Přehledné práce
BIOMARKERY TOLERANCE A REJEKCE PO TRANSPLANTACI LEDVINY BIOMARKERS OF TOLERANCE AND REJECTION AFTER KIDNEY TRANSPLANTATION EVA KRYŠTŮFKOVÁ, ONDŘEJ VIKLICKÝ Klinika nefrologie TC a Transplantační laboratoř PEM, Institut klinické a experimentální medicíny, Praha ABSTRAKT
Pro dlouhodobé pøijetí transplantované ledviny je nezbytná úèinná celoživotní imunosuprese. Pøi nedostateèné imunosupresi mùže dojít k rejekci štìpu, která mùže vyústit v jeho dysfunkci. Používání nových úèinných imunosupresivních režimù je spojeno s øadou nežádoucích úèinkù, zejména vìtším rizikem vzniku kardiovaskulárních onemocnìní, infekcí, malignit a lékové nefrotixicity. Hledají se biomarkery odrážející imunologický stav pacienta, které by umožnily individualizovat imunosupresivní terapii. Pøi hodnocení pøedtransplantaèního rizika je hlavním cílem mìøení úrovnì bunìèné a protilátkové allosenzitizace a urèení pøedtransplantaèního poškození štìpu. K tomu se využívá genová a proteinová expresní analýza a funkèní testy jako jsou metody detekce anti-HLA protilátek a IFN-γ ELISPOT. Cílem potransplantaèního vyšetøení je pøedpovìdìt rejekci a dlouhodobou funkci štìpu a dále identifikovat potenciálnì operaènì tolerantní pacienty, kteøí budou profitovat z minimální imunosuprese. Využívané metody jsou detekce anti-HLA protilátek, IFN-γ ELISPOT, molekulární fenotypizace bioptických vzrokù a analýza genové exprese v krvi, fenotypizace leukocytù a detekce imunitních markerù v moèi pomocí ELISA. I když je role biopsie zatím nezastupitelná, rozpaky spojené s interpretací øady nálezù vedou ke snaze zavést do bìžné praxe ménì invazivní a pøitom vìrohodnìjší metody, které lépe pomohou øídit léèbu nemocných po transplantaci ledviny. Klíèová slova: Transplantace ledviny, transplantaèní tolerance, regulaèní lymfocyty, tolerance, biomarker, ELISPOT, Luminex, molekulární fenotyp, HLA.
SUMMARY
Long-term renal graft acceptance requires lifelong immunosuppressive therapy. Insufficient immunosuppression could lead to graft rejection and its dysfunction. The use of new immunosuppressive regimens is accompanied by many adverse effects, in particular a higher risk of cardiovascular diseases, infections, malignancies and drug nephrotoxicity. Research continues for biomarkers that reflect a patient’s immunological status and thus allowing for individualized immunosupressive therapy. The main aim of the pretransplant risk evaluation is the assessment of cellular and humoral allosensitization and graft preinjury. In current use are gene and protein expression assays and functional tests, as such the methods for anti-HLA antibodies detection and IFN-γ ELISPOT. Prediction of rejection and long-term graft outcome and identification of potential operationally tolerant patients, who could profit from minimal immunosuppresive therapy, is the goal of post-transplant investigation. Several methods have been used, such as anti-HLA antibodies detection, IFN-γ ELISPOT, molecular phenotyping of bioptic samples, gene expression analysis of blood samples, leukocyte phenotyping and detection of immune markers in urine by ELISA. Although the role of renal graft biopsy is not substitutable, uncertainties with interpretation of many findings lead to efforts for introducing less invasive and more reliable methods which could better support administration of the treatment to patients after transplantation. Key words: Renal transplantation, transplantation tolerance, regulatory T cells, tolerance, biomarker, ELISPOT, Luminex, molecular phenotype, HLA.
