Badan Litbangkes Kementrian Kesehatan RI, Jakarta 10560, Indonesia 3. Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta 55281, Indonesia 4

Prosiding Rakernas dan Pertemuan Ilmiah Tahunan Ikatan Apoteker Indonesia 2016 e-ISSN : 2541-0474

OPTIMASI METODE ANALISIS PIRAZINAMID DAN ETAMBUTOL DALAM SEDIAAN FIXED DOSE COMBINATION (FDC) PADA DRIED BLOOD SPOT (DBS) MENGGUNAKAN LIQUID CHROMATOGRAPHYTANDEM MASS SPECTROMETRY (LC-MS/MS)

Noverda Ayuchecaria1*, Ully Adhie Mulyani2, Jarir At Thobari3, Abdul Rohman4, Dyah Aryani Perwitasari5, dan Endang Darmawan6 1

Akademi Farmasi-ISFI Banjarmasin, Kalimantan Selatan 70123, Indonesia 2 Badan Litbangkes Kementrian Kesehatan RI, Jakarta 10560, Indonesia 3 Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta 55281, Indonesia 4 Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta 55281, Indonesia 5,6 Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta 55166, Indonesia *Corresponding author email: [email protected] Abstrak Latar belakang: Penerapan farmakokinetika untuk perancangan dosis secara tepat harus diikuti dengan evaluasi klinik dan Therapeutic Drug Monitoring (TDM). Salah satu teknik pengumpulan sampel darah pada aplikasi TDM yang dapat digunakan adalah dried blood spot (DBS). Metode ini memiliki banyak keuntungan dibandingkan dengan metode konvensional. Selanjutnya, kadar obat dapat ditetapkan dengan Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS) karena memiliki sensitifitas dan selektifitas yang tinggi. Tujuan: Penelitian ini bertujuan untuk melakukan optimasi metode analisis pirazinamid (PZA) dan etambutol (EMB) secara simultan dalam DBS dengan menggunakan UPLC-MS/MS. Metode: Preparasi DBS dilakukan dengan teknik ekstraksi presipitasi protein. Analisis menggunakan UPLC-MS/MS dengan fase diam C18 (17 µm, 2,1 mm x 50 mm). Fase gerak yang digunakan merupakan kombinasi asam format 0,1% dan asetonitril yang mengandung asam format 0,1% dan diatur dengan teknik gradien. Kecepatan alir diatur sebesar 0,2 mL/menit. Detektor yang digunakan adalah triple quadropole mass spectrometry. Hasil penelitian: Hasil penelitian menunjukkan transisi analit yang diperoleh adalah 123,9  80,9 (PZA) dan 205,01  115,91 (EMB). Waktu retensi yang diperoleh adalah 0,77 menit (PZA) dan 0,61 menit (EMB). Nilai resolusi yang diperoleh untuk PZA (2,46 dan 62,85) dan EMB (2,09 dan 2,46). Tailing factor (TF) yang diperoleh adalah 0,82 (PZA) dan 0,78 (EMB). Kesimpulan: Telah didapatkan kondisi instrumen dan komposisi fase gerak yang optimal untuk analisis PZA dan EMB secara simultan pada DBS menggunakan UPLC-MS/MS. Kata kunci: optimasi, pirazinamid, etambutol, dried blood spot, UPLC-MS/MS.

1. PENDAHULUAN Tuberculosis (TB) merupakan penyakit infeksi penyebab utama kematian urutan kedua setelah human immunodeficiency virus (HIV). Survey tahun 2010 mengungkapkan, dari 246 juta jiwa penduduk Indonesia angka kejadian penyakit TB masih sebesar 185 orang per 100.000 populasi dengan angka kematian karena TB sebesar 27 orang per 100.000 populasi tiap tahunnya1. Dalam terapinya, Pirazinamid (PZA) dan Etambutol (EMB) merupakan 2 dari 4 first line yang sering kali digunakan untuk pengobata. Kombinasi ini juga dianjurkan sebagai pengobatan untuk infeksi laten TB2.

Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk menunjang keberhasilan pengobatan TB adalah therapeutic drug monitoring (TDM)3,4. Metode terbaru dalam memonitoring kadar obat yang kini banyak dikembangkan di dunia adalah teknik sampling menggunakan dried blood spot (DBS)5. Sedangkan untuk penetapan kadar obat dalam darah seperti high performance liquid chromatography (HPLC)-UV detektor6, HPLC dengan flouresen detector7 dan HPLC-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) juga telah banyak diadopsi dewasa ini8,9. Oleh karena itu, keberadaan metode ini akan sangat memudahkan pelaksanaan TDM 70

Prosiding Rakernas dan Pertemuan Ilmiah Tahunan Ikatan Apoteker Indonesia 2016 e-ISSN : 2541-0474

khususnya untuk menganalisis PZA dan EMB dalam campuran dengan anti TB lain menggunakan LC-MS/MS. Metode ini juga dapat digunakan pada jumlah sampel yang sedikit dengan konsentrasi analit dalam jumlah kecil seperti pada dried blood spot (DBS). 2. ALAT, BAHAN DAN METODE 2.1. Alat UPLC-MS/MS Waters, USA instrument meliputi Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), kolom tipe Acquity UPLC BEH C18 (1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm), UPLC– Quaternary Solvent Manager (QSM), UPLC-Flow Through Needle (FTN), dan XEVOtandem Quadrupole Detector (TQD). Kertas DBS tipe FTA DMPK-C (Whatman), disposable membrane filter unit ukuran 0,20 µm (Toyo Roshi Kaisha, Ltd, Japan), degasser (Branson,USA), neraca (AND), mikropipet (Scorex) dan alat-alat gelas. 2.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan antara lain : darah manusia sehat (whole blood) (Palang Merah Indonesia (PMI) Yogyakarta), isoniazid (INH, Beijing Second Pharma, India), rifampisin (RIF, Lupin Ltd., India), pirazinamid (PZA, Lupin Ltd., India), etambutol (EMB, Lupin Ltd., India), hypergrade acetronitrile : pro LC-MS (Merck), hypergrade metanol pro LC-MS (Merck), formic acid pro analysis (Merck), deionization water pro LC-MS (Merck). 2.3 Metode 2.3.1. Persiapan fase gerak. Masing-masing fase gerak disaring dengan penyaring vakum kemudian gas dihilangkan dengan degasser selama 15 menit. 2.3.2.Pembuatan larutan optimasi (simultan). Timbang INH, RIF, PZA dan EMB masingmasing lebih kurang 10 mg dan larutkan keempat analit dengan metanol hingga didapat konsentrasi

akhir campuran 1 mg/mL. Simpan pada suhu minus 60ºC hingga saat digunakan. 2.3.3. Preparasi larutan optimasi pada DBS. Pipet 50 µL larutan optimasi ke dalam microtube yang sudah berisi 450 µL whole blood, homogenkan microtube dengan bantuan vortex selama 20 detik dengan kecepatan maksimal. Sebanyak 50 µl diteteskan pada plate kertas DBS dan keringkan pada suhu 37ºC selama 1 jam. DBS kemudian dipotong dan potongan kemudian dimasukan ke dalam 500 µL metanol. Campuran divortex 3 menit dan disonifikasi 60 menit. Larutan hasil sonifikasi disaring menggunakan syringe filter ukuran 0,20 µm, masukan ke dalam tempat sampel dan siap diinjeksikan. 3. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1. Kondisi MS Proses optimasi diawali dengan tuning untk mendapatkan kondisi sistem yang sesuai meliputi : suhu kolom 35ºC, suhu autosampler 4ºC, kecepatan alir 0,2 mL/menit. Electrospray ionization (ESI) diatur pada model positif (ES+) dengan nitrogen sebagai nebulizer. Turbo gas diatur pada suhu 500ºC dan tegangan jarum ESI pada 5500V. Kuantifikasi analit menggunakan multiple reaction monitoring (MRM, MS/MS). Setelah diatur dalam kondisi awal tersebut, maka dilakukan analisis transisi untuk melihat pola fragmentasinya. Analit dianalisis dari ion molekul terprotonasi [M+H]+ yang dominan pada model ion positif. Ion molekul terprotonasi ini kemudian dipilih sebagai prekursor ion pada Q1 detektor massa. Produk ion yang dominan pada spektra MS/MS akan diteruskan dan dikuantifikasi pada multiple reaction-monitoring (MRM). Analisis MRM yang dipilih memungkinkan analisis keempat antituberkulosis secara bersamaan. Transisi pada PZA dan EMB menghasilkan fragmen parent dan daughter seperti yang tercantum pada Tabel 1.

