BAB V KESIMPULAN, SARAN DAN RINGKASAN
A. Kesimpulan Penelitian tentang Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Buah Merah (P. conoideus Lam) pada kadarTNF-α dan ekspresi ICAM-1 mencit Swiss (Mus musculus L) yang di infeksi P.berghei dapat disimpulkan: 1.
Kadar TNF-α mencit Swiss (Mus musculus L) yang diinfeksi P.bergheiyang diberi ekstrak etanol buah merah (P. conoideus Lam) dosis 130, 260, 520 mg/kgBB lebih rendah daripada kelompok mencit Swiss yang tidak diberi ekstrak etanol buah merah.
2.
Jumlah Ekspresi ICAM-1 pada sel endotel jaringan otak mencit Swiss (Mus musculus L) yang diinfeksi P.berghei yang diberi ekstrak etanol buah merah (P. conoideus Lam) dosis 130, 260 mg/kgBB lebih rendah daripada kelompok mencit yang tidak diberi ekstrak etanol buah merah.
B. Saran 1.
Perlu dilakukan penelitian tentang ekspresi CXCL9 pada sel endotel dengan adanya pengaktifan CPLA2 menyebabkan serebral malaria
2.
Perlu adanya penelitian tentang buah merah dapat mengaktifkan NK sel mencegah serebral malaria.
3.
Perlu dilakukan penelitan tentang efektif buah merah meregulasi FcγRIII pada sel neutrofil.
C. Ringkasan
Latar Belakang Malariamerupakan penyakit yang mengancam jiwa serta disebabkan oleh parasit Plasmodium yang ditularkan ke manusia melalui gigitan nyamuk terinfeksi (Cibulskis et al., 2011).Infeksi malaria P. falciparum yang berat dan fatal seperti serebral malaria, berkontribusi tinggi terhadap mortalitas pada semua kelompok usia, terutama penduduk di daerah endemik malaria. Kondisi ini selain disebabkan oleh beberapa faktor di atas ditunjang juga oleh sifat virulensi P. falciparum yang dapat menginfasi eritrosit baik tua, muda maupun sel induk eritropoetik (Harijanto, 2010). Antigen parasit dapatmengaktifkan APC dan mempresentasikan fragmen antigen protein dengan bantuan molekul permukaan yaitu MHC untuk memudahkan pengenalan antigen dengan bantuan TCR, interaksi ini mengawali aktivasi sel T sehingga dapat memproduksi berbagai molekul misalnya sitokin yang menjadikan
berbagai sel saling berkomunikasi. Interaksi sel tergantung dari sinyal yang timbul dari kontak TCR danMHC I dan II. Hal ini mutlak diperlukan dalam tahap awal aktivasi sel T, sehingga sel T yang teraktivasi akan berkembang menjadi sel T helper 1 yang mensekresi sitokin proinflamasi
seperti TNF-α, IL-1, IL-2, IFN-γ dan sel T helper 2
yang dapat
mensekresi sitokin antiinflamasi seperti IL-10, IL-5, IL-4, sehingga dapat melepaskan spektrum sitokin yang mengaktifkan sel T lainnya pada respon seluler atau sitotoksit serta membantu sel B berdiferensiasi menjadi sel plasma yang memproduksi antibodi (Baratawidjaja, 2009; Smeets et al., 2012). Kadar TNF-α yang tinggi dalam ruang serebrovaskuler dapat memperhebat terjadinya kerusakan jaringan otak dan defisit neorologis (Robbins & Cotran, 2010). Mekanisme protektif terhadap kondisi patologis dari malaria, sel T helper 2 (CD4+) melepaskan sitokin IL-4, IL-5, IL-10 yang merupakan sitokin imunosupresan, dengan menghambat aktivitas sel T helper 1 (CD4+) yaitu TNF-α oleh IL-10, peningkatan kadar IL-10 dapat mencegah kerusakan jaringan otak akibat serebral malaria. Komplikasi malaria berat ditentukan oleh kadar sitokin proinflamasi berupa TNF-α pada kadar tinggi dan berefek patologis, namun pada kadar rendah sebagai antiparasit (Harijanto, 2010). Produksi TNF-α akan meningkatkan ekspresi reseptor sel endotel otak (brain endothelial cell) seperti ICAM-1, selanjutnya akan berikatan dengan PfEMP-1 yang terdapat pada permukaan pRBC dan menyebabkan cytoadherence pRBC dengan sel endotel otak. Cytoadherence tersebut dapat menyebabkab obstruksi pembuluh
darah otak (Graninger et al., 1994; Harijanto, 2000; Wassmer et al., 2011). Pengobatan dengan antimalaria telah banyak dikembangkan, tetapi masalah utama yang dihadapi adalah kegagalan terapi karena resistensi parasit terhadap obat anti malaria. WHO merekomendasikan penggunaan obat herbal untuk dikembangkan sebagai terapi dalam penanganan masalah kesehatan (Nadesul, 1998). Buah merah (P. conoideus Lam) termasuk salah satu bahan makanan yang memiliki kandungan senyawa aktif yaitu total karotenoid 12.000ppm, total tokoferol 11.000ppm, betakaroten 700ppm, alfa tokoferol 500ppm, vitamin C 25,70mg, khasiat buah merah telah dibuktikan secara in vitro,in vivo, maupun uji klinis adalah β-karoten sebagai pencegahan penyakit degeneratif misalnya strok, jantung koroner, kanker, asam urat, osteoporosis serta mampu meningkatkan aktivitas sel T helper dan antibodi (Budi, 2005). Pemberian buah merah pada infeksi malaria falciparum dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit, khususnya pada jalur imunitas seluler dan humoral yang diperankan oleh subset sel limfosit T helper 2 DC4+, mengingat kandungan senyawa aktif β-karoten yang tinggi dalam ekstrak buah merah memiliki kemampuan untuk berinteraksi dan mengaktivasi sel T helper 2, sehingga jalur imunitas seluler dan humoral juga akan teraktivasi melalui pelepasan berbagai sitokin. Dengan demikian sel T helper 2 akan berinteraksi dan mengaktifkan proliferasi sel limfosit B, kemudian sel B mengalami diferensiasi menjadi antibodi spesifik antigen P. falciparum dan sel plasma, sehingga angka parasitemia dapat ditekan dan mencegah kondisi patologis akibat infeksi malaria (Baratawidjaja, 2006;Budi, 2005; Harijanto, 2000).