AKTUALITY V NEFROLOGII
• ROČNÍK 16 • 2010 • ČÍSLO 1
27
Přehledné práce ÚVOD Pro dlouhodobé pøijetí transplantované ledviny je nezbytná úèinná celoživotní imunosuprese. Pøi nedostateèné imunosupresi mùže dojít k rejekci štìpu, která mùže zpùsobit poškození štìpu vedoucí k jeho dysfunkci. Podle èasového hlediska se rejekce dìlí na akutní a chronické. Podle toho, jaký typ imunitní odpovìdi se pøi rejekci uplatní, na humorální (zprostøedkované protilátkami) a celulární (zprostøedkované T-buòkami). Zavedením kalcineurinových inhibitorù (CNI) cyklosporinu A (1985) a takrolimu (1994) do klinické praxe došlo k významnému snížení výskytu akutních rejekcí po transplantaci a tím i ke zlepšení pøežívání štìpù i pøíjemcù v èasném období po transplantaci a støednìdobì. Nicménì dlouhodobé pøežívání štìpù se v posledních letech výraznì nezlepšilo a chronická rejekce zùstává hlavní pøíèinou ztráty funkce štìpu v pozdním období po transplantaci [1]. Používání nových úèinných imunosupresivních režimù je navíc spojeno s významnì vyšším rizikem vzniku kardiovaskulárních onemocnìní, infekcí, diabetu, malignit a lékové nefrotoxicity. Tumory a kardiovaskulární choroby jsou nejèastìjšími pøíèinami úmrtí po transplantaci ledviny, zatímco infekce jsou nejèastìjší pøíèinou nemocnosti a nejèastìjší indikací k hospitalizaci [2]. V nedávné minulosti jsme byli svìdky snah o podávání co nejmenších dávek imunosupresiv. Cílem bylo snížit rizika vzniku výše uvedených komplikací spojených s imunosupresivní léèbou. Tato strategie ale nemìla oèekávaný pozitivní dopad na dlouhodobé výsledky transplantací ledvin pøedevším pro èasto pozorované zhoršení funkce štìpù a pozdní rejekce. Problém spoèívá v naší neschopnosti identifikovat ty nemocné, u kterých je snížení dávek imunosupresiv bezpeèné. V souèasné dobì se proto vìnuje velká pozornost fenoménu tolerance. Ten je náhodnì zjišśován u pacientù po transplantaci ledvin (nebo jater), kteøí pøestali užívat imunosupresi v dùsledku noncompliance nebo z nutnosti vysazení napøíklad pro malignitu nebo lékovou toxicitu [3]. Skuteèná, pravá tolerance transplantátu byla definována již v roce 1953 Billinghamem jako dobrá funkce štìpu, který je bez histologických známek rejekce, v nepøítomnosti jakéhokoli imunosupresivního léèiva, u imunokompetentního pøíjemce schopného pøijmout druhý štìp od stejného dárce, zatímco štìp od jiného dárce by byl odhojen [4]. Pionýrské práce Haška [5] pøinesly stejné závìry jako práce Medawara a spol. [6]. V klinické medicínì se používá termín „operaèní tolerance“ (operational tolerance) nebo „klinická operaèní tolerance“ (clinical operational tolerance). Tento termín je ménì striktnì definován jako stav, kdy je funkce štìpu stabilní nìkolik let po vysazení imunosuprese u pøíjemce, který ale zùstává imunokompetentní. Stav operaèní tolerance po transplantaci ledvin je popisován relativnì zøídka (< 1/1000) v porovnání s výskytem po transplantaci jater (zhruba 10 % - 15 %) [7–9]. Zatímco po transplantaci jater je použití imunosupresivních protokolù navozující toleranci u urèité skupiny pacientù možné a bezpeèné,
28
u pøíjemcù ledvinného štìpu je pokus o navození stavu operaèní tolerance spojen s vysokým rizikem ztráty štìpu [10]. V souèasné dobì je pøedmìtem klinických studií nìkolik protokolù s cílem navodit trvalé pøijetí štìpu s žádnou nebo nízkodávkovou imunosupresí [11–14]. Dosavadní výsledky ale neumožòují bezpeèné širší použití. Tolerance je tedy v souèasnosti klinicky prakticky nedosažitelná. Nalezení a využívání nových biomarkerù, které by identifikovaly pøedtransplantaèní imunitní riziko, vèas odhalily zaèátek imunitní odpovìdi proti štìpu nebo naopak stav neodpovídavosti vùèi štìpu, by umožnilo nastavit imunosupresivní terapii dle potøeby každého pacienta (individualizovaná imunosuprese), èili pøedejít tomu, aby funkce imunitního systému byly potlaèeny ménì nebo více, než je tøeba (obrázek 1).
Obr. 1: Individualizovaná imunosuprese (dle Sawitzki [21]). Nové biomarkery by mìly napomoct pøi stratifikaci pacientù dle imunitního rizika pøed transplantací a tak i volbì imunosupresivní terapie, po transplantaci pak pøedpovìdìt rejekci a umožnit vèasný terapeutický zásah nebo naopak identifikovat potenciálnì tolerantní pacienty, u kterých mùže být imunosuprese bezpeènì minimalizována.
Definice biomarkeru Biomarker je podle Biomarkers Definition Working Group znak, který je objektivnì mìøitelný a hodnotitelný jako indikátor normálních biologických procesù, patologických procesù nebo farmakologické odpovìdi na terapeutickou intervenci. [15] Konveèními a rutinnì užívanými testy po transplantaci ledvin je mìøení sérového kreatininu, odhad glomerulární filtrace a proteinurie. Tyto biomarkery funkce štìpu mohou upozornit na rejekèní epizodu. Jsou však nespecifické – zhoršení funkce štìpu mùže být zapøíèinìno napøíklad lékovou toxicitou, zhoršenou perfuzí štìpu nebo obstrukcí vývodných cest moèových. Kromì klinicky zøejmé rejekce, charakterizované poklesem funkce štìpu, mùže probíhat i rejekce bez klinických známek – subklinická. Samotné biomarkery funkce tak k její identifikaci nejsou použitelné. Zatím jediným bìžnì užívaným diagnostickým nástrojem k odhalení rejekce je histologické vyšetøení vzorku tkánì štìpu získaného biopsií. K té se pøistupuje v pøípadì zhoršení funkce transplantátu a dále se na vìtšinì pracovišś provádí u všech pacientù šest týdnù nebo tøi mìsíce po transplantaci. Zaøazení této tzv. protokolární biopsie do
AKTUALITY V NEFROLOGII
• ROČNÍK 16 • 2010 • ČÍSLO 1
Přehledné práce vyšetøovacího protokolu je opodstatnìno právì existencí subklinické rejekce. Zmìnám funkce štìpu pøedchází strukturální zmìny, jimž pøedchází zmìny imunitní reaktivity. Výše zmínìné biomarkery nepodávají informaci o stavu imunitního systému. Hledají se proto nové, imunitní markery, které by tuto informaci podaly a pomohly tak zamezit vzniku imunitní reakce nebo jejímu plnému rozvoji, který by pak vyústil v poškození štìpu (obrázek 2).
