Partnerské fórum č. 2 - Preklinické PREKLINICKÉ HODNOCENÍ LÉČIV hodnocení léčiv Králové, 5.2.2014 Hradec Brno, 7.6.2013
Typy preklinických studií MediTox s.r.o. - Praktické zkušenosti Martin Šlais Ph.D. RNDr. IvanaMgr. Šurová
• Léčiva, biopreparáty, prostředky zdravotnické techniky, doplňky stravy • Testovací systémy (in vitro, ex vivo, in vivo) • Genotoxicita, imunotoxicita, bezpečnostní farmakologie, studie akutní, subchronické/chronické toxicity, reprodukční a vývojová toxikologie, karcinogenita, neurotoxicita, ADME, PK/TK • Alternativní metody v preklinické toxikologii
Cíle preklinického testování •
Identifikace cílových orgánů a efekty testované látky v cílových orgánech
•
Vztah mezi dávkou a odpovědí
•
Reverzibilita nepříznivých efektů
•
Stanovení „human safe starting dose“
•
Identifikace důležitých parametrů pro monitoring v následných klinických studiích
Genotoxicita
Akutní toxicita
ADME a TK
Sub/chronické toxicita
Lokální tolerance
Karcinogenita Reprodukční a vývojová toxicita
Strategie preklinického zkoušení
Léčiva
Zdravotnické prostředky
Biopreparáty
Potravní doplňky
Testovací systémy In silico In vitro Ex vivo In vivo
Testovací systémy In silico QSAR, PBKM, neuronální sítě… Základní výzkum - odhad toxicity a kinetiky látek (hlavně chemické látky REACH) Neexistuje validace pro léčiva Komerční software • MULTICASE • DEREK • PALLAS • TOPKAT • BIOWIN
Testovací systémy In vitro/ex vivo Buněčné a tkáňové kultury Progresivní obor – základní výzkum (GM kvasinky, hepatocyty, linie nádor. buněk, kmenové buňky…) Preklinické testování - validované modely Lymfocyty, fibroblasty Keratinocyty Myší lymfom L5178Y/Tk+/Savčí buňky (V79, AS52…) Bakterie, kvasinky (Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Saccharomyces) 3D modely lidské epidermis (Epiderm, Episkin, SkinEthics) Ex vivo cornea, epidermis Vajíčka (HET-CAM)
Testovací systémy In vivo Laboratorní zvířata Hlodavec • Myš domácí, Mus musculus (Balb/c, DBA ..) • Křeček syrský, Mesocricetus auratus • Potkan obecný, Rattus norvegicus (Wistar, SD…) • Morče domácí, Cavia aperea (albino) Nehlodavec • Králík domácí, Oryctolagus cuniculus (NZW) • Fretka obecná, Mustellus putorius • Kočka domácí Felis catus • Pes domácíCanis familiaris (Beagle) • Prase domácí Sus Scrofa (minipig) • Primáti (makak rhesus) + další (drosophila, pískomil,drápatky, ryby, ptáci…
Standardizace Outbrední Inbrední Transgenní SPF Ustájení
Testovací systémy Limity biologických systémů • Aplikovatelnost výsledků na člověka je omezená • U in vitro metody chybí zcela vliv imunitního systému • Mezidruhové rozdíly v absorpci, distribuci, metabolismu a exkreci • Mezidruhové rozdíly v reakci imunitního systému • Rozdílné zastoupení receptorů FDA Guidance for Industry, Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers Dose translation from animal to human studies revisited (the FASEB journal 07-9574 LSF) • Konverze výsledků toxicity mezi zvířecími druhy a člověkem
Testovací systémy Aplikace a aplikační formy Jak a čím dostat testované léčivo do testovacího systému? Způsoby aplikace Per os, p.o. (kapsle, tablety, sonda) Intravenózně, i.v. (bolus, infůze, ocasní žíly, v. jugularis, v. saphena) Intramuskulárně, i.m. Intraperitoneálně, i.p. Subkutánně, s.c. Intradermálně Topicky Intrathekálně, i.t. Intraduodenálně Inhalačně Rektálně…
Testovací systémy Aplikace a aplikační formy Co je cílový orgán/tkáň/receptor? • Krevní oběh • CNS (hematoencefalická bariera) • Specifická tkáň Jak je veliká molekula testované látky? • Small molecules • Protein, peptid • Biologická léčiva • Kmenové buňky
