4
BAB II TINJUAN PUSTAKA
2.1 Bakteri Asam Laktat Bakteri asam laktat (BAL) ditemukan pertama kali oleh Pasteur, seorang professor Kimia di University of Lille, tahun 1887. Lister mengisolasi bakteri asam laktat asal susu yang tengik. Selain itu bakteri asam laktat juga di temukan pada saluran pencernaan hewan maupun manusia (Surono, 2004). BAL pernah diisolasi dari feses bayi (Ruzanna, 2011), dan diisolasi dari cairan rumen sapi bali (Suardana dan Suarsana, 2007). Bakteri asam laktat merupakan bakteri Gram positif yang menghasilkan asam laktat sebagai hasil dari fermentasi karbohidrat, katalase negatif, mikroaerotoleran dan asidotoleran. Bakteri asam laktat juga memiliki ciri-ciri non-motil, tidak berspora, berbentuk basil atau kokus, dan bersifat anaerob aerotolerant (Axelsson, 1998). Bakteri asam laktat bisa tumbuh pada suhu 5-45°C. Sebagian besar bakteri asam laktat dapat tumbuh pada suasana lingkungan dengan pH 4.0-4.5, dan membutuhkan asam amino dan vitamin B untuk dapat tumbuh (Jay et al., 2005). Bakteri asam laktat merupakan kelompok bakteri yang termasuk dalam filum Firmicute. Bakteri yang termasuk dalam kelompok ini adalah Carnobacterium, Enterococcus,
Lactobacillus,
Lactococcus,
Lactosphaera,
Leuconostoc,
Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus dan Weissella (Jay et al., 2005). Secara fisiologis dan aktivitas metabolismenya, bakteri asam laktat dibedakan menjadi bakteri asam laktat homofermentative melibatkan jalur Embden Meyerhof, yaitu glikolisis yang menghasilkan asam laktat, 2 mol ATP dari satu molekul glukosa/heksosa dalam kondisi normal, tidak menghasilkan CO2, dan menghasilkan biomassa sel dua kali lebih banyak daripada bakteri asam laktat heterofermentative. Sedangkan Bakteri asam laktat heterofermentative, melalui jalur 6-fosfoglukonat/fosfoketolase selain menghasilkan asam laktat juga
4
5
menghasilkan etanol asam asetat, senyawa citarasa, dan mannitol serta 1 mol ATP dari heksosa dan tidak mempunyai enzim aldolase (Surono, 2004). Bakteri asam laktat banyak ditemukan pada produk makanan olahan, baik produk hewani seperti daging dan ikan yang difermentasi, susu fermentasi, maupun pada produk nabati seperti fermentasi sayuran dan buah-buahan, serta silase. Selain itu bakteri asam laktat juga banyak terdapat pada organ dalam makhluk hidup, seperti pada saluran pembuangan, jalur genital, jalur intestin, maupun jalur respiratori pada manusia dan hewan (Stamer, 1979). Berikut merupakan beberapa jenis bakteri asam laktat menurut Sumanti (2008) dalam Pradani dan Hariastuti (2009) antara lain sebagai berikut : 1. Streptococcus thermophilus, Streptococcus lactis dan Streptococcus cremoris. Semuanya ini adalah bakteri Gram positif, berbentuk bulat (coccus) yang terdapat sebagai rantai dan semuanya mempunyai nilai ekonomis penting dalam industri susu. 2. Pediococcus cerevisae Bakteri ini adalah Gram positif berbentuk bulat, khususnya terdapat berpasangan atau berempat (tetrads). Walaupun jenis ini tercatat sebagai perusak bir dan anggur, bakteri ini berperan penting dalam fermentasi daging dan sayuran. 3. Leuconostoc mesenteroides dan Leuconostoc dextranicum. Bakteri ini adalah Gram positif berbentuk bulat yang terdapat secara berpasangan atau rantai pendek. Bakteri-bakteri ini berperanan dalam perusakan larutan gula dengan produksi pertumbuhan dekstran berlendir. Walaupun demikian, bakteri-bakteri ini merupakan jenis yang penting dalam 18 permulaan fermentasi sayuran dan juga ditemukan dalam sari buah, anggur, dan bahan pangan lainnya. 4. Lactobacillus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii. Organisme-organisme ini adalah bakteri berbentuk batang, Gram positif dan sering berbentuk pasangan dan rantai dari sel-selnya. Jenis ini umumnya lebih tahan terhadap