Obr. 2: Zmìny pøi rejekci a jejich monitorování. S-Cr – sérový kreatinin; GFR – glomerulární filtrace; PU –proteinurie
K hodnocení stavu imunitního systému jsou využívány funkèní testy, fenotypizace leukocytù a genová a proteinová expresní analýza. Mezi funkèní testy patøí metody k detekci HLA protilátek a IFN-γ ELISPOT. Fenotypizace leukocytù je provádìna pomocí prùtokové cytometrie. Genová expresní analýza využívá microarray technologie a metody real-time RT-qPCR. K analýze proteinové exprese slouží metoda ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
PŘEDTRANSPLANTAČNÍ VYŠETŘENÍ Hlavními faktory, které ovlivòují dlouhodobé výsledky transplantace ledviny, jsou pøedtransplantaèní poškození štìpu (dárcovské faktory, prodloužená ischémie, smrt mozku) [16–18] a donor-reaktivní imunologická pamìś (bunìèná i protilátková). Ta je výsledkem pøedchozí senzitizace imunitního systému pøíjemce expozicí cizím lidským leukocytárním antigenùm (HLA; napø. pøi opakovaných transfuzích, tìhotenství, pøedchozí transplantaci), zkøíženou reaktivitou nebo tzv. heterologní imunitou (infekèním agens navozená tvorba T-lymfocytù se zkøíženì reaktivní specifitou) [19, 20]. Pomocí cross-match testu (CM), rutinnì provádìného pøed každou transplantací, jsou eliminováni pøíjemci s preexistujícími donor-reaktivními protilátkami, které by po transplantaci zpùsobily hyperakutní rejekci vedoucí ke ztrátì štìpu. Pøedpokládá se, že pak pøekážkou vzniku tolerance a dùvodem vzniku rejekce po vysazení imunosuprese po transplantaci ledviny jsou pamìśové T-lymfocyty reagující na dárcovské antigeny [21]. Pøesto, že jejich klíèová role pøi vzniku rejekce je již dlouho
AKTUALITY V NEFROLOGII
• ROČNÍK 16 • 2010 • ČÍSLO 1
známá, pøítomnost donor-reaktivních T-lymfocytù není zatím bìžnì vyšetøována [21]. Pøi hodnocení pøedtransplantaèního rizika je hlavním cílem mìøení úrovnì bunìèné a protilátkové alosenzitizace a pøedtransplantaèní poškození štìpu. K tomu jsou využívány funkèní testy a genová a proteinová expresní analýza. Pro detekci HLA protilátek se používá klasická metoda založená na komplement-dependentní cytotoxicitì (CDC) a novìji metody využívající ELISA a prùtokovou cytometrii. Panel reaktivní protilátky (PRA). U všech pacientù zaøazených na èekací listinu je každé tøi mìsíce hodnocena frekvence PRA, protilátek testovaných na bunìèném panelu se známými HLA antigeny. Imunologické riziko vyjádøené procentem PRA hraje roli pøi alokaci ledvin (z pacientù v normálním poøadí na èekací listinì jsou upøednostòování ti s vysokou frekvencí protilátek proti HLA) a pøi volbì imunosupresivního režimu. Cross-match. Pøed transplantací se provádí crossmatch test neboli køížová zkouška, která ukáže reaktivitu pøíjemce na buòky dárce. Pozitivní cross-match je ve vìtšinì transplantaèních center považován za absolutní kontraindikaci k provedení transplantace, i když již existují protokoly, které transplantaci umožní (ovšem za cenu silné imunosuprese a horších výsledkù). Kromì standardní køížové zkoušky se v praxi používá i køížová zkouška s využitím prùtokové cytometrie (FCXM, flow crossmatch), která je minimálnì desetkrát citlivìjší a zachycuje i protilátky nevázající komplement (necytotoxické). Luminex. V posledních letech byly pøedstaveny metody detekce protilátek založené na vazbì na pevnou fázi. Nejpoužívanìjší se stal Luminex, který má vìtší senzitivitu než CDC metody. Na rozdíl od nich detekuje i protilátky nevázající komplement, pøesnì definuje protilátky namíøené proti jednotlivým lokusùm i jednotlivým alelám, umožòuje kalkulaci virtuálního PRA a predikci pozitivního cross-match (virtuální cross-match) (review [22]). IFN-γ ELISPOT. Detekci a kvantifikaci pamìśových/ efektorových alloreaktivních T-lymfocytù umožòuje relativnì nová, vysoce senzitivní metoda IFN-γ ELISPOT (enzyme-linked immunosorbent spot). Využívá sendvièovou ELISA k mìøení IFN-γ tvoøeného lymfocyty pøíjemce
Tab. 1: Pøedtransplantaèní vyšetøení; biomarkery, metody jejich stanovení a imunitní procesy, o nichž biomarkery vypovídají. Metoda
Biomarker
Imunitní proces
PRA, CM, Luminex
anti-HLA protilátky
protilátková alosenzitizace
IFN-γ ELISPOT
donor-reaktivní T-lymfocyty
bunìèná alosenzitizace
ELISA
sCD30
nejasný