Tabel 1. Transisi dan Model Ionisasi pada Optimasi Metode Analisis Pirazinamid dan Etambutol secara Simultan dalam Dried Blood Spot (DBS) Menggunakan LC-MS/MS Analit Pirazinamid Etambutol

Transisi (m/z)

Ion Mode

123,9  80,9 205,01  115,91

ES + ES +

71

Prosiding Rakernas dan Pertemuan Ilmiah Tahunan Ikatan Apoteker Indonesia 2016 e-ISSN : 2541-0474

3.2. Preparasi dan ekstraksi analit pada DBS Preparasi dan ekstraksi DBS merupakan titik kritis untuk mendapatkan keakuratan hasil analisis. Penggunaan kertas DBS jenis FTA DMPK-C berfungsi untuk menghindari pengaruh senyawa kimia pada kertas yang dapat mengganggu analisis. Agar didapatkan sampel yang homogen, whole blood yang telah mengandung analit diteteskan tegak lurus pada kertas DBS (Gambar 1).

Secara umum, dikenal 3 cara ekstraksi analit dari sampel biologi pada DBS yaitu ekstraksi cair-cair (LLE, liquid-liquid extraction), pengendapan protein (PPT, protein precipitation) dan ekstraksi fase padat (SPE, solid-phase extraction). Etambutol bersifat relatif polar sehingga sulit diesktraksi menggunakan teknik LLE. Sedangkan, teknik SPE jarang digunakan pada pemeriksaan rutin karena mahal10.

Gambar 1. Teknik penetesan sampel pada kertas DBS Berdasarkan pertimbangan tersebut, dilakukan teknik ekstraksi dengan pengendapan protein secara langsung menggunakan metanol untuk mencegah hilangnya analit dan menyederhanakan proses. 3.3. Optimasi fase gerak Kondisi awal UPLC diatur dengan suhu kolom 35ºC, suhu autosampler 4ºC dan

kecepatan alir 0,2 mL/menit. Komposisi fase gerak sangat mempengaruhi proses pemisahan dan ionisasi analit. Agar didapat fase gerak yang optimal, dicoba beberapa variasi komposisi fase gerak yaitu air, metanol dan asetonitril. Ketepatan komposisi fase gerak akan memberikan pemisahan yang optimal, respon analit yang tinggi dan bentuk puncak yang baik.

Tabel 2. Komposisi fase gerak dengan teknik elusi isokratik dan hasil pemisahan Komposisi fase gerak Air : Metanol (50:50) Air : Asetonitril (50:50) Asam format 0,1% : asetonitril - asam format 0,1 % (50:50) Pada kombinasi air-metanol (50:50) dan air-asetonitril (50:50) tidak terjadi pemisahan yang baik. Puncak PZA dan EMB saling tumpang tindih dengan pengotor lain dan menghasilkan waktu retensi yang rendah. Sedangkan, pada kombinasi asam format 0,1% dan asetonitril yang mengandung asam format

Hasil tidak memisah tidak memisah resolusi dan tailing factor belum memenuhi syarat 0,1%, memberikan hasil pemisahan yang lebih baik tetapi parameter resolusi dan tailing factor belum terpenuhi (Tabel 2). Hasil pemisahan dengan elusi isokratik kemudian dikembangkan menjadi elusi gradien untuk menyempurnakan pemisahan. Terdapat 3 komposisi gradien yang diujicobakan (Tabel 3).

72

Prosiding Rakernas dan Pertemuan Ilmiah Tahunan Ikatan Apoteker Indonesia 2016 e-ISSN : 2541-0474

Tabel 3. Komposisi fase gerak dengan teknik elusi gradient Komposisi Gradien I

Gradien II

Gradien III

Menit ke0-1 1-3 3-5 0-0,5 0,5-1 2-5 0-1 1-3 3-5

Komposisi fase gerak A:B 50:50 60:40 80:20 60:40 50:50 20:80 40:60 50:50 30:70

Analit Tidak memisah

Memisah

Tidak memisah

Komposisi nomor 2 pada teknik elusi gradien menunjukan kromatogram dengan pemisahan yang baik (Gambar 2).

Gambar 2. Profil kromatogram hasil Optimasi Metode Analisis Pirazinamid dan Etambutol dalam Sediaan Fixed Dose Combination (FDC) pada Dried Blood Spot (DBS) menggunakan Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS); Puncak A dan D pengotor, Puncak B = etambutol; Puncak C=pirazinamid Setelah didapat kromatogram yang baik, dilanjutkan dengan menghitung parameter resolusi dan tailing factor (Tabel 4). Hasil

penelitian memenuhi semua syarat, sehingga dapat disimpulkan bahwa telah didapatkan kondisi optimal.

