9
BAB 3
PERCOBAAN
3.1 Alat, Bahan dan Miroba 3.1.1 Alat Bunsen, inkubator 37oC, sentrifuga (Mikro 200R Hettich), Eppendorf 100 ul, 500 ul, 1,5 mL, tabung mikrosentrifuga (Eppendorf), neraca timbang (Mettler Toledo, PB303), inkubator goyang, vortex, 2720 Thermal cycler (Applied Biosystem), Ose, pinset, elektroforesis DNA (Tipe EPS 200 Pharmacia Biotech), laminar air flow (the Germfree Laboratries Inc, model BBF6 S/N 6C-15-B-4119, USA), pipet mikro, oven pengering (Heraus, tipe B 5402), otoklaf (All American Model 25X Amerika), sarung tangan, tip, tangas air, lampu ultraviolet (UVP model R-25G), penentu urutan nukleotida otomatis.
3.1.2 Bahan Kristal violet, etanol 90%, amonium oksalat, iodium, kalium iodida, safronin, tryptone, yeast extract air suling atau air suling ganda, nutrien agar (NA), Taq DNA polimerase (MD Bio), bufer Taq (MD Bio), deoksinukleotida trifosfat ‘dNTP’ (MD Bio), MgCl2 (MD Bio), kit GFXTM(Amersham), agarosa (Boehringer Mannhein), larutan dapar TAE (Tris base, EDTA, asam asetat glasial), etidium bromida (Merck), T4 DNA ligase (Amersham), dapar ligase (Amersham), vektor pGEM-T Kit (Promega), media Luria Bertani ekstrak ragi (Difco), tripton (Difco), NaCl (Merck)), bakto agar (Difco), ampisilin (Sigma), 5-bromo-4chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside
(X-Gal)
(Sigma),
Isopropyl-beta-D-
thiogalactopyranoside (IPTG) (Sigma), asam etilen diamin tetraasetat (EDTA) (Merck), sodium dodesil sulphate (SDS) (Merck), natrium asetat (Merck), natrium hidroksida (Merck),
sukrosa (Merck), enzim restriksi NdeI (Roche),
kalsium klorida, Tris-Cl
(Merck), etanol absolut (Merck), marka DNA 1kb (MD Bio), serbuk kitin koloid, asam asetat glasial dan natrium asetat trihidrat, primer BactF1 (5’ggt tac stt gtt acg act t 3’), primer UniB1 (5’ aga gtt tga tct tgg tct cag 3’) primer ChiFwd (5’ ggc gat cgt tgc tgc gtt ttt 3’), dan primer ChiRev (5’ gcc ggc cgg gtt ctt cca gtt 3’).
3.1.3 Mikroba C. violaceum, Bacillus cereus dan E. coli JM 109
10 3.2 Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram dilakukan terhadap C. violaceum dan B. cereus. Pewarnaan Gram bertujuan untuk mengkonfirmasi bakteri yang digunakan dan sebagai informasi yang dibutuhkan pada proses isolasi kromosom menggunakan kit reagen Wizard. Kultur bakteri semalam (16-18 jam) dipindahkan pada media baru dan diinkubasi kembali selama empat jam, kemudian disentrifuga hingga didapat pelet bakteri. Pada kaca objek bersih, satu Ose aquades diteteskan, kemudian ditambahkan satu Ose koloni dari pelet bakteri, tunggu hingga mengering. Kemudian larutan kristal violet diteteskan hingga menutupi suspensi bakteri yang telah kering, dibiarkan selama 1 menit, larutan kristal violet dibuang, suspensi dibilas dengan larutan lugol. Larutan lugol diteteskan hingga menutupi suspensi, biarkan selama 30 detik, lapisan lugol dibuang, dibilas dengan etanol hingga warna ungu hilang. Fuschine basa diteteskan hingga menutupi suspensi bakteri, biarkan selama 30 menit, lapisan fuschine dibuang kemudian dibilas dengan air biarkan hingga mengering. Hasil pewarnaan diamati di bawah mikroskop dengan cara memperhatikan warna dan bentuk sel bakteri.
