Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999
TEKNIK PEMBUATAN KULTUR MEDIA BAKTERI YUSUF HIDAYAT DAN SUTARMA Balai Penelitian Veteriner, JI.R.E. Martadinata 30, Bogor 16114.
RINGKASAN Media adalah suatu substansi yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembang biakan bakteri . Untuk menaikan tekanan osmose dan menjaga keseimbangan fisikokhemis sel-sel bakteri yang tumbuh, kedalam media harus ditambahkan NaCL. Wadah yang digunakan pada pembuatan media dipakai alat-alat gelas dan stainless, sedangkan pH (derajat keasaman) media bisa diukur dengan kertas penunjuk, pH meter dan zat penunjuk . Untuk sterilisasi media dapat dilakukan dengan uap air panas bertekanan (autoclave), uap air panas yang mengalir (steam) atau dengan saringan Seitz EK, sedangkan alat-alat gelas disterilisasi dengan udara panas kering (oven) . Setiap batch media yang sudah dikontrol sterilitas dan mutunya harus disimpan pada suhu 5°C-8°C, selama belum/tidak dipakai .
PENDAHULUAN Media adalah suatu substansi yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembang biakan jasad renik (mikroorganisme) . Media dapat berbentuk padat, cair dan semi padat (semi solid) . Didalam laboratorium mikrobiologi, kultur media sangat penting untuk isolasi, pengujian sifat-sifat phisis dan biokhemis bakteria serta untuk diagnosa suatu penyakit . Zat makanan yang dibutuhkan bakteri pada umumnya sangat bervariasi, dapat berbentuk senyawa-senyawa organik sederhana atau senyawa-senyawa organik komplek (majemuk) . Untuk menumbuhkan bakteri pada tanah cukup dengan mempergunakan senyawa organik sederhana, tetapi bakteri patogen membutuhkan media' yang mengandung ekstrak daging bagi pertumbuhan dan perkembang biakannya . Ekstrak daging mengandung antara lain : asam-asam amino dan pepton (Supar dan Ibrohim, 1981) . Pepton adalah sebagai sumber/persediaan nitrogen bagi pertumbuhan bakteri, mudah larut dalam air, tidak rusak/menggumpal pada suhu tinggi dan juga berfungsi sebagai buffer (penyangga) . Pepton dapat dibuat dengan pengasaman atau hidrolisa dengan enzym dari protein hewani atau protein nabati, seperti : otot, hati, darah, susu, kasein, laktalbumin, gelatin dan kacang kedelai (Cowan, 1975) . Selain mengandung zat makanan, media harus mengandung NaCL untuk menaikan tekanan osmose media . Tekanan ini sangat penting bagi keseimbangan fisikokhemis suatu sel bakteri yang tumbuh dalam media tersebut . Lebih dari 200 macam media tersedia dan dikenal untuk pembiakan, pemeliharaan dan identifikasi bakteri, namun demikian tidak semua media dapat mendorong pertumbuhan bakteri . Ada bakteri tertentu yang memerlukan . media
149
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999
spesifik/khusus untuk pertumbuhannya . Menurut jenis dan kegunaannya media dapat dikelompokan sebagai berikut : media dasar, media penyubur, media selektif, media disferensial dan media yang mengandung karbohidrat . Unit Media Balai Penelitian Veteriner Bogor dalam penyiapan kebutuhan media untuk penelitian bakteriologi khususnya yang bersifat umum, dilakukan tahapan-tahapan sebagai berikut : penimbangan, penggunaan bahan pelarut dan wadah, pengukuran derajat keasaman (pH), pengisian dan sterilisasi, kontrol sterilitas dan uji pertumbuhan serta penyimpanan . Tulisan ini disajikan sebagai informasi cara membuat kultur media bakteri secara umum .
