PEMBUATAN MEDIUM KULTUR JARIhIGAN-) Drs. fman Budisantosoo M.P.
I.
**)
PENDAHTILUAN Perbanyakan tanaman dengan sistem Kultur Jaringan dilaksanakan dalam
suatu laboratorium yang aseptik, baik peralatan maupun bahan-bahannya. Peralatan sederhana yang masih sederhana dapat digunakan yaitu almari penabur (ent kas) buatan
sendiri ataupun dengan peralatan laboratorium kultur jaringan khusus yang lebih canggih seperti Laminar Air Flow Cabinet.
Salah satu faktor penentu keberhasilan pelaksanaan kerja kultur jaringan adalah pemberian nutrisi dalam jumlah dan perbandingan yang benar pada medium
kultur. Medium yang dipergunakan pada kultur in vitro tumbuhan ada bermacammacam. Pemilihan medium tergantung pada jenis tanaman yang digunakan, selera,
tujuan serta perhitungan masing-masing peneliti (George Z. Sherringlon, 1984 dalam Indrianto,
4
2002). Pada dasarnya tidak ada satu macam medium kultur yang dapat
rnemberikan pertumbuhan optimal untuk semua sel, penggantian medium atau salah
satu komponen medium seringkali diperlakukan untuk merespon setiap type pertumbuhan dan satu macam eksplan.
II.
PEMBUATAN MEDIUM KI]LTUR Sebelum membuat medium, maka terlebih dahulu kita harus menentukan
medium apa yang akan kita buat. Jenis medium dengan komposisi unsur kimia yang berbeda dapat digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda pula.
Misalkan, medium Vacin Went sangat baik untuk media tumbuh Anggrek, tetapi tidak cocok untuk media tumbuh tanaman yang lain. Untuk menanam eksplan dari tanaman keras sering menggunakan medium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dantanaman hias) sering menggunakan medium
MS Medium Knudson C hanya cocok
untuk menanam eksplan kelapa Kopyor dan Anggrek.
*)
Disampaikan dalam rangka Pengenalan Teknik Kultur Invitro Anggrek MGMP guru SMAN Tegal, Purwokerto, 15 Desember 20T5
bio.unsoed.ac.id
*8) Dosen Tetap Fakultas Biologi Unsoed
2
Untuk membuat medium kultur jaringan, biasanya menimbang setiap : bahan
kimia yang terdapat pada resep media dasar. Bahan kimia media seperti hara makro, sukrosa, agar-agar dapat ditimbang biasa, sementara untuk bahan media seperti hara
mikro, besi, vitamin, hormon dan mio-inositol karena ukuran sangat kecil maka harus dilakukan dengan cara membuat larutan stok supayatakaran sesuai dengan resep yang ditentukan, Untuk pembuatan larutan stok harus cermat, jangan terlalu pekat karena dapat terjadi pengendapan bila disimpan dalam lemari es, bila terjadi pengendapan harus dipanaskan dulu sebelum digunakan dan bila terkontaminasi mikoorganisme tidak
boleh digunakan lagi.
l. Cara pembuatan
larutan stolg media MS, stok hara mikro.
Sebagai contoh akan diuraikan tentang cara pembuatanlarutan stok mikronutrien
pada medium MS. Mikronutrien yang diperlukan jumlahnya sangat sedikit, maka stok
mikronutrien harus dibutat dalam satu wadah sebagai stok campuran. Di bawah ini akan dibuat larutan stok (Ari Indrianto, 1990) dengan volume 500 ml (100 kali konsentrasi). Dalam contoh ini sengaja dibuat 100 kali konsentrasi. Tujuannya adalah supaya dalam penimbangan komponen bahan kimia tidak mengalami ksesulitan sebab berat bahan
kimia tersebut sangat kecil (CoClz.6l{z0 beratnya 0,025 mili gram). Apabila konsentrasi dikalikan 100 maka penimbangan menjadi 2,5 mlli gram sehingga tidak
telalu kecil dan tidak sulit untuk ditimbang. Langkah-langkah pembuatannya ialah sebagai berikut
:
(a) Menimbang bahan-bahan kimia mikronutrien dengan timbangan analitik masingmasing sebanyak MnSO+.HzO
.
