BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada periode waktu Juni 2007 sampai dengan Juni 2008 di Instalasi Karantina Hewan (IKH) Balai Besar Karantina Hewan Soekarno Hatta dan Laboratorium Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian.
Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan yaitu: biosafety cabinet class II, ELISA reader, ELISA washer, microplate dasar V, multichannel micropipet 20-200µl, single microplate 5-50 µl, single microplate 20-200 µl, microplate dasar V (kit berjumlah 6 @ 16 well), konjugat 2.5 ml (tutup orange): protein A/peroksidase (konsentrasi 10x) konjugat diluent 50 ml, buffer peroxidase substrate 50 ml, kontrol negatif 2.5 ml (tutup hijau) dengan konsentrasi 10x, kontrol positif 2.5 ml (tutup merah) dengan konsentrasi 10x, sample diluent/SD 50 ml, wash solution 25 ml dan adesif film 6 film.
Metodologi Penelitian adalah suatu proses mencari sesuatu secara sistematis dalam waktu yang relatif lama dengan menggunakan metode ilmiah serta aturan yang berlaku. Dalam proses penelitian ini ditunjukkan untuk mengetahui hubungan antara titer antibodi terhadap virus rabies dengan risiko masuknya penyakit rabies dari negara yang belum bebas dan telah bebas penyakit rabies. Konseptualisasi proses tersebut kemudian dituangkan menjadi suatu metode penelitian lengkap dengan pola analisis observasi serta pengumpulan data yang diperlukan untuk melukiskan keadaan tersebut. Sesuai dengan anggapan dasar serta hipotesis dalam penelitian ini bahwa deskripsi yang dimaksudkan menggambarkan peubah yang digunakan untuk menilai pengaruhnya terhadap titer antibodi, serta menggambarkan peubah tersebut dalam menentukan angka titer kekebalan rabies. Data tersebut perlu dilakukan analisis untuk menguji hipotesis dan mengadakan interpretasi tentang hubungan dan pengaruhnya.
29 Kerangka Studi Penelitian ini menggunakan disain studi lintas seksional dengan metode penelitian kualitatif. Metode penelitian kualitatif merupakan metode penelitian yang berlandaskan pada falsafah positifisme.
Metode ini digunakan untuk
meneliti populasi, pengumpulan data menggunakan instrumen penelitian, analisis data bersifat kuantitatif/statistik dengan tujuan menguji hipotesis yang telah ditetapkan (Sugiyono 2006). Studi ini dilaksanakan dengan menggunakan kajian lintas seksional. Kajian lintas seksional adalah suatu kajian observasional yang meneliti secara sekaligus faktor exposure dan penyakit tanpa arah dimensi penyelidikan tertentu (Budiharta dan Suardana 2007). Pemilihan kajian ini dengan dasar studi dilakukan pada satu titik waktu (periode waktu satu tahun). Keuntungan dilakukannya studi lintas seksional ini adalah: 1. Sampel dipilih secara acak dari populasi target. 2. Cukup valid untuk melihat pengaruh suatu faktor risiko terhadap penyakit. 3. Memungkinkan untuk generalisasi hasil studi karena pengambilan sampel dilakukan pada populasi yang besar. 4. Memungkinkan untuk menyidik beberapa faktor penyebab potensial penyakit. Kajian ini akan memberikan potret pada satu saat tertentu atau periode tertentu. Kajian ini sangat baik untuk menguji hipotesis asosiasi antara penyakit dan faktor permanen (tidak akan berubah seumur hidup), misalnya umur, genetik dan sebagainya pada inferensi yang bersifat kausal (Budiharta dan Suardana 2007). Dependent
Independent 1. Antibodi protektif (positif) 2. Antibodi tidak protektif (negatif)
Faktor: 1. Umur 2. Aplikasi vaksin 3. Jarak waktu vaksinasi dengan pengujian serum darah 4. Status negara asal 5. Ulangan vaksinasi 6. Jenis kelamin 7. Jenis vaksin
Gambar 4 Kerangka disain penelitian.