TAHAPAN PEMEMBUAT MEDIA Penimbangan, penggunaan pelarut dan wadah Media yang akan dibuat selain yang siap pakai, artinya untuk membuatnya tinggal menimbang dengan jumlah tertentu kemudian melarutkannya, ada pula yang harus diramu dengan komposisi yang ditentukan (Anonymous, 1982 dan 1994) . Timbangan yang praktis dipakai adalah timbangan "top loading" Sartorius yang mempunyai angka 2 atau 3 desimal (2 atau 3 angka dibelakang koma) . Untuk menghindari adanya bahan-bahan yang dapat mempengaruhi kelarutan (solubilitas) zat yang digunakan, merubah warna media jika kena panas, meracuni (bakterisidal) atau dapat menghambat pertumbuhan bakteri dalam pembuatannya digunakan air suling (aquadest) sebagai pelarutnya . Sedangkan untuk wadah •tempat melarutkan, jika jumlahnya sedikit dipakai alat-alat gelas seperti erlenmeyer atau gelas piala, jika pembuatannya dengan jumlah banyak dipakai ember yang terbuat dari stainless . Wadah dari tembaga atau seng tidak digunakan untuk menghindari terjadinya kelarutan pada kedua metal tersebut, karena keduanya diketahui mudah teroksidasi dan korosif. Jumlah sekecil apapun dari kedua metal ini jika terlarut dalam media akan bersifat sebagai bakterisidal (Collin dan Patricia, 1987) . Pengukuran derajat keasaman (pH) Pengukuran derajat keasaman atau eksponen hidrogen (pH) media sangat penting . Jika terlalu asam atau basa, maka pertumbuhan bakteri akan dihambat . Hampir semua bakteri tumbuh pada media pH 7 .00 - 7 .50, dan hanya beberapa saja yang tumbuh pada media yang pH nya dibawah 7 .0, misalnya Mycobakterium, yaitu bakteri tahan asam yang tumbuh pada media pH 6 .8 . Pengukuran pH hendaknya dilakukan pada suhu kamar, untuk menghindari penyimpangan/kesalahan . Pengukuran bisa dengan : kertas penunjuk (indikator), pH meter elektrik dan zat penunjuk . dilakukan Untuk memperoleh pH media yang kehendaki, jika terlalu rendah dipakai tetesan larutan NaOH I N, sebaliknya jika terlalu tinggi diturunkan dengan tetesan larutan HCL' 1 N . Zat penunjuk dipakai khususnya pada media diferensial yang mengandung karbohidrat atau unsur karbon lain, digunakan untuk mempelajari sifat-sifat bakteri . Jika penunjuk yang dipakai adalah phenol red, maka warna media adalah merah, karena pH 7 .0 - 7 .5 . Kemudian jika terjadi fermentasi karbohidrat oleh bakteri, maka media
1 50
Lokakarva Fungsional Non Pene lai 1999
akan berubah menjadi asam, pH nya akan turun yang menyebabkan warna . media berubah menjadi kuning . Bermacam-macam zat penunjuk yang biasa dipakai serta jarak perubahan warnanya dapat dilihat pada Tabel 1 . Pengisian dan Sterilisasi Pengisian media yang sudah diukur pH nya kedalam tabung/botol sebaiknya jangan terlalu penuh untuk menghindari tumpah atau pecah jika disterilkan .. Untuk bentuk padat yang mengandung 2% agar-agar atau bentuk semi solid yang mengandung 0,2% - 0,5% agar-agar, sehelum diisikan harus dipanaskan dahulu supaya agarnya larut dan homogen . Sedangkan untuk pembuatan media agar plat . dimasukan kedalam erlenmeyer yang kemudian ditutup dengan kapas/alumunium foil . Media dalam tabung, botol atau erlenmeyer, kemudian disterilkan dengan uap air jenuh bertekanan (autoclave) . Pada proses ini ada hubungan antara suhu yang diinginkan dengan tekanan uap airnya (Tabel 2) . Dengan sterilisasi sel-sel vegetatif dan spora bakteri akan mati . Jika media tersebut mengandung bahan-bahan yang tidak bisa disterilkan dengan autoclave, dapat disterilkan dengan uap air yang mengalir, suhunya 100° C (steam) . Lama sterilisasi dengan steam bervariasi antara 10 - 30 menit, tergantung bahan yang disteril, media yang mengandung selenit atau tetrationat cukup 10 menit, dan untuk karbohidrat 30 menit (Cowan, 1975) . Untuk mensterilkan bahanbahan yang tidak tahan terhadap panas, misal serum, beberapa macam vitamin dilakukan sterilisasi dengan menggunakan saringan, yaitu mengunakan kertas saring ashes (SEITZ EK), dengan bantuan pompa vakum yang bisa menyedot atau menekan udara . Sedangkan untuk mensterilkan alat-alat gelas, dipakai sterilisasi panas kering (hot air open), suhunya 160°C selama I jam atau 170°C selama 40 menit (Collin dan Patricia, 1987) . Pada pengisian kedalam cawan-cawan petri dilakukan secara aseptik didalam "biohazard" atau dekat nyala api bunsen untuk menghindari kontaminan dari udara . Pada pembuatan media agar slope (agar miring), media dalam tabung/botol yang masih panas/cair dimiringkan dan diganjal dengan tabung kaca, lalu diatur sedemikian sehingga ujung media tidak terlalu dekat dengan leher botol/tabung . Pengisian media kedalam tabung/botol dan cawan petri yang biasa digunakan dapat dilihat pada Tabel 3 . Kontrol sterilitas, uji pertumbuhan dan penyimpanan Setiap batch media yang dibuat sebelum digunakan harus dikontrol dahulu sterilitasnya, yaitu dengan menyimpan didalam inkubator pada suhu 37"C selama 24 jam . Media yang terkontaminasi harus dibuang . Beberapa sampel media yang sudah dikontrol sterilitasnya diuji pertumbuhannya dengan bakteri yang cocok untuk penggunaan media tersebut, misal untuk media agar Brilian green (BRG) digunakan bakteri Salmonella, dan untuk agar Mac Conkey (MCC) digunakan bakteri E.coli . Media yang baik adalah apabila media BRG dengan pertumbuhan Sabnonella harus berubah warna menjadi merah, dan media MCC dengan pertumbuhan E.coli harus berubah menjadi merah .
