BAHAN DAN METODE Data penefitian ini berasal dari data primer dan data sehnder. Data primer dipmleh drtri dua bentuk peneIitian, yaitu: penehtian lapangan untuk memperol& data karaktm drsterd (ldcumlkuran tub* waroa dan pla m a ) dan penditian lsboratorium wtuk m e m p l e h data polimdsrne DNA
mihstelit
Data sekunder bentpa datrt mono@
populasi ternak diperoleh dari kantor Biro
Pusat
daerah peliiian dm
Statist& setiap Kabupateu
clam& penehtian dan kantor BAPPEDA Propinsi Sumatera Barat.
Tempat dam Waktu Penelitian lapangan diIakukan di tiga subpopdasi sapi Pesisir Sumatera B*
yaitu:
1. Desa Sungai L
h dan Pasir di K
Ranah Pesisir, Kabupaten Pesisir
Sehm2, Desa Ulakan dan Toboh di Kecmatm Ulakan Tapalas, Kabupten Padang 3. t k a Mum Putus dm Lubuak C;Hdang di K e m W m Tanjmg M u m -AgBm,
Peta seleagkapya dari daaah pelitian ini disajikan pada Lampiran 1. Subppuki sapi low di Ika Smgai Lila,
K
m Ranah P-,
Kabupaten Pesisir Selatan merupakan populasl inti karma popultrsi temak sapi di
dsterah hi diduga behrm b y & tmmm oleh bangs&@ sapi lain baik melalui pejtmtan hidup m a u p mddui h m i n a s i b u m jika dibandingkan dengau daerah lainnya P d t i a n ltrpangm ini dilakukirn selama lebih kurrmg enam bulm rnutai bulan Februari ampai den* JuIi 2002.
Bahan dan Alat Penelitian ini dilakukan pada sampel temak sapi Pesisir d i k masyarakat
di ~ g subpopulasi a sepanjang daerah p i s i r Sumatera Barat, yaitu: Pesisir
SeIatan, Padang Pariman, dan Agam. Pedatan yang digunakaa d a b penelitian ini terdiri dari: timbangan
tern& kapasitas 400 kg merek GHL Products (England) dengan ketepatan sampai 2 kg, pita ukur (108 inci) dengan M a 0.5 inci produksi Tbe Coburn Co., hc. Mtewater, Wisconsin, toagkat ukur satuan cm dengan skah 0.1 cm,
clan alat-alat adis. Metode Penelitian PenariRon SsmpeI TernaRSopi
Penadcan sampel ternak sapi dilakukan demgan cara penarikau otoritas
(Steel & Torrie, 1W5) dengan hitaia: bangsa sapi daIah sapi Pesisir yang
pisir pantai Sumatera Barat. Smpel ternak sapi t d i r i dati
hidup di d&
tiga kelompok umm mak (urnur & 0.5
- I1.4 tahun); muda (umur 1.5 - 5 2.9
a m ) dan dewasa (umur 3 - I6 tahun) untuk ke dua jenis kdamin jantan dan
betina dari masing-maskg subpopulasi. Penentuan umur temak sapi sampd
dilakukm M d a n pada keterangrm langsung dari peternak dm pertukaran gigi seri menurut Wifikasi:
11
berganti umur 15 - 18 bulan dm m b u h
seanpuma pada umur 2 tahun, Iz berganti umur 2.5 tahun dm twnbuh sempurna
m w 3 tahzm, 13 b e r m m 3 . 5 tahllfldmtumbuh smpmaF#tdaurmu4 tahun, dan Is berganti umur 4.5 tahun dan tumbuh s e m m pada umur 5 tahm.
lmlabdanse~sampelteraaksapimealrnrtmbpqdA,um~r~
jenis keI-
pada peaelitian ini disajhn pada Lampiran 2.
Peubak rlon M
a PaguRwsn
Peubah yang diamati dm diukur pada penelitian hi adalah: (a) karakter
kuantitatif @obt t m k panjang badan, h g g i pundak
dads, lebar dads, dalam da& tinggi ping@, lebar pinggd, panjang kepala, dan Iebar kepala); (b) kara)cter ku&W(wam dan pola w-).
