BAHAN DAN METODE 1. Waktu dan Tempat penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rumah Kaca Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB- BIOGEN) di Jl. Tentara Pelajar 3A, Cimanggu, Bogor 16111. Penelitian ini dilakukan pada bulan September 2006- Oktober 2007. 2. Bahan Penelitian 2.1. Konstruksi vektor over-ekspresi gen OsWRKY76 Bahan penelitian yang digunakan pada pembuatan konstruk vektor overekspresi gen OsWRKY76 meliputi : tanaman padi varietas Nipponbare, bahan isolasi DNA padi, primer spesifik untuk gen OsWRKY76, bahan untuk melakukan PCR, plasmid pGEM-T Easy, enzim restriksi, bahan untuk isolasi plasmid, enzim T4-DNA ligase, bahan untuk transformasi plasmid ke vektor, elektroforesis, vektor biner pCAMBIA-1301, plasmid pSP13, plasmid pST8, bakteri E. coli strain DH5α, bakteri Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105. 2.2. Transformasi padi Nipponbare dengan A. tumefaciens Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah benih padi varietas Nipponbare sebagai sumber eksplan, bahan untuk kegiatan kultur jaringan dan transformasi, zat pengatur tumbuh, antibiotik dan bakteri Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105 rekombinan yang mengandung vektor over-ekspresi gen OsWRKY76. 2.3. Analisis molekuler tanaman padi transgenik dengan PCR. Untuk melakukan kegiatan ini bahan yang digunakan adalah DNA padi Nipponbare tipe liar, DNA padi Nipponbare putatif transgenik, bahan untuk melakukan PCR seperti PCR kit, elektroforesis, primer higromisin. 3. Metode Penelitian Pada
penelitian
berkesinambungan, yaitu
ini
dilakukan
3
rangkaian
kegiatan
yang
perakitan konstruk vektor over-ekspresi gen
OsWRKY76, transformasi padi Nipponbare dengan A. tumefaciens, dan analisis molekuler tanaman padi transgenik dengan teknik PCR (Gambar 1).
Konstruksi vektor over-ekspresi gen OsWRKY76
Transformasi padi Nipponbare dengan A. tumefaciens
Analisis molekuler tanaman padi transgenik dengan PCR
Gambar 1. Diagram alur penelitian
3.1. Konstruksi vektor over-ekspresi gen OsWRKY76 Tujuan dari kegiatan ini adalah untuk merakit konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam vektor ekspresi. Prosedur urutan kerja dari kegiatan konstruksi gen OsWRKY76 dimulai dari
mendisain
primer
untuk
gen
OsWRKY76
dan
diakhiri
dengan
mengintoduksikan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam A. tumefaciens. Prosedur selengkapnya adalah sebagai berikut (Gambar 2):
Disain primer
Isolasi plasmid pSP8, pST13 dan pCAMBIA- 1301 dari E.coli
Amplifikasi gen OsWRKY76 dari Nipponbare dengan PCR
Pemotongan pSP8, pST13 dan pCAMBIA -1301 dengan enzim restriksi yang sesuai
Purifikasi fragmen gen OsWRKY76 dari gel agarose fragmen gen OsWRKY76
Purifikasi fragmen promotor, terminator danpCAMBIA-13 dari gel agarose
Kloning fragmen ke pGEM-T Easy Pemotongan ujung-ujung fragmen gen OsWRKY76 dengan enzim restriksi yang sesuai
Fragmen promotor, terminator dan pCAMBIA-1301
Purifikasi fragmen gen OsWRKY76 dari gel agarose Fragmen gen OsWRKY76
LIGASI
Plasmid pCAMBIA-1301 rekombinan Hasil ligasi ditransformasi ke E.coli Isolasi plasmid
verifikasi plasmid rekombinan
Transformasi ke Agrobacterium tumefaciens strain Agl-l dan EHA-105
Untuk kegiatan transformasi padi
Gambar 2. Bagan alur prosedur kegiatan konstruksi over-ekspresi gen OsWRKY76
Fragmen gen OsWRKY76 di dapatkan dari hasil amplifikasi DNA genom padi varietas Nipponbare menggunakan primer spesifik yang telah dirancang menggunakan software PRIMER. Perancangan primer berdasar sekuen DNA genom yang diperoleh dari bank gen melalui perunutan situs di internet (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) . Pasangan primer yang digunakan adalah : Forward primer = 5’-AATAGGATCCTGGTCGTCGTCGTCGTCGATG-3’ dan Reverse primer
= 5’-AGTCAGTCGACGCTAGAATTCGGGCAGCTTC-3’.
