BJ (HR)

HYDRAGEL 2 IF / BJ (HR)

Ref. 4803

Masque standard / Standard mask

2016/03

HYDRAGEL 2 IF / BJ (HR) - 2016/03 Masque standard / Standard mask

ZAMÝŠLENÝ ÚČEL

Sada HYDRAGEL 2 IF / BJ (HR) je navržena pro detekci a identifikaci monoklonálních bílkovin a Bence Jonesových bílkovin, monoklonální bez lehkých řetězců kappa nebo lambda v lidském séru a moči pomocí imunofixační elektroforézy. Sady se používají ve spojení s poloautomatickým přístrojem HYDRASYS pro elektroforézu. Bílkoviny oddělené elektroforeticky na alkalicky pufrovaných (pH 9,2) agarózových gelech jsou vyvolány jednotlivými antiséry, které jsou zaměřeny proti : - těžkým řetězcům gama (Ig G), alfa (Ig A) a mí (Ig M) a lehkým (volným a vázaným) řetězcům kappa a lambda a / nebo, - trivalentním protilátkám těžkých řetězců (gama, alfa a mí), protilátkám volných a vázaných lehkých řetězců kappa a lambda a protilátkám volných řetězců kappa a lambda. Po odstranění nespecifických bílkovin jsou obarveny barvivem kyselá violeť. Každý agarózový gel v sadě HYDRAGEL 2 IF / BJ (HR) je určen k analýze dvou vzorků. Pro diagnostické použití In Vitro.

POZNÁMKA : V tomto návodu se název "HYDRASYS" používá pro poloautomatické přístroje HYDRASYS a HYDRASYS 2.

PRINCIP TESTU

Abnormální proužky zjištěné elektroforézou v zóně beta a gamaglobulinů mohou být monoklonální bílkoviny (M-bílkoviny, parabílkoviny, monoklonální imunoglobuliny) a tedy indikací monoklonální gamapatie. Pro určení těchto abnormálních frakcí je indikována imunofixace. Imunofixační elektroforéza je jednoduchá technika, která umožňuje zachycení bílkovin v gelu po elektroforéze, kde tvoří nerozpustné komplexy s příslušnými protilátkami. Snadno se provádí a interpretuje ve čtyřech krocích : 1. Separace bílkovin elektroforézou na agarózovém gelu. 2. Imunofixace (imunoprecipitace) rozdělených bílkovin – příslušné migrační stopy jsou překryty jednotlivými antiséry. Antiséra difundují do gelu a precipitují přítomné antigeny. Bílkoviny v referenční stopě jsou fixovány fixačním roztokem. 3. Nevysrážené, rozpustné bílkoviny jsou z gelu odstraněny během odsávání a promývání. Precipitovaný komplex antigen-protilátka je zachycen v matrici gelu. 4. Vysrážené bílkoviny jsou vizualizovány obarvením. Imunoprecipitované frakce jsou potom porovnány s příslušnými abnormálním frakcemi v elektroforetickém záznamu vzorku a identifikovány podle reakce nebo nepřítomnosti reakce s jednotlivými antiséry.

Elektroforetické dělení, jehož cílem je detekce a identifikace podezřelých monoklonálních složek, probíhá současně v šesti stopách. Po elektroforéze slouží jedna stopa jako referenční a poskytuje úplné elektroforetické uspořádání bílkovin ve vzorku. Zbývajících pět stop slouží k charakterizaci monoklonální složky podle přítomnosti nebo nepřítomnosti reakce s antisérem proti těžkým řetězcům gama (Ig G), alfa (Ig A) a mí (Ig M), proti volným a vázaným lehkým řetezcům kappa a lambda a/nebo trivalentním protilátkám těžkých řetězců (gama, alfa a mí), protilátkám proti volným a vázaným lehkým řetězcům kappa a lambda. Imunofixační proužky jsou porovnány s podezřelými frakcemi referenčního vzorku – příslušný proužek by měl mít stejnou migrační pozici. Tato jednoduchá a rychlá technika poskytuje jasné a lehce interpretovatelné výsledky.

REAGENTY A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SOUPRAVĚ HYDRAGEL 2 IF / BJ (HR) VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy.

POLOŽkY Agarózové gely (připravené k použití) Pufrované proužky (připravené k použití) Barvivo kyselá violeť (zásobní roztok) Ředicí roztok (připravený k použití) Aplikátory (připravené k použití) Filtrační papíry - tenké Hřebeny z filtračních papírů Filtrační papíry - silné

kAT. Č. 4803 10 gelů 10 balení po 2 kusech 1 lahvička, 75 mL 1 lahvička, 32 mL 1 balení po 10 kusech 1 balení po 10 kusech 1 balení po 10 kusech 1 balení po 10 kusech

POZNÁMKA : Fixační roztok a antiséra jsou dodávány samostatně (viz POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V SADĚ). OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku.

1. AGARÓZOVÉ GELY Příprava

Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok pH 9.2 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Nosné médium pro elektroforézu a imunofixaci bílkovin.

Skladování, stabilita a známky znehodnocení roztoku

Gely skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech při pokojové teplotě (15 až 30 °C) nebo v chladničce (2 až 8 °C). Jsou stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady a na balení gelu. (Šipky na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Neskladovat v blízkosti okna nebo tepelného zdroje. Zamezte prudkým změnám teploty při skladování. NEMRAZIT. - 170 -

SEBIA NÁVOD - Czech


Nepoužívejte : (i) když se vytvoří krystaly nebo sraženiny na povrchu gelu nebo jeho struktura změkne (oboje v důsledku zmrazení gelu), (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) když je v obalu gelu abnormální množství tekutiny (výsledek vypocení tlumivého roztoku z gelu v důsledku nesprávného skladování).

2. PUFROVANÉ PROUŽkY Příprava

Pufrované houbovité proužky (stripy) jsou připraveny k použití. Každý obsahuje : tlumicí roztok s pH 9.0 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Pufrované proužky fungují jako zásobník pufru pro elektroforézu a zajišťují kontakt gelu a elektrod.


Pufrované proužky skladujte ve svislé poloze v originálním ochranném obalu při pokojové teplotě nebo v chladničce. (Šipky na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku balení pufrovaného proužku. NEMRAZIT. Pokud je balení otevřeno a pufrovací proužky vyschlé, zneškodněte je. POZNÁMKA : Během skladování se může barva pufrovacích proužků změnit na žlutou, což nemá nepříznivý vliv na jejich vlastnosti.

3. kYSELÁ VIOLEŤ Příprava

Lahvička zásobní kyselé violeti může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 300 mL. Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok pH ≈ 2 ; kyselou violeť ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Barvení gelů po elektroforéze a imunofixaci. DŮLEŽITÉ : Barvicí roztok je určen k obarvení pouze 10 gelů. Roztok vyměňte po 10 použitích k barvení.


Zásobní i pracovní barvicí roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní barvicí roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky barvicího roztoku. Pracovní barvicí roztok je stabilní 6 měsíců.

4. ŘEDÍCÍ ROZTOk Příprava

Ředící roztok je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok pH 7.5 ± 0.5 ; bromofenolová modř ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Na ředění vzorků. Bromfenolová modř se používá jako praktický značkovač migrace.


