o
!
Niet meer na een DNA-analyse!
Eveline Schaeffer – Kandinsky College Nijmegen Iris Bakker – Kandinsky College Nijmegen Roos Vincken en Inge Verheul – Kandinsky College Nijmegen Hienke Sminia – Netherlands Bioinformatics Centre & Leve DNA!
Inhoud van de workshop Lezing: (25 min) Van genomics naar metagenomics De techniek achter metagenomics
Aan de slag met publieke metagenomen (25 min) Leerlingproject: Waalwater PWS (30 min) Wrap-up (10 min)
Genomics? Verbetering DNA-technieken + Toename rekenkracht van computers = DNA-onderzoek aan populaties en het hele genoom ipv. individuele organismen en specifieke stukjes DNA http://www.youtube.com/watch?v=mmgIClg0Y1k
Genomics is • Holistisch: onderzoek naar het hele genoom in relatie tot het organisme en de omgeving • High throughput: grote hoeveelheden data worden in relatief kort tijdsbestek gegenereerd • Onderzoek vanuit data: in tegenstelling tot ‘traditioneel onderzoek’ waarbij wordt uitgegaan van een hypothese
Genomics Metagenomics
versus
Genoom van een organisme of populatie
Genoom van een ‘omgeving’
Domein Rijk
Voorbeeld 1: Sargasso Zee Lente 2004: J. Craig Venter gebruikt zeewater om microbiële genomen van het zeewater te bestuderen.
Afdeling / Stam Klasse Orde
Familie Tak Geslacht Sectie
1,2 miljoen genen gevonden Waarvan 70,000 compleet nieuwe genen Van, naar verwachting, zo’n 1800 soorten Inclusief 148 nieuwe bacteriële fylogenetische groepen
Reeks
Soort Ondersoort Varieteit Vorm
2: Onderzoek aan Mammoeten: Paleo-omgevingen • Herconstrueren is nuttig om: – Begrijpen van de dynamiek van ecosysteemveranderingen – Het herconstrueren van ecosystemen voor de industralisatie – Belangrijk voor publieke en politieke keuzes in conservatiebiologie
Wat heeft Naturalis/NBIC gedaan • Onderzoek aan uitwerpselen en maaginhoud van gevonden mammoeten • 3 vindplaatsen – Yukagir : Maag en darmen – Lyuba : Jong, maar eten uitwerpselen ouderen > in maag – Cape Blossom: Uitwerpselen
Resultaten • Plantenfamilies geindentificeerd, sommigen tot op genus • Yukagir: 8 • Cape Blossom: 12 • Lyuba: 7
• Gevonden planten ondersteunen hypothese van mammoet steppe omgeving • Extra: mammoeten lijken coprofagen te zijn
Hoe krijg je data? Extraheren DNA Kopiëren 16S rRNA met PCR
16S rRNA Subunit van het bacteriële ribosoom
Rood: hoog variabele regio’s
1540 nucleotides Wordt veel gebruik in evolutionair onderzoek Geconserveerde regio’s: Makkelijk om primers op te ontwerpen
Hypervariabele regio’s: Soortonderscheidend
Groen: hoog geconserveerde regio’s
Hoe krijg je data? Extraheren DNA Kopiëren 16S rRNA met PCR
Lezen DNA met Sequencer
Sequencen
Sanger sequencing Tot ±2005 Gebruikt bij HUGO 3 miljard dollar en 13 jaar om het menselijk genoom te lezen.