M
d pengukman untuk masing-masing peubab dilakukan
dmga~
berikut:
a. Bobot badan (kg), diperoleh dengan menimbang ternak sapi sampel rnenggudm m g a n teknis khusus untuk temak sapi, dilaMran pada pagi - siang hari.
b. Panjang badan {cm), diukur j&
llrms dari tonjolan bahu atau
tubemiurn humeri laterale sampai pada tulang duduk aiau tuber isckii
menggunakan pita ukur.
c. Tinggi pmW (an),diukm dari ti* t d & pundak m e l d b e w g scapula tegak lurus ke tauah magpalcan tongkat ukur ddam skala sentimeter dengan posisi sapi tegak dan tempat pijakan yang rats. d. DaIm dada (cm),diukur dari titik dasar gumba (pada mas tulang
beldmg 3-4) samprri ke tulang daclrl tqat di belakaug siku
m e n e m tongkat ukur dalam skala seutimeter. e.
L h r dada (a) diukur , dari j d tabear dads sebelah kanan dan kki pa& posisi pengukuran lmgkar dada diukur menggunakan tongkat ukur
d
&
I
m
~
~
~
.
f. Lingkar dada (cm),diukur rndingkm rongga dada di bel&ang bahu atau
di behkmg siku kaki depan kgak lunls dengzm sumbu tub& menggudan pita ukur dengan skala inci. g ~in'gpjpzmggul 0, diukur jarak tegak lurus dari tulang sacrum pertama m p a i ke p%rmukaan tanah m e n g g m h tongkat ukur dmgm skala sentime-
h. Lebar pin@ i. Mar k@a
(a) diukur , j d e b a r dimtara kedua mdi ping@ touglrat ukur d m g m skala sentimeter. (cm), diukur jarak diantara kedua tonjohn tulang m t a mistar dengrm d d a seatimeter-
j- Paujmg kepda (an), diukur p d a posisi tagah kepala diantara dm tmduk sampi ke batas hitam mulut (gusi), meuggmab mistar (a).
k W m bulu tub& adalah macam warn dominan setiap tern& sa7i =pel berdasarkan pada h h i a warm pubh atau keputihm, k g rttau kekmhgan, m d bata, d l & dm hitam. Penyebaran m a utama
AoflisisData Data ukuran-ukuraan tub& (bobot dm ukuran-dmm dirnensi tubuh) dianalisis dm*:
(1) statistik dishiptif, (2) uji rataan antara subpopulasi, (3)
analisis diskrimimm, dan (4) analisis korelasi kanonik. Data sebaran wama bulu dari setiap individu sampel untuk ketiga
subpopulasi dianalisis secara diskriptif d m bentuk persentase.
Anelisis SkriWk Diskriptiif Analisis statist& dislcriptif ditujukan untuk memperoleh karakterisasi bobot tubuh dm ukuran-ukm tubuh pada sapi p i s i r Sumatera Barat. Analisis
dimana
Xi
addah ukuran ke
i
dari peubah X, n adalah jumlah sampei yang
diambil dari populasi.
Uji Raiaan Beda nyata rataan ukmm-ukurau tub& antar subpopulasi diuji den@ maggumha uji-1 pa& a dihitung dengan:
= 0.05D
dan derajat bebas (nI+ fi - 2). Nilai lh
*
dimma: X1=maan s;PmpeI kdmpok pertama x2= sampel padakelompokkedua xIj= nilai penke j pada keIompok pertama x.= nilaipengmataa kej p& kelompok ke dua nl =jumlah ~ampel@a kelompok Pertama n, =jumlah sampel pda kelompok ke dua b t u k rnekhkm pahitungan persrrmaan di
d k m a b program
tan (nl + s - 2) apabila th bemilai positif atau h < h (nl + n2 - 2) apabila rh
SU satu peudekm ymg smhg digunakan daIm aaalisis diskrhhm sulel;lh den-
m e n g p a h jarak Mahahobis (Manly, 1986; dm Nei, 1987)
P W program statist& SAS ver. 6.12 dengm prosedur PROC.DISCRIM
Analisis ini digunakan untuk pendugam parameter hadtatif yang
( M d y , 1986). Analisis korelasi kanonik ini dikeajakm dengan mmggunakm paket p g m m SAS V6.12.
