BAB I PENDAHULUAN 1.1
Latar Belakang Masalah Semakin banyak orang yang mengabaikan kesehatan dikarenakan alasan
kesibukan. Hal ini mengakibatkan penyakit dapat menyerang kesehatan manusia dengan mudah, baik penyakit yang tergolong ringan dan berat sekaligus. Penyakit gagal ginjal merupakan salah satu penyakit berat yang semakin sering terdengar akhir-akhir ini, tidak hanya orang tua melainkan juga anak muda usia produktif bekerja. Penyakit ini biasanya muncul pada penderita diabetes dan hipertensi akut atau beberapa kasus penyakit langka pada manusia. Berdasarkan data yang dirilis PT. Askes pada tahun 2010 (dikutip dalam Nawawi, 2013) jumlah pasien gagal ginjal ialah 17.507 orang. Pada tahun 2011, jumlah penderita gagal ginjal mengalami peningkatan menjadi 23.261 pasien. Jumlah penderita gagal ginjal terus bertambah menjadi 24.141 pasien pada tahun 2012. Jumlah penderita diperkirakan akan terus meningkat pada tahun-tahun berikutnya karena meningkatnya populasi penderita diabetes dan hipertensi di Indonesia. Pola hidup yang tidak baik dapat meningkatkan resiko seseorang terserang penyakit ginjal, sehingga diperlukan pemeriksaan rutin untuk memeriksa kesehatan anggota tubuh, termasuk ginjal. Pemeriksaan kesehatan ginjal dapat dilakukan dengan analisis kreatinin. Analisis kreatinin merupakan salah satu analisis penting yang digunakan untuk menentukan fungsi ginjal dan otot yang gagal. Penurunan fungsi ginjal dan akumulasi racun dari metabolisme protein ini sangat berbahaya bagi kesehatan manusia (Koncki, 2008). Analisis kreatinin menguji konsentrasi kreatinin yang ada di urin dan darah. Kreatinin merupakan produk turunan dari kreatin yang diproduksi dari otot. Kreatinin merupakan salah satu substansi yang dikeluarkan lewat urin. Kandungan kreatinin dalam darah dan urin pada dasarnya ditentukan oleh massa
1
2
otot dan kemampuan ekskresi ginjal. Konsentrasi kreatinin merupakan indikasi penting untuk memantau fungsi ginjal (Schulze, 2003). Seiring pertambahan waktu, berbagai macam cara ditemukan untuk menganalisis kreatinin yang terdapat di dalam urin maupun darah. Secara umum, penentuan kadar kreatinin dengan berdasarkan metode Jaffe pertama kali ditemukan oleh M. Jaffe pada tahun 1886. Metode ini dilakukan dengan cara mereaksikan kreatinin dengan asam pikrat dalam suasana basa menghasilkan kompleks pikrat-kreatinin yang berwarna oranye. Metode Jaffe pertama kali dianalisis dengan menggunakan metode spektrofotometri. Akan tetapi, metode Jaffe memiliki kelemahan pada sensitivitas yang kecil terhadap senyawa yang dianalisis. Sharma et al. (2003) menyebutkan bahwa reaksi ini tidak sepenuhnya spesifik untuk kreatinin karena terdapat senyawa lain dalam darah yang menjadi pengganggu seperti glukosa, piruvat, urea, asam urat, dan dopamin (dikutip dalam Mohabbati-Kalejahi et al., 2012). Hal ini memacu para peneliti lain untuk menemukan analisis kreatinin yang lebih efektif. Beberapa instrumen juga pernah digunakan dalam analisis ini. Mo et al. (2003) menganalisis kreatin dan kreatinin dengan menggunakan instrumen High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) sederhana dengan deteksi elektrokimia. Bila dibandingkan dengan metode Jaffe, penggunaan HPLC lebih teliti dan mempunyai sedikit interferensi. Yokoyama et al. (2005) telah menganalisis kreatinin dengan menggunakan kromatografi penukar kation berkapasitas rendah. Selain itu, Pobozy et al. (2003) telah melakukan analisis kreatinin dengan menggunakan Micellar Electrokinetic Chromatography (MEC). Mohabbati-Kalejahi et al. (2012) menyatakan bahwa akurasi pendeteksian kreatinin bergantung pada akurasi penggunaan kromatografi. Kelemahan dari metode ini adalah instrumen untuk teknik ekstraksi yang mahal sehingga teknik ini tidak cocok digunakan untuk analisis rutin. Metode lain yang sering digunakan untuk analisis kreatinin adalah menggunakan enzim. Drion et al. (2012) melaporkan bahwa teknik secara enzimatik memberikan hasil yang lebih akurat dibandingkan dengan metode Jaffe sehinggga teknik enzimatik yang lebih spesifik lebih dipilih digunakan untuk
3
praktek klinis dalam rangka menghasilkan estimasi yang layak. Penggunaan serangkaian enzim meningkatkan selektifitas untuk mendeteksi kreatinin, walaupun membutuhkan biaya yang mahal. Waktu hidup dari enzim pun terbatas, tergantung
dari
aktivitas
enzim
tersebut.