Testovací systémy Aplikace a aplikační formy Jaká je biologická dostupnost / rozpustnost testované látky? • Ty nejůčinnější látky jsou nerozpustné • Nízká dostupnost, nebo rozpustnost > velké aplikační objemy, toxicita Maximální aplikovatelný objem • druh zvířete • Potkan: p.o. 2-5ml/100g, i.v. 0,5ml/100g, i.p. 2ml/100g
Vehiculum • Netoxické • Rozpouštědlo u roztoků • Homogenita u suspenzí a emulzí • VFI, fyz. roztok, PBS, glukóza, methylcelulóza, oleje, ethanol, PEG, DMSO, DMF
Studie genotoxicity AMES – Bacterial Reverse Mutation Test (1975) Detekuje bodové mutace, které navrací zpět mutace přítomné v testovacích kmenech Salmonella typhimurium a Escherichia coli a obnovuje jejich schopnost syntetizovat esenciální aminokyseliny (histidin, tryptofan), detekovatelné růstem kultur v minimálním mediu. 4 kmeny Salmonella +1 kmen E.coli • Expozice kultur 5 koncentracím testované látky (+ kontrola, + MAS) 48-72h • Počty kolonií úměrné mutagennímu působení
Studie genotoxicity Micronucleus Test in vitro Detekuje poškození chromozómů nebo mitotického aparátu (klastogenní a aneugenní) lymfocytů indukované testovanou látkou. Mutagenní účinnek se projevuje zvýšením frekvence výskytu mikrojader v dělících se buňkách, u kterých vlivem blokátoru (cytochalasin B) nebyla dokončena cytokineze Testovací systém: lidské lymfocyty • Kultivace lymfocytů 48h • Expozice lymfocytů testované látce 4h • Blokace cytokineze, inkubace 26h • Fixace, barvení, počítání mikrojader
Studie genotoxicity Test Chromosomálních aberací Identifikace látek indukujících strukturální (chromosomální či chromatidové) aberace chromosomů v kultuře savčích buněk. Test systém: linie savčích buněk (lidské lymfocyty, křeččí fibroblasty aj.) • Inkubace buněk ve třech koncentracích testované látky (+ poz. a neg. kontrola, +MAS) po dobu 1,5 buněčného cyklu (3-6h) • Blokace metafáze (kolchicin) • Fixace, barvení, mikroskopické hodnocení poškození
Studie genotoxicity Mouse Lymphoma Assay Detekce bodových mutací i chromozomálních mutací (delece, mitotické rekombinace, aneuploidie) v kultuře buněk myšího lymfomu. Mutagenní působení testované látky způsobí nemožnost produkce thymidinkinázy > buňky s mutací rostou v mediu s TFT Test systém: buňky myšího lymfomu L5178Y/Tk+/• Kultivace buněk 7d • Expozice testovanou látkou ve 4 koncentracích (+ poz. a neg. kontrola, +MAS) 4h • Inkubace s TFT 11-13d • Hodnocení kolonií mutantů
Studie Imunotoxicity Dosud není komplexní in vivo/in vitro studie pro hodnocení imunotoxicity. Několik in vitro testů je v průběhu validace (IL18, Keratinosense, T-cell activation, h-CLAT) • Hodnocení imunomarkerů (ATB, CD4+/CD8+, IL, KC) součástí jiných studií toxicity Hypersensitivita in vivo • GPMT • Buehler method • LLNA
Studie Imunotoxicity GPMT, Buehler method Identifikace kontaktních alergenů. Testovací zvíře je vystaveno opakované expozici – indukci alergenem (topické, intradermální). Po vyvinutí imunitní reakce je provedena provokace a hodnoceny dermální projevy Testovací systém: morče domácí (albino), 20 testovaných, 10 kontrolních
LLNA (Local Lymph Node Assay) Identifikace kontaktních alergenů. • Testovací systém: myš, 12-20 ks • jednorázové expozice – indukce alergenem. • Odběr uzlin • Hodnocení proliferace lymfocytů (radioaktiv., ELISA, Luminiscence)