Berdasarkan latar belakang, rumusan masalah yang diajukan dalam penelitian ini adalah: Apakah pemberian ekstrak buah merah (P. conoideus Lam) dapat menghambat kadar TNF-α dan ekspresi ICAM-1 pada sel endotel jaringan otak mencit Swiss jantan yang dinduksi P. berghei ?
Tujuan Penelitian Mengetahui efek ekstrak buah merah terhadap perubahan jumlah kadarTNF-α ekspresi ICAM-1 di sel endotel jaringan otak mencit Swiss jantan yang diinfeksi P.berghei. Keaslian Penelitian Kumala et al, 2008 melakukan penelitian tentang pengaruh ekstrak buah merah (P. conoideus Lam) terhadap pertumbuhan in vitro limfosit dan sel tumor. Hasil penelitian menunjukan bahwa ekstrak buah merah menggunakan n-heksan lebih menunjukan efek imunostimulan dan efek toksik dibanding ekstrak etanol dan etil asetat. Selain itu ekstrak buah merah memiliki efek imunostimulan terhadap sel limfosit berada pada konsentrasi rendah yaitu, 0,06875 mg/ml, serta dapat memberikan efek toksik pada konsentrasi yang lebih tinggi yaitu
lebih dari
14,000g /mL. Pada penelitian ini akan dilihat perubahan kadar TNF-α dan ekspresi ICAM-1 pada sel endotel mikrovaskuler akibat pemberian ekstrak buah merah.
Tinjauan pustaka Ketika sporozoit yang masuk kedalam sirkulasi darah dan menuju kehati maka terjadi proses perlekatan sporosoit seperti CSP, dengan reseptor heparin sulfat proteoglikan atau disebut juga LPR yang terdapat pada permukaan sel hati, segera dihadapi oleh sistem imun non spesifik terutama sel fagositosis seperti neutrofil, monosit, makrofag dan denritik, semua ini merupakan APC. Selain itu makrofag
dapat memfagositosis antigen parasit
dengan pelepasan IL-12 untuk
mengaktifkan NK dan mengekspresi IFN-γ yang berfungsi meningkatkan aktivitas sitolitik makrofag untuk pemusnahan antigen parasit yang sudah di fagositosis dan opsonisasi
melalui
jalur
imunitas
nonspesifik
(Agudelo
et
al.,
2012;
Baratawidjaja, 2006). Produksi sitokin diawali dengan antigen parasit melalui LPS yang dikenali oleh CD14 dan mengaktifkan TLR4 sehingga memacu penggabungan dan mengaktifkan MyD88 dengan TIR (Lepenies et al., 2008).MyD88 yang aktif dapat memfosforilari IRAK1dan 4 dan mengekspresi TRAF6 sebagai sinyal tranduksi, sehingga TAK1 aktif dan mengfosforilasi IKK menyebabkan IKβ aktif dan melepaskan NFkβ, sehingga NFkβ yang aktif masuk kedalam nukleus
maka terjadi gen regulasi
imflamatorik seperti TNF-α, IL-1, IL2, IFN-γ (Picard et al., 2011; Poli, 2011; Zhu et al., 2005).Peningkatan kadar TNF-α dapat mengaktifkan NOX4 sehingga melepaskan •O2- sehingga dapat mengaktifkan cPLA2 dan memfosforilasi fosfat yang berikatan dengan IKβ-α dan melepaskan P50, P65 yang aktif dan akan masuk kedalam nucleus dan memfosforilasi fosfat yang berfungsi sebagai regulasi gen.