30 Setiap kelompok diselidiki terhadap faktor risiko melalui data dan riwayat kesehatan hewan yang diperoleh dari lembar permohonan karantina, dokumen kesehatan yang disertakan bersama dengan hewan dari negara asal, serta lembar kartu status hewan saat dilakukan pemeriksaan di IKH. Setiap hewan dilakukan pengujian titer antibodi rabies dan dilakukan observasi selama 14 hari sesuai petunjuk teknis Badan Karantina Pertanian Indonesia (Surat Keputusan Kepala Badan Karantina Nomor 344.b/Kpts/PD.670.370/L/12/06). Hasil pengujian dimasukkan dalam tabel yang dibuat dengan berdasarkan pengelompokan nilai hasil pengujian titer antibodi, yaitu protektif dan tidak protektif. Data hasil pengujian titer antibodi yang telah diperoleh akan dilakukan analisis secara statistik chi square (X2) dengan umur, aplikasi vaksinasi, jarak waktu vaksinasi dengan pengukuran titer antibodi, ulangan vaksinasi, jenis kelamin, dan jenis vaksin guna mengetahui pengaruh masing-masing faktor terhadap titer antibodi. Uji statistik X2 digunakan untuk melihat hubungan antara faktor-faktor yang berpengaruh terhadap titer antibodi (Thrusfield 2005).
Tabel 1 Definisi operasional peubah penelitian No
Peubah
1.
Titer antibodi Titer protektif (positif) Titer tidak protektif (negatif)
2.
3.
Faktor umur Umur <6 bulan Umur >6 bulan
Definisi operasional Merupakan kelompok hewan yang memiliki nilai titer antibodi rabies ≥0.6 EU/ml Merupakan Kelompok hewan yang memiliki nilai titer antibodi rabies <0.6 EU/ml
Adalah hewan yang berumur kurang dari 6 bulan saat diimpor ke Indonesia Adalah hewan yang berumur lebih dari 6 bulan saat diimpor ke Indonesia
Cara aplikasi vaksin Injeksi Merupakan cara vaksinasi dengan melakukan Intramuskular injeksi vaksin pada otot (IM) Injeksi Merupakan cara vaksinasi dengan melakukan Subkutaneus injeksi vaksin pada jaringan dibawah (SC) kulit/subkutis
Skala Ordinal 2 1
Ordinal 1 2
Ordinal 1
2
31 No Peubah Definisi operasional 4. Jarak waktu vaksinasi dengan pengujian x < 1 bulan Selisih waktu vaksinasi dengan waktu pengujian serum darah kurang dari 1 bulan x > 1 bulan Selisih waktu vaksinasi dengan waktu pengujian serum darah lebih dari 1 bulan
Skala Ordinal 1
5.
Ulangan vaksinasi 0 Hewan mendapatkan vaksinasi rabies pertama kali 1 Hewan mendapat ulangan vaksinasi rabies satu kali ≥2 Hewan mendapat ulangan vaksinasi rabies dua kali atau lebih
Ordinal 1
Faktor status negara Negara bebas Negara-negara yang tidak pernah dilaporkan rabies (rabies terjadi kasus rabies, mempunyai system free country) surveilans penyakit yang efektif, mempunyai aturan yang jelas dalam pencegahan dan pengendalian rabies, serta Negara yang dalam periode 2 tahun terakhir tidak terjadi kasus rabies pada manusia maupun spesies hewan. Negara Negara yang dilaporkan masih terjadi kasus endemik rabies pada manusia maupun spesies hewan rabies dalam periode waktu kurang dari 2 tahun.
Ordinal 1
Jenis Kelamin Jantan Hewan yang memiliki alat reproduksi jantan dan belum dikastrasi Betina Hewan yang memiliki alat reproduksi betina dan belum disteril
Ordinal 1
Jenis vaksin
Ordinal 2
6.
7.
8.
Tunggal Kombinasi
Vaksin dalam satu vial hanya berisi antigen rabies Vaksin dalam satu vial berisi antigen rabies dan antigen lainnya.
Cara ukur
Observasi dan pemeriksaan titer antibodi
Alat ukur
1. Data pemasukan hewan Balai Besar Karantina Pertanian Soekarno Hatta (kuesioner pemilik) 2. Data hasil pemeriksaan laboratorium Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian Jakarta
2
2 3
2
2
1
32 Teknik Pengambilan Data Penelitian ini dilakukan pada anjing yang berasal dari negara bebas rabies dan negara endemik rabies (menurut daftar Wahid Interface OIE tahun 2008) pada periode waktu Juni 2007-Juni 2008. Data yang akan digunakan adalah data primer dengan mengumpulkan data pengujian laboratorium titer antibodi di Laboratorium Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian.
Sedangkan data
sekunder diperoleh melalui lembar permohonan karantina, dokumen kesehatan yang disertakan bersama dengan hewan dari negara asal, buku vaksinasi, dokumen karantina hewan serta lembar kartu status hewan saat dilakukan pemeriksaan di IKH.