keadaan
asam
dari
pada
5
jenis-jenis
Pediococcus
atau
6
Streptococcus dan oleh karenanya menjadi lebih banyak terdapat pada sayuran. Sebagai bakteri bermanfaat dalam saluran pencernaan, bakteri asam laktat berpotensi dalam memproduksi bakteriosin dan bersifat probiotik (Ruzanna, 2011). Bakteriosin memiliki peranan penting dalam menanggulangi terjadinya suatu infeksi, serta memiliki kelebihan dari pada senyawa antimikroba yang lain yaitu dapat bekerja secara selektif, aman dan mampu mencegah atau menghambat resistensi (Marshall dan Arenas, 2003). Kemampuan BAL dalam memproduksi senyawa antimikrobia menunjukkan pentingnya peranan BAL dalam melindungi makanan terhadap pembusukan yang disebabkan oleh bakteri dan kapang karena BAL dapat menghambat pertumbuhan bakteri pembusuk, bakteri patogenik, dan bakteri penghasil bioamin yang mungkin mengkontaminasi produk bahan makanan fermentasi (Lawalata, 2012). 2.2 Bakteri Asam Laktat dalam Saluran Pencernaan Saluran pencernaan manusia ataupun hewan diperkirakan mengandung flora 12
normal sampai 10 bakteri per gram isi saluran cerna dan setidak-tidaknya terdiri atas 500 species yang sebagian besar merupakan bakteri asam laktat (Drasar dan Hill, 1974 dalam Salminen dan Wright, 1998). Menurut Lambert dan Hull (1996) pada usus besar atau colon bisa ditemukan sebanyak 400-500 jenis bakteri yang jumlahnya dapat mencapai triliunan (1012-14) bakteri. BAL umumnya ditemukan sekitar 104-109 bakteri per gram isi kolon. Clostridium, Streptococcus, staphylococcus dan Lactobacillus adalah bakteri yang sering di temukan pada colon (Young dan Huffman, 2003 dalam Surono, 2004), Enterococcus merupakan bakteri asam laktat penghuni usus halus yang dominan disamping Lactobacillus. Jumlahnya mampu mencapai 1010 sel/g dalam usus halus dan berkurang hingga 108 sel/g dalam feses (Mitsuoka, 1989). 2.3 Aktivitas Antibakteri Bakteri Asam Laktat Senyawa antimikroba merupakan senyawa biologis atau kimia yang dapat menghambat pertumbuhan dan aktivitas mikroba. Menurut Fardiaz (1992), 6
7
senyawa antimikroba dapat bersifat bakterisidal (membunuh bakteri), bakteristatik (menghambat pertumbuhan bakteri), fungisidal (membunuh kapang), fungistatik (menghambat pertumbuhan kapang), dan germisidal
(menghambat germinasi
spora bakteri). Umumnya hampir semua senyawa yang diproduksi oleh BAL mampu menghambat pertumbuhan BAL lainnya dan beberapa di antaranya memiliki efek bakterisidal terhadap bakteri lain yaitu bakteri pembusuk dan patogenik asal makanan seperti Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, dan Clostridium botulinum (Gorris dan Bennik, 1994). 2.4 Sapi Bali Sapi bali yang merupakan sapi asli Indonesia, merupakan hasil domestikasi banteng (Bos (Bibos) banteng) (Batan, 2006). Sapi bali masih diternakkan secara murni di Bali, tanpa campuran dari sapi luar. Oleh karena itu, ciri-ciri sapi bali masih sama dengan banteng yang hidup liar di hutan. Semenjak zaman Belanda, di Bali tidak pernah diimpor sapi dari luar, bahkan sampai saat ini masih dipertahankan, dengan maksud untuk menjaga kemurnian darah sapi bali. Sebagai plasma nutfah dan sebagai aset nasional sapi bali sangat perlu dipertahankan keberadaanya
karena
memiliki
beberapa
keunggulan
yang
diantaranya