selain itu juga cPLA2 yang berfungsi untuk mengubah
fosfolipid menjadi AA
setelah itu dengan bantuan enzim COX-2 akan diubah menjadi PGH2 dengan bantuan enzim PGE sintase menjadi PGE2 dan diekspresikan kepermukaan membran sel endotel sebagai molekul sinyal yang berikatan dengan reseptor
protein G
sehingga protein G aktif dan mengaktifkan AC yang akan memproduksi cAMP dari ATP dan dapat mengaktifkan enzim PKA yang memfosforilasi atau menambah gugus fosfat pada protein CREB karena didalam DNA ada elemen yang merespon cAMP yang akan berikatan dengan binding protein. CREB akan menempel pada cAMP, untuk dapat menempel CREB harus difosforilasi, karena PKA dapat memfosforilasi CREB dan dapat menempel pada CRE, kemudian ada fosfat yang difosforilasi oleh P50 dan P65 yang akan mengaktivasi CREB untuk proses regulasi gen ICAM-1 (Dixon, 2001;
Hadad et al., 2011; Narumiya,
2007; Pol, 2011; Sommerfelt et al., 2013). Parasit malaria dapat mendegradasi hemoglobin eritrosit inang 20-80% dan mengasamkan dengan pengaktifan Phosphoenolpyruvate Carboxylase mengubah piruvat menghasilkan laktat yang menyebabkan asidosis laktat yang menyebabkan terjadi penurunan afinitas oksigen P02 2,0 - 2,8 mmHg, sehingga dengan mudah mendegradasi organela di vacuola, proses degradasi hemoglobin, enzim-enzim juga mengkatalisasi detoksifikasi heme FP IX menjadi hemozin dan melepaskan radikal bebas, Phosphoenolpyruvate Carboxylase ketika berikatan dengan bikarbonat akan membentuk OAA dan menghasilkan aspartate yang berfungsi mendegradasi hemoglobin eritrosit, selain itu juga aktivasi dari makrofag dalam memfagositisi
parasit malaria dan eritosit terparasit sehingga menyebabkan anemia (Muller, 2004; Silbernagl & Florian, 2007; Storm et al., 2014). Senyawa aktif yang terkandung dalam buah merah adalah karotenoid total 12.000ppm, tokoferol total 11.000ppm, β-karoten 700ppm, α-tokoferol 500ppm, kandungan buah merah yang lain adalah vitamin C 25,70mg, asam oleat, asam linoleat, asam linolenat, dan dekonoat merupakan antioksidan yang tinggi dan berperan dalam menstabilitas membran sel serta melindungi komponen seluler dari kerusakan oksidatif. Selain itu juga β-karoten dapat meningkatkan imunitas serta meningkatkan sel limfosit, sel T helper, serta produksi antibodi. Senyawa β-karoten
merupakan
provitamin
A,β-karoten
mempunyai
ikatan
rangkap
cis- β-karoten sehingga peka terhadap oksidasi, proses tersebut terjadi pada rantai karbon yang mengandung ikatan rangkap, β-karoten merupakan penangkap oksigen dan sebagi antioksidan dan efektif sebagai pengikat radikal bebas bila dalam konsentrasi oksigen 2-21mmHg (Bai et al., 2005; Baratawidjaja, 2009; Budi, 2005; Sies & Stahl, 1995). Betakaroten bila berada dalam usus halus akan bereaksi dengan karoten dioksigenases menjadi retinaldehida dan disimpan didalam hepar, ketika dibutuhkan dalam sel akan dihidrolisis oleh enzim pankreas esterase menjadi retinol dan diikat oleh retinol binding protein menuju sel dan masuk kesitosol dan berikatan dengan celluler receptor binding protein dan dihidrolisis oleh retinol dehidrogenases dan alkohol dehidrogenases sehingga menjadi retinal dan retinal akan diubah menjadi all-trans-RA dengan bantuan retinaldehyde dehydrogenases, all-trans-RAmasuk
kedalam
nukles
dan
berikatan
dengan
RAR
sehingga
terjadi
transcriptional activation of vitamin A responsive genes, sehingga vitamin A berperan dalam meregulasi fungsi imun, nonspesifik dan respon seluler dan humoral, selain itu juga vitamin A berperan dalam perkembangan dan diferensiasi subset T helper 1 dan T helper 2, mempertahankan antibodi normal atas pengaruh T helper 2 yang
menekan
produksi
IL-12,
TNF-α
dan
IFN-γ
oleh
T
helper
1
(Baratawidjaja, 2009; Iwata et al., 2003; Litwack, 2007). Selain itu juga all trans retinoid acid ketika berikatan dengan protein PPAR dapat meregulasi protein M2 yang berfungsi mengaktifkan Phospholipase C dan mengubah PIP2 membentuk DAG dan PIP3 yang berfungsi mengatur kadar ion Ca2+ intrasel dengan cara berikatan pada reseptor PIP3 pada permukaan reticulum endoplasma dan stimulasi pelepasan ion Ca2+ dari retikulum endoplasma, ion Ca2+ bebas dapat terikat pada kalmodulin dan dapat mengaktifkan kalsineurin, sehingga kalcineurin memfosforilasi phospat yang digunakan
nuklear faktor aktivasi T
sehingga NFAT aktif dan masuk nukleus berikatan dengan interferon regulation factor 4, IRF4 akan berikatan dengan promoter IL-10 sehingga terjadi regulasi protein-protein anti inflamatorik antara lain IL-10 (Khalaf et al., 2013; Mandrekar-Colucci et al., 2013; Poli, 2011; Rangaswamy & Speck, 2014; Shong et al., 2013).
Berdasarkan penelaan pustaka diatas, diperoleh landasan teori sebagai berikut: 1.
Malaria disebabkan oleh Plasmodium melalui GPI dan LPS akan mengaktifkan makrofag dan memproduksi sejumlah sitokin proinflamasi pada mekanisme imunitas seluler antara lain TNF-α.
2.
Peran dari TNF-α sebagai imunoprotektif pada infeksi malaria namun ketika peningkatan produktifitas kadarTNF-α sangat berkontribusi pada mekanisme patofisiologi serebral malaria yaitu dengan adanya ekspresi ICAM-1 pada sel endotel pada jaringan otak.
3.
Ekstrak buah merah memiliki sejumlah kandungan senyawa aktif yang dapat memberikan efek imunostimulan baik pada sistem imun seluler maupun humoral dan bekerja sebagai antioksidan namun penggunaan pada dosis tinggi tidak akan efektif sebagai antioksidan.
Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini menggunakan rancangan eksperimen kuasi dengan post test only control group design (Creswell, 2013).Enam puluh ekor mencit Swiss jantan, umur 8 minggu, berat badan 20-30g, dibagi menjadi 6 kelompok, kelompok I tidak diberi ekstrak etanol buah merah (BM) dan tidak diinfeksi Plasmodium berghei, kelompok II diberi BM 260 mg/kg BB, namun tidak diinfeksi P. berghei, kelompok III, IV, V diberi BM berturut turut 130, 260, dan 520 mg/kg BB selanjutnya diinfeksi P. berghei. Kelompok VI tanpa BM namun diinfeksi P. berghei.Ekstrak buah merah
atau bahan pembawa diberikan selama 4 minggu, infeksiP. berghei dilakukan pada awal minggu ke-3. Pemeriksaan kadar TNF-α dilakukan pada hari ke-3 dan hari ke-9 setelah infeksi, dengan mouse TNF-α ELISA kit. Pemeriksaan ekspresi ICAM-1 sel endotel jaringan otak dilakukan pada hari ke-3 dan hari ke-9 dengan pewarnaan imunohistocimia (IHC).
Alat dan Bahan Penelitian Kandang mencit lengkap dengan tempat pakan dan minumnya, timbangan berat badan untuk mencit, tabung plastik 1,5 mL, spuit injeksi 1 mL, spuit injeksi
3
mL, conical tube dengan rak, mikropipet dengan blue & yellow tip, microplate, meja bedah, gunting bedah, mikroskop cahaya, pinset anatomis dan pinset sirurgis, tabung kapiler dan tempat sampel jaringan otak, sentrifus, labu ukur 50 mL,
objek
glass, kapas, sarung tangan, masker, dan alat tulis. Mencit Swiss jantan berumur 8 minggu dengan berat badan 20-30g, bahan makanan mencit AD2 (berbentuk pellet), P. berghei dengan tingkat kepadatan
1x10 7 sel/0,2mL,
sediaan
ektrak
buah
merah,
Tween
40,
mouse TNF-α ELISA test kit, mouse IHC ICAM-1 test kit, antikoagulan (citrate phospat dextrose/CPD), alkohol 70%, larutan kloroform untuk mengorbankan mencit, asam pikrat untuk menandai mencit, medium RPMI 1640: 3x100 ml, PBS steril: 3x100ml, minyak imersi, metanol absolut, akuades, dan phosphate buffer.
Dosis Ekstrak Buah Merah Dalam berbagai penelitian buah merah, dosis terapi serta peningkatan stamina tubuh dari ekstrak buah merah yang dianjurkan karena relatif aman, bahkan sudah terdapat dalam bentuk sediaan komersial adalah 1000 sampai 5000 mg, atau 1-5g / hari / 70 Kg BB dengan konversi dosis dari manusia 70 kg ke mencit dengan bobot 20g adalah 0,0026g (Harmita & Radji, 2008). Selanjutnya diambil dosis untuk meningkatkan stamina tubuh yakni 2000 mg (2g)/hari/70 kg BB Manusia dengan dikonversi dosis tersebut ke mencit 0.0026g (Budi, 2005; Ngatidjan, 2006), dapat dihitung sebagai berikut =2g x 0,0026g = 0,0052 /20g= 0,00026 g x 1000 = 0,26mg/g = 0,26 x1000 = 260mg / Kg BB. Dosis ekstrak buah merah akan diberikan dalam 3 peringkat dosis, sehingga dosis 260mg/kg BB merupakan dosis lazim yang setara dengan dosis untuk manusia. Dosis lain adalah setengah dari dosis lazim (130 mg/kg BB), dan dua kali dosis lazim (520 mg/kg BB).
Cara menyiapkan Ekstrak Buah Merah Volume maksimal bahan uji yang akan diberikan per oral untuk mencit dengan berat badan 20g adalah 1 mL. Oleh karena itu, semua sediaan dibuat dengan kadar tertentu sehingga volume maksimal yang diberikan adalah 1 mL per 20g mencit. a.
Cara menyiapkan bahan uji untuk kelompok yang diberi bahan uji dengan dosis 520mg/kgBB.
Tiap mencit 20g memerlukan (520mg/1000g)x 20g = 10,4 mg, oleh karena itu sediaan dibuat dengan kadar 10,4 mg/mL. Bila bahan uji akan dibuat dengan volume 60 mL, maka diperlukan bahan uji sebanyak 10,4 mg x 60 = 624 mg. Larutan Tween digunakan sebagai pelarut bahan uji, dengan kadar sehingga larutan tween
0,6% v/v,
yang diperlukan untuk 60 mL adalah 0,36mL.
Selanjutnya disiapkan bahan uji, sebanyak 624mg, ditambahkan larutan Tween sebanyak 0,36mL dan ditambah akuades sampai 60 mL (disebut sediaan 1). b.
Cara menyiapkan bahan uji untuk kelompok yang diberikan bahan uji dengan dosis 260mg/kgBB.
Sediaan untuk kelompok ini dibuat dari sediaan yang digunakan untuk yang diberikan bahan uji dengan dosis 520mg/kgBB
kelompok
(sediaan 1).Sediaan 1
sebanyak 30 mL ditambahkan akuades 30 mL akuades (sediaan II). c.
Cara menyiapkan bahan uji untuk kelompok yang diberi bahan uji dengan dosis 130mg/kgBB.
Sediaan untuk kelompok ini dibuat dari sediaan yang digunakan untuk kelompok yang diberi bahan uji dengan dosis 260mg/kgBB (Sediaan II).Sediaan II sebanyak 30mL ditambahkan akuades 30mL akuades (Sediaan III).