Bahan dan Metodi Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian Iaboratwium antara lain
darah sapi Pesisir Sumatem Barat, pereaksi isolasi DNA pereaksi
addah -pel
PCR,primer mikrosatdit, dan paeaksi pewarnaan paak. S~mpdDamh
Sampel damh b
d dari sampel tmdi sapi Pesisir dari dua subpopulasi
sapi Pesisir Sumafera Bar;it yah: subppdasi Pesisir Selatan dm Padang Pariaman. Peta daerah pmgambilan sampel ini d i s a j h pada Lampiran 1.
B
u
b
u
~ u-k u hImm ~ DNA
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA terdiri dati: lyss bufer, digestion bufler, rime bufer,
phenol cklorofom, llarutan ChloroformIsso
Amyl Alcohol (CIAA), etanol absoh, -01
70% larutan
TE
1% dm larutan
TBE 10x. Bahilfl-bahm pelarutlpxaksi yang digunakan pada isolasi DNA selagbpya disajikan pda Lampiran 3.
Bahan Penw8si PC'R P d s i yang d
i
w untuk analisis PCR antara Iain adaI&: deionized
mM (Promem), dNTP solution Mix f 0 m M (Biolabs), Taq DNA polymerase 5.000 Uhnl (Biolabs), dm water, t h e m 1 W e r PCR 10r (Biofabs), MgCl2 25
primer FIR (Prolip).
Bahan Un&k Yiiuliwd DNA HadI&d Bahan yang digmakan mtuk melihat j d a h dm kualitas DNA basil
isolasi antam lain addah: gel agorose, larutan TBE 1% dm pewarna erhidium bromide.
m h n U n a W a W D N A H d PCR
Bahan yang digunakan untuk magamati hasil a m p l i h i (PCR) fiagmen
DNA
antar lain adalah: loading &e (bludomnge 6x), 50 bp DNA
la&er
90 pg, 34 pg/pl, 30% acyiutnid gel mix, TBE 10x bufler, 25%
Ammonium pmxodisulfote (APS), 1eImmethyiene diamine (TEMED), CTAB
(N-CwlN, N,N - rrymethyl ammonium bromide), m 0 H (ammonia solution 25%), A@@
(silwr nitrate), NaOH !ON, Na2Ca (sodium carbonute
anhydrous),FA (rormaidehyde sololuiion min. 3 7%), asam asetat, dan aquadest.
P n
Untbk
PCR, Ban FZCIOW DNA H a d PCR
Alat-alat yang digmakan untuk isolasi dan visualisasi DNA tetdiri dari:
mihpipd ukuran Pto, P2a PZOO, dan PIMW G h n (France) beserta pipet tipnya, m i e m b e eppendodukuran ( 1.5 ml, 0.5 mi, dan 0.2 ml), waterbathIinkubator (Gmd hmbatmA tllngku peananas (Sybm Thamolyne Nuova 11 Hot plate), wrm (Maxi Mix Thmolyne 37600 Mixer), mikmsentdbs (Eppendorf
Centrifuge 5415 C), nxxh PCR (Gene Amp PCR System 2400, Pakin Elmer),
ac voltage stabilizer Fern resonant 1500 (ICA), kamera pengamatan gel has11 (Mrtsubishi Vidw Copy
el&rof&
Rocessor modd P91E CB, monitor
LCD, UVI Tec), vacum dmr (Cenbi Vap Concentrator, Labconw), magnetic (Mg 78), electmnic balance
IV, lntel
(ADHX lOO), desk top komputer (Pentiurn
20 GB), agc~megel elecimphoresis apparahrs, voltagdmrrent
reglllator
PS loo),
a d a m i d gel elecimphowsis appmm, g&
dmIdm gelas er/er?mqwr. Mdodapcnditian
Koiekd S u mD a d Darah diambil dmgm meflggmakau disposable syringe 10 d dari &anyak
individu sapi s i q d yang didata mtdt k m b r eksternal 5 ml dari wmjugularis di bagian Ieher, dmasukkan kedcllam tube test
12 ml yang t e M ~diisi alkobol 96% &anyak 5 ml dan diberi label m u n i t
individu ssrmpel. Tabmg yang telah berisi darah ini kmudian dishpan rapi untuk selanjubya d i i ke hmtorium.
h mE d-
W DNA
Isolasi DNA dilakukan menggunakan metode Sambrook et al., (1989) modifikasi.