Sequencen
Sequencen 2012 Maximaal afleesbare lengte: 200bp Betrouwbaarheid: 98% Duur ‘run’: 2 uur Aantal bp per run: ±1 miljard Kosten: $1 per miljoen basen Techniek: Chip leest vrijkomen elektrische lading bij binding base
Hoe krijg je data? Extraheren DNA Kopiëren 16S rRNA met PCR
Lezen DNA met Sequencer
Hoe krijg je data? >T0UG1:4:281 TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGCCGTGTCTCAGTCCAGT GTGCTGATCATCGTCCCGAAATTTGGTTAAACCCCCAAAGG GCCTAACCAGCTATGATCACGCTGTAAGCTACTGCCTCACA ACTGCTATCAGACGCGAGCCTCCTGGCGGATTCCTCTTGC TCCAGACTGCGTACGGGTATTAGCAGCCGTTCCACTGTGTC CCTACCACGACAGTCTCGCGTTATACGTCCGCCATGCAAC C >T0UG1:5:36 TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCA AATGTGGACCGGTCACCCCTCTAGCAAGGCCCGGATACCT AACCCCGGTACGCTAAAAAGCCCATTTGGATTAAAAGCCCA ACTACCCCAACCAAACAAACGCCTGAAATAAACGGACCGTC CGAAAGATCCAATTC >T0UG1:5:208 TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCGGACCGTGTCTCAGTTCCAG TGTGCTGATCATTCTCCTCGACAGCTATGATCATCCGCTTG GTAAGCTACTTTGGCCTTCCACCAACTTAGCTAATCAGATC CGCAGGTAGCCCACCTCGGGTCGGTTTCCTCGTTTGCCTA CCTCGACATCAGTTAGG >T0UG1:11:250 TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTCGTCCTACAGTC CCAAGTTGTGGCCTCGTAACGTCACTCGCCTCCGCAACCT AGCTAAACTGACACGCTCGAACGCCTACTTGGCCGATCCA CCTACTTAGCCTAACTCAGACGCGGATCTCCTGGCGTTC
13.917 reads
Soorten-analyse Denk aan: Welke bacteriën zorgen voor de smaak van kaas? Wat is de biodiversiteit van een onbewoond eiland? Komt in deze rivier een schadelijke bacterie voor?
PCR-stap bepaalt uitkomst Extraheren DNA Kopiëren 16S rRNA met PCR
Lezen RNA met Sequencer
PCR-stap bepaalt uitkomst Kopiëren 16S rRNA met PCR
Kopiëren al het DNA met PCR
of Voordeel: relatief goedkoop Nadeel: alleen soortenanalyse
Voordeel: functie-analyse mogelijk Nadeel: relatief duur
Functie-analyse Denk aan: Voorkomen van functies in een zoet water biotoop versus zout water biotoop Zijn bepaalde functies afwezig in een vervuild milieu? Zijn er genen waarvan we niet wisten dat bacteriën die ook hadden?
Zelf data bekijken • Start Firefox op • Ga naar: http://metagenomics.anl.gov • Log in: hienke password: levedna2013 • Klik op de wereldbol rechtsbovenin (duurt lang!)
Leerlingenproject: Waalwater
Leerlingproject: Waalwater • “iets met bioinformatica” • “een proefje doen”…
• Deze projecten waren niet haalbaar
Leerlingenproject: Waalwater vervuiling van de rivier (riool overstroming, vee, industrie) Onderzoek naar de aanwezigheid van bepaalde bacterien die met vervuiling te maken hebben. Leerlingen hebben op 3 momenten monsters genomen in de waal op 3 verschillende plaatsen
In het Waalwater kijken Dag, locatie, monsternummer
049 050 051 052 053 054 057 059 060
monster 111 monster 112 monster 121 monster 122 monster 131 monster 132 monster 221 monster 231 monster 232
Er zijn twee monsters per locatie per dag genomen Data: Dag 1 28 juni 2012 Dag 2 5 september 2012 (Dag 3 22 oktober 2012)
Metagenomen vergelijken Klik op de wereldbol rechtsbovenin. Klik dan op het getal achter ‘Available for analysis’
Selecteer één van de Waalwatersamples door op de code (bijv. 060_greater200) te klikken Klik op Analyze (bovenaan de pagina)
Metagenomen vergelijken Klik op het plusje achter ‘Metagenomes’. Selecteer de gewenste metagenomen (049 t/m 060 muv 052) door ze met de pijltjes-knop in het rechtervlak te zetten.
Metagenomen vergelijken Klik op het plusje achter ‘Annotation sources’. Selecteer ‘Greengenes’ en klik op ok. (Greengenes is een 16s rRNA-databank)
Selecteer
en klik dan op ‘generate’. (vergeet niet de values op ‘raw’ te zetten!)
