Samenvatting Milieuverontreiniging door chloorverbindingenis de laatste decennia veel in het nieuws geweest.Een voorbeeld is 1,2-dichloorethaan,afgekort DCE. DCE wordt door de chemischeindustrie op grote schaalgemaakt, met name als tussenproduktbij de synthese van vinylchloride, waar PVC van gemaakt wordt. Verder wordt DCE gebruikt als oplosmiddelin de chemischeen farmaceutische industrie. Uiteindelijk komt een deel in het milieu terecht waar het bodem- en grondwaterverontreinigingveroorzaakt. Ondankshet giftige karakter van DCE zijn er bacteriënte vinden die het afbreken en het omzetten naar ongev&rlijke stoffen. Sommige zijn zelfs in staat om erop te groeien, zonder andere groeistoffen. Uit vroeger onderzoekbleek dat deze bacteriën een eiwit produceren dat DCE en soortgelijke gechloreerdekoolwaterstoffen met water kan laten reageren tot een betrekkelijk ongevaarlijkealcohol en chloride ionen. Het eiwit is naar zijn biochemische activiteit haloalkaan dehalogenasegenoemd: alkanen zijn een bepaald soort koolwaterstoffen, halo betekentdat die stoffen gechloreerd of gebromeerd zijn, en dehalogenasebetekentdat het eiwit een enzym is dat decl,loreert, dat wil ze1gen dat het chloor (of broom-) atomen (halo) van koolwaterstoffenaÍhaalt en ze omzet in chloride (of bromide)ionen. Het reactiemechanisme van haloalkaan dehalogenase Eén manier om chloorverbindingenonschadelijk te maken is het chloor eraf te laten splitsen door water, ofwel hydrolyse. Zonder enzym wordt DCE nauwelijks door water gesplitst.Het enzym versneltdezereactiedoor het DCE sterk te binden en door de in omzetting twee stappen te laten verlopen. Eerst wordt het chloor als het ware van DCE af getrokken, waarbij de rest van het DCE molecuul aan het enzym vast gebonden wordt (Fig. l, stap l). Vervolgens splitst een watermolecuul dit tussenprodukt, dat ook wel intermediair heet, waarbij de alcohol vrij komt (Fig. 1, stap 2). FIG l. Reactiemechanisme van haloalkaan dehalogenase.In stap 1 reageertaspartaat124 met DCE. Hierbij wordt een DCE-enzym tussenprodukt gevormd, terwijl het chloor wordt afgesplitst en tussen de tryptofanen (Irp) terecht komt. In stap 2 wordt het tussenprodukt door water gesplitst, en komt een alcohol en een proton (H*, zuur deeltje) vrij. Het water wordt hiertoe aangezeÍdoor histidine 289. De pijltjes geven de bewegingen aan van elektronen, de geladen deeltjes, die zorgen voor de verbindingen tussen de DCE, het water, en het enzym. Aspl24 en His289 zijn aminozuren die voor de versnellins van de reactiezorgen.
104
Y
rní75
aY
Stap 1
r..-,iN
DCE
cr H Xr^
- c Hr ct-""r\ocu"..i
'o'o
o
o HN luro
r/A'/ / )\ Asp260
./ His289
)
Aso124
Y TrPtzs ;-f ( )t.)) t:7-Ylr
Stap 2 ^, ./cHor vr
b
W
í
-
\^u
cl
ojl_o _. o xH i'to--í-fH
\l Y -\ | Hit289 Asp260
AsD124
SamenvoÍting
blo -lÍípl25
FIG 2. I energie prol reactie van zonder hal halogenase. zorgt ervooÍ energie die t het afsplitser verminderdr reactie in tw laten verlope stappen zijn Fig. I en in r
Hierna kan dehalogena splitsen. Dew is voor heta zeer veel en wordt verlaa van Prof. Dr dat bestaat aminozuren koolstofbin DCE. Aspa verwijdering splitsingvan in het enzyn
Het doel v: Het < reactiegoed Wat gebeur activiteit var lastig afbre sprekendan Om< zorgt dat de DNA besta aminozuren
rcl in het It door de l synthese bruikt als :n deel in t afbreken n erop te teriën een water kan Í eiwit is zijn een :bromeerd v1l zeggen omzet in
rr eraf te lijks door ,n door de
p175
,ir-l\
VV _À
Trpl25
,ïr-^ arlt-f -l-
Típ125
energlenodlgzonder --haloalkaan dehdoganaso FIG 2. Schematische energie profielen van de reactie van DCE met en zonder haloalkaan de halogenase. Het enzym zorgt ervoor dat de vele energie die nodig is voor het afsplitsen van chloor verminderd wordt door de reactie in twee stappen te laten verlopen. De twee stappen zijn verklaard in Fig. I en in de tekst.