Pasangan primer tersebut memasukkan situs pemotongan enzim restriksi BamHI dan SalI ke produk amplifikasi pada bagian 5’ dan 3’yang digunakan untuk keperluan ligasi. Reaksi PCR dilakukan dalam 20 ul larutan yang mengandung bahan-bahan sebagai berikut : 2 ul 10x buffer PCR yang mengandung MgCl2 (Roche), 4 ul 5x GC-rich Solution (Roche), 0,4 ul dNTPs mix (10 mM)
(Promega), primer
Forward dan Reverse spesifik untuk gen OsWRKY76 masing-masing 0,5 ul (100 ng/ul) , 0,2 ul Enzim Taq-polimerase (5 U/ul) (Fast-start/Roche). DNA padi Nipponbare tipe liar yang diamplifikasi sebanyak 10 μl (konsentrasi 10 ng/μl). Reaksi PCR menggunakan mesin PCR PTC-100 (MJ Research, Inc.). Profil suhu yang digunakan adalah predenaturasi pada 94oC selama 5 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus denaturasi pada 94oC selama 1 menit, penempelan primer pada 55oC selama 1 menit, dan pemanjangan pada 72oC selama 2 menit. Pada tahap akhir PCR dilakukan pemanjangan akhir pada 72oC selama 5 menit. Sebanyak 15 μl produk PCR diseparasi dengan teknik elektroforesis pada gel agarose 1% (w/v). Hasil amplifikasi gen OsWRKY76 dengan ukuran sekitar 1.200 bp pada gel agarose dipotong dan dipurifikasi dengan menggunakan Gel Extraction Kit (Qiagen) mengikuti prosedur yang direkomendasikan oleh perusahaan. Fragmen gen OsWRKY76 tersebut kemudian diligasi ke dalam plasmid pGEM-T Easy (Promega) dan ditransformasikan
ke dalam E. coli.
Koloni hasil transformasi yang tumbuh di media seleksi kemudian ditumbuhkan di media LB cair dan dilakukan isolasi plasmid dengan metode lisis alkali. Plasmid yang diperoleh kemudian dipotong dengan menggunakan enzim restriksi BamHI dan SalI. Hasil pemotongan diseparasi dengan elektroforesis dan fragmen
berukuran sekitar 1.200 bp dipurifikasi menggunakan Gel Extraction Kit (Qiagen). Fragmen promoter 35S-CaMV yang berawal dari -526 sampai situs awal transkripsi (TTS/transcription start site) diperoleh sebagai fragmen 0,55 kb HindIII-BamHI dari turunan pBS-SK+ dari pDH51 (Pietrzak et al. 1986). Fragmen terminator 35S-CaMV diperoleh sebagai fragmen 0,21 kb SalI-EcoRI dari turunan pBS-SK+ dari pDH51 (Pietrzak et al. 1986). Plasmid pCAMBIA 1301 digunakan sebagai vektor biner, yang untuk keperluan ligasi dipotong dengan enzim restriksi HindIII-EcoRI. Fragmen-fragmen promotor 35S-CaMV, terminator 35S-CaMV, pCAMBIA-1301 dipurifikasi dari gel menggunakan Gel Extraction Kit (Qiagen). Konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 dirakit dengan meligasikan fragmen-fragmen individual (promotor, gen OsWRKY76, dan terminator) dengan ujung-ujung kohesif yang kompatibel bersama-sama ke dalam vektor biner dalam satu reaksi. Plasmid rekombinan tersebut kemudian ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli kompeten yang disiapkan menggunakan CaCl2 (0,1 M) dengan metode heat shock (Sambrook et al., 1989). Koloni-koloni tunggal yang diperoleh dari hasil transformasi tersebut kemudian ditumbuhkan dalam media LB cair yang mengandung antibiotik kanamisin 100 mg/L dan diisolasi plasmidnya dengan menggunakan metode lisis-alkali (Sambrook et al. 1989). Keberhasilan konstruksi diverifikasi dengan memotong plasmid rekombinan dengan menggunakan enzim restriksi yang sesuai. Plasmid rekombinan ini kemudian dimasukkan ke dalam Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105 dengan metode ‘freezethaw’.