Ředicí roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky rozpouštěcího roztoku. Ředicí roztok nesmí obsahovat sraženiny.

5. APLIkÁTORY Použití

Nastříhané aplikátory na jedno použití určené k aplikaci vzorků.

Skladování

Aplikátory skladujte v suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

6. FILTRAČNÍ PAPÍR - TENkÝ Použití

Bločky tenkého absorpčního papíru na jedno použití jsou určeny pro odsání přebytečné vlhkosti z povrchu gelu před aplikací vzorků.

Skladování

Tenké filtrační papíry skladujte v suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

7. HŘEBENY Z FILTRAČNÍCH PAPÍRŮ Použití

Nastříhané hřebeny ze silného absorpčního papíru na jedno použití určené k odsávání fixačního roztoku a antisér z povrchu gelů po provedení imunofixace.

Skladování

Hřebeny z filtračního papíru skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce v suchém místě.

8. TLUSTÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Použití

Bločky tlustého absorpčního papíru na jedno použití určené k odsávání neprecipitovaných bílkovin z povrchu gelů po provedení imunofixace.

Skladování

Tlusté filtrační papíry skladujte v suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

- 171 -


POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy.

1. BALENÍ ANTISÉRA A FIXAČNÍHO ROZTOkU IF

Balení antisér a fixačního roztoku pro imunofixaci IF se standardní maskou, SEBIA, kat. č. 4815, obsahuje 5 lahviček s antiséry proti Ig G, Ig A, Ig M, řetězcům kappa (lehké volné a vázané) a řetězcům lambda (lehké volné a vázané), každou o objemu 1 mL, a 1 lahvičku s fixačním roztokem o objemu 2,5 mL. Jsou specifická pro imunofixační postup se standardní maskou, například 2 IF (HR) a 2 BJ (HR), SEBIA.

1.1 ANTISÉRA

Příprava

Připraveno k použití. Všechna antiséra jsou savčí imunoglobuliny, protilátky proti lidským bílkovinám. Ke snadnějšímu rozlišení a jako pomůcka pro jejich sledování jsou antiséra zbarvena různými barvami neškodnými pro člověka, které odpovídají barvě štítku lahvičky. Při výskytu lehkého zákalu ponechejte antisérum minimálně 10 minut stát při pokojové teplotě. To by mělo dostačovat k vyčištění roztoku. Přetrvávající zákal by však neměl žádným způsobem ovlivnit imunochemickou reakci. V případě nerozpustných sraženin se doporučuje antiséra centrifugovat 5 minut při 600 g.

Použití

K imunofixaci bílkovin, které byly rozděleny elektroforézou. POZNÁMKA : Antiséra jsou specifická pro imunofixační postup s maskou například 2 IF (HR) a 2 BJ (HR), SEBIA. Antiséra mohou pocházet z různých zvířecích druhů. Nemíchejte dvě různé lahvičky s antiséry i když jsou stejné specifikace a při výměně lahviček s antiséry VŽDY měňte špičky pipety. DŮLEŽITÉ : Aby se zabránilo vzájemné kontaminaci činidel, dávejte pozor na záměnu víček odpovídajících lahviček po jejich použití.


Antiséra skladujte v chladničce (2 až 8 °C). Jsou stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítcích lahviček antisér.

1.2 FIXAČNÍ ROZTOk

Příprava

Fixační roztok je připraven k použití s migračním programem "2 IF (HR) (SM)". Obsahuje : kyselý roztok pH ≈ 2 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro snadnou identifikaci a jako pomůcka pro sledování jeho nanášení je fixační prostředek obarven neškodným barvivem odpovídajícím barvě štítku použité lahvičky. VAROVÁNÍ : V případě migračního programu "2 BJ (HR) (SM)" před použitím nařeпte fixační roztok na dvojnásobek destilovanou nebo deionizovanou vodou. Doporučuje se naředit fixační roztok těsně před použitím a připravit pouze objem fixačního roztoku potřebný pro imunofixační postup.

Použití

Fixace elektroforeticky rozdělených bílkovin v referenční stopě (ELP). POZNÁMKA : Fixační roztok je specifický pro imunofixační postup se standardní maskou například 2 IF (HR) a 2 BJ (HR), SEBIA.

DŮLEŽITÉ : Aby se zabránilo vzájemné kontaminaci činidel, dávejte pozor na záměnu víček odpovídajících lahviček po jejich použití.


Fixační roztok (připravený k použití pro migrační program "2 IF (HR) (MS)") skladujte v chladu (mezi 2 a 8 °C). Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady či na štítku lahvičky fixačního roztoku. Pracovní fixační roztok zředěný na dvojnásobek destilovanou nebo deionizovanou vodou (připravený pouze pro migrační program "2 BJ (HR) (MS)") skladujte při pokojové teplotě (15 až 30 °C) nebo v chladu (mezi 2 a 8 °C) ; musí se spotřebovat během dne (maximálně do 8 hodin). Fixační roztok nesmí obsahovat sraženiny.

2. BALENÍ ANTISÉRA A FIXAČNÍHO ROZTOkU GAM, k, L

Balení antisér a fixačního roztoku pro imunofixaci GAM, K a L se standardní maskou, SEBIA, kat. č. 4835, obsahuje 3 lahvičky s antiséry (proti těžkým řetězcům gama, alfa a mí (trivalentní antisérum) a volným a vázaným lehkým řetězcům kappa a volným a vázaným lehkým řetězcům lambda) každou o objemu 1 mL, a 1 lahvičku s fixačním roztokem o objemu 2,5 mL. Jsou specifická pro imunofixační postup se standardní maskou, například 2 IF (HR) a 2 BJ (HR), SEBIA. Příprava, použití, skladování, stabilita a označení znehodnocení roztoku : Viz předchozí odstavce 1.1 a 1.2. VAROVÁNÍ : V případě migračního programu "2 BJ (HR) (SM)" před použitím zřeпte fixační roztok na dvojnásobek destilovanou nebo deionizovanou vodou. Doporučuje se zředit fixační roztok těsně před použitím a připravit pouze objem fixačního roztoku potřebný pro imunofixační postup.

3. BALENÍ ANTISÉRA PRO LEHkÉ ŘETĚZCE

Balení antisér pro lehké řetězce kappa a lambda pro imunofixaci se standardní maskou, SEBIA, kat. č. 4836, obsahuje 2 lahvičky anitsér, každou o objemu 1 mL. Jsou specifická pro imunofixační postup se standardní maskou, například 2 IF (HR) a 2 BJ (HR), SEBIA. Příprava, použití, skladování, stabilita a označení znehodnocení roztoku : Viz předchozí odstavec 1.1.

POZNÁMKA : Během přepravy je možné uchovávat antiséra a fixační roztok při pokojové teplotě (15 až 30 °C) po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na jejich vlastnosti.

4. ODBARVOVACÍ ROZTOk Příprava

Každá lahvička zásobního odbarvovacího roztoku (SEBIA, kat č. 4540, 10 lahviček, 100 mL v každé) může být zředěna destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 100 litrů. Praktické je zředit pouze 5 mL zásobního roztoku na 5 litrů, což je objem láhve na odbarvovací roztok. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok pH ≈ 2.