ï en€rgle
'-
I'i Slap 1
energlenodlgmet haloalkaandehdog€naso Prcdukbn
Stap
Hierna kan het enzym weer met een ander DCE molecuul aan de slag. Haloalkaan dehalogenasekan op deze manier per secondeca. 5 maal een chloor-koolstof binding splitsen. De werking van het enzym berustop verlagingvan de hoeveelheidenergiedie nodig is voor het afsplitsenvan chloor. Zonder chloor is DCE zeer stabiel,omdat voor de splitsing zeer venl energie nodig is (zie de hoge piek bij Fig. 2). De hoeveelheidbenodigdeenergie wordt verlaagd door binding van DCE aan het enzym. Dankzij het onderzoekvan de groep van Prof. Dr. B.W. Dijkstra van de vakgroepBiofysischeChemiewetenwe hoe het enzym, dat bestaat uit een keten van 310 deeltjes, aminozuren genaamd, is opgevouwen. Vier aminozurenspeleneen belangrijke rol bij de binding van DCE en de splitsing van chloorkoolstof bindingen: de tryptofanen(Trp125 en Trp175 in Fig. 1) trekkenaan het chloor van DCE. Aspartaat 124 (Aspl24 in Fig. l) zorgt voor de eerste stap: binding van DCE en verwijdering van het chloor. Histidine 289 (His289 in Fig. 1) zorgt voor de tweedestap, de splitsing van het tussenprodukt.De preciezemanierwaaropdezeaminozurenbij elkaar staan in het enzym is te zien in Fig. 3. Het doel Yan het onderzoek Het doel van het promotieonderzoekwas om de rol vu dezevier aminozurenin de reactiegoed te bestuderen.Zijn dezeaminozurenessentieelvoor éénofvoor beide stappen? Wat gebeurt er als deze aminozurenveranderdworden? Dit willen we weten opdat we de kunnenveranderen:misschienkunnenzo andereheel activiteit van haloalkaandehalogenase lastig afbreekbareverbindingen ook door haloalkaandehalogenasegesplitst worden. We 'protein sprekendan van engineering'. Om de aminozurente veranderenhebje het erfelijk materiaal,DNA, nodig dat ervoor zorgt dat de bacterie, die kan groeien op DCE, haloalkaandehalogenasekan maken. Dit DNA bestaatuit allemaal letters. Door gericht de letters te veranderen,veranderje ook de aminozurenin haloalkaandehalogenase. SamenvoÍting
r05
FIG 3. Stereoplaatjevan de'active site' van haloalkaandehalogenase. Stereo-kijkenkan door de figuur zo'n 20 à 30 cm van de ogen af te houden en te concentrerenop iets wat zich achter de figuur bevindt. De twee figuren vallen dan samen, en er treedt na enige tijd dieptewerking op. In een holte in het enzymbindt DCE (hier niet afgebeeld,wel in Fig. 1). Aspartaat124 reageertdaarna met een koolstofatoom van dit molecuul. Er splitst dan een chloride-ion afdat gebondenwordt door de tryptofanen 125 en 175. Het tussenproduktwordt dan gesplitst door het water molekuul (Wa|, dat hiertoe gestimuleerd wordt door histidine 289. Zo komt dan een alcohol vrii en een H* deeltie.