2.230,0 mg
ZnSOq.4HzO
860,0 mg
{rBo,
624,0 mg
KJ
83,0 mg
NaMoO+.2I{zO
25,0 mg
CuSO+.5HzO
2,5 mg
CoClz.6HzO
2,5 mg
(b) Bahan-bahan tersebut dimasukkan satu per satu ke dalam gelas piala 500 ml yang
bio.unsoed.ac.id
berisi air suling sebanyak 300 ml. Setiap kali dimasukkan bahan kimia harus segera
3
dilarutkan (botol erlenmeyer digoyang-goyang pelan-pelan dengna arah memutar). Kemudian bahan-bahan berikutnya
di
masukkan. Apabila semua bahan kimi a
dimasukkan secara bersamaan, dapat teqadi presipitat (endapan). Apabila bahan kimia tersebut adayang sukar dilarutkan, daprt menggunakan alat magnetic stirer.
(c) Larutan yang sudah jadi kemudian ditambah air suling sampai volume menjadi 500 ml.
(d) Botol-botol tersebut ditutup dengan rapat, kemudian diberi label : Mikronutrien 100
kali,5 mlll. (e) Untuk membuat
I liter medium memerlukan 5 ml stok, dan untuk membuat 50 ml
ml stok. Untuk larutan stok besi karena komponen Naz.EDTe dan Fe2SO4.7H2O sukar larut di dalam air suling, maka perlu medium memerlukan 2,5
ditambahkan beberapa tetes HCl, dan kemudian dipanaskan.
2.2.
Stok Zat Pengatur tumbuh
zat pengatur tumbuh yang akan digunakan memerlukan pengetahuan tentang cara menghitung dosisnya. Hal ini sangat penting karena apabila Penentuan
perhitungannya keliru dapat berakibat fatal bagi pertumbuhan jaringan Seperti telah diuraikan di muka bahwa zat pengatur tumbuh dengan dosis yang terlalu tinggi justru akan mnghambat pertumbuhan kalus.
Zat pengatur tumbuh hanya diperlukan dalam jumlah sedikit sekali. Biasanya zat pengatur tumbuh ini dibuat dengan kepekaan 1-10 mglml. Menurut Indrianto (1990), cara membuat larutan stok IAA,
(l
NAA 2,4-D
mglT ml) adalah sebagai berikut
(1)
sebanyak 100 ml dengan dosis 1000 ppm
:
Bahan sebanyak 100 mg ditimbang dan setiap bahan dituangkan ke dalam gelas
piala 100 ml yang berisi air suling kira-kira 70 ml.
(2) Sambil diaduk, diteteskan sedikit larutan KOH 1 N dengan hati-hati sampai Iarut benar (ernih). (3) Larutan dipindahkan dalam labu takar 100 ml dan ditamb ah air suling sampai volume menjadi 100 ml. (4) Memindahkan larutan ke dalam wadah stolg kemudian ditutup rapat-rapat, dan diberi label IAA (t mg/ml), NAA (l mglml), 2,4-D (t mg/ml), atai IBA (l
bio.unsoed.ac.id
mg/ml). Selanjutnya disimpan dalam almari es.
I ml stok setara dengan 1 mg
(5) Untuk membuat perlakuan auksin pada auksin.