Použití

Roztok je určen k odstranění přebytečného barviva a odbarvení pozadí gelů. K opláchnutí barvicího oddílu po provedení mycí procedury. K neutralizaci kyselé reakce odbarvovacího roztoku nalijte do prázdné nádoby na odpady 15 mL 50 % (w/w) komerčně dostupného roztoku NaOH (≈ 19 M NaOH). - 172 -


Skladování, stabilita a označení znehodnocení roztoku

Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování v uzavřené láhvi při pokojové teplotě. Nepřidávat azid sodný. Pracovní odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μL/dL roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, kat. č. 2059, 1 lahvička, 5 mL). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky.

5. HYDRASYS – PROMÝVACÍ ROZTOk Příprava

Každá lahvička promývacího roztoku HYDRASYS (SEBIA, kat č. 4541, 10 lahviček, 80 mL každá) může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 5 litrů. Promývací pracovní roztok po zředění obsahuje : tlumicí roztok pH 8.7 ± 0.5.

Použití

Promývací roztok HYDRASYS je určen k vymytí nevysrážených bílkovin z gelů. Slouží rovněž pro čištění barvicího prostoru systému HYDRASYS. Používejte jej pravidelně – například při každodenním používání přístroje promývejte barvicí prostor jednou týdně. Viz příbalový leták s návodem k použití.


Zásobní i pracovní roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřených nádobách. Stabilní jsou do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku mikrobiální kontaminace.

6. ŘEDICÍ ROZTOk NA VZORkY HYDRAGEL IF

Ředicí roztok (SEBIA, kat. č. 4588, 1 lahvička, 80 mL) je připraven k použití. Reagent potřebný pro automatické ředění vzorků. Viz předchozí odstavec "ŘEDICÍ ROZTOK".

7. FLUIDIL Příprava

Fluidil (SEBIA, kat. č. 4587, 1 lahvička, 5 mL) je připraven k použití.

Použití

K ředění viskózních nebo zakalených vzorků, například sér obsahujících kryoglobulin nebo kryogel.


Skladovat při pokojové teplotě. Je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky roztoku Fluidil. Fluidil nesmí obsahovat sraženiny.

POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr ≤ 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µS/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm.

VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ NEOBSAŽENÉ V BALENÍ

1. HYDRASYS Systém SEBIA : HYDRASYS 2 SCAN kat. č. 1200, HYDRASYS 2 kat. č. 1201, HYDRASYS 2 SCAN FOCUSING kat. č. 1202, HYDRASYS 2 FOCUSING kat. č. 1203, HYDRASYS kat. č. 1210 nebo kat. č. 1211 nebo HYDRASYS FOCUSING kat. č. 1212. 2. Manuální nebo automatizovaný mikropipetor, SEBIA HYDRAPLUS, kat. č. 1216 nebo SEBIA HYDRAPLUS 2, kat. č. 1217 nebo SEBIA ASSIST, kat. č. 1218 jako alternativu k vzorkovým aplikátorům. 3. Vlhká zásobní komora, kat. č. 1270, dodávána se systémem HYDRASYS. 4. Souprava nádob dodávaná se systémem HYDRASYS. 5. Vodící tyčka šablony dodávaná s HYDRASYS systémem. 6. Souprava příslušenství pro HYDRASYS 2 IF / BJ (HR), SEBIA, kat. č. 1254, obsahující 2 standardní masky 2 IF (HR) a 2 BJ (HR). 7. Pipety : 10 µL, 20 µL, 100 µL a 200 µL.

VZORkY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků

Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky séra. Odběr séra a moči musí být v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky co nejdříve po odběru uložené do chladničky (2 až 8 °C) je možné uchovávat až jeden týden. Pro delší skladování vzorky zmrazte (stabilní nejméně jeden měsíc). Mražení sér s 0,02 g/dL azidu sodného zvyšuje stabilitu při skladování. Obdobně zvyšuje stabilitu při skladování mražení moči s HEPES 0,1 M (pH 6,75) a s 0,02 g/dL azidu sodného. DŮLEŽITÉ: Nepoužívejte kyselinu boritou jako konzervant. Rozmražené vzorky mohou obsahovat slabé aplikační značky vlivem denaturace bílkoviny nebo lipoproteidu (pro sérum). - 173 -


Příprava vzorků

1. Sérum a migrační program "2 IF (HR) (SM)"

Sérum před použitím zřeďte, abyste zabránili překrytí zón při vysoké úrovni antigenu a dobře promíchejte. Připravte 2 vzorky gelu HYDRAGEL 2 IF / BJ (HR). STOPA

SÉRUM (SE) (µL)

Imunofixační stopa Ig G

20

Referenční stopa ELP a všechny další imunofixační stopy

30

ŘEDICÍ ROZTOk (DE) (µL) 100 60

Zvláštní případy : • Je-li hladina celkového imunoglobulinu > 2 g/dL (hypergamaglobulinemie), použijte vyšší ředění vzorku (kromě stopy ELP) pro získání normální koncentrace imunoglobulinů. • Je-li hladina celkového imunoglobulinu < 0,5 g/dL (hypogamaglobulinemie), použijte menší ředění vzorku. • Vzorky séra pacienta mohou být testovány i na přítomnost Bence Jonesových bílkovin ; v takovém případě se doporučuje použít migrační program "2 BJ (HR) (SM)" (viz následující odstavec). Vzorek by měl být testován pomocí soupravy HYDRAGEL 2 IF / BJ (HR) a soupravy proti volným lehkým řetězcům kappa (SEBIA, kat. č. 4610) a proti volným lehkým řetězcům lambda (SEBIA, kat. č. 4611) nebo pomocí soupravy antisér proti volným lehkým řetězcům kapa a lambda pro imunofixaci, standardní maska, SEBIA, kat. č. 4836 (viz odstavec POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ). V takovém případě se sérum ředí fyziologickým roztokem nebo ředicím roztokem pro imunofixaci po předchozím ředění 1/4 (1 díl ředicího roztoku, 3 díly deionizované nebo destilované vody) : 1/10 pro stopy ELP, GAM, K, L (1 díl séra + 9 dílů fyziologického roztoku nebo ředěného ředicího roztoku) a 1/3 (1 díl séra + 2 díly fyziologického roztoku nebo ředěného ředicího roztoku) pro zóny (stopy) volných řetězců kappa a lambda (Kf, Lf). Pokud je celková koncentrace imunoglobulinů < 0,5 g/dL, doporučuje se menší zředění vzorku séra ; například 1/5 pro ELP, GAM, K a L stopy a 1/2 pro Kf a Lf stopy. • Po skladování v chladničce při 2 až 8 °C nebo po zmrazení se některá séra (zejména taková, která obsahují kryoglobulin nebo kryogel) mohou stát viskyzními nebo vznikne zákal. Taková séra mohou špatně difundovat do zubů aplikátoru. V takovém případě přidejte 25 µL Fluidilu na 75 µL séra a promíchejte (na vortexu) 15 vteřin. Dále pokračujte podle standardního postupu. • Některé monoklonální bílkoviny mohou polymerizovat a výsledkem je "monoklonální frakce" ve všech imunofixačních stopách. V tomto případě (i) připravte 1% beta-merkaptoetanol (BME nebo 2 ME) ve Fluidilu, (ii) přidejte 25 µL tohoto roztoku k 75 µL séra, (iii) promíchejte na vortexu a čekejte minimálně 15 min (maximálně 30 minut) a teprve potom použijte standardní postup. • Pro analýzu Ig D a / nebo Ig E použijte stejné řešení jako pro volné a vázané lehké řetězce kappa a lambda.