Hoofdstuk 2 beschrijft het isoleren van het DNA van haloalkaan dehalogenase. Verder staat in dit hoofdstuk beschrevenhoeveel haloalkaandehalogenasedoor andere bacteriën wordt gemaakt, nadat het geïsoleerdeDNA (haloalkaandehalogenasegen, dhlA) in dezebacteriënis gebracht.Het erfelijk materiaaldat direct vóór dit stukje DNA ligt bleek belangrijk te zijn voor de hoge produktie in anderebacteriën.Dit stukje DNA noemenwe gen. Verder bleek dat er waarschijnlijk nog een de promoter van het haloalkaandehalogenase ander, onbekendeiwit gemaaktwordt. Hoofdstuk 3 gaat over de rol van aspartaat124 (zie Fig. 1) in de omzetting van gehalogeneerdesubstraatmoleculen door het enzym nÍrarprodukt. Dit aminozuur is negatief geladen. Vervanging van dit aminozuur door een neutraal aminozuur b{kt te leiden tot inactivering van het haloalkaan dehalogenase. Ook is de reactie uitgevoerdin aanwezigheidvan water met zuurstofatomendie een atomaire massa van 18 in plaats van 16 hebben. Omdat de reactie van haloalkaan dehalogenaseeen hydrolyse is, kan verwachtworden dat dit zware zuurstofatoomook in het produkt, dat wil zeggen de alcohol, terecht komt. Dit is aangetoondmet behulp van massaspectrometrie, waarmeede massavan zeerkleine hoeveelheden stoffenvastgesteldkan worden. Tevensblekende zwarezuurstofatomeninderdaadin aspartaat124 tere*,htte komen. Dit betekentdat de zuurstof van het water via het enzym wordt doorgegevenaan de alcohol.
l0ó
Samenvatting
De alcoholm vele anderee Hoofd Vervanging l opnieuw te le Er ontstonde reactie aanwe conclusie:vor groot belang, essentieel.Hi dat de alcohc watermolecu tussenstap I Hoofd Uit onderzoe gevondendat Veranderingr van afgesplit van het oorsp In dit l zwÍutr water zuurstofatoo tryptofanenb chloor af te s reactievan he voor de snelh In hoo asparagine.D meer met DC DCE kan op ontbreekt. Ti activiteit aan oorspronkelij aanvalt.In dit worden omge Ditis aminozuur12 dat direct na na een paar ( omzetting var gewoonlijk ni dat bij histidi In hoc die op een he van het dehal afbreken.De: chloorhexaan waar DCE gr
ndoor rchter eÍking at 124 af dat )orhet m een
ogenase. r andere n, dhlA) igt bleek )menwe nog een ting van negatief ridentot die een loalkaan rk in het ulp van eld kan komen. rlcohol.
De alcoholmoleculenkrijgen dus niet het zuurstofatoomrechtstreeksvan het water, wat bij vele andereenzymenwel gebeurt. Hoofdstuk 4 beschrijft de rol van aminozuur 289 (zie Fig. 1), een histidine. Vervanging van dit aminozuur door een glutamine, dat geen water kan activeren, bleek opnieuw te leiden tot inactivatievan het enzym. Wel bleek de eerstestap nog op te treden. Er ontstondenalleen chloride-ionenen wel net zoveel als er ook enzymmolekulenin de reactie aanwezig waren. Er werden geen alcoholenafgesplitst. Dit leidde tot de volgende conclusie:voor de eerstereactiestap,waarbij het chloride-ionvrijkomt is de histidine niet van groot belang, en voor de tweedestap, waarbij de alcohol wordt vrijgemaakt, is histidine 289 essentieel.Histidine289 is dus noodzakelijkomdathet de reaktiviteitvan het watermolecuul dat de alcohol doet afsplitsen (zie ook hoofdstuk 3f verhoogt. Zonder de histidine is het watermolecuulniet actief en verloopt de tweedestapvan de reactieniet. Het enzym blijft dan tussenstap 1 en 2 steken. Hoofdstuk 5 beschrijft twee andereaminozuren,tryptofaan 125 en 175 (zie Fig. 1). Uit onderzoekaan de ruimtelijke structuurvan haloalkaandehalogenase was al door anderen gevondendaï dezetryptofanenbetrokkenwaren bij het binden van het afgesplitstechloride. Veranderingvan dezetwee tryptofanenleiddedan ook, zoalsverwacht, tot slechterebinding van afgesplitst chloor. Ook de activiteit van het veranderdeenzym was een stuk lager dan van het oorspronkelijke ('wild type') haloalkaandehalogenase. In dit hoofdstuk staanook experimentenbeschrevenmet reactiesin DrO, dat ook een zwaar water is, nu echter met een zwaarderwaterstofatoomin plaats van een zwaarder zuurstofatoom zoals in hoofdstuk 3 was gebruikt. De resultaten