151
Lokakarva Fungsionu! Non Penelitt 1999
Media-media yang sudah dikontrol sterilitas dan uji pertumbuhannya selaina belum digunakan harus disimpan didalam lemari pendingin (cool room) suhu 5"C-8‚C . Beberapa contoh media siap pakai dapat dilihat pada gambar 1 .
° ° t t)tt st)It)1b+1ttlit)11 °1 t. -SC At1141I1)14+1fJ!111I t 11011+0f4I1)It)14I4 1 0It °1 f utt01014 1 4h1-0101t °1 4 44 4)a0 1uIt+11-04t)1 0 I01 4 11414 . Of, t)It) 1 . 01to1411t It II °I tkoIt)Ift1U , 09t)ft 01444$1141-14)4+)14110Ift11+I1 )ttIIU4t °+ ~OI1)141f011)11 14 , if+IIt1It114If+)tt)90lh °0 4-04.4101t,14-)4it11)14111+0f 1014014111VIt 111014111)141It4otoatiIV1o .4f-Oft 01ft10a41410a4 , 04 . 144t' 11 .04 . 01 1 )a1110141of , it II IIt01014 .14, 90u 8 01f .1 4,+04 )01 1164 )14)44ttz011)t4 t+)10 f411 4 , I1+14 04t01t111114 , 11 . 0Ito9t)I(I 0 1 . 04 °I ft 0 4- 14-2W .e10a004- . 04 1 14+114 1,tiIIt0140a41 11'6 1 .bItIIt1&4 . 4 . 6 0 9 t0 V ,Z1146414f , 0411114 to I111111fl-I6to9toIt)ttt °O f . 0tt i °+ i1+1f )i1134+01 +1 t11114 , 11)14 , 14 t/ 441(t1 0 1t11411 . II If+) ftott)$4 , 1t , ~0010a01 0 1 f0ft) 9 412 4 °0 441111 >s1)t04 .14 )t u114 , - 1+1 . 1410411t , 04of0 411t)It)1f ., 04(Itfle(0C . 0#' . 10t 844 ~11 1 1411+,1414 41016)9 4 +* ° . It 1 9 01t)I 404+)1ut1 ° ° -- -e014, 4 4 f 4ttlN t A~I4 1 . :,, 11++) t11n ti (I 14), )It1auaa .ii + ))4 f O f+ ° 1 f°) )1U11+'t. .)40)1141)1a4' .+41 11 4 041 °1 -11141F 4191t01 014- . 4It ° ltHtOS41t t)tt 14L,~ '14 ''St t)t+ to 41 1) 1 , , 14' . t•1 11~i4H~"tf 4 ) 1t)` 141 f to 1 t*t ' 1t(0 9 00 9 ))1'4L 1 °0 0 ! t 10, 0 ° 00, ; 1011$ , .04W °fv)
a
a
:,- )e
Gambar 1 . Contoh media siap pakai
KEMUNGKINAN KESALAHAN YANG BISA TERJADI Kesalahan pertama kemungkinan dalam penimbangan, pencampuran bahan, penggunaan bahan yang salah serta pengukuran keasaman (pH) media . Kesalahan selanjutnya yang bisa terjadi antara lain adalah ° Berkurangnya kapasitas pertumbuhan : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan (over sterilisasi), pencairan yang berulang dari media padat, tercampur dengan garam-garam logam, dan salah penggunaan moralitas larutan yang dapat merubah pH . ° Penyusutan kekentalan : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan, hidrolisis media yang mengandung agar karena pH rendah, dan pencairan berulang dari media padat .