PRA – panel reactive antibody, panel reaktivní protilátky; CM – cross-match, køížová zkouška; IFN-γ ELISPOT – enzyme-linked immunosorbent spot, ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay; HLA – human leukocyte antigen, lidské leukocytární antigeny; CD – cluster of differentiation, povrchové molekuly leukocytù; „s“ – soluble, rozpustný
29
Přehledné práce po jejich stimulaci buòkami dárce. T-lymfocyty, které se zatím nesetkaly s antigeny, jimž jsou pøi testu vystaveny, budou reagovat jen malou produkcí IFN-γ na rozdíl od presenzitizovaných lymfocytù. Vysoká frekvence donor-reaktivních T-lymfocytù pøed transplantací koreluje s rizikem tìžké akutní rejekce v èasném potransplantaèním období [19, 23–25] a je nezávislá na jiných známých korelátech presenzitizace jako je vysoká koncentrace PRA, pøedchozí transplantace, krevní transfuze a tìhotenství [19]. Nekoreluje s poètem neshod v HLA A, B a DR [23]. Donor-reaktivní bunìèná senzitizace nemusí znamenat humorální senzitizaci a naopak. Z uvedeného vyplývá, že pacienti s vysokou frekvencí IFN-γ produkujících T-lymfocytù by mohli profitovat z terapie imunosupresivy, která pùsobí inhibici nebo depleci pamìśových T-bunìk. Augistene et al. [20] ukázali výrazný pokles rejekcí u ELISPOT(+) pacientù, kteøí dostali indukèní terapii (antithymocytární globulin nebo anti-CD25 protilátku). Souèasnì došlo po transplantaci k poklesu IFN-γ produkujících T-lymfocytù. Naopak u ELISPOT negativních pacientù s indukcí a bez ní byl výskyt rejekcí srovnatelný. Z toho vyplývá, že pøedtransplantaèní mìøení donor-reaktivní bunìèné imunity by mohlo sloužit k individualizaci indukèní terapie. sCD30. Jako slibný marker rejekce štìpu spojený se zhoršenými výsledky transplantace se jevila vysoká koncentrace molekuly sCD30 pøed transplantací (i po ní) [26-29]. Vzniká odštìpením membránovì vázané molekuly CD30 z bunìèného povrchu. Její nízké sérové koncentrace se nacházejí u zdravých jedincù, vyšší sérové koncentrace byly detekovány za patologických situací jako je SLE, revmatoidní artritida a další [30]. Využití sCD30 k pøedtrasplantaèní stratifikaci rizika ale ztìžuje nález velkých interindividuálních rozdílù v sérových koncentracích u potenciálních pøíjemcù ledvinných štìpù [31]. Geny kódující proteiny, uplatòující se pøi zánìtu. Jsou dùkazy o tom, že již intraoperaènì probíhá ve štìpu mírný zánìt. Avihingsanon et al. [32] definovali sadu genù (vèetnì TNF-alfa, IL-6 a CD25) exprimovaných ve tkáni
štìpu 15 minut po vaskulární reperfuzi, která pøedpovídá epizodu akutní rejekce a šestimìsíèní funkci štìpu.
POTRANSPLANTAČNÍ VYŠETŘENÍ Cílem potransplantaèního vyšetøení je identifikovat pacienty s vìtším rizikem rejekce nebo s poèínající rejekcí a vèas terapeuticky zasáhnout nebo naopak rozpoznat pacienty, u kterých mùže být imunosuprese minimalizována nebo dokonce vysazena. Jak bylo výše uvedeno, k diagnostice subklinické i klinické rejekce se bìžnì používá jen histologické vyšetøení biopticky získaného vzorku tkánì štìpu. Ideální by bylo nahradit tuto invazivní metodu s nízkou senzitivitou metodami neinvazivními nebo ménì invazivními a citlivìjšími, proto jsou hledány biomarkery stanovitelné v krvi a v moèi. K hledání biomarkerù imunitního stavu po transplantaci se využívají metody IFN-γ ELISPOT, analýza genové exprese, fenotypizace leukocytù a detekce imunitních markerù v moèi pomocí ELISA. Biomarkery v krvi Detekce HLA protilátek, IFN-γ ELISPOT. I v potransplantaèním období se používá detekce protilátek proti dárcovským antigenùm a to pøi podezøení na humorální rejekci v biopsii štìpu. Potransplantaèní monitorování IFN-γ produkujících donor-reaktivních T-lymfocytù bìhem prvních týdnù mùže odhalit pacienty s nastupujícím imunitním poškozením štìpu a umožnit tak vèasnou úpravu imunosuprese [19]. V procesu rejekce alogenního štìpu se uplatòují rùzné populace bílých krvinek. U pacientù s akutní a chronickou dysfunkcí štìpu by mìly být detekovatelné odlišné lymfocytární subpopulace než u pacientù se stabilní funkcí štìpu. Pøedpokládá se, že nemocní s operaèní tolerancí budou v periferní krvi vykazovat množství specifických znakù charakteristických pro stav tolerance. Treg. Nejvíce zkoumanou bunìènou populací v transplantologii se od jejich objevení v roce 1995
tolerance
rejekce