Bagan penelitian KI KII KIII KIV KIV
A D A P T A S I
KVI H0
Minggu Keterangan : Kontrol
I
II
H3
H9
III
IV
: Ekstrak buah merah : P.berghei R : Randomisasi K : Kelompok H : hari K1 : Kelompok tanpa bahan uji dan tidak diinfeksi P. berghei. KII : Kelompok yang diberi ekstrak etanol buah merah (BM) 260 mg /kgBB tanpa diinfeksi P. berghei. KIII : Kelompok yang diberi BM 130 mg/kg BB/ hari satu kali sejak awal minggu pertama sampai akhir minggu perlakuan, dan diinfeksiP. berghei satu kali awal minggu ke-tiga pada H0. KIV : Kelompok yang diberi BM 260 mg/kg BB/ hari satu kali sejak awal minggu pertama sampai akhir minggu perlakuan, dan diinfeksiP. berghei satu kali awal minggu ke tiga pada(H0) KV : Kelompok yang diberi BM 520 mg/kg BB/hari satu kali sejak awal minggu pertama sampai akhir minggu perlakuan, dan diinfeksi P. berghei satu kali awal minggu ke tiga pada(H0) KVI : Kelompok tanpa BM, diinfeksi P. berghei satu kali awal minggu ke- tiga pada H0 H3, H9 : Hari pengambilan sampel darah dan pemeriksaan ekspresi ICAM-1 pada sel endotel jaringan otak Gambar 5. Bagan Penelitian
Pemeriksaan Laboratorium
a.
Pengambilan Darah untuk Pemeriksaan Kadar TNF-α.
Pada hari ke-tiga dan ke-sembilan setelah infeksi P. berghei,6 ekor mencit dari tiap kelompok dikorbankan untuk dilakukan pengambilan darah melalui vena orbitalis menggunakan microhematokrit.Darah disentrifus dan diambil serumnya, serum disimpan dalam freezer.Sementara sisa mencit yang tersisa dari tiap kelompok dibiarkan hidup untuk dievaluasi. Semua serum mencit yang disimpan dalam freezerdiambil dan dibuat preparat pemeriksaan ELISA menggunakan mouse TNF-α ELISA test Kit. b.
Pengukuran kadar TNF-α dengan menggunakan mice TNF-α ELISA Test Kit Persiapan detector complex dengan cara mencampur
anti-
mouse TNF-biotin conjugate dengan streptovidin alkaline conjugate dalam volume sama banyak. Persiapan 60 x N µL untuk tiap reagen
(N adalah
jumlah sumuran yang akan digunakan untuk assay). Campuran tersebut disimpan disuhu ruangan sampai digunakan.Waktu antara persiapan dan pemakaian sekitar 60-90 menit setelah itu sisa larutan dapat disimpan pada 20C -80C selama 2 bulan. Transfer 150µL sampel dan kontrol ke dalam sumuran plate 96 dengan replikasi 2 kali kemudian plate ditutup dengan adhesive coversecara hati-hati untuk menghindari gelembung udara di dalam sumuran dan melekatnya larutan dalam
plate pada cover. Selanjutnya diinkubasikan selama 1 jam pada suhu 370C. Masa inkubasi dapat diperpanjang sampai 3 jam untuk meningkatkan nilai OD setelah itu buka cover dengan hati-hati, aspirasi semua sumuran, tambahkan 300 µL washing buffer pada tiap sumuran dan diaspirasi lagi. Ulangi pencucian sebanyakdua kali, kemudian aspirasi dapat diulang sekali lagi untuk membersihkan semua sisa washing buffer. Kemudian tambahkan 100µL detector complexpada masing-masing sumuran secara hati-hati jangan sampai menyentuh permukaan sumuran. Tutup plate dengan adhesive cover dan diinkubasikan selama 1 jam pada suhu 370C. Menjelang akhir inkubasi segera larutkan 2 mL substrat buffer menjadi 20 mL dengan akuades. Tambahkan 2 tablet substrat dengan menggunakan pinset steril ke dalam buffer dan dilarutkan dengan vortex mixer. Pastikan bahwa substrat telah terlarut homogen. Substrat pNPP ini harus disimpan di tempat gelap atau ditutup dengan aluminium foildan digunakan dalam waktu 30 menit. Plate dikeluarkan dari inkubator dan ulangi prosedur pencucian dan tambahkan 100µL substrat pNPP pada masing-masing sumuran dan tutup dengan adhesive cover dan inkubasikan pada 300C, hindari pemaparan dengan lampu atau dapat ditutup dengan aluminium foil. Setelah inkubasi selama 30 menit, dan dalam interval 30 menit, dapat dilakukan monitoring pembentukan warna dan hilangkan semua gelembung udara sebelum melakukan monitoring. Nilai absorbance pada 405 nm untuk 7000 pg/mL standar harus antara 1,0-2,0 absorbance unit sebelum pembacaan akhir
ditentukan.Jika nilai tersebut telah dicapai maka reaksi dihentikan dengan menambah 30µL NaOH3M untuk masing-masing sumuran.Setelah itu dilakukan pembacaan dengan spektrofotometer pada absorbance 450 nm (Crowther, 2001). c.
Pemeriksaan ekspresi ICAM-1 di sel endotel jaringan menggunakan metode Immunohistochemistry (IHC).
otak dengan
Pada hari ke-3 dan hari ke-9 ada enam ekor mencit yang diambil dari setiap kelompok dan dikorbankan untuk dilakukan isolasi sel endotel pada jaringan otak mencit Swiss yang telah diinfeksi dengan P. berghei dan diberi ekstrak buah merah, dengan teknik Immunohistochemistry (IHC). Untuk melihat ekspresi ICAM-1 digunakan IHC ICAM-1 test Kit. 1)
Terminasi Mencit
Agar hewan coba mati dengan layak, cara terminasi dilakukan menyuntikkan ketamin 50mg dalam 1mL sebelum dilakukan dislokasi tulang leher. Setelah mencit mati, reseksi korteks serebri,
lapisan meningen
dan pembuluh darah besar di permukaan. 2)
Pembuatan blok paraffin jaringan otak
Setelah mencit diterminasi, jaringan otak diambil dengan hati-hati melalui pemotongan jaringan otak, diiris 3µm dengan mikrotom. 3)
Fiksasi jaringan otak dengan buffer formalin 10% dalam tempat jaringan
4)
Dehidrasi dilakukan secara bertahap, yaitu lakukan dehidrasi dalam larutan alkohol 30,40,50,60,70,80,90,100% dengan lama waktu yang sama untuk setiap kadar alkohol yaitu 3x15 menit, kemudian dimasukan ke dalam
larutan yang berisi toluol alkohol selama 20 menit dan toluol murni selama 60 menit. 5)
Embedding Paraffindengan memasukan jaringan otak ke dalam parafin 10 menit 4 kali kemudian disimpan dalam oven dengan suhu 600C setelah itu dimasukan ke dalam cetak blok parafin.