Metode
immobilisasi
dapat
meningkatkan waktu hidup enzim. Metode yang biasanya digunakan untuk immobilisasi enzim adalah gel entrapment, polymer entrapment, crosslinking, direct nonimmobilized deposition, adsorpsi, ikatan dan enkapsulasi kovalen. Metode crosslinking memberikan stabilitas yang tinggi dibandingkan metode immobilisasi lainnya, namun berpengaruh pada sensitivitas dan jarak analitis yang menurun. Metode-metode dengan menggunakan berbagai instrumen dan teknik enzimatik tidak cocok dan sangat rumit digunakan untuk penentuan kadar kreatinin sehari-hari. Oleh karena itu, diperlukan metode yang cocok dan praktis digunakan untuk analisis kreatinin pada laboratorium dan rumah sakit sehari-hari. Dalam metode usulan ini, metode Jaffe dimodifikasi menjadi metode ekstraksi ke dalam kloroform dengan bantuan instrumen spektrofotometer UV-Vis dan dalam suasana basa yang berasal dari larutan NaOH. Metode spektrofotometri UV-Vis dipilih karena metode ini tergolong murah dan dapat digunakan dengan mudah untuk analisis. Metode yang sederhana ini akan digunakan sebagai dasar untuk pengembangan metode selanjutnya. 1.2
Tujuan Penelitian
1.
Mempelajari analisis kreatinin dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut kloroform dengan pereaksi asam pikrat (metode Jaffe).
2.
Menentukan kondisi optimum analisis kreatinin menggunakan trioktil metil ammonium klorida (TOMA-Cl) secara spektrofotometri UV-Vis dengan ekstraksi.
3.
Menentukan sensitivitas ekstraksi dengan kloroform pada analisis kreatinin.
4
1.3
Manfaat Penelitian
1.
Mengetahui metode baru dalam analisis kreatinin dengan cara ekstraksi.
2.
Memberikan wawasan baru dalam teknologi analisis kreatinin.
3.
Mengetahui kemampuan kloroform dalam mengekstraksi kompleks pikratkreatinin.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Metode Jaffe merupakan metode dasar yang digunakan untuk analisis kreatinin pada berbagai laboratorium. Metode ini dilakukan dengan cara mereaksikan antara kreatinin dengan alkali pikrat yang menghasilkan kompleks yang berwarna oranye. Kompleks pikrat-kreatinin ini kemudian dianalisis dengan cara spektrofotometri pada panjang gelombang 485 nm. Narayanan dan Appleton (1980) telah melakukan penelitian mereaksikan kreatinin dengan senyawa lain, yaitu asam dinitrobenzoat. Reaksi tersebut menghasilkan kompleks yang memberikan banyak warna sehingga disimpulkan bahwa alkali-pikrat lebih cocok untuk direaksikan dengan kreatinin karena lebih stabil dan menghasilkan absorpsi cahaya yang lebih baik. Seiring berjalan waktu, penelitian terkait semakin sering dilakukan untuk mengetahui kelemahan dan kelebihan lain dari metode Jaffe. Kelemahan metode Jaffe pun ditemukan lewat beberapa penelitian. Narayanan dan Appleton (1980) mengemukakan bahwa interferen yang ada di darah adalah aseton, asam asetoasetik, fruktosa, dan glukosa. Selain itu, Benkert et al. (2000) menemukan keberadaan askorbat, cefoxitin, cephalotin, cefatril, dan cefazolin yang menjadi interfen dalam analisis metode Jaffe. Adapun, Sharma et al. (2003) menyatakan bahwa terdapat urea, asam urat, piruvat dan dopamin yang berperan sebagai interferen dalam darah (dikutip dalam Mohabbati-Kalejahi et al., 2012). Tidak hanya gangguan pada sampel yang digunakan, tetapi juga temperatur dan nilai pH berpengaruh pada analisis kreatinin. Metode Jaffe juga menghabiskan banyak waktu dan tidak selektif dikarenakan terdapat banyak interferen dari reaktan yang digunakan. Oleh karena itu, metode Jaffe tidak layak digunakan untuk penentuan kreatinin pada praktik laboratorium sehari-hari. Salah satu analisis kreatinin yang cukup populer dilakukan sekarang adalah dengan bantuan enzim. Drion et al. (2012) melakukan penelitian dengan 5
6
membandingkan metode Jaffe dan metode enzimatik untuk mengukur kreatinin dalam darah. Perbandingan hasil penelitian metode Jaffe dan metode enzimatik disajikan pada Gambar 2.1.