Krátkodobé toxicity Bezpečnostní farmakologie Hodnotí základní farmakodynamické vlastnosti testované látky a její vliv na základní vitální funkce (kardiovaskulární a respirační systém) • Testovací systém: pes, primáti, • 3 skupiny zvířat (kontrolní, nízká a vysoká dávka), 3M+3F/sk. • Aplikace dle terapeutického použití, jednorázová / opakovaná • Hodnocení krevního tlaku, tepové frekvence, EKG, srdečního rytmu, dechové frekvence
Krátkodobé toxicity Akutní toxicita Hodnotí toxicitu látky po jednorázovém podání. Podklad pro RD Toxicity LD50 vyškrtnuta, MTD, Up and Down, Fixed dose, Acute toxic class method MTD (maximální tolerovaná dávka) Aplikace stupňujících se dávek až do projevení toxických efektů • Testovací systém: myš, potkan, pes, primáti… • 1 - 5 skupin zvířat, 3M+3F/sk. • Aplikace dle terapeutického použití, perioda pozorování 2 – 3 dny • Klinické pozorování, D14 Gross necropsy • Stanovení MTD
Sub/chronické toxicity Hodnotí komplexní toxicitní profil testované látky po x-denním opakovaném podání • 28d/90d zásadní toxikologická studie, LOAEL, NOAEL, SSD, pro prekliniku 2 druhy (hlodavec, nehlodavec) • Délka 7, 14, 28, 90, 180 dnů • Testovací systém: myš, potkan, králík, pes, opice… • 4 skupiny - kontrolní, 3 dávkové, 3-20M, F/sk. • Aplikace dle terapeutického použití (i.v., p.o., i.p.), denně/intervaly • Hodnocení: klinický stav, BW, FC, HEM, BCH, URI, PAT, neurobehavioralní změny • Recovery, TK,
Reprodukční a vývojová toxikologie Hodnotí vliv testované látky na reprodukční orgány a prvotní vývoj organismu • Testovací systém: potkan, (králík) • Vychází z výsledků RD Toxicity, design a vyšetření podobná
Fertilita
Embryo-fetal toxicita
Před repr. > implantaci
Implantace > uzavření tvrdého patra
Maturace gamet Sexuální chování Fertilita Preimplantační stádia embrya
Embryofetální mortalita Zvýš. tox. gravidních Růstové změny Strukturální změny
Pre/postnatalní vývojová toxicita Implantace > odstav, (F1) Pre/postnatální mortalita potomků Vývojové změny Funkční změny u potomků, maturace
Karcinogenita Hodnotí karcinogenní potenciál testované látky v průběhu života organismu • Pokud je látka podezřelá z mutagenity (genotoxicita, RD toxicita) • Pokud je terapeutické použití delší než 6 měsíců • Testovací systém: myš, potkan • Doba trvání: myš 18M, potkan 24M • Aplikace dle terapeutického použití • 3 dávkové + kontrolní skupina, 50m+50F/Sk. • Hodnocení jako u RD Toxicity, specifická histopatologie
Lokální tolerance Hodnotí lokální toleranci tkání na testovanou látku v místě aplikace • Testovací systém:králík Oční iritace APLIKACE
Dermální iritace
Intravenózní tolerance
Intramuskulární tolerance
• Hodnocení subjektivní • erytém/edém, poškození oka… • Histologie
ADME, Toxikokinetika (TK), Biodistribuce Hodnotí kinetické parametry testované látky v krevním oběhu, její metabolismus, exkreci či distribuci v tkáních • Obvykle součást AT, RD Toxicity • Aplikace testované látky • Odběry krve (moče) ve zvolených intrvalech (0, 15m, 30m, 1h, 2h, 4h, 8h, 24h) • Odběry tkání pro biodistribuci • Analýza vzorku (analytická laboratoř) • Hodnocení TK parametrů (Cmax, Tmax, T½, AUC…)
Alternativní metody v preklinické toxikologii Reduce
3R Princip (Russell&Burch, 1959)
Refine Replace
ECVAM, ICCVAM, ZEBET - validace metod Zaměřeno hlavně chemické látky, v preklinice použití omezené Metody: • MNT in vitro • LLNA • ICE, BCOP • Epiderm, Episkin tests • LAL • Up and Down
Thank you for attention MediTox s.r.o. Pod Zamkem 279, 281 25 Konarovice, Czech Republic Tel: +420 313 129 374 E-mail:
[email protected]