Vmalhsi dam Kamkf&m' DNA H a d Isolasi Kualitas DNA hasil isom d i d u a s i deslgm mmjalankwl DNA st& pada
elektroforesis 1 -2 % gel agar selarna lebib kurang 45 menit dengan voltase 90 volt. Gel agar 1.2% dibuat dengan rnelarutkm 0-6 gr agamse powder dalam 50
ml TBE buffer lx. Bahan pewarna untuk gel ini digunakan 2.5 pl ethidium bromide.
h i 1 eldctroforesis hi diamati menggunakan monitor UV Video Copy jika pita DNA yang krbalk teM dan bersih lagsung dapat dicw
Pr-r,
ke disk& 3.5 HD sebagai d o b e n m i . S i m p stok DNA lmebut unhdc ampliskasi PCR Sebalilmy.r5 jika pita DNA yang t d m t u k semir (tipis) atau
kotor maka tabmg stok DNA tersebut dibuang dan isolminya di-g -, .*,
sarapai pita-pita DNA yang '
AmpIr-siDNA
kembali
bmir-klxrsihdanW.
d b s a a
PCR mmqmkm k h k peaggandm jumlah molekul DNA pa& testentu yang u k u m panjangnya
bqm
ditmtukau 01th posisi sepasang p e r yang
mengap-
Pelipat gandsan jwdah molekd DNA tersebut d W u h secara in v i m pads DNA sunpel (DNA template) dengan banturm eflzim Taq
poljmem, unh& m m e n target ~ ~ DNA yang a h diperbanyak.
Primer yang digunakan untuk untdc mmperoIeh data sebaran dan jumlah
ald
"
tdit terdiri dari eraam lokus mikrosatdit, yaitu ETH225, ET'H3,
INRA037, BM2 113, LLSTS006, dan HEL9. Keterangan rinci dari ke eoam Iokus mikmat& ini disajikan p d a T
M 2.
Pemilihan terhadap ke eoam lokus mikrosatelit ini berdmarkm pada
rekomendasi Roslin Institute (1 9%) dan derajat polimo~smehkus h s a t e l i t
ini cukup tinggi mtuk menduga kemgaman geaetik antar kelompk dalam fd Bovjhe.
Tabel 2 Karakteristik lokus mikrosatelit yang digunakan untuk mempelajari keragarnan genetik sap1 Pesisir di Sumatera Barat No
Kro Mosom
Lokus
1
ETH225
9
2
BM2113
11
- - -- ---
--
Sekuen primer ( 5'
- 3')
F: GATCACCTTGCCACTATTTCCT
Motif ulangan
Temp.
h.
OC
Ukuran ale1 (bp) Mak Min
Iumlah AIel
(CAhs
60
159
141
10
F: GCTGCCTTCTACCAAATACCC R: C'ITCCTGAGAGAAGCAACACC
(CA)2o
58
143
123
11
R: ACATGACAGCCAGCTGCTACT
3
ILSTS006
7
F: TGTCTGTATITCTGCTGTGG R: ACACGGAAGCGATCTAAACG
(GT)23
54
299
281
10
5
MU037
10
F : GATCCTGCTTATATITAACCAC R: AAAATTCCATGGAGAGAGAAAC
(TG)12
58
148
112
15
6
ETH3
19
F : GAACCTGCCTCTCmGCATTGG R: ACTCTGCCTGTGGCCAAOTAGG
(TG)24
60
125
10s
10
IrtszraWiprdik PCR ( E m f o n d g e l &-mid)
Elektroforesis gel akrilarnid dikejakan dengan menggmakan vertical electrophorais apparafusyang memiliki dua gel, masing-masing gel terdiri dari
14 sumur sampel. Elektroforesis ini dijalaukan pada tegmgan 90 volt selama 4
jam. Gel akrilamid yang digunakan pada elektroforesis ini berukuran pmjang 20 cm. Bahan-bahan yang digunakan mtuk membuat satu gel akrilamid ini
terdiri dari: 22.0 rnl aquades, 3.0 ml TBE 1 Ox, 5 ml acrylarnid solution 30% 125 p1 APS 25% dan 12 p1 TEMED.