Gambar 2.1 Perbandingan hasil penelitian metode Jaffe (kiri) dan metode enzimatik (kanan). (Drion et al., 2012) Hasil dari perbandingan ini adalah metode Jaffe mempunyai bias yang lebih tinggi dibandingkan dengan metode enzimatik. Metode enzimatik dinilai lebih baik dibandingkan metode Jaffe. Penggunaan enzim tidak hanya dapat digunakan untuk analisis kreatinin, namun juga sudah diteliti aplikasinya dalam bidang kesehatan. Zinchenko et al. (2012) telah melakukan penelitian untuk mempelajari aplikasi biosensor sensitif kreatinin untuk kontrol hemodialisis. Penelitian tersebut menyatakan bahwa biosensor yang telah dikembangkan pada penelitian terdahulu dapat digunakan untuk memantau konsentrasi kreatinin pada cairan setelah dialisis (kontrol kapasitas dan kualitas hemodialisis) dan pendeteksian konsentrasi kreatinin pada darah dan urin dalam patologi. Selain itu, metode yang digunakan juga memberikan sensitivitas yang tinggi, selektif, dan metode analisis kreatinin yang cepat. Kelemahan dari metode enzimatis adalah biaya metode enzimatik yang mahal dan masa pakai dari sensor enzimatik terbatas, bergantung pada aktivitas enzim tersebut. Chen et al. (2006) menyatakan bahwa performa dari biosensor juga bergantung pada stabilitas dari lapisan enzim sehingga kalibrasi kembali
7
sensor perlu dilakukan. Ketebalan lapisan enzim juga dapat membatasi sinyal analitis dan waktu respon karena menghalangi transpor analit melalui lapisan yang dimodifikasi. De Araujo et al. (2012) telah melakukan analisis kreatinin dengan metode elektroanalisis tanpa menggunakan enzim untuk deteksi kreatinin dari sampel urin. Sampel urin yang digunakan diencerkan terlebih dahulu sebelum diberi perlakuan metode. Perbandingan hasil penelitian metode spektrofotometri dan metode usulan disajikan pada Tabel 2.1. Tabel 2.1 menunjukkan bahwa metode usulan dapat digunakan untuk mengukur kreatinin dengan interferen yang cukup rendah. Tabel 2.1 Perbandingan hasil penelitian metode spektrofotometri dan metode usulan de Araujo et al. (de Araujo et al., 2012) Sampel 1 2 3
Metode Spektrofotometri (mmol/L) 11,4 ± 0,1 13,7 ± 0,3 18,9 ± 0,2
Metode Usulan (mmol/L) 11,0 ± 0,4 13,8 ± 0,1 19,0 ± 0,8
Tymecki et al. (2013) telah mengembangkan metode penentuan konsentrasi kreatinin dengan sistem Multicommuted Flow Analysis (MCFA) dengan menggunakan detektor Paired Emitter Detector Diode (PEDD). Hasil dari penelitian dengan sistem MCFA menunjukkan bahwa sistem ini efisien digunakan untuk analisis kreatinin. Selain itu, analisis kreatinin dengan sistem MCFA memiliki potensi untuk dikembangkan dalam bidang biomedis. Sistem ini selanjutnya dapat digunakan untuk memantau pelepasan kreatinin pada saat pencucian darah. Analisis kreatinin juga dikembangkan dengan menggunakan metode Tandem Mass Spectrometry (TMS). Huskova et al. (2004) telah melakukan penelitian ini dengan menggunakan sampel urin untuk menganalisis kreatinin. Urin dipreparasi terlebih dahulu dengan SPE pertukaran ion atau sampel urin secara langsung dituangkan ke dalam sebuah sumber ion tanpa preparasi terlebih dahulu. Preparasi SPE digunakan untuk menghilangkan garam dan mengurangi
8