6)
Pewarnaan ekspresi ICAM-1 di sel endotel pada jaringan otak dengan metode IHC. Sel dicuci dengan PBS pH 7,4 sebanyak tiga kali selama masing-masing lima menit. Sel di tetesi dengan 0,02% sodium aside. Jaringan dapat disimpan dalam lemari pendingin untuk beberapa hari. Jaringan dicuci dengan PBS pH 7,4 tiga kali selama lima menit. Jaringan di tetesi dengan larutan H202 dalam PBS selama 10 menit.Sel di tetesi dengan bloking serum 5% FBS yang mengandung Triton-X 0,25% selama satu jam. Sel dicuci dengan PBS.Inkubasi antibodi primer ICAM-1 dalam serum 1:200 selama 24 jam.Jaringan disimpan pada suhu 40C.jaringan di keluarkan pada suhu ruangan selama 15 menit. Jaringan dicuci dengan PBS dua kali masing-masing selama lima menit. Sel diinkubasi dengan antibodi sekunder biotin-goat anti-mouse 1:400 selama satu jam pada suhu ruangan. Jaringan dicuci dengan PBS dua kali selama masing-masing lima menit. Sel ditetesi dengan diamino benzidine (DAB) dalam buffer DAB. Sel ditetesi dengan courstexin selama 10 menit.Jaringan dicuci dengan akuades selama 10 menit.Jaringan dibiarkan pada suhu kamar.Jaringan di tutup
dengan objek glass.Setelah itu dibiarkan semalam dan diamati dengan mikroskop perbesaran 200 kali (Hewitson, 2009).
Hasil Penelitian Ekstrak etanol buah merah (P. conoideus Lam) diberikan selama14 hari sebelum mencit Swiss diinfeksi P.berghei dan dilanjutkan sesudah infeksi. Rerata kadar TNF-α pada semua kelompok pada hari-3 dan hari-9 setelah infeksi dinalisis menggunakan Nonparametrik, Kruskal Wallis Test p<0,05 dan dilanjutkan Mann-Whitney Test disajikan pada Tabel 2, dan ekspresi ICAM-1 pada sel endotel jaringan otak terlampir pada Tabel 3. Tabel.2. Rerata Kadar TNF-α mencit Swiss pada hari ke-3 dan hari ke-9 setelah mencit diinfeksiP.berghei. Kelompok
Rerata kadar TNF-α setelah infeksi (ng/ml)
n=3
Hari ke-3
Hari ke-9
I. Tidak diberi BM, tidak diinfeksi P.berghei
0,009 ± 0,006
0,007 ± 0,002
II. Diberi BM 260 mg/kg BB tidak diinfeksi P.berghei
0,008 ± 0,003
0,013 ± 0,006
III. Diberi BM 130 mg/kg BB diinfeksi P.berghei
0,007 ± 0,001
0,015 ± 0,005*
IV. Diberi BM 260 mg/kg BB diinfeksi P.berghei
0,010 ± 0,007
0,015 ±
V. Diberi BM (520 mg/kg BB diinfeksi P.berghei
0,009 ± 0,002
0,012 ± 0,002*
VI. Tidak diberi BM, diinfeksi P.berghei
0,010 ± 0,003
0,026 ± 0,003
0*
Keterangan: BM : Ekstrak Etanol Buah Merah * : p<0,05 (dibandingkan dengan kelompok VI)
KadarTNF-α mencit kelompok 1 yang tidak diberi ekstrak etanol merah dan tidak diinfeksi P.berghei tidak menunjukan perbedaan yang bermakna (p>0,05) antara hari
ke-3 setelah hari infeksi maupun hari ke-9 setelah hari infeksi. Hasil ini menunjukan bahwa tanpa pemberian apa pun, tidak akan mengubah kadar TNF-α. Mencit kelompok
VI yang diinfeksi P.berghei tanpa diberi ekstrak etanol buah merah,
menunjukan peningkatan kadar TNF-α (p<0,05) pada hari ke-9 setelah infeksi dibandingkan hari ke-3 setelah infeksi. Pada kelompok mencit yang tidak diinfeksi P.berghei (kelompok I dan II), pemberian ekstrak etanol buah merah dengan 3 macam dosis (kelompok III, IV,V) selama 14 hari sebelum infeksi sampai 3 hari setelah infeksi tidak memberikan perbedaan kadar TNF-α yang berbeda (p>0,05) dengan kelompok mencit yang tidak diberi ekstrak etanol buah merah (kelompok VI). Namun, pemberian ekstrak etanol buah merah selama 14 hari sebelum infeksi sampai 9 hari setelah diinfeksi (kelompok III, IV, dan V) menunjukkan kadar TNF-α yang lebih rendah (p<0,05) dibandingkan kelompok mencit yang tidak diberi ekstrak etanol buah merah (kelompok VI). Hasil ini menunjukan bahwa pemberian ekstrak etanol buah merah dengan dosis 130, 260, 520 mg/kgBB selama 14 hari sebelum infeksi dan dilanjutkan sampai 3 hari setelah infeksi belumdapat menurunkan kadar TNF-α, namun setelah pemberian ekstrak etanol buah merah dilanjutkan sampai 9 hari setelah infeksi menyebabkan penurunan kadar TNF-α. Rerata ekspresi ICAM-1 pada sel endotel jaringan otak semua kelompok pada hari ke-3 dan ke-9 setelah hari infeksi disajikan pada tabel 2. Kelompok mencit yang diinfeksi P.berghei (kelompok VI) menunjukan ekspresi ICAM-1 yang lebih besar (p<0,05) dibandingkan kelompok I yang tidak diinfeksi P. berghei. hasil ini