Elekmforesis akdamid dijalankan pada voltase 90 volt seIama l&ib kurang empat jata Setiap sumw pada gel diisi dedlgan p d u k PCR sebmyak 5 pl yang dicarnpur dengan 1 pl lmtan pemberat (loading dye). Satu sumur gel
terakhir (ski gel paling kanan) diisi dmgm
3 p1 DNA ladder 50 bp
ukuran standar pita-pita DNA hasil amplrfikasi. Produk amplifikasi lokus-lob mhsatelit yang dijalankan prtda gel M a m i d dievaluasi dengan menggunakan pewarnaan perak (silver staining).
Pewmaan paak iai dilakukan dengan tujuh tahap pewamaan memurut
pereaksi yang digunakan sebagaimana disajikan pada Tabel 3 berikut. Tabel 3 Larutan dan bahan pewarna perak (silverstaining)
Aquadest
200 ml 200 ml
V
Aqdest
W
FA
l
Aqdest masetat Aquadest
200 ml
~
200~1 200 ml
d
Lama (waktu) permdamn mtuk msh~grmasingcairanlpereaksl adalah: larutan I 20 menit, larutan I1 10 menit, larutan 111 20 menit, larutan IV 20 menit,
larutan V 10 menit, lanrtan VI bebempa saat sampai pita-pita m u n a landan VIl sebagai larutan pencuci akhir untuk waktu paling lama 12 jam. P h gel hasil pewamaan ini akan talihat pita-jitst yang a t u k pads setiap alur sumur yang berisi -pel
DNA produk PCR Pada sumur DNA
I d e r d m m u n d pita-pita mulai dari p h g bwah berukuran SO bp, Wti
k
d atas 100 bp, 150 bp, 200 bp, 225 bp, 300 bp, 350 bp dan seterusnya. Penandam dei-del atau peamentuan u k u m (pb) M a p l o b mkmsatetit
yang terbmtuk pada gel akrilamid dilakukan dm-
membandingkan posisi pita
yang t d m u k dengan posisi pita DNA l d e r 50 bp terteatu. Hasil @tungtrn
ukuran masing-masing pitdale1 DNA mkosatelit dan j d a h alel yang
. .
d h d k m p d a masing-g
l o h dmosateiit disajikan pula Lampiran4 - 9.
Analisis Ihta Ald-Ald Lobs DNA Mikrosatelit Analisis dm polimorkme DNA rdmsatelit pada penelitian ini antam
lain d&: fiekueasi ald, mtaa dm simpangaa baku hetmzigosim. FrekuemiAH Frdnmsi ale1 diperoleh dengan r n w n m g langsung j d a h satu alel tdmdap totaI alel yang dibasilkan old
Iokus t-tu dalam satu subpopulasi. Frekuensi ale1 untuk lokus mhsatelit tertentu ditritung
medlggunaktm m w Nu (1987), berikut ini.
dimana: xi = Mmmsi alel Ice i
nii =jumlah individu homozigot ald ke i nij = jumlah individu hetmozigot
n
=j
d a h individu sampel
Rsgam h Simngrrn lkh F . M . Alel Ragam dari h h m s i suatu ale1 dijelaskan oleh Nei (1987) dengan rumus:
d i m m : xi = kkuensi alel ke i n =jumlafi individu sampe1
Simpangan baku dari fiekuensi alel dihittmg deagan akar pangkat dua dari nilai
Dugam unbiased (h)dihitung dengan:
d i m: n
= jumlah
sampel
Xi = fdmensi populasi
dari del ke ip d a satu lokus tertentu
n
H
= rataan hetmzigositas untuk
seluruh lokus
r = j d a h lokm yang diuji Ragom den Simpungan Buku Ratban Hderozigosiras ( g )
Ragam ratam heteroxigositas
(H)antar sejumlah ldrus dihihing dengan
n adalah ukuran sampel Cjumiah individu) dan r aMah j d a h lokus yang diamati. Simpanpn baku dari dugam hi kernudian dihitung sebagai akar paugkat dua dari ragam.
R q p l -pd
rmm l o b dari ratasn ke~n-
gen
(He)
r adalah jumlah lokus dm o2e,m=gdcu ymg did-rn
psda ragam dari b e h a g a m a n s e w :
gen pada lokus
ke j,