2. Migrační program pro vzorky moči nebo séra "2 BJ (HR) (SM)" Moč

Analýza se provádí s nezahuštěnou močí. Detekční úroveň pro Bence Jonesovy bílkoviny je obecně v rozmezí 1 - 5 mg/dL. Zahuštěná moč se používá pouze pro postupy zavedené v laboratoři nebo pokud je zapotřebí vyšší citlivost. Zahuštění na 20 - 100 násobnou koncentraci je obvykle dostatečné. POZNÁMKA : Difúze vzorků moči do špičky aplikátorů může být narušena, pokud je moč (čistá nebo koncentrovaná) zakalená. V tomto případě se doporučuje odstranit částice působící zákal centrifugací (Postupujte podle obvyklých doporučení pro předanalytickou fázi pro analýzu vzorků moči) nebo filtrací (např. stříkačkový filtr 0,45 µm).

Zvláštní případy : • Některé vzorky moči mají vysokou koncentraci solí. V důsledku toho může dojít k poškození gelu při migraci a následně ke zkreslení migračních profilů. Toto zkreslení může být příčinou nepřesné interpretace výsledků a proto by soli v těchto vzorcích měly být odstraněny dialýzou. • Polymerizace Bence Jonesových bílkovin obecně snižuje citlivost detekce antiséry proti volným lehkým řetězcům ; polymerizace totiž může blokovat epitopy, které normálně reagují s těmito antiséry. Když není dosažena žádná detekce a existuje podezření na Bence Jonesovy bílkoviny, proveпte před elektroforézou depolymerizaci : Smíchejte 100 µL moči s 5 µL beta-merkaptoetanolu, zředěného 1:10 fyziologickým roztokem. • Parabílkoviny v moči mohou být proteolyticky změněny v důsledku mikrobiální kontaminace. To může způsobit pozitivní reakci s volnými lehkými řetězci antiséra. V takovém případě se sérový paraprotein vylučovaný do moči může s trivalentním antisérem, jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům a s antisérem proti příslušnému volnému lehkému řetězci, jevit jako monoklonální proužek.

Vzorky séra

Kromě moči lze otestovat na přítomnost Bence Jonesovy bílkoviny. Zřeпte sérum ve fyziologickém roztoku nebo ředicím roztoku pro imunofixaci, který byl před tím zředěn v poměru 1/4 (1 díl ředicího roztoku a 3 díly destilované nebo deionizované vody) : Pro stopy ELP, GAM, K a L zřeпte v poměru 1/10 (1 díl séra, 9 díly zředěného ředicího roztoku nebo fyziologického roztoku) a pro Kf a Lf zřeпte v poměru 1/3 (1 díl séra, 1 díly zředěného ředicího roztoku nebo fyziologického roztoku). Pokud je celková hladina imunoglobulinů < 5 g/L, doporučuje se nižší ředění vzorku séra ve fyziologickém roztoku nebo ředicím roztokem pro imunofixaci připravené následujícím způsobem : 1 díl ředicí roztok, 3 díly destilovaná nebo deionizovaná voda Například sérum pro stopy ELP, GAM, K a L zřeпte v poměru 1/5 (1 díl séra, 4 díly zředěného ředicího roztoku nebo fyziologického roztoku) a pro stopy Kf a Lf zřeпte v poměru 1/2 (1 díl séra, 1 díl zředěného ředicího roztoku nebo fyziologického roztoku). Pro analýzu Ig D a / nebo Ig E použijte stejné řešení jako pro volné a vázané lehké řetězce kappa a lambda.

Vzorky, které není vhodné používat

• Nepoužívejte vzorky plazmy. Proužek fibrinogenu v beta zyně by mohl být považován za monoklonální imunoglobulin a mohl by zvýšit procento příslušné zyny. • Nepoužívejte hemolyzované vzorky. • Nepoužívejte vzorky staré, nesprávně skladované moči, u nichž mohla proběhnout enzymatická degradace bílkovin.

POZNÁMKA : Odběrové zkumavky a centrifugační parametry pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci for zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků…). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, nebo k centrifugaci uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. - 174 -


POSTUP

Systém HYDRASYS je poloautomatický víceparametrový přístroj. Automatizované kroky zahrnují zpracování agarosových gelů HYDRAGEL v následujícím pořadí : aplikace vzorku, elektroforetická migrace, inkubace s fixačním roztokem a antisérem, vysušení, barvení, odbarvení a závěrečné vysušení. Manuální kroky zahrnují manipulaci se vzorky a gely, nanesení fixačního roztoku a antisér a nastavení přístroje k činnosti. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE UŽIVATELSKÝ NÁVOD K PŘÍSTROJI HYDRASYS / HYDRASYS 2.

DŮLEŽITÉ : Zkontrolujte, zda je šablona správně umístěna a zda jsou perfektně vyrovnány elektroforetické profily a jamky šablony.

I. NASTAVENÍ MIGRACE

1. Zapněte přístroj HYDRASYS. 2. Umístěte jeden aplikátor na rovný povrch s čísly jamek vpravo nahoře (obr. 1). - Aplikujte 10 µL správně zředěného séra nebo nezahuštěné moči do jamek následujícím způsobem. Aplikátor naplňte do 2 minut. MIGRAČNÍ / IMUNOFIXAČNÍ STOPA VZOREK č. 1 - JAMKA č. VZOREK č. 2 - JAMKA č.

ELP 2 9

G / GAM 3 10

A/k 4 11

M/L 5 12

k / kf 6 13

L / Lf 7 14

POZNÁMKA : Pro HYDRAGEL 2 IF / BJ (HR) se jamky 1, 8 a 15 nepoužívají, je proto vhodné je označit fixem, aby nebyly omylem naplněny vzorky. - Vložte aplikátory do vlhké zásobní komory zoubky směrem nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček) ; Další informace jsou uvedeny v příbalovém letáku vlhké komory. - Nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut po aplikaci posledního vzorku. Pro pozdější použití (až do 8 hodin) uložte celou komůrku do chladničky. 3. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte nahoru migrační rámeček s elektrodami a nosičem aplikátorů. VAROVÁNÍ : Nikdy nezavírejte víčko, pokud jsou držáky zdviženy!

