhechtingstemperatuur 62°C en 64°C
Beide PCR’s geven bij de verschillende aanhechtingstemperaturen aspecifieke fragmenten. Ook hierbij is het fragment met de correcte grootte niet aanwezig.
PCR programma 2: gradiënt 45°C-69°C
PCR 1 geeft nog steeds een aspecifieke reactie bij deze verschillende temperaturen, maar omdat sommige fragmenten in de buurt liggen qua grootte van het gewenste fragment werden sommige fragmenten gesequeneerd om na te gaan als deze het gewenste fragment opleverden. Dit was niet het geval. Bij PCR 2 komen geen van de fragmenten in de buurt van het gewenste product. Er werd besloten om nieuwe primers voor CHEK2 te ontwikkelen.
Primerparen (2): CHEK2
Sequentie
startplaats
Bisearch
PCR1F PCR1R
AGGTTTAGCGCCACTCTGCT GTGCCTCACACCTCTTATCC
7 499
1 product 493 bp
PCR2F PCR2R
CCAATCTTGAGACAGAGTCTG ACTACCAACAACTTCTTGACAAG
377 1601
1 product 1225 bp 1225 bp
PCR3F PCR3R
GAGCATAGGACTCAAGTGTCA AGTTCACAACACAGCAGCACA
1510 1840
3 producten 351 bp + pseudogenen : 350 en 389
PCR programma 2: aanhechtingstemperatuur 58°C en 60°C
Alle drie de PCR’s verlopen aspecifiek, waarbij de gewenste groottes van fragmenten niet aanwezig zijn.
PCR programma 2: aanhechtingstemperatuur 62°C en 64°C
Idem als bij aanhechtingstemperatuur 58°C en 60°C. Hierbij valt wel op dat PCR duidelijk minder goed doorgaat.
PCR programma 1: gradiënt 50°C-70°C
De amplificatie voor alle drie de fragmenten is slechts heel licht doorgegaan. Hoewel er fragmenten van de correcte grootte werden geamplificeerd zullen we deze gradiënt PCR eerst uitvoeren met gebruik van PCR programma 2.
Programma 2: gradiënt 45°C-69°C
CHEK2 PCR1 geeft een specifiek fragment van de correcte grootte in laan 12, deze laan komt overeen met een aanhechtingstemperatuur van 68°C. Dit programma en de aanhechtingstemperatuur van 68°C zal weerhouden worden voor de amplificatie van dit fragment Bij de uitgevoerde gradiënt PCR voor CHEK2 PCR2 levert slechts enkel aspecifieke amplificatie op. In een volgende fase zal deze gradiënt uitgevoerd worden met een mastermix waaraan 5% DMSO aan toegevoegd werd. CHEK2 PCR3 geeft na PCR een specifiek fragment in laan 11, hoewel hierbij nog een ander fragment geamplificeerd wordt (lichter bandje), is het gewenste fragment sterker geamplificeerd. Programma 2 met een aanhechtingstemperatuur van 65°C zal gebruikt worden bij de amplificatie van dit fragment.
PCR programma 2: gradiënt PCR 45-69°C; mastermix met 5% DMSO
Specifieke amplificatie van CHEK2 PCR2 stelt men vast in laan 9 bij een aanhechtingstemperatuur van 65°C. Voor amplificatie van dit fragment zal PCR
programma 2 gebruikt worden met een aanhechtingstemperatuur van 65°C. Aan de mastermix zal voor amplificatie van dit fragment 5% DMSO toegevoegd worden.
BIJLAGE 9: Overzicht predicties Alamut
Resultaat Alamut predictie op splicing voor c.517G>C (links) en c.7618-6G>T (rechts). Alamut voorspeld een lichte daling in de sterkte van de acceptor splice site voor de c.517G>C, terwijl de acceptor splice site versterkt zou worden door de aanwezigheid van de c.7618-6G>T variant.
In silico predictie voor c.3326C>T variant. Een nieuwe donor splice site wordt voorspeld voor de c.3326C>T variant (aangeduid door de blauwe balken).
Predictie voor de c.681+111C>G variant. SpliceSiteFinder-Like en NNSPLICE voorspellen een nieuwe acceptor splice site op de positie van de variant, terwijl MaxEntScan en Human Splicing Finder een lichte versterking geven aan de mogelijk aanwezige acceptor splice site (Figuur rechts). De eerstvolgende donor splice site wordt voorspeld op positie c.681+390 (figuur rechts)
BIJLAGE 10: Alamut donor- en acceptor splice predicties
Predictie c.671-2A>G. Verscheidene in silico predictie tools voorspellen het verlies van de acceptor splice site op positie c.671.
Acceptor splice site gelegen op positie c.594.
Acceptor splice site aanwezig op positie c.3881 (zwak!) en c.3897.
Voorspelde donor splice site na positie 787.