152
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999
Warna menjadi keruh (gelap) : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan akibat terjadi karamelisasi karbohidrat (gula-gula), dan pemanasan yang tidak merata . Perubahan pH : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan, pencampuran yang tidak merata (homogen), hidrolisis dari bahan-bahan yang dipakai, menggunakan wadah yang bersifat alkali, dan pemanasan berulang . Pengendapan : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan, pemanasan media agar yang terlalu lama dengan temperatur tinggi, dan bahan-bahan yang dipakai tidak sesuai .
KESIMPULAN Dalam pembuatan kultur media yang perlu diperhatikan adalah 1 . Mengandung zat-zat makanan (nutrisi) yang bisa dipergunakan untuk pertumbuhan dan perkembang biakan bakteri . 2 . Mempunyai tekanan osmosis/tegangan permukaan dan derajat keasamari (pH) yang sesuai . 3 . Tidak mengandung zat-zat penghambat/inhibitor dan bakterisidal . 4 . Steril .
DAFTAR BACAAN ANONYMOUS 1994 . Difco Manual of Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiological and Clinical Laboratory Procedures . Tenth edition . Detroit, Michigan USA . ANONYMOUS 1982 . The Oxoid Manual of Culture Media, Ingredients and other Laboratory Service, Fifth edition . Basingstoke - England . COLLIN .C H and PATRICIA M .LYNE 1987 Microbiological Method, Fifth edition . Butterworths, London . COWAN ST 1975, Cowan and Steel's Manual for identification of medical bacteria . Second edition, Cambridge University Press . Cambridge . SUPAR dan IBROHIM 1981 . Kultur Media dan Cara Pembuatannya . Balai Penelitian Penyakit Hewan Bogor .
1 53
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999
Lampiran I Tabel 1 . Zat penunjuk yang biasa dipakai untuk pembuatan kultur media bakteri ')
")
Konsen trasi (%) xx )
-Methyl red - Andrade's
0,2 0,5
Penambahan NaOH 0,05 N per gram penunjuk (ml) 30 "1
-Litmus Bromcresol purple Bromthimol blue
2,5 0,2 0,2
Penunjuk
Jarak pH Pelarut
Perubahan warna asam ke basa
alkohol 50% air
4,2-6,3 5 - 8
37
alkohol 40% air/alkohol 50 %
5 - 8 5,2-6,8
merah - kuning merah muda kuning (pink) merah - biru kuning - unggu
32
air/alkohol 50 %
6,0-7,6
Kuning - biru
Neutral red 0,1 air/alkohol 50% 6,8-8,0 Phenol red 0,2 57 air 6,8-8,4 x"x) Surnber Cowan 1975 ; ") 30 nil NaOH I N ; 10 ml larutan penunjuk untuk 1 liter media
Merah - kuning Kuning - merah
Tabel 2 . Hubungan antara suhu dan tekanan uap air jenuh pada sterilisasi dengan autoclave ') Suhu (° C) 100 105 110 115,5 121 127 134,5 '' Sumber
154
kg/cm2 0 0,20 0,43 0,72 1,06 1,50 2,11
Tekanan uap air Win' 0 2,8 6,1 10,2 15,0 21,2 30
: Cowan 1975 Keterangan : 1 lb = 454 gram
Waktu Sterilisasi (menit) 30 25 20 15 6 2
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999
Lampiran 2 . Tabel 3 .
Pengisian kultur media kedalam botol, tabung clan cawan petri Spesifikasi
Alat gelas
Tabung
Botol - MacCartney - Universal - Universal - Bijou -Bijou -Roux Cawan petri
Isi Media (ml)
Tinggi (cm) 10 12,50 15 10
Diameter (cm) 1,20 1,50 1,50 1,00
Isi (MI) 8 17 21 7
Cair
Padat
5 8,50 10 3,50
Semi Solid 5 8,50 10 3,50
8 9 7 .20 4,80 6,50 26,50 1,40 1,20 1,60 1,50
2,50 2,60 2,70 2,00 2,30 9,00 6,50 11,50 10,00
24 30 30 6,50 15,50 1100 62,50 35 125 100
12 13 14 3 7 -
12 13 3 -
10 10,50 12 2,50 6 150 15 - 20 12- 15 25 - 30 20-25
4 7 . 8 2,50
I Keterangan : Bentuk padat dalam tabung/botol untuk pembuatan media agar slope/agar miring
155