4. Podle vzorku, který se bude analyzovat (sérum nebo moč), zvolte migrační program "2 IF (HR) (SM)" nebo "2 BJ (HR) (SM)" v menu přístroje (levá strana klávesnice). 5. Vyjměte z ochranného obalu pufrované proužky – uchopením za plastové konce. Děrovanými konci plastového vyztužení je upevněte na kovové výstupky elektrodového nosiče, přičemž musí plastové vyztužení proužků směřovat k nosiči (viz obr. 2). 6. Vybalte desku HYDRAGEL. - Odsajte přebytečnou kapalinu tak, že na povrch gelu rychle a rovnoměrně narolujete filtrační papír. Papír ihned odstraňte. VAROVÁNÍ : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu, mohlo by dojít k dehydrataci gelu. - Aplikujte 200 µL destilované nebo deionizované vody do dolní třetiny rámu vyraženého na termoregulační destičce migračního modulu. - Opřete gelovou desku (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (obr. 3). - Gel ohněte a zavěšte dolů na hladinu vody. Zkontrolujte, zda nedošlo k zachycení vzduchových bublin, že je voda rozprostřena po celém povrchu gelové desky a zda je gel vyrovnán s vyznačeným rámečkem (obr. 3). 7. Sklopte oba držáky dolů. V této pozici se pufrované proužky nedotýkají gelu. NETLAČTE NA RÁMEČEK DOLŮ SILOU. 8. Vyjměte aplikátor z vlhké komory. Uchopte jej při tom za ochranný rámeček. - Ulomte ochranný rámeček chránicí zuby aplikátoru. - Umístěte aplikátor do polohy č. 5 na rámečku. Pro zlepšení reprodukovatelnosti aplikace vzorků umístěte vždy aplikátory na levou stranu nosiče. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátorech musí směřovat k operátorovi (obr. 4). 9. Uzavřete víko migračního modulu. 10. Ihned zahajte postup stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice. DŮLEŽITÉ : Zkontrolujte, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje.

MIGRACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ • • • • •

Oba nosiče jsou sklopeny a proužky s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu. Probíhá aplikace vzorků do gelu. Migrace se provádí při konstantních 20 W při 20 °C řízených Peltieriho článkem až do akumulovaných 75 Vh (přibližně 15 minut). Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. Ozve se pípnutí a odjistí se víko migračního modulu. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "e AS" / "e ANTISERA". POZNÁMKA : Víko migračního modulu zůstává během migrace zajištěné.

II. NASTAVENÍ IMUNOFIXACE

1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Vyjměte a zneškodněte aplikátor vzorku. 3. Zdvihněte oba nosiče, vyjměte pufrované proužky za plastové konce a zneškodněte. - Vyjměte oba nosiče. - Otřete elektrody měkkou zvlhčenou látkou. - Gel ponechejte na místě v migračním modulu. 4. Připravte šablonu pro aplikaci reagentů dle následujícího postupu (viz obr. 5). - Umístěte rámeček aplikační šablony na ukotvující trny (může být ponechána v migračním modulu po celou dobu). - Uchopte šablonu za okraj a položte ji na rámeček (přičemž zářezy jsou vyrovnané se značkami). - Sklopte šablonu na gel. 5. Reagenty používejte následujícím způsobem : - 175 -

STOPA ELP

OBJEM (µL)

G GAM A K M L K Kf L Lf

90 55 55 55 55 55


OZNAČENÍ

fixační roztok (připraven k použití) s migračním programem "2 IF (HR) (SM)" fixační roztok (zředěný 1/2) s migračním programem "2 BJ (HR) (SM)" antisérum proti těžkým řetězcům gama trivalentní antisérum

antisérum proti těžkým řetězcům alfa antisérum proti lehkým (volným i vázaným) řetězcům kappa antisérum proti těžkým řetězcům mí antisérum proti lehkým (volným i vázaným) řetězcům lambda antisérum proti lehkým (volným i vázaným) řetězcům kappa antisérum proti volným lehkým řetězcům kappa antisérum proti lehkým (volným i vázaným) řetězcům lambda antisérum proti volným lehkým řetězcům lambda

BARVA žlutý

růžová fialová tmavě modrá světle zelená žlutozelená světle modrá světle zelená oranžová světle modrá červená

POZNÁMKA : Pro zamezení záměny reagentů je jejich barva vyznačena na štítcích lahviček i na šabloně. - Při pipetování se vyvarujte tvorby a nasávání bublin do špičky pipety. - Aplikujte reagenty (viz obr. 6) : - Pipetu držte svisle a při aplikaci špičku zlehka opřete o boční stranu jamky. - Vstříkněte reagent do jamky tak, aby nedošlo k zachycení žádných bublin vzduchu. 6. Uzavřete víko migračního modulu. 7. Ihned zahajte postup stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice. Na displeji se zobrazí zpráva "[INCUBATION]".

IMUNOFIXACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ

• Inkubace při 20 °C (řízeno Peltierovým efektem) po dobu 5 minut pro program "2 IF (HR) (SM)" nebo po dobu 10 minut pro migrační program "2 BJ (HR) (SM)". • Ozve se pípnutí a odjistí se víko migračního modulu. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "a AS" / "a ANTISERA". POZNÁMKA : Víko migračního modulu zůstává během inkubace zajištěné.

III. ODSTRANĚNÍ PŘEBYTkU REAGENTŮ

1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Odstraňte nadbytek reagentů pomocí hřebenu z filtračního papíru (obr. 7). - Zasuňte každý hřeben pod úhlem 30° do slotů na dolním konci šablony tak, aby se zoubky dotýkaly svislé strany dále od obsluhy. - Lehce se dotkněte zoubky kapaliny tak, že sklopíte hřeben v úhlu 45° k hladině kapaliny (viz obr. DŮLEŽITÉ : Hřeben musí zůstat nakloněn (45°). Pokud je vztyčený, mohl by poškodit gel.

3. Zahajte postup stisknutím tlačítka "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice).

ODSTRANĚNÍ REAGENTŮ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ

• K odsáván reagentů je vymezeno 15 vteřin při 20 °C (řízeno Peltierovým efektem). • Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "e PAP." / "e THICK FILTER PAPER".

IV. ODSÁVÁNÍ GELU

1. Vyjměte hřeben. 2. Zkontrolujte, zda jsou reagenty naabsorbované, což je indikováno : - nepřítomností reagentů na gelu. - obarvením celé délky zubů. Je-li absorpce neúplná, vložte stejný hřeben z filtračního papíru znovu (ve stejné pozici) a opakujte manuálně postup odstranění. 3. Uchopte aplikační masku na činidla za výstupek, zdvihněte a odstraňte. 4. Položte na gel tlustý filtrační papír : - vyrovnejte okraj filtračního papíru s okrajem gelu (nakloňte jej v úhlu 45°) : - a opatrně jej položte na gel. VAROVÁNÍ : Pevně přitlačte na celý povrch filtračního papíru pro zajištění jeho dokonalého přilnutí ke gelu.

5. Uzavřete víko migračního modulu. 6. Zahajte postup stisknutím tlačítka "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice). 7. Aplikační šablonu očistěte malým kartáčkem (např. kartáčkem na zuby) podle postupu uvedeného v části "POSTUP ČIŠTĚNÍ MASKY". Ověřte, že je šablona před opakovaným použitím zcela suchá ; pomocí sacího papíru odstraňte z jamek kapky vody.

ODSÁVÁNÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ

• Odsávání trvá 3 minuty při 40 °C a je řízeno Peltierovým efektem. • Zazní zvukový signál. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "a PAP." / "a THICK FILTER PAPER".

V. VYSUŠENÍ GELU 1. 2 3. 4.

Otevřete víko migračního modulu. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na místě. Zavřete víko. Zahajte postup stisknutím tlačítka "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice). Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "[DRYING]". - 176 -


VYSUŠENÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ

• Vysušení při 50 °C trvá 6 minut a je řízeno Peltierovým efektem. • Ozve se pípnutí signalizující odjištění víka. Teplota plotny zůstává až do otevření víka na 50 °C. POZNÁMKA : Víko migračního modulu zůstává během sušení zajištěné.