Het genereren van de grafieken kan even duren…
Zoek eens naar … 1. Kies een bacterie uit 2. Wat doet deze bacterie? http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/MicrobeWiki
3. Komt de bacterie voor in het Waalwater? 4. Hoe kan dit in het sample zitten en/of wat is het gevolg voor het Waalwater? Citrobacter freundii Deinococcus radiodurans Prochlorococcus marinus
Staphylococcus epidermidis Legionella pneumophila (Synechococcus elongatus )
Wrap-up Metagenomics: onderzoek naar het genoom van een omgeving Online analyse: publieke metagenomen en analyse staan online en zijn voor iedereen (dus ook voor leerlingen) toegankelijk Lesmateriaal: laat je emailadres achter om het te ontvangen
Publieke metagenomen Klik bijvoorbeeld op het bovenste ‘public’ metagenoom: CA_05_4.6 Dit metagenoom valt binnen een groter project The oral metagenome in health and disease Het is een Spaans onderzoek. Bij Project Information vind je: Onderzoek naar bacteriële genomen in de mond (en de functies van aangetroffen bacteriële genen). Vergelijking metagenoom van mensen mét en zonder cariës (tandbederf)
Publieke metagenomen Klik helemaal onderaan de pagina op [show] bij Metadata Klik vervolgens op ‘last’ onderaan de tabel. Hier vind je: De data afkomstig van een 42-jarige man die 24 uur geleden zijn tanden heeft gepoetst Hij heeft last van tandbederf Humane DNA-sequenties zijn niet meegenomen in de analyse Bij Functional Category Hits Distribution staan taartdiagrammen die inzicht geven in de verschillende gen-functies Bij Taxonomic Hits Distribution staan taartdiagrammen die inzicht geven in de voorkomende soorten
Publieke metagenomen
Bron: wikipedia
Hoeveel procent van het monster is Streptococcus? 4,2%
Nederlands
Engels
Domein
Domain
Rijk
Kingdom
Afdeling / Stam
Division Phylum
Klasse
Class
Orde
Order
Familie
Family
Tak
Tribe
Geslacht
Genus
Sectie
Section
Reeks
Series
Soort
Species
Ondersoort
Subspecies
Varieteit
Variety
Vorm
Form
Publieke metagenomen Hoeveel hiervan is Streptococcus mutans? Scroll naar boven en klik op ‘analyze’
1
Klik vervolgens op ‘barchart’ En dan op ‘generate’. Zet de ‘values’ op ‘raw’ (ipv normalized) om percentages te krijgen.
2 3
Publieke metagenomen Klik steeds op de juiste taxonomische onderverdeling:
Bron: wikipedia
Hoeveel hiervan is Streptococcus mutans? 3,05% van Streptococcus van 4,2% van het totaal Dus: 0,1281% van het totale monster Hoeveel soorten zijn er in totaal bij deze 42-jarige man in de mond aangetroffen? 1655 soorten
Publieke metagenomen Bij een gezond persoon ziet de pagina er zo uit:
Welk aandeel heeft Streptococcus mutans hier? 1,20% van 20,1% van het totaal Dus: 0,2412% van het totale monster
Metagenome NameNOCA_01P
Publieke metagenomen Cariës
versus
Aanwezigheid S. mutans 0,1281%
gezond gebit
Aanwezigheid S. mutans 0,2412%
Publieke metagenomen The oral metagenome in health and disease Pedro Belda-Ferre, Luis David Alcaraz, Raúl Cabrera-Rubio, Héctor Romero, Aurea Simón-Soro, Miguel Pignatelli, and Alex Mira ISME J. 2012 January; 6(1): 46–56. Published online 2011 June 30. doi: 10.1038/ismej.2011.85 PubMed 21716308
“These data show that cavities are not dominated by Streptococcus mutans (the species originally identified as the ethiological agent of dental caries) but are in fact a complex community formed by tens of bacterial species, in agreement with the view that caries is a polymicrobial disease.” Pilot-onderzoek (kleinschalig), dus populatieonderzoek is nodig om bovenstaande trend te bewijzen. Geeft wel inzicht in het zoeken naar medicijn: Op zoek naar bacteriën die veelvuldig voorkomen bij mensen zonder cariës, en weinig bij mensen met cariës.