menunjukan bahwa infeksi P. berghei dapat meningkatkan jumlah ekspresi ICAM-1 sel endotel jaringan otak mencit Swiss. Tabel.3
Rerata ekspresi ICAM-1 pada sel endotel jaringan otak mencit Swiss pada hari ke-3 dan hari ke-9 setelah mencit diinfeksi P. berghei. Kelompok n=3
(Ekspresi Icam-1/Jumlah) sel x 100 Hari ke-3
Hari ke-9
I. Tidak diberi BM, tidak diinfeksi P.berghei
0,319 ± 0,168*
0,878 ± 0,133*
II. Diberi BM 260 mg/kg BB tidak diinfeksi P.berghei
0,307 ± 0,532
9,052 ± 2,333
III. Diberi BM 130 mg/kg BB diinfeksi P.berghei
7,681 ± 6,692*
19,204 ± 5,513*
IV. Diberi BM 260 mg/kg BB diinfeksi P.berghei
7,068 ± 4,021*
2,944 ± 1,775*
V. Diberi BM (520 mg/kg BB diinfeksi P.berghei
27,274 ± 14,580
16,719 ± 11,975
VI. Tidak diberi BM, diinfeksi P.berghei
26,980 ± 4,087
27,373 ± 0,102
Keterangan: BM : Ekstrak Etanol Buah Merah * : p<0.05 (dibandingkan dengan kelompok VI)
Pada kelompok mencit yang diinfeksi P.berghei, kelompok yang diberi ekstrak etanol buah merah dosis 130 mg/kgBB (kelompok III dan IV) menunjukkan jumlah ekspresi ICAM-1 pada sel endotel jaringan otak yang lebih rendah (p<0,05) dibandingkan kelompok VI yang tidak diberi ekstrak etanol buah merah (tabel 2.). Hal tersebut terjadi baik pada hari ke-3 maupun hari ke-9 setelah diinfeksi P.berghei. Namun, kelompok mencit yang diberi ekstrak etanol buah merah dasis paling besar (520 mg/kgBB) menunjukan tidak ada perbedaan (p>0,05) dengan kelompok yang tidak diberi ekstrak etanol buah merah (kelompokVI). Hasil ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak etanol buah merah dengan dosis 130 mg/kgBB dan 260 mg/kgBB dapat menurunkan ekspresi ICAM-1 pada sel endotel jaringan otak yang meningkatkan infeksi P. berghei. namun dosis yang lebih besar 520 mg/kgBB
tidak menurunkan ekspresi ICAM-1 baik pada hari ke-3 maupun hari ke-9 setelah diinfeksi P. berghei, menunjukan ada kemungkinan mekanisme lain yang mempengaruhinya,
sehingga
perlu
dilakukan
penelitian
lebih
lanjut.
Gambaran histologi sel endotel jaringan otak pada hari ke-3 setelah infeksi dan hari ke-9 setelah infeksi pada semua kelompok disajikan pada Gambar 6 dan Gambar 7.
Pembahasan 1. Pengaruh Pemberian Ekstrak Buah Merah terhadap Kadar TNF-α. Kelompok II yang diberi ekstrak etanol buah merah 260 mg/kgBB namun tidak diinfeksi P. berghei menunjukan adanya peningkatan kadar TNF-α (0,013±0,006) hal ini disebabkan karena buah merah β-caroten atau provitamin A dapat berperan dalam meregulasi fungsi imun, berperan dalam perkembangan dan diferensiasi subset Th1 yang memproduksi sitokin proinflamasi seperti TNF-α dan Th2 yang memproduksi sitokin anti inflamasi untuk mempertahankan antibodi normal, begitu juga sitokin yang sama dapat diproduksi selama reaksi imun nonspesifik maupun spesifik (Bratawidjaja, 2009; Litwack, 2007). Hasil Analisis Mann-whitney Test didapatkan kadar TNF-α hari-9 setelah diberi infeksi P. berghei pada kelompok III, IV, V yang diberi ekstrak etanol buah merah dosis berturut-turut 130, 260, 520 mg/kgBB lebih rendah (p<0,05) bila dibandingkan dengan kelompok yang tidak diberi ekstrak etanol buah merah dan diinfeksi P. berghei (kelompok VI). Pemberian senyawa bioaktif dalam ekstrak buah merah β-caroten bila berada dalam usus akan bereaksi dengan karoten
dioksigenases menjadi retinaldehida dan disimpan dalam hepar. Pada saat dibutuhkan, oleh sel akan diubah menjadi retinol dan diikat melalui retinol binding protein menuju sel melewati STRA6 dalam bentuk all trans Retinol (atRO) di ikat oleh CRBP dan ubah oleh Alkohol dehidrogenase menjadi retinal dehidrogenase dalam bentuk atRAL setelah itu diubah oleh RALDHS menjadi atRA atau all trans retinoid acid akan aktif dan berikatan denganPPAR dapat meregulasi protein M2 yang befungsi mengaktifkan PLC, mengubah PIP2 menjadi PIP3 dan DAG, PIP3 akan melepaskan kalsium Ca2+ dari retikulum endoplasmik sehingga akan mengaktifkan kalmodulin dan teraktifnya kalcineurin yang mampu memfosforilasi fosfat untuk mengaktifkan NFAT dan meregulasi IL-10, sedangkan IL-10 bekerja sebagai inhibitor dari NFkβ sehingga tidak dapat (Khalaf