VI. PŘÍPRAVA ZPRACOVÁNÍ GELU

1. Otevřete víko. 2. Vyjměte usušený gel pro další zpracování. 3. Otevřete držák gelu. Položte jej na rovnou plochu a vysušený gel umístěte (gelovou stranou vzhůru) do žlábků obou tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že gel je uvnitř držáku správně umístěn (viz obr. 9). 4. Držák gelu vložte do modulu pro vyvíjení a barvení. DŮLEŽITÉ : Před spuštěním programu pro vyvíjení/barvení zkontrolujte následující : - zda nádoba na promývací roztok obsahuje nejméně 400 mL promývacího roztoku ; - zda nádoba na barvicí roztok obsahuje nejméně 300 mL barvicího roztoku ; - zda nádoba na odbarvovací roztok obsahuje nejméně 1 L odbarvovacího roztoku ; - zda je nádoba na odpad prázdná. Připojení vedení činidel : viz informace zobrazené na obrazovce přístroje (vyberte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte uzavřít nepoužité přívody. 5. Z menu přístroje vyberte barvicí program "IF ACID VIOLET" a spusťte program stisknutím tlačítka "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice). Během barvení, odbarvování a sušení je tento prostor uzamčen. Po ochlazení se odjistí víko migračního modulu (větrání zůstane zapnuté až do vyjmutí držáku gelu).

POZNÁMKY :

- Teplota migrační plochy poklesne po otevření až na 20 °C (za méně než 5 minut). Potom je možné zahájit novou migraci. - Vraťte aplikátor vzorků a nosič elektrod zpět na místo. - Otřete migrační plochu jemnou vlhkou látkou.

VII.DOkONČENÍ ZPRACOVÁNÍ GELU

1. Vyjměte držák gelu z modulu, otevřete jej a vyjměte vysušený gel. 2. Je-li zapotřebí, očistěte zadní stranu (plastovou nosnou stranu) vysušeného filmu vlhkým jemným papírem.

VÝSLEDkY

Vyhodnocení

SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace.

1. Sérum

Nepřítomnost monoklonální složky

• Normální vzorek séra vykazuje jemně difúzní zbarvení polyklonálních imunoglobulinů ve všech stopách. • Hypergamaglobulinemie je charakterizována výrazně zbarvenou, difúzní zónou gama bez přítomnosti ostrých proužků.

Přítomnost monoklonální složky

• Přítomnost monoklonálního bílkoviny (gamapatie) je charakterizována monoklonálním proužkem detekovaným jedním z antisér proti těžkým řetězcům (gama, alfa a mí) a nebo antisérem proti lehkým řetězcům kappa nebo lambda. Detekovaný monoklonální proužek, obvykle ostrého a ohraničeného výskytu, musí být lokalizován ve stejné migrační vzdálenosti jako možná monoklonální frakce spatřená v referenční stopě (ELP). • Absence reakce s antiséry proti těžkým řetězcům a současná reakce s jedním z antisér proti lehkým řetězcům může svědčit o : a) velmi vzácné gamapatii Ig D nebo Ig E : potvrпte pomocí antisér proti těžkým řetězcům delta nebo epsilon, b) gamapatii lehkého řetězce : potvrпte pomocí antisér proti lehkým řetězcům kappa nebo lambda. • Chybí-li pozitivní reakce s antiséry proti lehkým řetězcům, zatímco některé z antisér proti těžkým řetězcům reagují, může jít o velmi vzácnou gamapatii těžkých řetězců (gama, alfa nebo mí).

Přítomnost dvou nebo více monoklonálních komponent

Ve vzácných případech může proliferovat několik klonů B-buněk – imunofixací je odhaleno několik monoklonálních proužků : • Biklonální gamapatie – je charakterizována přítomností dvou proužků těžkých řetězců (identických nebo různých) a dvou proužků lehkých řetězců (identických nebo různých). • Polymerizované imunoglobuliny jsou charakterizovány přítomností několika proužků téhož typu těžkého řetězce a odpovídacího lehkého řetězce. K potvrzení přítomnosti jednoduché monoklonální abnormality je nutná depolymerizace beta-merkaptoethanolem a opakovaná imunotypizace (viz "Vzorky pro analýzu"). • Oligoklonální gamapatie je charakterizována přítomností mnohočetných proužků jednoho nebo více typů těžkých řetězců nebo jedním či dvěma typy řetězců lehkých. - 177 -


Zvláštní případy

• Monoklonální proužek pozorovaný při elektroforéze ( ELP stopa), který nelze potvrdit imunofixací, svědčí pro přítomnost fibrinogenu (ve vzorku plazmy). • Pro některé vzorky může proužek monoklonálního typu pozorovaný na všech stopách indikovat pozici bodu aplikace. • Vyskytne-li se monoklonální proužek ve všech imunofixačních stopách, může se jednat o kryoglobulin nebo polymerizovaný Ig M. Nutno depolymerizovat pomocí redukčního reagentu a analýzu opakovat (viz "Analyzované vzorky"). • U parabílkovin s vysokou koncentrací může být pozorováno srážení ve všech stopách na stejné úrovni. V takovém případě se doporučuje použití vyšší zředění vzorku pro stopy antiséra. • U některých gamopatií Ig A mohu být přítomny antiséra proti lehkým řetězcům s mírnou afinitou k odpovídajícímu monoklonálnímu imunoglobulinu, takže je jejich detekce ztížena. V takovém případě se doporučuje otestovat vzorek pomocí imunofixačního postupu 2 BJ (HR) (SM), kdy je reakce antiséra zesílena v důsledku delší doby inkubace. • Při polyklonálním pozadí se doporučuje použít vyšší zředění vzorku pro antisérové stopy a zejména pro stopu Ig G.

2. Moč

Pro imunofixační typy moče platí podobné interpretační koncept jako je popsaný výše pro séra.

Přítomnost Bence Jonesovy bílkoviny v moči je charakterizována :

• monoklonální frakcí zjištěnou anitséry proti volným a vázaným lehkým řetězcům kappa nebo lambda (stopy K nebo L), • stejnou monoklonální frakcí zjištěnou odpovídajícími antiséry proti volným lehkým řetězcům (stopy Kf nebo Lf), • nepřítomností reakce s trivalentním antisérem (stopa GAM).

Sérový paraprotein eliminovaný v moči bez Bence Jones bílkoviny je charakterizován :

• detekovaným jedním monoklonálním proužkem s trivalentním antisérem, • stejnou monoklonální frakcí zjištěnou jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům, • nepřítomností reakce s odpovídajícím antisérem proti volným lehkým řetězcům.

Sérový paraprotein eliminovaný v moči asociovaný s Bence Jonesovou bílkovinou je charakterizován :

• detekovaným jedním monoklonálním proužkem s trivalentním antisérem, • stejnou monoklonální frakcí zjištěnou jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům, • jednou monoklonální frakcí zjištěnou jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům, Tento proužek se všeobecně neposouvá na stejné úrovni jako proužek detekovaný trivalentním antisérem, • stejnou monoklonální frakcí zjištěnou jedním z antisér proti volným lehkým řetězcům. Ve vzácných případech tyto dvě frakce migrují společně (poté je obarvení ve stopě lehkých řetězců silnější než ve stopě GAM).