Tab. 2: Potransplantaèní vyšetøení; biomarkery, metody jejich stanovení a imunitní procesy, o nichž biomarkery vypovídají. Metoda
Biomarker
Imunitní proces
PRA, CM, Luminex
anti-HLA protilátky
protilátková alosenzitizace
IFN-γ ELISPOT
donor-reaktivní T-lymfocyty
bunìèná alosenzitizace
ELISA
IP-10
chemoatrakce
analýza genové exprese
granzym B, perforin CD154, ICOS TOAG-1 α-1,2-manosidáza
bunìèná cytotoxicita kostimulace regulace T-bunìèné apoptózy negativní regulace aktivity T-bunìk
prùtoková cytometrie
CD4+CD25highFoxP3+ podíl mCD4+/mCD8+ a CD4+CD25+FoxP3+
pøítomnost regulaèních T lymfocytù (bunìk udržujících toleranci)
analýza genové exprese
geny tvoøící „otisk tolerance“
klidový stav imunitního systému
PRA – panel reactive antibody, panel reaktivní protilátky; CM – cross-match, køížová zkouška; IFN-γ ELISPOT – interferon-gamma enzymelinked immunosorbent spot, ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay; HLA – human leukocyte antigen, lidské leukocytární antigeny; CD – cluster of differentiation, povrchové molekuly leukocytù; IP-10 interferon-inducible protein; ICOS – inducible costimulator; TOAG-1 – tolerance associated antigen; FoxP3 – forkhead box P3, transkripèní faktror charakteristický pro T regulaèní buòky
30
AKTUALITY V NEFROLOGII
• ROČNÍK 16 • 2010 • ČÍSLO 1
Přehledné práce staly CD4+CD25+ T regulaèní buòky (Treg). Pozdìji byl identifikován transkripèní faktor FoxP3, klíèový pro rozvoj a funkci Treg, jehož mutace nebo nižší exprese jsou u èlovìka asociovány s nìkterými autoimunitními chorobami. FoxP3 mùže být pøechodnì exprimován v aktivovaných T-buòkách, které ale nevykazují regulaèní funkce. Dále byly popsány další subpopulace T regulaèních bunìk – CD4+ Tr1, Th3, D8+CD28-, NK T-buòky, nicménì za nejdùležitìjší jsou považovány CD4+CD25+FoxP3+. U zdravých jedincù je imunitní homeostáza udržována rovnováhou mezi efektorovými T-buòkami a T regulaèními buòkami. U operaènì tolerantních pacientù po transplantaci ledviny byly v periferní krvi namìøeny vysoké koncentrace CD4+CD25highFoxP3+ [33]. Studie Braudeau et al. ukazují redukované množství periferních CD4+CD25highFoxP3+ u pacientù s chronickou rejekcí v porovnání s pacienty se stabilní renální funkcí na imunosupresi i bez ní (operaènì tolerantní pacienti) [34]. Kreijveld et al. [35] ukázali vìtší pomìr mezi pamìśovými CD8+ nebo CD4+ a CD4+CD25+FoxP3+ Treg tìsnì pøed vysazením takrolimu u pacientù, u kterých vznikla akutní rejekce po vysazení tohoto CNI oproti pacientùm bez rejekce. Dále zaznamenali pokles v zastoupení naivních CD4+ bunìk u pacientù v nižším riziku akutní rejekce po vysazení takrolimu. Kombinace obou tìchto markerù tvoøí test s vysokou prediktivní hodnotou. V souèasnosti je studován vliv používané imunosuprese na koncentrace Treg. Ukazuje se, že øada imunosupresiv, donedávna považovaných za depleèní nebo inhibièní pro všechny druhy T-bunìk, šetøí populaci Treg nebo dokonce podporuje její expanzi. V budoucnu by se tìchto poznatkù dalo využít k podpoøe pøijetí štìpu, možná v kombinaci s léèbou založenou na T regulaèních buòkách [36]. Transkripty cytotoxických lymfocytù. Cytotoxické lymfocyty hrají dùležitou roli pøi vzniku rejekce štìpu. Bylo popsáno zvýšení transkriptù cytotoxických lymfocytù jako je granzym B a perforin v mononukleárních buòkách periferní krve v dobì akutní rejekce nebo dokonce døíve [37, 38]. Kostimulaèní geny. Alakluppi et al. [39] ukázali, že vyšší exprese kostimulaèních genù CD154 a ICOS (inducibilní kostimulátor), je spojena s akutní rejekcí. TOAG-1 a α-1,2-manosidáza. Skupina Volka a Sawitzké [40] identifikovala ve dvou transplantaèních modelech (ledviny a srdce) u dvou živoèišných druhù (potkan a myš) dva nové markery k predikci rejekce štìpu a trvalého pøijetí štìpu – TOAG-1 a α-1,2-manosidáza. TOAG-1 (tolerance associated antigen) je gen kódující protein zatím neznámé funkce. Dosud provedené testy ukazují, že by se mohl uplatòovat v regulaci apoptózy T-bunìk. α-1,2-manozidáza je dùležitá pro N-glykosylaci membránovì vázaných a secernovaných proteinù. Pøi její inhibici dochází ke zvýšení produkce IL-2, dùležitého k pøežití, proliferaci a diferenciaci T-bunìk. Exprese obou tìchto genù je vysoká pøi pøijetí štìpu, klesá pøi rejekci a silnì pozitivnì koreluje s funkcí štìpu. K poklesu tìchto markerù v krvi i ve štìpu dochází tøi dny pøed akutní rejekcí.