meregulasi et
al.,
protein–protein 2013;
proinflamatorik
Mandrekar-Colucci
et
al.,
antara 2013;
lain Poli,
TNF-α 2011;
Rangaswamy & Speck, 2014; Smallie et al., 2010; Zhong et al., 2013). 2. Pengaruh pemberian Ekstrak Buah Merah terhadap Ekspresi ICAM-1 pada sel endotel jaringan otak. Ekspresi ICAM-1 hari ke-3 dan hari ke-9 setelah diberi infeksi P. berghei pada minggu ketiga, kelompok III, IV, yang diberi ekstrak etanol buah merah 130, 260 mg/kgBB lebih rendah p<0,05 bila dibandingkan dengan kelompok yang tidak diberi ekstrak etanol buah merah tetapi diinfeksi P. berghei (kelompok VI) setelah dilakuan Mann-Whitney Test, sehingga dapat di simpulkan, penghambatan terhadap ekspresi ICAM-1 pada hari ke-3 dan hari ke-9 terjadi karena pemberian
ekstrak etanol buah merah setelah diinfeksi dapat menunjukan adanya peran dari senyawa β-caroten, tokoferol, vitamin C bekerja sebagai antioksidan, terutama untuk mengikat radikal bebas (Baratawidjaja, 2009; Litwack, 2007; Sies & Stahl, 1995). Selain itu juga ketika terinfeksi malaria, parasit malaria dapat mendegradasi hemoglobin eritrosit inang 20-80% dan mengasamkan serta mendegradasi organela di vacuola, proses degradasi hemoglobin, enzim-enzim akan mengkatalisasi detoksifikasi heme FP IX menjadi hemozin dan melepaskan radikal bebas. Parasit malaria mengandung protease aspartat sehingga dapat mendegradasi hemoglobin dan menurunkan glukosa dengan pengaktifan PEPC mengubah piruvat menghasilkan laktat yang menyebabkan asidosis laktat sehingga terjadi penurunan afinitas oksigen yaitu dengan konsentrasi Po2 2,0 – 2,8 mmHg. Dengan adanya penurunan tekanan Po2, terjadi perubahan struktur dan fungsi β-caroten dari senyawa prooksidan menjadi antioksidan yang bekerja mengikat radikal bebas, karena betakaroten sebagai antioksidan ketika tekanan Po2 2-21mmHg dan konsentrasi betakaroten 260mg/ml/kgBB sehingga bekerja sebagai antioksidan. selain itu juga aktifasi dari makrofag dalam memfagositosis parasit malaria dan eritosit terparasit menyebabkan adanya pelepasan radikal bebas (Litwack, 2007; Muller, 2004; Ostera et al., 2011; Sies & Stahl, 1995; Silbernagl & Florian, 2007; Storm et al., 2014; Weber et al., 1994). Kandungan tokoferol yang berfungsi sebagai pendonor hydrogen fenolat untuk menetralisirkan β-carotin yang berada dalam kondisi pro-oksidan, ketika
ketersediaan oksigen memadai, dan PO2 cukup tinggi seperti pada kondisi sebelum infeksi, setelah infeksi parasit, banyak senyawa pro oksidan atau oksiradikal yang akan dihasilkan sehingga tokoferol berfungsi sebagai antioksidan (Litwack, 2007; Sies & Stahl, 1995). Ekspresi ICAM-1 hari ke-3 dan hari ke-9 untuk kelompok V BM 520 mg/kgBB diinfeksi P. berghei bila dibanding dengan kelompok VI tidak diberi ekstrak etanol buah merah tetapi diinfeksi P. berghei hasilnya tidak menunjukan penurunan ekspresi ICAM-1 p>0,05 hal tersebut didukung oleh penelitian (Kumala et al, 2008), mengatakan bahwa konsentrasi dosis ekstrak buah bila lebih dari 0,06875 mg/ml dapat memberikan efek toksit, selain itu juga (Bai et al., 2005; Sies & Stahl, 1995), mengatakan bahwa konsentrasi β-caroten didalam plasma bekerja sebagai anti inflamasi dan antioksidan, tidak boleh lebih dari 260 mg/ml/kgBB sehingga dapat bekerja sebagai antioksidan yang aktif pada Po2 2- 21 mmHg.
Kesimpulan Penelitian
tentang
Pengaruh
Pemberian
Ekstrak
Etanol
Buah
Merah
(P. conoideus Lam) pada kadar TNF-α dan ekspresi ICAM-1 mencit Swiss (Mus musculus L) yang di infeksi P. berghei dapat disimpulkan: 1.
Kadar TNF-α mencit Swiss (Mus musculus L) yang diinfeksi P. berghei yang diberi ekstrak etanol buah merah (P. conoideus Lam) dosis 130, 260, 520
mg/kgBB lebih rendah daripada kelompok mencit Swiss yang tidak diberi ekstrak etanol buah merah. 2.
Jumlah Ekspresi ICAM-1 pada sel endotel jaringan otak mencit Swiss (Mus musculus L) yang diinfeksi P. berghei
yang diberi ekstrak etanol
buah merah (P. conoideus Lam) dosis 130, 260 mg/kgBB lebih rendah daripada kelompok mencit yang tidak diberi ekstrak etanol buah merah.