Polymerizované formy Bence Jonesovy bílkoviny jsou charakterizovány :

• nedostatek reakce s trivalentním antisérem. • několik frakcí zjištěných jedním z antisér proti volným a vázaným lehkým řetězcům, • stejnými frakcemi zjištěnými příslušnými antiséry proti volným lehkým řetězcům.

Interference a omezení

Viz VZORKY PRO ANALÝZU. Použití jiných, než specifických antisér pro tuto imunofixační metodu pro použití standardní masky, může mít špatný vliv na výsledky. Vzhledem k omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou touto metodou detekovány.

Řešení problémů

Pokud při dodržení veškerých pokynů pro přípravu a skladování materiálů a provedení testu uvedených v příbalovém letáku testy nevycházejí, kontaktujte technickou podporu svého dodavatele. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : www.sebia.com.

ÚDAJE O VÝkONU

Byly použity standardní materiály, příprava vzorku a postupy pro analýzu séra a moči. Všechny elektroforegramy byly vyhodnoceny vizuálně. Po vizuální kontrole elektroforeogramů nebyly viditelné žádné rozdíly mezi opakováními. Dobrá reprodukovatelnost gelu a mezi gely (přesnost) byla získána postupem HYDRAGEL 2 IF / BJ (HR).

Analýza séra (migračním programem 2 IF (HR))

Reprodukovatelnost mezi vzorky (na jednom gelu) a specifikum

Reprodukovatelnost mezi vzorky byla demonstrována na 3 různých patologických vzorcích : jeden s jednou monoklonální složkou o vysoké koncentraci a jeden o nízké koncentraci a jeden vzorek se čtyřmi monoklonálními složkami. Každý vzorek byl analyzován dvakrát na každém gelu pomocí postupu HYDRAGEL 2 IF (HR) a 2 šaržích gelů. Všechny testované vzorky poskytly identické výsledky pro obě šarže s typickými frakcemi očekávanými pro testovaný vzorek. Imunofixace umožňovala charakterizovat jednu monoklonální složku pro 2 první vzorky a 4 monoklonální složky pro třetí vzorek.

Reprodukovatelnost mezi gely a specifikum

Reprodukovatelnost mezi gely byla prokázána na 2 patologických vzorcích séra, jeden s jednou vysokou monoklonální složkou a jeden s 2 monoklonálními složkami. Každý vzorek byl analyzován jednou na každém gelu pomocí postupu HYDRAGEL 2 IF (HR) na 10 gelech stejné šarže. Všechny testované vzorky poskytly identické výsledky pro všechny gely s typickými frakcemi očekávanými pro testovaný vzorek. Imunofixace umožňovala charakterizovat jednu monoklonální složku pro první vzorek a 2 monoklonální složky pro druhý vzorek. - 178 -


Studie shody

Studie shody byly provedena na 36 různých vzorcích séra postupem HYDRAGEL 2 IF (HR) a dalším komerčně dostupném agaryzovém gelovém imunofixačním systému. 6 normálních a 30 patologických vzorků séra bylo analyzováno pomocí obou technik. Studie prokázala 100 % shodu mezi oběma technikami. Pro 6 patologických vzorků séra : úplná shoda. Pro 30 patologických vzorků séra : úplná shoda. U všech analyzovaných patologických vzorků séra byly výsledky získané jednotlivými postupy ve shodě a identické proužky byly zjištěny u všech patologických vzorcích v každém systému.

Citlivost

Byly připraveny následně ředěné 3 patologické vzorky, všechny s obsahem monoklonálních složek a analyzovány pomocí postupu HYDRAGEL 2 IF (HR) se specifickým antisérem. Výsledky jsou sumarizovány dále. Č. VZORkU 1 1 2 2 3 3 4 4

TYP mí kappa gama kappa alfa lambda gama lambda

MONOkLONÁLNÍ SLOŽkA

kONC. (g/dL) 0.50 0.50 0.55 0.55 1.29 1.29 0.88 0.88

Analýza vzorků čisté moči a ředěných vzorků séra (migračním programem 2 BJ (HR))

DETEkČNÍ LIMIT (mg/dL) HYDRAGEL 2 IF (HR) 6 12 25 25 12 12 25 12

Reprodukovatelnost mezi vzorky (na jednom gelu) a specifikum

Reprodukovatelnost mezi gely byla demonstrována na 2 různých patologických vzorcích moči obsahujících Bence Jonesovy bílkoviny, jeden s jednou monoklonální složkou o vysoké koncentraci a jeden o nízké koncentraci a jeden vzorek se 3 volnými lehkými řetězci. Každý vzorek byl analyzován dvakrát na každém gelu pomocí postupu HYDRAGEL 2 BJ (HR) a 2 šaržích gelů. Všechny testované vzorky poskytly identické výsledky pro obě šarže s typickými frakcemi očekávanými pro testovaný vzorek. Imunofixace umožňovala charakterizovat jednu monoklonální složku pro 2 vzorky moči a 3 monoklonální složky pro vzorek séra.

Reprodukovatelnost mezi gely a specifikum

Reprodukovatelnost mezi gely byla prokázána na 2 patologických vzorcích (jeden vzorek moči s vysokou koncentrací Bence Jonesovy bílkoviny a jeden vzorek séra se 3 monoklonálními složkami obsahujících jeden volný lehký řetězec). Každý vzorek byl analyzován jednou na každém gelu pomocí postupu HYDRAGEL 2 BJ (HR) na 10 gelech stejné šarže. Všechny testované vzorky poskytly identické výsledky pro všechny gely s typickými frakcemi očekávanými pro testovaný vzorek. Imunofixace umožňovala charakterizovat jednu monoklonální složku pro vzorek moči a 3 monoklonální složky pro vzorek séra.

Studie shody

Byla provedena studie shody na 28 různých vzorcích moči (4 normální a 24 patologických) a na 10 různých vzorcích séra (2 normální a 8 patologických) mezi postupem HYDRAGEL 2 BJ (HR) a dalším komerčně dostupném imunofixačním postupem na agaryzovém gelu : 6 normálních a 32 patologických vzorků bylo analyzováno pomocí obou technik. Studie prokázala 100 % shodu mezi oběma technikami : Pro 6 normálních vzorků moči a séra : úplná shoda. Pro 32 patologických vzorků moči a séra : úplná shoda. U všech analyzovaných patologických vzorků moči a séra byly výsledky získané jednotlivými postupy ve shodě a identické proužky byly zjištěny u všech patologických vzorcích v každém systému.

Citlivost

Byly připravené sériově ředěné typické vzorky s obsahem Bence Jonesových bílkovin a analyzovány pomocí postupu HYDRAGEL 2 BJ (HR) se specifickými antiséry. Minimální mez detekce pro Bence Jonesovy bílkoviny byla přibližně 1,2 až 2,5 mg/dL pro antiséra proti kappa a lambda (volným a vázaným lehkým řetězcům) a okolo 5 mg/dL pro antiséra proti volným lehkým řetězcům kappa a lambda. Vzhledem ke struktuře a typu volných lehkých řetězců a jejich polymerizaci se detekční limit může lišit a je obecně nižší než 5 mg/dL (proti volným lehkým řetězcům kappa nebo lambda).