3.3 Amplifikasi dan Penentuan Urutan Nukleotida Gen Pengkode 16s rDNA PCR dilakukan dengan komposisi sebagai berikut: Bufer Taq polymerase 10 X tanpa MgCL2 2,5 µL, dNTP 200µM 0,5 µL, MgCl2 25 mM 2,5µL, primer UniB1 20 µM 1µL, primer BactF1 25 µM 1 µL, Taq polimerase 0,2 µL, hasil isolasi kromosom (pengenceran 1:20) 0,5 µL dan air MilliQ 16,8 µL untuk setiap 25 µL reaksi. Proses denaturasi awal dilakukan pada suhu 94°C 5 menit, amplifikasi dilakukan sebanyak 30 siklus dimana setiap siklus terdiri atas tahap denaturasi pada suhu 94°C 1 menit, penempelan primer 48°C 1 menit dan polimerisasi 72°C 1 menit, dan polimerisasi akhir 72°C 10 menit. Produk PCR dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1% pada tegangan 80 V selama 60 menit.
3.4
Uji Kualitatif Aktivitas Kitinase dalam Media NA yang mengandung suspensi Kitin Koloid 3 g NA, 0,5 g NB dan 100 mg kitin koloidal dilarutkan dalam 100 mL aquadest, media disterilisasi dan dituang dalam cawan petri. Media dibagi menjadi 3 daerah sama besar, daerah pertama diteteskan 5 µL suspensi bakteri E. coli JM sebagai kontrol negatif, daerah kedua teteskan 5 µL suspensi bakteri Bacillus .cereus, daerah ketiga teteskan 5 µL suspensi bakteri C. violaceum. Inkubasi media dilakukan pada suhu 32°C selama 10 hari.
11 3.5 Amplifikasi Fragmen Gen Pengkode Kitinase PCR dilakukan dengan komposisi sebagai berikut: Bufer Taq polimerase tanpa MgCL2 10X 2,5 µL, dNTP 0,5 µL, MgCl2 2,5 µL, primer ChiFwd 1 µL, primer ChiRev 1 µL, Taq polimerase 0,5 µL, kromosom (pengenceran 1:20) 0,5 µL dan air MilliQ 16,8 µL untuk setiap 25 µL reaksi. Proses denaturasi awal dilakukan pada suhu 94°C 5 menit, amplifikasi dilakukan sebanyak 30 siklus dimana setiap siklus terdiri atas tahap denaturasi pada suhu 94°C 1 menit, penempelan primer 52°C 1menit, polimerisasi 72°C 1,5 menit dan polimerisasi akhir 72°C 10 menit. Produk PCR dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1% pada tegangan 80 V selama 60 menit.
3.6 Kloning Produk PCR Kitinase pada pGEM-T dalam E. coli JM 109 Produk PCR diligasikan pada vektor kloning pGEM-T kemudian ditransformasi dalam E. coli JM 109 kompeten. Seleksi biru putih dan resisten ampisilin dilakukan untuk seleksi klon, kemudian plasmid diisolasi dari koloni putih yang dipilih. Karakterisasi plasmid rekombinan dilakukan dengan metode analisa migrasi, analisa PCR, dan analisa pemotongan dengan enzim restriksi. Penentuan urutan nukleotida DNA sisipan dilakukan untuk mengetahui kebenaran klon.
3.6.1 Pembuatan Sel Kompeten Satu buah koloni bakteri E.coli JM 109 dari media padat dikultur pada media LB cair, kemudian diinkubasi selama satu malam (16-18 jam). Satu mL suspensi bakteri dalam LB cair disubkultur dalam 9 mL LB cair segar kemudian inkubasi 2-3 jam pada suhu 37°C 150 rpm. Satu mL subkultur dipindahkan ke dalam Eppendorf 1,5 mL steril, dinginkan dalam es selama 10 menit, kemudian disentrifuga 8000 rpm 5 menit pada suhu 4°C. Supernatan hasil sentrifuga dibuang, kemudian pelet sel dicuci dengan 0,5 mL CaCl2 0,1 M dingin steril, kemudian diinkubasi dalam es selama 10 menit, kemudian disentrifuga 8000 rpm 5 menit pada suhu 4°C. Supernatan hasil sentrifuga dibuang, pelet sel diresuspensi dengan 50 µL CaCl2 0,1 M dingin steril kemudian diinkubasi 12-24 jam pada suhu 4°C.