AKTUALITY V NEFROLOGII
• ROČNÍK 16 • 2010 • ČÍSLO 1
„Otisk tolerance“. Práce Brouard et al. [41] vedla k identifikaci biomarkerù v krvi, specifických pro stav operaèní tolerance. Porovnáním vzorkù od operaènì tolerantních pacientù, pacientù s chronickou rejekcí a zdravých dobrovolníkù za užití metody cDNA microarray identifikovali „otisk tolerance“ (“tolerant footprint“) 49 genù schopných odlišit s vysokou specifitou fenotyp tolerance a chronické rejekce. Tento genový podpis odráží klidový stav imunitního systému. Biomarkery v moèi IP-10. V posledních letech se zamìøuje pozornost na markery rejekce detekovatelné v moèi, vzhledem k neinvazivitì metody. Jedním z nich je IP-10 (interferon-inducible protein). Jeho koncentrace a koncentrace mRNA pro IP-10 korelují s výskytem epizod akutní rejekce a dlouhodobou funkcí štìpu. Dùležitým poznatkem je, že zvýšené koncentrace moèového IP-10 bìhem prvních ètyø týdnù po transplantaci, pøedpovídaly funkci štìpu v 6 mìsících dokonce i v nepøítomnosti akutní rejekce [42]. Biomarkery v biopsii, protokolární biopsie Protokolární biopsie hraje zatím nezastupitelnou roli v diagnostice subklinické (i klinické) rejekce. Stanovení biomarkerù rejekce, pøijetí štìpu a dlouhodobé funkce štìpu ve tkáni transplantátu korelované s jeho funkcí a nálezem stejných biomarkerù v krvi a moèi, je cestou k zavedení ménì invazivních diagnostických metod. Pøedmìtem studia jsou také odlišné molekulární fenotypy pøedpovídající riziko progrese rejekce a selhání štìpu. Snaha o klinické využití tìchto poznatkù má velký význam, dokud se nestane protokolární biopsie nahraditelnou. FoxP3. Jak bylo uvedeno výše, FoxP3 se nenachází pouze v T regulaèních buòkách, ale je pøechodnì exprimován vìtšinou aktivovaných T bunìk. V biopsiích štìpu provedených z klinické indikace, byly nalezeny vyšší koncentrace FOXP3 mRNA u pacientù s diagnózou akutní rejekce v porovnání s pacienty bez rejekce. Vyšší koncentrace FOXP3 mRNA také korelovaly s delším pøežitím štìpu [43]. Dle Bunnang et al. [44], kteøí nalezli vyšší expresi FOXP3 mRNA v biopsiích transplantovaných pacientù s akutní rejekcí, avšak nepotvrdili asociaci s budoucí lepší funkcí štìpu, se FoxP3+ buòky nebo jejich prekurzory hromadí v místech zánìtu jako strategie ke kontrole možného vzniku autoimunity. Treg. Závìr, že pøítomnost FoxP3+ Treg ve štìpu hraje dùležitou roli v pøijetí štìpu, uèinili Bestard et al. [45] a Kawai et al. [11] První nalezli mezi transplantovanými, kteøí byli léèeni králièím antithymocytárním globulinem (ATG) a sirolimem, skupinu pacientù vykazující sníženou donor specifickou odpovídavost, která byla vázána na cirkulující Treg a pøítomnost FoxP3+ bunìk ve štìpu. Druzí popsali navození tolerance transplantací kostní døenì a ledviny od pøíbuzných žijících dárcù s neshodou v HLA a její udržení i po ztrátì chimérismu asociované s pøítomností Treg ve štìpu. Tento nález naznaèuje, že FoxP3+ buòky ve štìpu mohou indukovat lokální toleranci. Transkripty cytotoxických lymfocytù. Byla prokázaná silná korelace exprese transkriptù cytotoxických lym-
31
Přehledné práce focytù jako je granzym B a perforin ve štìpu s nálezem akutní rejekce po transplantaci ledvin [46, 47]. Podle složení transkriptù cytotoxických lymfocytù lze dokonce odlišit na terapii rezistentní a senzitivní rejekci [48]. TOAG-1 a α-1,2-manozidáza. Snížení exprese tìchto dvou genù, objevených skupinou Volka a Sawitzké, ve štìpu i v periferní krvi tøi dny pøed rejekcí na zvíøecím modelu již byla zmínìna výše. K možnému klinickému využití tìchto dvou genù jako markerù pøijetí štìpu je nutné provést jejich expresní analýzu u èlovìka. Cytokiny a chemokiny. Výzkumy v transplantaèní laboratoøi IKEM ukázaly, že nemocní se zvýšenou genovou expresí TGF-β1 a MCP-1 (monocyte chemoatractant protein 1) jsou ve vyšším riziku budoucího selhání [49] a že pacienti se specifickým molekulárním fenotypem rejekce (snížená exprese CD20) jsou v riziku její rezistence k léèbì a k rychlejší ztrátì funkce transplantované ledviny [50].