Tabel 4. Waktu tambat (tR), Resolusi (R) dan tailing factor (TF) dari komposisi fase gerak terpilih Parameter Waktu tambat (menit) Resolusi (R) Tailing factor (TF)

PZA

EMB

Syarat

0,77 62,85 0,82

0,61 2,09* dan 2,46** 0,78

>2 ≤2

Ket : *=terhadap puncak sebelah kiri (punvak A); **=terhadap puncak sebelah kanan (puncak B); PZA=Pirazinamid; EMB=Etambutol Rentang pH terbaik untuk pemisahan dengan kolom berbasis silika adalah 2-8. Akan tetapi, pada pH tersebut senyawa-senyawa basa (seperti EMB) akan mengalami ionisasi sehingga menjadi bersifat polar dan tidak tertahan di kolom. Selain itu, pada pH > 3 gugus silanol akan mengalami ionisasi sehingga berikatan dengan analit basa yang terion dan menghasilkan pengekoran puncak11,12.

Asam format 0,1% akan menghasilkan pH yang rendah sehingga dapat mencegah gugus silanol berikatan dengan EMB memperkuat daya elusi, meningkatkan respon analit dan mengurangi tailing. Pada sistem UPLC, diameter dan panjang kolom telah diperkecil sehingga dapat meningkatkan resolusi kromatogram yang dihasilkan dan mengurangi risiko tailing yang sering terjadi pada sistem KCKT menggunakan kolom konvensional. 73

Prosiding Rakernas dan Pertemuan Ilmiah Tahunan Ikatan Apoteker Indonesia 2016 e-ISSN : 2541-0474

4. KESIMPULAN Penelitian ini berhasil mendapatkan kondisi instrumen dan fase gerak yang optimal. DAFTAR PUSTAKA 1. World Healt Organization, Tuberculosis Control in the South-East Asia Region Annual TB Report 2014, WHO/HTM/TB/ 2014.08, 2014, Geneva: World Health Organization. 2. Gong Z, Basir Y, Chu D, McCort-Tipton M. A rapid and robust liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for simultaneous analysis of antituberculosis drugs: ethambutol and pyrazinamide in human plasma. Journal of Chromatography B. 2009;877:1698-1704. 3. Allanson A.L, Cotton M.M, Tettey J.N.A, Boyter A.C. Determination of rifampicin in human and blood spots by high performance liquid chromatograpy with UV detection : A potential method for therapeutic drug monitoring. J. of Pharm. And Biomed. Anal. 2007;44;963-969. 4. Sotgiu G, Jan-Willem C, Alffenaar, Rosella C, Lia D, Antonio S, Andrea P, Giovanni B.M. Therapeutic drug monitoring : how to improve drug dosage and patient safety in tuberculosis treatment. Int. J. of Inf. Diseases. 2015;32:101-104. 5. Edelbroek P.M, Van der Heijden J, Stolk L.M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Therapeutic Drug Monitoring. 2009;31(3): 327–336. 6. Baietto L, D‘Avolio A, De Rosa F.G, Garazzino S, Patanella S, Siccardi M, Sciandra, M, Di Perri G. Simultaneous quantification of linezolid, rifampicin, levofloxacin, and moxifloxacin in human plasma using high-performance liquid

7.

8.

9.

10.

11.

12.

chromatography with UV. Ther. Drug Monit. 2015;31:104-109. Hong L, Jiang W, Zheng W, Zeng S. HPLC analysis of para-aminosalicylic acidand its metabolite in plasma, cerebrospinal fluid and brain tissues. J. Pharm. Biomed. Anal. 2011;54: 1101–1109. Song S.H, Jun S.H, Park K.U, Yoon Y, Lee J.H, Kim J.Q, Song J. Simultaneous determination of first-line anti-tuberculosis drugs and their major metabolicratios by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 2007;21: 1331–1338. Gong Z, Basir Y, Chu D, McCort-Tipton M. A rapid and robust liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for simultaneous analysis ofantituberculosis drugs – ethambutol and pyrazinamide in human plasma. J.Chromatogr. B: Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2009;877: 1698–1704. Huan W, Cuifang C, Chunxia C, Jing L, Ying K, Meng Z, Tianhong Z. A simple and rapid HPLC/UV method for simultaneous quantification of four constituents in antituberculosis 4-FDC tablets by pre-column derivatization. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2012;7:303-309. Ornaf R.M dan Dong M.W. Key Concepts Of HPLC In Pharmaceutical Analysis, dalam: Ahuja S, Dong M.W. (Eds.). Handbook Of Pharmaceutical Analysis By HPLC. Elsevier Academic Press. Amsterdam. 2005. hal. 19–44. Dong M.W. HPLC Instrumentation In Pharmaceutical Analysis: Status, Advances, And Trends, dalam: Ahuja S, Dong M.W. (Eds.). Handbook Of Pharmaceutical Analysis By HPLC. Elsevier Academic Press. Amsterdam. 2005. hal. 47–73.

74