RB OsWRKY76
35SP
550 bp HindIII/EcoRI
Gambar
490 bp BamHI
710 bp EcoRI
LB
35ST 210 EcoRI/SalI
EcoRI
3. Skema konstruk 35SCaMV::OsWRKY76::35SCaMV dengan pemotongan enzim restriksi dan ukuran dari masing-masing fragmen
situs
3.2. Transformasi padi Nipponbare dengan Agrobacterium Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengintroduksikan rakitan konstruk vektor over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam genom tanaman padi varietas Nipponbare menggunakan bantuan Agrobacterium tumefaciens. Metode transformasi yang digunakan mengikuti prosedur yang diuraikan dalam Greco et al. (2001) dengan sedikit modifikasi. Benih padi varietas Nipponbare (Japonica) dikupas sekamnya dan disterilisasi dengan larutan alkohol 70% selama 1 menit. Kemudian biji direndam menggunakan larutan NaOCl komersial dengan konsentrasi 5,25% selama 30 menit, dicuci dengan akuades steril sebanyak 6 kali masing-masing selama 15 menit, dan direndam semalam dalam aquades steril pada suhu ruang. Biji padi kemudian ditanam pada media induksi kalus yaitu media dasar NB (Lampiran 1) yang mengandung 30 g/L sukrosa , 2,5 mg/L hormon 2,4-D, dan dipadatkan dengan 2,5 g/L Phytagel . Setelah 25-30 hari kalus yang tumbuh disubkultur pada media induksi kalus baru. Dua minggu kemudian kalus yang tumbuh diseleksi dengan menggunakan mikroskop binokuler untuk mendapatkan kalus yang embriogenik. Kalus embriogenik ini digunakan sebagai bahan untuk transformasi dengan
menggunakan
Agrobacterium
yang
telah
mengandung
plasmid
rekombinan yang membawa konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76. Transformasi dilakukan dengan merendam kalus-kalus embriogenik ke dalam suspensi bakteri Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105 yang mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76. Biakan bakteri yang digunakan untuk transformasi berasal dari biakan koloni tunggal yang ditumbuhkan pada 5 mL media YEP (Lampiran 2) cair yang mengandung 100 mg/L antibiotik kanamisin dan 75 mg/L karbenisilin. Suspensi bakteri yang tumbuh kemudian ditumbuhkan pada 3-4 petri media AB (Lampiran 2) padat yang mengandung 100 mg/L antibiotik kanamisin dan 75 mg/L karbenisilin selama 3 hari pada suhu 28oC. Biakan bakteri tersebut disuspensikan pada 50 mL media kokultivasi cair yaitu media dasar R2 (Lampiran 1) yang mengandung 10 g/L glukosa, 100 uM asetosiringon dan 2,5 mg/L hormon 2,4-D dengan pH 5,2. Kepadatan sel bakteri yang digunakan untuk transformasi diperkirakan mencapai OD600=1 (3-5x109 sel/mL). Suspensi bakteri inilah yang digunakan untuk
merendam kalus. Perendaman kalus-kalus dilakukan selama 10-15 menit. Kaluskalus kemudian dikeringkan dengan mengguling-gulingkannya di atas kertas saring dan ditanam pada media ko-kultivasi padat selama 3 hari dengan kondisi pemeliharaan dalam keadaan gelap pada suhu 16-18oC. Kemudian kalus-kalus dipindahkan pada media seleksi yaitu media R2 yang mengandung 2,5 mg/L 2,4D, 400 mg/L antibiotik cefotaksim, 100 mg/L vancomisin, 50 mg/L higromisin, dan 30 g/L sukrosa. Dua minggu kemudian kalus-kalus dipindahkan ke media seleksi yang baru. Kalus-kalus