ZÁVĚR Novou možností jak dále pøispìt k individualizaci imunosuprese je hledání biomarkerù vypovídajících o aktuálním imunitním stavu nemocných. Výše popsané nové biomarkery nejsou zatím až na výjimky využívány v klinické praxi. V souèasnosti jsou pøipravovány studie, ve kterých bude imunosuprese po transplantaci ledviny pøizpùsobována právì podle tìchto biomarkerù. Jedinì prospektivní validace užiteènosti tìchto biomarkerù totiž mùže opodstatnit jejich budoucí klinické využití. Podìkování: Práce byla podpoøena grantem IGA MZ ÈR è. NS10517-3/2009.
LITERATURA 1. Berlanda, M., et al., Clinical operational tolerance after kidney transplantation: a short literature review. Transplant Proc, 2008. 40(6): p. 1847–51. 2. Dharnidharka, V.R., et al., Cat scratch disease and acute rejection after pediatric renal transplantation. Pediatr Transplant, 2002. 6(4): p. 327–31. 3. Ashton-Chess, J., et al., Spontaneous operational tolerance after immunosuppressive drug withdrawal in clinical renal allotransplantation. Transplantation, 2007. 84(10): p. 1215–9. 4. Billingham, R.E., L. Brent, and P.B. Medawar, Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature, 1953. 172(4379): p. 603–6. 5. Hasek, M., et al., [Immunologic considerations on embryonic parabiosis of duck and chick.]. Ceskoslov Biol, 1955. 4(3): p. 135–7. 6. Medawar, P.B., The immunology of transplantation. Harvey Lect, 1956(Series 52): p. 144–76. 7. Roussey-Kesler, G., et al., Clinical operational tolerance after kidney transplantation. Am J Transplant, 2006. 6(4): p. 736–46. 8. Martinez-Llordella, M., et al., Multiparameter immune profiling of operational tolerance in liver transplantation. Am J Transplant, 2007. 7(2): p. 309–19.
32
9. Martinez-Llordella, M., et al., Using transcriptional profiling to develop a diagnostic test of operational tolerance in liver transplant recipients. J Clin Invest, 2008. 118(8): p. 2845– 57. 10. Di Cocco, P., et al., Clinical operational tolerance after solid organ transplantation. Transplant Proc, 2009. 41(4): p. 1278–82. 11. Kawai, T., et al., HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. N Engl J Med, 2008. 358(4): p. 353–61. 12. Hutchinson, J.A., et al., A cell-based approach to the minimization of immunosuppression in renal transplantation. Transpl Int, 2008. 21(8): p. 742–54. 13. Pascual, J., et al., Calcineurin inhibitor withdrawal after renal transplantation with alemtuzumab: clinical outcomes and effect on T-regulatory cells. Am J Transplant, 2008. 8(7): p. 1529–36. 14. Scandling, J.D., et al., Tolerance and chimerism after renal and hematopoietic-cell transplantation. N Engl J Med, 2008. 358(4): p. 362–8. 15. Lesko, L.J. and A.J. Atkinson, Jr., Use of biomarkers and surrogate endpoints in drug development and regulatory decision making: criteria, validation, strategies. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2001. 41: p. 347–66. 16. Pratschke, J., et al., Review of nonimmunological causes for deteriorated graft function and graft loss after transplantation. Transpl Int, 2008. 21(6): p. 512–22. 17. Reutzel-Selke, A., et al., Donor age intensifies the early immune response after transplantation. Kidney Int, 2007. 71(7): p. 629–36. 18. Weiss, S., et al., Brain death activates donor organs and is associated with a worse I/R injury after liver transplantation. Am J Transplant, 2007. 7(6): p. 1584–93. 19. Nickel, P., et al., Enzyme-linked immunosorbent spot assay for donor-reactive interferon-gamma-producing cells identifies T-cell presensitization and correlates with graft function at 6 and 12 months in renal-transplant recipients. Transplantation, 2004. 78(11): p. 1640–6. 20. Augustine, J.J., et al., Preferential benefit of antibody induction therapy in kidney recipients with high pretransplant frequencies of donor-reactive interferon-gamma enzyme-linked immunosorbent spots. Transplantation, 2008. 86(4): p. 529–34. 21. Sawitzki, B., et al., Can we use biomarkers and functional assays to implement personalized therapies in transplantation? Transplantation, 2009. 87(11): p. 1595–601. 22. Tait, B.D., et al., Review article: Luminex technology for HLA antibody detection in organ transplantation. Nephrology (Carlton), 2009. 14(2): p. 247–54. 23. Heeger, P.S., et al., Pretransplant frequency of donor-specific, IFN-gamma-producing lymphocytes is a manifestation of immunologic memory and correlates with the risk of posttransplant rejection episodes. J Immunol, 1999. 163(4): p. 2267–75. 24. Bellisola, G., et al., Monitoring of cellular immunity by interferon-gamma enzyme-linked immunosorbent spot assay in kidney allograft recipients: preliminary results of a longitudinal study. Transplant Proc, 2006. 38(4): p. 1014–7. 25. Kim, S.H., et al., Pretransplant donor-specific interferongamma ELISPOT assay predicts acute rejection episodes in renal transplant recipients. Transplant Proc, 2007. 39(10): p. 3057–60. 26. Heinemann, F.M., et al., Association of elevated pretransplant sCD30 levels with graft loss in 206 patients treated with modern immunosuppressive therapies after renal transplantation. Transplantation, 2007. 83(6): p. 706–11. 27. Pelzl, S., et al., Soluble CD30 as a predictor of kidney graft outcome. Transplantation, 2002. 73(1): p. 3–6.