- 179 -

BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY


Pour des informations complémentaires sur l'interprétation des profils obtenus par immunofixation, voir : For additional information on interpretation of immunofixation patterns refer to : 1. Brouet J.C. Orientation diagnostiquée en cas d’anomalies des immunoglobulines plasmatiques (Ig E exclues). La Revue du Praticien, n° 9, 21/03/91, p. 782 à 785. 2. Cameron J.S. 1987. The nephrotic syndrome. Am. J. Kidney Dis., 10 : 157-171. 3. Chopin N. 1991. Étude de la protéinurie. Inf. Tech. Biol., 1 : 23-28. 4. Cohen R., François B., Sabot J.F., Bernard P., Picq J.P., Adeleine P. 1985. Étude comparative de l’immunoélectrophorèse urinaire et de quatre index de sélectivité glomérulaire au cours des glomérulopathies chroniques. Path. Biol., 33 : 23-26. 5. Garnier J.P., Laurent D., Clauvel J.P., Danon F., Bousquet B., Dreux C. 1987. Dosages des protéines sériques : cause d’erreur en cas d’immunoglobuline monoclonale. Act. Pharm. Biol. Clin., 4, p. 275 à 278. 6. Jepperson J.O., Laurell C.B., Franzen B. 1979. Agarose gel electrophoresis. Clin. Chem., 25 : 629-638. 7. Joachim G.R., Cameron J.S., Chwartz M., Belker E.L. 1964. Selectivity of protein excretion in patients with the nephrotic syndrome. J. Clin. Invest., 43, 2332-2346. 8. Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation : Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd ed., 1994, 397 pp. 9. Keren D.F. Protein electrophoresis in clinical diagnosis. Arnold, London, Great Britain, 1st ed., 2003, 402 pp. 10. Le Bricon T., Erlich D., Bengoufa D., Dussaucy M., Garnier JP., Bousquet B. 1998. SDS-agarose gel electrophoresis of urinary proteins : Application to multiple myeloma. Clin. Chem., 44 : 1991-1997. 11. Le Carrer D. 1989. L’interprétation de l’électrophorèse des protéines. L’Eurobiologiste, Tome XXIII, n° 182, p. 27 à 33. 12. Le Carrer D. 1990. Protéinuries : Mise au point sur leur exploration biologique en 1990. L’Eurobiologiste, 190 : 395-405. 13. Le Carrer D., Nicolas A., Ducasse L. 1992. L’analyse des protéinuries au laboratoire de biologie en 1992. Revue française des laboratoires, 225 : 41-47. 14. Le Carrer D. 1991. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Première partie : Les techniques de diagnostic protéinologique, principes et limites. L’Eurobiologiste, Tome XXV, n° 194, p. 203 à 212. 15. Le Carrer D. 1991. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Seconde partie : Diagnostic protéinologique du myélome, de la maladie de Waldenström et des autres gammapathies monoclonales. L’Eurobiologiste, Tome XXV, n° 195, p. 283 à 285. 16. Le Carrer D. 1993. Intérêt du profil protéique, cible immunitaire en biologie clinique. Revue Française des Laboratoires. 17. Le Carrer D., Chopin N. 1994. Profil protéique urinaire : Proposition d’un protocole d’exploration biologique des protéinuries. Revue française des laboratoires, 269 : 29-37. 18. Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris. 19. Le Carrer D. 1994. Électrophorèse et Immunofixation des Protéines Sériques, Interprétations illustrées. Laboratoires SEBIA, 120 pp. 20. Philipon C. 1989. Protéines urinaires : Intérêt clinique et interprétation. Technique et Biologie, 6 : 239-249. 21. North M.L. Mars 1990 Détection et caractérisation d’une immunoglobuline monoclonale. Revue Française des Laboratoires, n° 203, p. 54 à 58. 22. Peltre G. 1990. Électrophorèse, les trois principes de base. Technique et Biologie, 1, p. 16 à 23. 23. Sicard D. 1990. Du bon usage de l’électrophorèse des protéines. Le Concours Médical, 05.05.90, 112, 16, p. 1513 à 1515. 24. Van Den Abelle. 1987. Électrophorèse des protéines sériques. Intérêt, limites, apport du profil protéique. Larc Medical, n° 7, Vol VI, p. 348 à 351. 25. Waller K.V., Ward K.M., Mahan J.D., Wismatt D.K. 1989. Current concepts in proteinuria. Clin. Chem., 35 : 755-765. 26. Whicher J.T., Spence C.E. 1987. Serum protein electrophoresis - an out moded test. Ann. Clin. Biochem., 24, p. 133 à 139. 27. Wendling A. 1986. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, Sept : 93-97.

- 264 -


SCHÉMAS / FIGURES Figure 1

Figure 2

9 10 78 56 34 12

11

12

13

15 14

Figure 3

Figure 4

12

123

456

789

10 11

12 13

34

5 6 sebia 78 9 10 11

12

14 15

Figure 6

2

4

Figure 5

4

3 2

a sebi

1

3

- 265 -

SCHÉMAS / FIGURES

Figure 7

Figure 8

Figure 9 HYDR 16

PR AGEL

17

18

19

OTEIN

20

21

22

(E)

23

15/30

24

25

26

sebia 27

28

29

30

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

11

12

13

14

15

HYDR 16

PR AGEL

17

18

19

OTEIN

20

21

22

(E)

23

15/30

24

25

26

sebia 27

28

29

30

1

- 266 -

2

3

4

5

6

7

8

9 10

11

12

13

14

15


Benelux SCS / Comm. V Jan Olieslagerslaan 41 1800 Vilvoorde Belgique / België Tél. : 32 (0)2 702 64 64 : 32 (0)2 702 64 60 Fax e-mail : [email protected]

Brasil Edifício Baker Office Tower Rua Barão do Triunfo, 73, conjunto 51 CEP 04602-000 Bairro Brooklin Paulista, São Paulo - SP Brasil Tel. : 55 11 3849 0148 Fax : 55 11 3841 9816 e-mail : [email protected]

GmbH Münsterfeldallee, 6 36041 Fulda Deutschland Tel. : 49 (0)661 3 30 81 Fax : 49 (0)661 3 18 81 e-mail : [email protected]

Hispania S.A. C/Sicilia, n° 394 08025 Barcelona España Tel. : 34 93 208 15 52 Fax : 34 93 458 55 86 e-mail : [email protected]

Inc. 400-1705 Corporate Drive Norcross, GA 30093 U.S.A. Tel. : 1 770 446 - 3707 Fax : 1 770 446 - 8511 e-mail : [email protected]

Italia S.r.l. Via Antonio Meucci, 15/a 50012 Bagno a Ripoli (FI) Italia Tel. : 39 055 24851 Fax : 39 055 0982083 e-mail : [email protected]

UK Ltd River Court, Meadows Business Park Station Approach, Blackwater Camberley, Surrey, GU17 9AB United Kingdom Tel. : 44 (0)1276 600636 Fax : 44 (0)1276 38827 e-mail : [email protected]

Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses - 91008 EVRY Cedex - France Tél. : 33 (0)1 69 89 80 80 - e-mail : [email protected]

Shanghai Representative Office Cross Tower, Room 2306-07 318 Fuzhou Road Shanghai 200001 China Tel. : 00 86 (21) 6350 1655 Fax : 00 86 (21) 6361 2011 e-mail : [email protected]

BJ (HR)

Recommend Documents