12
3.6.2 Ligasi Vektor pGEM-T dengan Produk PCR Kitinase Jumlah produk PCR yang akan digunakan harus dihitung menggunakan rumus: ng vektor x kb DNA sisipan x rasio DNA sisipan : vektor kb vektor
Komposisi campuran reaksi yang dicampurkan dalam tabung Eppendorf setelah perhitungan terangkum dalam tabel 3.1, kemudian campuran reaksi diinkubasi 24 jam pada temperatur 37°C.
Tabel 3.1
Komposisi Campuran Reaksi Ligasi Vektor pGEM-T dengan Produk PCR Kitinase Kontrol +
Kontrol -
Sampel A
Sampel B
5
5
5
5
Vektor pGEM-T
1
1
1
1
Produk PCR
-
-
0,321
0,642
DNA insert (kontrol +)
2
-
-
-
T4 DNA ligase
1
1
1
1
Milli Q water
1
3
2,679
2,358
Bufer 2X rapid ligation, t4 DNA ligase
3.6.3 Transformasi Hasil ligasi disentrifuga 3000 radian per minute satu menit untuk mengumpulkan seluruh cairan ke dasar tabung. 2 µL hasil ligasi ditambahkan dalam tiap – tiap tabung Eppendorf yang berisi sel kompeten. Tabung Eppendorf disimpan dalam es selama 20 menit, kemudian dimasukkan dalam tangas air 42°C selama 45-50 detik untuk heat shock, segera masukan kembali dalam es selama 2 menit. 950 µL LB cair ditambahkan ke dalam campuran ligasi pada suhu kamar kemudian campuran diinkubasi selama 4 jam pada 37°C 150 rpm. Kultur bakteri disentrifuga 8000 rpm selama satu menit, kemudian 700 µL supernatan dibuang. 50 µL kultur dituang ke dalam media padat LB yang mengandung ampisilin, IPTG dan x-Gal kemudian diinkubasi semalam (16-18 jam) pada suhu 37°C (untuk menghasilkan jumlah transforman yang lebih banyak, dapat digunakan 200 µL kultur sel E. coli JM 109 kompeten).
13
3.6.4 Seleksi dan Karakterisasi Klon Rekombinan Dari koloni bakteri yang tumbuh, dipilih koloni putih untuk dikarakterisasi lebih lanjut. Plasmid dari koloni yang terpilih diisolasi menggunakan kit reagen Qiaprep dan prosedurnya mengikuti Qiaprep kit manual. Plasmid yang telah diisolasi dikarakterisasi menggunakan 3 metode analisa, yaitu analisa migrasi, analisa PCR dan analisa pemotongan enzim restriksi. Analisis migrasi dilakukan dengan membandingkan jarak migrasi elektroforesis antara plasmid rekombinan hasil isolasi di atas dengan plamid pGEM-T tanpa DNA sisipan menggunakan agarosa 1% pada tegangan 80V selama 60 menit. Analisa PCR dilakukan dengan komposisi reaksi sebagai berikut: Bufer Taq polimerase tanpa MgCL2 10X 2,5 µL, dNTP 0,5 µL, MgCl2 2,5 µL, primer ChiFwd 1 µL, primer ChiRev 1 µL, Taq polimerase 0,5 µL, hasil isolasi Qiaprep 0,5 µL dan air MilliQ 16,8 µL untuk setiap 25 µL. Proses denaturasi awal dilakukan pada suhu 94°C 5 menit, amplifikasi dilakukan sebanyak 30 siklus dimana setiap siklus proses denaturasi pada suhu 94°C 1 menit, penempelan primer 52°C 1 menit, polimerisasi 72°C 1,5 menit dan polimerisasi akhir 72°C 10 menit. Produk PCR dielektroforesis agarosa 1% pada tegangan 80 V selama 60 menit. Analisa pemotongan dengan enzim restriksi dilakukan dengan mencampurkan 10X sure/cut bufer H 2,5 µL, plasmid rekombinan 0,9 µL, Enzim restriksi NdeI 1,5 uL dan MilliQ water ad 25 µL. Satu campuran reaksi dibuat tanpa enzim restriksi sebagai kontrol negatif. Campuran diinkubasi dalam suhu 37°C selama 1 malam ( 16-18 jam).