AKTUALITY V NEFROLOGII
• ROČNÍK 16 • 2010 • ČÍSLO 1
Přehledné práce 28. Susal, C., et al., Identification of highly responsive kidney transplant recipients using pretransplant soluble CD30. J Am Soc Nephrol, 2002. 13(6): p. 1650–6. 29. Susal, C., S. Pelzl, and G. Opelz, Strong human leukocyte antigen matching effect in nonsensitized kidney recipients with high pretransplant soluble CD30. Transplantation, 2003. 76(8): p. 1231–2. 30. Schlaf, G., et al., Soluble CD30 serum level--an adequate marker for allograft rejection of solid organs? Histol Histopathol, 2007. 22(11): p. 1269–79. 31. Altermann, W., et al., High variation of individual soluble serum CD30 levels of pre-transplantation patients: sCD30 a feasible marker for prediction of kidney allograft rejection? Nephrol Dial Transplant, 2007. 22(10): p. 2795–9. 32. Avihingsanon, Y., et al., On the intraoperative molecular status of renal allografts after vascular reperfusion and clinical outcomes. J Am Soc Nephrol, 2005. 16(6): p. 1542–8. 33. Louis, S., et al., Contrasting CD25hiCD4+T cells/FOXP3 patterns in chronic rejection and operational drug-free tolerance. Transplantation, 2006. 81(3): p. 398–407. 34. Braudeau, C., et al., Variation in numbers of CD4+CD25highFOXP3+ T cells with normal immuno-regulatory properties in long-term graft outcome. Transpl Int, 2007. 20(10): p. 845–55. 35. Kreijveld, E., et al., Immunological monitoring of renal transplant recipients to predict acute allograft rejection following the discontinuation of tacrolimus. PLoS One, 2008. 3(7): p. e2711. 36. Yeung, M.Y. and M.H. Sayegh, Regulatory T cells in transplantation: what we know and what we do not know. Transplant Proc, 2009. 41(6 Suppl): p. S21–6. 37. Sabek, O., et al., Quantitative detection of T-cell activation markers by real-time PCR in renal transplant rejection and correlation with histopathologic evaluation. Transplantation, 2002. 74(5): p. 701–7. 38. Simon, T., et al., Serial peripheral blood perforin and granzyme B gene expression measurements for prediction of acute rejection in kidney graft recipients. Am J Transplant, 2003. 3(9): p. 1121–7. 39. Alakulppi, N.S., et al., Diagnosis of acute renal allograft rejection by analyzing whole blood mRNA expression of lymphocyte marker molecules. Transplantation, 2007. 83(6): p. 791–8. 40. Sawitzki, B., et al., Identification of gene markers for the prediction of allograft rejection or permanent acceptance. Am J Transplant, 2007. 7(5): p. 1091–102.
AKTUALITY V NEFROLOGII
• ROČNÍK 16 • 2010 • ČÍSLO 1
41. Brouard, S., et al., Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(39): p. 15448–53. 42. Matz, M., et al., Early post-transplant urinary IP-10 expression after kidney transplantation is predictive of short- and long-term graft function. Kidney Int, 2006. 69(9): p. 1683– 90. 43. Muthukumar, T., et al., Messenger RNA for FOXP3 in the urine of renal-allograft recipients. N Engl J Med, 2005. 353(22): p. 2342–51. 44. Bunnag, S., et al., FOXP3 expression in human kidney transplant biopsies is associated with rejection and time post transplant but not with favorable outcomes. Am J Transplant, 2008. 8(7): p. 1423–33. 45. Bestard, O., et al., Achieving donor-specific hyporesponsiveness is associated with FOXP3+ regulatory T cell recruitment in human renal allograft infiltrates. J Immunol, 2007. 179(7): p. 4901–9. 46. Lipman, M.L., et al., The strong correlation of cytotoxic T lymphocyte-specific serine protease gene transcripts with renal allograft rejection. Transplantation, 1992. 53(1): p. 73–9. 47. Lipman, M.L., A.C. Stevens, and T.B. Strom, Heightened intragraft CTL gene expression in acutely rejecting renal allografts. J Immunol, 1994. 152(10): p. 5120–7. 48. Nickel, P., et al., Cytotoxic effector molecule gene expression in acute renal allograft rejection: correlation with clinical outcome; histopathology and function of the allograft. Transplantation, 2001. 72(6): p. 1158–60. 49. Hribova, P., et al., Intrarenal cytokine and chemokine gene expression and kidney graft outcome. Kidney Blood Press Res, 2007. 30(5): p. 273–82. 50. Viklicky, O., et al., Molecular Phenotypes of Acute Rejection Predict Kidney Graft Prognosis. J Am Soc Nephrol, 2010, v tisku.
MUDr. Eva Kryštùfková Transplantaèní laboratoø PEM Institut klinické a experimentální medicíny Vídeòská 1958/9 140 21 Praha 4 E-mail:
[email protected]
33