yang tahan di media seleksi kemudian disubkultur ke media EIM (media induksi embrio) (Lampiran 1) yang mengandung 100 mL/L air kelapa, 2,5 mg/L 2,4-D, dan 100 mg/L antibiotik cefotaksim, 100 mg/L vancomisin, dan 50 mg/L higromisin dan dipelihara dalam keadaan gelap. Setelah 10-14 hari kalus- kalus embriogenik diseleksi dengan menggunakan mikroskop binokuler dan dipindahkan ke media regenerasi yaitu media dasar LS yang mengandung sukrosa 40 g/L, 0,5 mg/L IAA + 0,3 mg/L BAP, 30 mg/L higromisin, 100 mg/L cefotaksim, 100 mg/L vancomisin. Dua minggu kemudian kalus disubkultur ke media regenerasi yang baru. Kalus-kalus dipelihara sampai tumbuh tunas. Setelah ukuran tunas kurang lebih 2 cm dipindahkan ke media perakaran yang mengandung 40 mg/L antibiotik higromisin. Apabila akar planlet sudah berkembang, planlet dikeluarkan dari botol dan diaklimatisasi di dalam tabung reaksi yang berisi air. Seminggu kemudian planlet dipindahkan ke bak persemaian yang berisi tanah lumpur. Dua minggu kemudian planlet dipindah ke dalam ember yang berisi tanah lumpur yang telah ditambah pupuk kandang di rumah kaca.Tanaman putatif transgenik dipelihara sampai menghasilkan biji. Parameter yang diamati adalah jumlah kalus awal yang ditransformasi, jumlah kalus yang terseleksi pada media seleksi, jumlah kalus yang berhasil beregenerasi membentuk planlet, jumlah tanaman, jumlah galur independen yang berhasil diperoleh.
3.3. Analisis molekuler tanaman transgenik dengan teknik PCR Tujuan dari kegiatan ini adalah untuk mengetahui apakah konstruk overekspresi gen OsWRKY76 berhasil diintroduksikan di dalam jaringan tanaman padi varietas Nipponbare. Analisi PCR adalah metode deteksi secara cepat untuk mengetahui keberadaan transgen di dalam jaringan tanaman putatif transgenik. DNA genom diisolasi dari daun padi dengan metode miniprep SDS-Urea (Pereira and Aarts 1998). DNA dari tanaman padi transgenik generasi T0 dan T1 digunakan untuk analisis molekuler menggunakan teknik PCR dengan primer spesifik
higromisin
yaitu
GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3’
primer dan
primer
Forward Reverse
: :
5’5’-
GCATCTCCCGCCGTGCAC- 3’. Reaksi PCR menggunakan mesin PCR PTC-100 (MJ Research, Inc.). Reaksi PCR dilakukan dalam 20 ul larutan yang mengandung bahan-bahan sebagai berikut : 2 ul 10x buffer PCR yang mengandung MgCl2 (Roche), 0,4 ul dNTPs mix (10 mM) (Promega), primer spesifik untuk gen higromisin masingmasing (Forward dan Reverse) 1 ul (5 uM), 0,16 ul Enzim Taq-polimerase (5 U/ul) (Fast-start/Roche). DNA padi Nipponbare transgenik yang diamplifikasi sebanyak 5 ul (konsentrasi 10 ng/μl). Profil suhu yang digunakan adalah predenaturasi pada 94oC selama 4 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus denaturasi pada 94oC selama 30 detik, penempelan primer pada 60oC selama 30 detik, dan pemanjangan pada 72oC selama 45 detik. Pada tahap akhir PCR dilakukan pemanjangan akhir pada 72oC selama 5 menit. Sebanyak 15 μl produk PCR diseparasi dengan teknik elektroforesis pada gel agarose 1% (w/v), dicat dengan EtBr dan divisualisasi dengan sinar UV menggunakan instrumen CHEMIDOC.