mempunyai sifat reproduksi dan kualitas karkas sangat baik, tahap pada kondisi lingkungan tropis dan pakan jelek, serta mempunyai fertilitas yang tinggi (Supriyantono et al., 2008). Saluran pencernaan semua hewan dapat dianggap sebagai tabung dari mulut sampai ke anus dan berfungsi untuk mencerna, mengabsorbsi, dan mengeluarkan sisa makanan yang tidak tercerna. Disamping itu, saluran pencernaan merupakan tempat perkembangbiakan mikroorganisme yang segera terbentuk setelah dilahirkan. Saluran pencernaan akan menjadi barrier koloni mikroorganisme non patogen dan patogen (Abun, 2008). Mikroorganisme pada saluran cerna menurut Gorbach (2001) berfungsi memfermentasi karbohidrat yang tidak bisa dicerna terutama yang berasal dari polysaccharidae dinding sel tanaman seperti pektin, selulosa, dan hemiselulosa menjadi asam lemak rantai pendek, dimana asam yang dihasilkan dari proses
7
8
fermentasi tersebut, selanjutnya dapat digunakan sebagai sumber energi yang sangat penting bagi tubuh hospes. 2.5 Analisis Molekuler 2.5.1 Identifikasi Molekuler gen 16S rRNA Teknik yang akurat untuk identifikasi molekular bakteri adalah identifikasi terhadap gen penyandi 16S rRNA, dikenal dengan sebutan ribotyping/ riboprinting. Identifikasi tersebut didasarkan pada tingkat kesamaan dalam sekuen gen 16S rRNA sebagai sidik jari genetik bakteri atau disebut sekuen sidik jari. Gen 16S rRNA dari setiap spesies bakteri memiliki bagian yang stabil dalam sekuen dan satu sel bakteri memiliki ribuan kopi RNA. 16S rRNA berupa polinukleotida besar (1500-2000 basa) dan merupakan bagian dari subunit kecil dari ribosom prokariot. Protein 16S rRNA bersama dengan beberapa protein kecil tergabung dalam subunit kecil ribosom. Analisis terhadap gen penyandi 16S rRNA merupakan metode terpilih untuk identifikasi dan melihat filogenitas bakteri. Keuntungannya adalah RNA secara umum dimiliki oleh semua bakteri, sedikit berubah dalam waktu tertentu, merupakan unit yang konstan dan merupakan target yang sensitif karena terdapat dalam jumlah banyak dalam sel yang aktif. Jika sekuen nukleotida dari gen 16S rRNA dari dua tipe organisme sangat mirip atau memiliki sedikit perbedaan basa dalam rRNA, maka kedua organisme tersebut memiliki hubungan kekerabatan yang dekat, ditinjau
dari
kedekatan secara evolusinya (Puspaningrum, 2008). Pohon filogenetik dapat di buat dengan membandingkan basa sekuen sehingga akan menunjukkan kemungkinan rute spesies yang beragam dan berasal dari nenek moyang yang sama (Dale et al., 2004 dalam Normawati, 2012). Secara teknis, metode ini melibatkan teknik PCR untuk amplifikasi sekuen rRNA dari strain yang kita uji. Hasil amplifikasi ini kemudian disekuensing untuk mendapatkan sekuen basa nitrogen. Sekuen basa nitrogen ini kemudian dibandingkan dengan sekuen bakteri lain yang sudah jelas kita ketahui spesiesnya dan genusnya (Widodo, 2003). Analisis 16S rRNA digunakan dalam mengkonfirmasi adanya kelompok predominan yang dijelaskan dengan analisis
8
9
fenotip dan untuk menentukan gabungan file genetik. Sekuen dari berbagai isolat akan ditunjukan derajat kesamaan yang tinggi dengan Gen Bank (98,79%-99,8%). Pohon filogenetik pada skuens gen 16S rRNA menunjukan konsistensi yang tinggi dengan titik-titik yang di dukung oleh nilai bootstrap. Analisis urutan basa filogenetik 16S rRNA merupakan metode molokuler yang akurat untuk identifikasi mikroba (Ennahar et al., 2003). 2.5.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik yang dilakukan untuk memperoleh aplikon dari sekuen DNA tertentu dalam jumlah yang banyak dengan waktu yang cepat secara in-vitro (Elizabeth, 2004 dalam Hestiningtyas, 2008). Teknik PCR banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetik. Komponen utama PCR adalah DNA cetakan, oligonuleotida primer, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP, enzim Taq DNA polymerase berfungsi melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Reaksi PCR dibagi menjadi tiga macam tahapan. Reaksi melipat gandakan suatu fragmen DNA melalui tahap denaturasi cetakan DNA sehingga rantai DNA beruntai ganda terpisah menjadi beruntai tunggal. Tahap annealing terjadi saat suhu diturunkan sehingga primer akan menempel pada DNA cetakan yang terpisah. Primer akan membentuk jembatan hidrogen pada cetakan sekuen yang komplementer dengan sekuen primer (Yuwono, 2006) 2.5.3 Elektroforesis Elektroforesis adalah metode pemisahan molekul yang menggunakan media listrik (elektro) sebagai pergerakan molekul dan matriks penyangga berpori (foresis). Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul. Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis DNA, RNA, maupun protein. Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan fragmen DNA pada gel agarose atau gel Akrilamid. Gel agarosa merupakan polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut (Yuwono, 2005). Gel agarosa tersebut kemudian diberikan ethidium bromide akan membuat fragmen DNA 9
10
dapat terlihat di bawah sinar ultraviolet (Dale et al., 2004 dalam Normawati, 2012). 2.5.4 Sekuensing Penentuan urutan (sekuensing) DNA merupakan proses penentuan urutan basa suatu segmen DNA. Metode sekuensing yang paling banyak digunakan adalah metode dideoksi Sanger. Metode ini mirip dengan amplifikasi DNA melalui PCR, yaitu menggunakan enzim DNA polimerase dan monomermonomer dNTP untuk memperpanjang primer sepanjang untai, yang dilakukan melalui siklus suhu yang berulang. Bedanya, proses sekuensing dapat menggunakan DNA untai tunggal maupun untai ganda dan hanya memerlukan satu primer (Milanda, 2001). Pada reaksi sekuensing, perpanjangan untai DNA diterminasi secara acak dengan adanya analog dNTP, yaitu dideoksinukleotida trifosfat (ddNTP). Proses ini menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan selisih satu nukleotida saja. Fragmen-fragmen tersebut dipisahkan melalui elektroforesis gel poliakrilamida beresolusi tinggi. Deteksi produk sekuensing dilakukan dengan cara pelabelan radioaktif atau non radiaktif (menggunakan pelabel fluoresen). Pelabelan dapat dilakukan terhadap primer maupun komponen ddNTP. Pelabelan fluoresen pada ddNTP (dye terminator labeling) memberikan kemudahan, karena memungkinkan pemisahan fragmen hasil sekuensing berlangsung pada satu sumur gel saja. Hal itu disebabkan setiap nukleotida terakhir akan memberikan warna yang berbeda (Milanda, 2001). 2.5.5 Program BLAST BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan suatu program untuk pencarian kemiripan sekuen (sequence similarity) dan merupakan alat dalam identifikasi gen dan karakter genetik. BLAST dapat melakukan pencarian sekuen melalui perbandingan dengan database DNA dalam waktu singkat. BLAST
dapat
diakses
secara
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 10
terbuka
melalui
website
11
Ada 5 program utama dalam BLAST, yaitu : a. Nucleotide blast (blastn) : membandingkan suatu sekuen nukleotida meragukan (query sequence) yang kita miliki dengan database sekuen nukleotida. b. Protein blast (blastp) : membandingkan suatu sekuen asam amino yang kita miliki dengan database sekuen protein. c. Blastx : membandingkan produk translasi konsep 6‐frame sebuah sekuen nukleotida (translated nucleotide) yang kita miliki dengan database sekuen protein. d. Tblastn : membandingkan suatu sekuen protein yang kita miliki dengan database sekuen nukleotida yang secara dinamis ditranslasi pada semua pembacaan 6 frame. e. Tblastx : membandingkan suatu translasi 6 frame dari nukleotida. (NCBI, 2003). 2.6 Kerangka Konsep Kerangka konsep penelitian ini dimuat pada gambar 1.
BAL Penumbuhan pada MRS Uji Katalase
Uji aktivitas antimikorba
Isolat 9A asal kolon sapi bali Amplifikasi gen 16S rRNA dengan primer B27F dan U1492R
Pewarnaan Gram
Spesifik Strain BAL
Berpotensi sebagai kandidat Probiotik
Gambar 1. Kerangka konsep penelitian
11