Pengambilan Sampel Darah Pengambilan sampel darah dilakukan pada setiap kedatangan anjing yang berasal dari luar negeri (sampel 100% hewan yang datang) baik yang berasal dari negara bebas rabies dan negara endemik rabies. Setiap anjing yang datang akan diistirahatkan terlebih dahulu selama 1-2 hari agar kondisi tubuhnya berada pada kondisi yang baik sebelum dilakukan pengambilan darah. Pengambilan darah ditujukan untuk mendapatkan serum sebagai bahan untuk pemeriksaan kandungan antibodi rabies dari hewan yang telah divaksinasi. Darah anjing sebanyak 1-2 ml diambil dari Vena femoralis kaki belakang atau Vena saphena kaki depan dengan menggunakan spuit steril berukuran 2.5 ml. Spuit yang telah berisi darah kemudian dibiarkan pada suhu luar sampai terjadi pemisahan antara serum dan bekuan sel darah.
Cairan serum yang sudah
terpisahkan dari bekuan darah ini kemudian dipindahkan ke dalam tabung gelas/plastik (tabung venoject/ampul) yang steril.
Tabung yang berisi cairan
serum tadi kemudian disimpan dalam boks/kotak dengan suhu dingin (berisi batu es), atau langsung dimasukkan ke dalam freezer suhu -20 oC sampai serum tersebut digunakan atau diuji. Sebelum digunakan untuk pengujian, cairan serum diinaktivasi terlebih dahulu dengan cara menempatkan tabung berisi serum tadi pada mesin penghangat air (waterbath) dengan suhu 56 oC untuk selama 30 menit.
33
Gambar 5 Pengambilan sampel darah pada hewan impor.
Pemeriksaan Laboratorium Pada penelitian ini pemeriksaan titer antibodi terhadap virus rabies dilakukan dengan menggunakan metode ELISA. Metode ini merupakan salah satu metode yang direkomendasikan dalam Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines (OIE 2000). Metode ini cukup baik untuk digunakan sebagai pengujian cepat titer antibodi rabies. Menurut Cliquet et al. (2004), hasil pengujian titer antibodi anjing dengan menggunakan
ELISA
ini
menunjukkan
spesifisitas
yang
baik
apabila
dibandingkan dengan pengujian menggunakan gold standard uji fluorescent antibody virus neutralization (FAVN) yang direkomendasikan OIE, namun ELISA menunjukkan sensitifitas yang lebih rendah. Menurut Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2008, ELISA dapat digunakan sebagai pilihan uji alternatif untuk perdagangan dan lalu lintas hewan selain uji yang direkomendasikan, yaitu FAVN dan rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT). Uji ini telah divalidasi dan terbukti memiliki kinerja yang memuaskan dengan sensitifitas, spesifisitas dan kemampuan menunjukkan hasil yang sama pada pengujian berulang (Servat et al. 2007).
34
Gambar 6 Kit ELISA rabies pada sampel serum darah hewan.
Uji ELISA merupakan alat uji yang baik guna melakukan screening secara cepat terhadap sampel serum hewan kesayangan. Uji ini telah digunakan secara rutin sebagai uji standar pemeriksaan serum darah hewan kesayangan di karantina pertanian Indonesia. Keuntungan uji ini adalah mampu menampilkan hasil yang lebih cepat apabila dibandingkan gold standard yang dapat mencapai 4 hari. Alat uji ini hanya membutuhkan waktu 4 jam hingga diperoleh hasil titer antibodi. Pengujian laboratorium akan menggunakan diagnostic kit SERELISATM RABIES Ab Mono Indirect dengan sensitivitas 76.2% dan spesifisitas 97.2% (Cliquet et al. 2004). Prinsip kerja dari ELISA ini adalah berdasarkan atas ikatan antigen (Ag) coating di dasar sumur microplate dengan antibodi (Ab) dari serum dan konjugat yang ditandai adanya perubahan warna karena adanya penambahan substrat. Titer serum ditentukan berdasarkan atas optical density (OD) dalam bentuk equivalen unit terhadap serum standar OIE. Hasil titer yang protektif ditunjukkan dengan nilai ≥0.6 EU/ml yang nilainya ekuivalen dengan ≥0.5 IU/ml sebagai standar protektif titer antibodi menurut OIE, sedangkan sebaliknya akan dianggap tidak protektif. Prosedur kerja ELISA rabies ini dilakukan pertama kali dengan mengeluarkan kit ELISA dari refrigerator, sampel dan serum standar OIE dari freezer dan didiamkan pada suhu 27 oC (suhu ruang) selama 1 jam. Pengenceran dengan wash solution 1 bagian (20 ml) + 9 bagian (180 ml) air destilata; Plate