konsentrasi analit lain. Hasil dari metode ini dibandingkan dengan metode Jaffe dan analisis kreatinin dengan menggunakan enzim. Kesimpulan dari penelitian ini adalah metode TMS ini menghasilkan analisis kreatinin yang selektif, sensitif, dan cepat pada urin yang tidak dipreparasi. Li et al. (2012) telah mengembangkan analisis kreatinin pada urin manusia dengan metode TMS. Perbedaan metode ini dengan metode yang dilakukan Huskova et al. (2004) adalah penambahan metode dilusi isotop EESI (Extractive Electrospray Ionization). EESI dapat mengurangi pengaruh ion-ion yang tidak diinginkan dalam kompleks matriks (contohnya urin, bir, jenis minyak yang dapat dikonsumsi, dan lain-lain) diinjeksikan secara langsung. Keuntungan dari dilusi isotop adalah yaitu kontaminan, kesalahan, pengurangan, dan lain-lain yang muncul selama preparasi sampel dan/atau saat analisis instrumental dapat diprediksi dan diperbaiki bergantung pada sifat psikokimia senyawa saat analisis yang cukup mirip dengan pembanding. Metode TMS dengan penambahan dilusi isotop EESI memberikan analisis yang cepat (kurang dari 0,3 menit untuk satu kali analisis) dan kuantifikasi yang akurat walaupun dengan menggunakan sampel urin tanpa preparasi dan pemisahan secara kromatografi. Selain itu, akurasi dan reproduksibilitas dari metode ini berpotensi dapat ditingkatkan lebih lanjut dengan menggunakan sumber EESI yang dibuat sendiri. Meras et al. (2005) melakukan analisis kreatinin menggunakan HPLC dengan deteksi fotometri dan fluorimetri. Penelitian Meras mencoba menentukan kreatinin bersamaan dengan analisis metotreksa dan beberapa jenis pteridin. Untuk meminimalisir kesalahan, metode penentuan kreatinin dan pteridin dan sampel yang digunakan berasal dari sampel urin yang sama. Hasil dari penelitian tersebut menunjukkan bahwa analisis kreatinin sebaiknya dilakukan secara indipenden untuk mendapatkan hasil yang lebih akurat. Metode HPLC pertukaran ion dengan kapasitas rendah telah dilakukan untuk
menganalisis
kreatinin
dan
asam
amino
aromatis
menggunakan
kromatografi pasangan ion oleh Yokoyama et al. (2000) (dikutip dalam Yokoyama et al., 2005). Kelemahan dari metode HPLC adalah sistem yang hanya menerima elusi isokratik yang mengakibatkan terbatasnya penggunaan metode
9
tersebut. Dash dan Sawhney (2002) telah melakukan penelitian tentang analisis kreatin dan kreatinin menggunakan metode LC (Liquid Chromatography) dengan deteksi UV. Penelitian tersebut menunjukkan bahwa metode ini merupakan metode yang sederhana dan sensitif. Akan tetapi, larutan kreatin yang digunakan memiliki masa pakai tertentu. Masa pakai ini dapat diperhitungkan dan ditentukan saat preparasi bahan. Analisis kreatinin juga telah dilakukan menggunakan instrumen GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) oleh Fernandez-Fernandez et al. (2014). Sebuah prosedur dilusi isotop GC-MS telah dikembangkan untuk penentuan kreatinin pada sampel kompleks darah. Hasil penelitian menunjukkan bahwa waktu yang digunakan untuk melakukan analisis lebih lama dibandingkan dengan bila analisis dilakukan menggunakan LC-MS (Liquid ChromatographyMass Spectrometry) dan LC-MSMS. Penggunaan dilusi isotop GC-MS memberikan penentuan kreatinin tanpa interferen dalam waktu kurang dari 45 menit. Tetapi, metode ini tidak dapat digunakan dalam analisis kreatinin dalam darah pada laboratorium klinis. Krishnegowda et al. (2013) menguji kadar kreatinin pada sampel darah manusia dengan metode spektrofotometri. Penelitian tersebut menggunakan metol sebagai reagen karena dapat larut dengan air, ekonomis, dan lebih tidak beracun bila dibandingkan dengan reagen aromatis yang pernah diinformasikan pada uji kreatinin lain. Metode tersebut menghasilkan reproduksibilitas dan akurasi yang baik, selain itu tidak terpengaruhi gangguan-gangguan yang ada pada sampel. Hasil dari tes yang muncul juga menunjukkan bahwa metode spektrofotometri cocok untuk estimasi kadar kreatinin dalam darah secara terus menerus. Kemudahan dalam preparasi reagen dan biaya penggunaan instrumen yang relatif rendah membuat metode ini semakin layak digunakan.