Sisa dari larutan stok dapat disimpan dan dapat digunakan lagi apabila membuat
medium yang lain. Jika larutan stok yang tersedia tadi dalam dosis 1000 ppm, dan diumpamakan pembuatan medium yang baru memerlukan larutan stok dengan dosis
2 ppm sebanyak 500 ml, maka larutan stok yang dengan rumus sebagai berikut
VlMl :
Vl : Ml :
akan kita ambil dapat dihitung
:
V2M2 volume larutan stok yang dicari (x) dosis larutan stok yang tersedia
v2:
volume medium yang akan dibuat
l\/t2 :
dosis medium yang akan dibuat
Maka perhitungannya adalah sebagai berikut
VlMl : x.1000
x
: :
:
Y2M2 500.2 T
mlllrter
Berarti untuk membuat medium dengan volume 500 ml, kita mengambil larutan stok sebanyuP. -
J9i 1000
rT= o,5ml
2.3. Cara Membuat Medium MS
Komposisi hormon dalam media sangat bervariasi, tergantung dari spesies atau varietas tanaman yang dikembangbiakan, eksplan yang dipakai, d,an tujuan dari
kultur. Oleh karena itu, penambahan zat pengatur tumbuh tidak dapat diterapkan kadarnya.tidak dapat diterapkan kadarnya.ikut
ini
dijelaskan tahap -tahap pembuat
medium yang diperjelas dengan skema pembuatan medium MS (Gambar- 20).
bio.unsoed.ac.id
Makro nutrien
Stok mikronutrien Stok vitamin
Sukrosa
Ukur pH 5.7 -5. Bila pH kurang tambah KOH Bila pH lebih tambah HCL
Tambahkan aquades sampai volume menjadi 1000 ml
Masukkan AGAR-AGA& panaskan sampai larut sambil diaduk dengan pengaduk kaca
Tuangkan larutan dalam erlenmeyer atau botol kultur
Tutup botol dengan kapas dan alumunium foil, lalu STERILISASI
bio.unsoed.ac.id
Gambar 20- Skema pembuatan medium MS volume
I liter
2.4. Keterangan Gambar
l.
:
Menyiapkanalat-alat yang akan digunakan, yaitu
:
timbangan analitik, tabung
erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, pipet, pengaduk kaca, stirer, kompor gas, kerta pH, botol medikunq aluminium foil, kapas (boleh tidag.
2.
Bahan kimia makro nutrien dan setiap larutan stok sudah dipersiapkan dengan dosis I mglmtl. Aquades sebanyak kurang lebih 300 ml dalam labu erlenmeyer dipersiapkan.
Menimbang komponen-komponen bahan
kimia makro nutrierq
kemudian
dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer tadi satu per satu sambil digoyangkan secara memutar datar sehinggabahan kimia yang dituangkan sungguh-sungguh larut. 5.
Mengambil larutan stok besi, mikro nutrien,vitamin dan hormon yang dosisnya 1000 ppm, sehingga untuk
I liter medium harus diambil
10
ml larutan stok. Labu
erlenmeyer digoyangkan. 6. Menimbang mio-inositol dan sukrosa, kemudian dimasukkan ke dalam labu satu
per satu sambil digoyang-goyangkan sampai larut. Aquades dituangkan sampai kurang lebih menjadi 900 ml(mendekati 1000 ml). 8. pH-nya diukur dengan menggunakan kertas pH, dan dilihat angkanya pada skala warna. Bila pH masih dibawah 5,7 maka perlu ditambah KoH 1-2 tetes, tetapi bila pH sampai mencapai 6,0 (melebihi 5,g) maka ditambah HCI 1 tetes. 7.
9.
Menuangkan aquades hingga volume mencapai 1000 ml.
10. Memasukkan agar-agar ke dalam labu. 11. Erlenmeyer dipanaskan
di atas kompor gas sambil diaduk dengan pengaduk kaca
sampai mendidih dan agarnya larut semua. 12"
Dituang ke dalam botol medium kurang lebih 5 -10 ml perbotol, tergantung besar kecilnya botol.
13' Botol medium ditutup dengan aluminium
foil, dan diusahakan supaya benar-benar
tertutup rapat. 14' Memasukkan botol-botol medium tersebut dengan
ke dalam autoklaf dan disterilisasi suhu 1200c, dantekanan r,5 kglcmz selama 15 - zomenit.
bio.unsoed.ac.id
7 15.
Botol-botol yang mediumnya sudah steril diangkat, kemudian disimpan di tempat yang sejuk sampai siap untuk penanamaneksplan.
Daftar Pustaka Hendaryono, D.P.S. dan Ari Wijayani,I994
Teknik Kultur Jaringan. Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif - Modern, Penerbit Kanisius - Iakarta.
.r€
bio.unsoed.ac.id