35 dasar F disediakan untuk pengenceran dan diisi 90µl sampel diluen (SD) pada A1G1 untuk standar serum OIE dan sumur-sumur selanjutnya sesuai dengan jumlah sampel yang akan diuji (tidak duplo). Selanjutnya dilakukan pengenceran serum sesuai standar OIE, yaitu sebagai berikut:1:10, 1:30, 1:100, 1:150, 1:300, 1:1000, 1:3000; Lalu dimasukkan 10 µl serum sampel ke dalam sumur-sumur yang sudah terisi SD dan dicampur mulai dari sumur H1, A2, B2, C2, dan seterusnya sesuai dengan jumlah sampel, selanjutnya plate kit ELISA diambil sesuai dengan jumlah sampel, lalu dimasukkan 90 µl SD pada sumur A1 dan A2 untuk kontrol negatif dan sumur B1 dan B2 untuk kontrol positif. Sebanyak 90 µl SD dimasukkan pada sumur C1, D1, E1, F1, G1, H1 dan C2, D2, E2, F2, G2, H2, dan A3, A4 untuk standar serum OIE dan sumur-sumur selanjutnya sesuai dengan jumlah sampel yang akan diuji (duplo). Sebanyak 10 µl kontrol negatif dimasukkan ke sumur A1 dan A2, 10 µl kontrol positif dimasukkan ke sumur B1 dan B2, 10 µl standar serum OIE dan serum sampel yang telah diencerkan dimasukkan ke sumur C1, D1, E1, F1, G1, H1 dan C2, D2, E2, F2, G2, H2 dan A3, A4, dan sumur-sumur selanjutnya sesuai dengan jumlah sampel yang akan diuji (duplo). Sumur-sumur ditutup dengan adhesive film dan larutan dilarutkan dengan shaker. Plate diinkubasi pada suhu 37±3 oC selama 1 jam ± 5 menit. Cairan dibuang dan dicuci 4 kali, masingmasing 3 menit. Sebanyak 100 µl buffer peroksidase ditambahkan ke substrat dan tidak ditutup dengan adhesive film, kemudian dilarutkan dengan shaker.
Plate
diinkubasi pada suhu 20±5 oC selama 30 menit ± 5 menit (warna berubah menjadi biru), setelah itu ditambahkan stop solution 50 µl dan warna akan berubah menjadi kuning. Selanjutnya, dilarutkan kembali dengan shaker dan terakhir dibaca OD pada 450 nm/630 nm (mesin ELISA Reader). Nilai valid bila OD kontrol positif ≥ 0.300 , OD kontrol negatif <0.50 x OD kontrol positif, koefisien korelasi diantara Ln Ods dan Ln rabies Ab untuk standar serum OIE >0.95. Titer kalkulasi: Ln [Rab Ab concentration (EU/ml)] = a+b*Ln OD, sampel Rab Ab concentration (EU/ml) = e(a+b* Ln OD), jika titer kalkulasi >0.5 dikatakan hewan protektif, sedangkan sebaliknya akan dikatakan tidak protektif.
36 Tabulasi Data Data pengujian yang telah diperoleh dan data kuisioner dikelompokkan berdasarkan faktor-faktor yang telah ditentukan.
Data yang layak digunakan
untuk analisis statistik.
Analisis Data Data yang telah dikumpulkan dan direkapitulasi sehingga diperoleh gambaran secara menyeluruh terhadap hasil pengumpulan data di lapangan. Menurut Hosmer dan Lemeshow (1989), untuk mengukur hubungan antara peubah terikat (dependent variable) dan peubah bebas (independent variable) dianalisis sebagai berikut : 1. Analisis univariat. Analisis ini berfungsi untuk melihat distribusi frekuensi responden menurut berbagai karakteristik yang diteliti, baik peubah terikat maupun peubah bebas. 2. Analisis bivariat. Analisis ini berfungsi untuk melihat besarnya hubungan antara peubah terikat dan peubah bebas 3. Analisis multivariat. Analisis ini berfungsi untuk melihat pengaruh beberapa faktor risiko yang signifikan secara bersamaan terhadap munculnya titer antibodi tidak protektif. Dengan analisis ini akan diperoleh nilai Odds Ratio (OR) yang dapat mengukur kekuatan asosiasi faktor tanpa memandang cara pengambilan sampel (Budiharta dan Suardana 2007). Dalam penelitian ini akan digunakan analisis statistik deskriptif, chi square (X2) dan statistik logistik regresi dengan menggunakan bantuan software SPSS versi 17.