wezen erop dat de tryptofanen betrokken waren bij het verlagenvan hoeveelheidenergiedie nodig is om het chloor af te splitsenvan DCE, de eerstestap in Fig. 1 en 2. Ook bleek dat deze stap in de reactievan het wild type enzym niet snelheidsbepalend is. Een anderestapis dus belangrijker voor de snelheidvan het enzym. In hoofdstuk 6 is aspartaat124, het aminozuurdat DCE bindt, vervangendoor een asparagine.Dit aminozuurlijkt veel op aspartaat,maaris niet negatiefgeladen,zodat het niet meer met DCE kan reageren.De verwachtingwas nu dat het veranderdeenzym nog wel DCE kan opnemen, maar niet meer kan reageren, omdat de negatief geladen zuurstof ontbreekt. Tijdens opzuivering van het asparaginebevattendeenzym bleek echter toch activiteit aanwezig te zijn! Het vermoedenwas dat hetzelfde watermolekuul dat in het oorspronkelijkeenzym het tussenprodukt splitst (stap2 in Fig. 1) nu aminozuur I24 zelf aanvalt. In dit geval zou ammoniakworden afgesplitst,en zou de asparaginein een aspartaat worden omgezet, zodat het oorspronkelijkeenzym weer gevormd wordt. Dit is in dit hoofdstukaangetoonddoor eenfragmentvan het enzym te zuiveren waar aminozuur 124 inzit, en vervolgensde aminozuurvolgordehiervante bepalen.Het blijkt dan dat direct na zuivering meestalnog asparagineop de plaatsvan aminozuur 124 zit, en dat na een paar dagen alleen nog maar aspartaataangetoondkan worden op deze plaats. De omzetting van asparaginenaar aspar[aatvindt dus inderdaadplaats. Omdat deze omzetting gewoonlijk niet of slechtszeer langzazmoptreedt,betekentdit werr dat het watermolekuul dat bij histidine 289 is gelegenbijzonder reactief is. In hoofdstuk 7 tenslottestaanmutantenvan het haloalkaandehalogenase beschreven, die op een heel anderewijze verkregenzijn dan in de voorgaandehoofdstukken.Het DNA van het dehalogenaseis in een anderebacterie gezet,ennPseudomonas,die l-hexanol kan afbreken. Deze alcohol ontstaatwanneerhet dehalogenase l-chloorhexaansplitst. Echter, lchloorhexaankan niet door haloalkaanworden omgezetomdat het niet goed in de holte past waar DCE gebondenwordt, het is te groot. SamenvaÍting
107
Vervolgenshebbenwe de Pseu.domonas kan makenlaten groeien die het dehalogenase in flessenwaarin alleen l-chloorhexaanals groeistof aanwezigwas. Het bleek dat de bacterie zich snel kon aanpassenaande afbraakvan l-chloorhexaandoor eenveranderddehalogenase te maken. Het veranderdeenzym kon wèl l-chloorhexaansplitsen. Zo zljn er zes verschillendemutantenvan haloalkaandehalogenasegevonden. De veranderingenbleken allemaalin hetzelfdegebiedvan het enzym te hebbenplaatsgevonden, namelijk in een deel van het enzym dat als een dekselop de holte ligt waar DCE gebonden wordt. Hierdoor is enigszinsbekend geworden welke aminozurenvan invloed zijn op de voorkeur van haloalkaandehalogenase voor kleine of grote gechloreerdestoffen. Verder leek het ontstaanvan deze mutantenniet geheelwillekeurig. Er zljn precies daar veranderingen opgetreden waar al repeterendevolgordes in het DNA van het oorspronkelijke haloalkaandehalogenase aanwezigwaren. Op grond van deze volgordes en die van het veranderdeDNA worden in dit hoofdstuksuggestiesgedaanover het mechanisme dat zou leiden tot het ontstaanvan deze mutanten,en tevensover de evolutie van het wild type haloalkaan dehalogenase.Het lijkt erop dat enige grote veranderingen hebben plaatsgevondenvoordat het enzym geschiktwas om DCE om te zetten. Hoofdstuk E is de engelstaligeversievan dit hoofdstuk.Daartussenstaanaanvullende opmerkingenover experimentendie wel gedaanzijn, maar niet beschreven.Verder gaat een deel over enzymen die mogelijk evolutionair verwant zijn met haloalkaandehalogenase. Tenslotte wordt een aantal suggestiesgedaanvoor experimentendie zouden kunnen leiden tot een haloalkaandehalogenase dat eenhogereactiviteit heeft en meer stoffen kan omzetten. Daarvoor is het nodig meer te weten over aminozurendie invloed hebbenop de snelheid waarmeede reactiesverlopen, en hoe groot dezeinvloed is.
108
SamenvaÍting
