Bacillus cereus
Bacillus cereus
Historie Bacillus cereus • První záznamy týkající se otrav z potravin způsobené rodem Bacillus pochází z roku 1906, kdy Lubenau popsal propuknutí onemocnění v sanatoriu, kde se u 300 pacientů a zaměstnanců objevily silné průjmy, křeče žaludku a zvracení. Přestože Lubenau pojmenoval microorganismus, které onemocnění vyvolalo, Bacillus peptonificans, vlastnosti, které u microorganismu popsal, se podobaly vlastnostem Bacillus cereus. V Evropě se pak objevila řada takovýchto onemocnění a v letech 1936 až 1943 Stockholmské ministerstvo zdravotnictví odhadovalo, že byl tento mikroorganismus tvořící aerobní spory příčinou onemocnění ve 117 případech z 367 zkoumaných.
Historie Bacillus cereus •
•
Do roku 1950 nebyl Bacillus cereus definitivně potvrzen jako příčina onemocnění z potravin. Stalo se tak až vyjasněním taxonomie rodu. Hauge popsal čtyři propuknutí nákazy v Norsku dohromady u 600 lidí. Zdrojem byla vanilková omáčka, která byla připravena den předem a uložena při pokojové teplotě. U této omáčky bylo později zjištěno 2,5*107 až 1,1*108 /ml buněk Bacillus cereus. Tyto klasické zprávy a mnohé další popisují onemocnění, pro které byl převládajícím příznakem průjem. Je známo, že je Bacillus cereus zodpovědný za dva odlišné typy onemocnění z potravin: „průjmové onemocnění“ („diarrhoeal syndrom“) s relativně delší inkubační dobou a onemocnění projevující se zvracením, tzv. „emetický syndrom“, který má rychlý začátek a byl poprvé popsán v roce 1971 ve Spojeném Království.
Charakteristika organismu • Bacillus cereus je typická, v půdě žijící Gram-pozitivní, tyčinkovitá, betahemolytická bakterie. Některé kmeny jsou nebezpečné pro lidi a vyvolávají onemocnění z potravy, (foodborne illness), zatímco jiné mohou být prospěšné jako probiotika pro zvířata. • Podle tvaru sporangia se člení do tří skupin • Také se označuje jako syndrom čínské restaurace ( Fried Rice Syndrome). • B. cereus je aerobní, a podobně jako další členové rodu Bacillus tvoří endospory. • Serotypizace je založena na bičíkovém H antigenu
Systematické zařazení
Scientific classification Kingdom
Bacteria
Phylum
Firmicutes
Class
Bacilli
Order
Bacillales
Family
Bacillaceae
Genus
Bacillus
Species
Cereus
Sporulující kultura B.cereus – barveno podle Grama
Růst a jeho kontrola • Teplota: Optimum 30-37 ºC. Některé kmeny mohou růst až do 55 ºC zatímco další rostou ještě při 4 - 5 ºC (mléčné výrobky) • pH: minimum pro růst je 4.3 a maximum okolo 9,3. • Atmosféra: Růst je optimální v přítomnosti kyslíku. Růst za annaerobních podmínek je pomalý s nízkou produkcí toxinů. • Vodní aktivita: Minimální rozsah vodní aktivity k vegetativnímu růstu je 0,912 – 0,950.
Onemocnění vyvolaná B.cereus •
• • • • • •
B.cereus tvoří několik enterotoxinů. Ojediněle může způsobovat onemocnění u imunokompromitovaných pacientů (meningitis, endokarditis, endophtalmitis, konjunktivitis nebo akutní gastroenteritis).Je též původcem oportunních infekcí. otrava z potravin (enterotoxikóza) meningitís endokarditis konjunktivitis pneumonie sepse infekce ran
Diarhoeální (průjmové) onemocnění • Inkubace: 10-12 hodin po požití kontaminované potraviny • Symptomy: bolest břicha, vodnatý průjem a občasné zvracení (podobné jako při infekci C. perfringens). • Příčinou je požití vegetativních organismů nebo spor a jejich následné množení a produkce toxinu v zažívacím traktu (enterotoxin Nhe a/nebo hemolytický enterotoxin HBL) • V Evropě dosti častý výskyt
Emetický syndrom • Inkubace: 1- 6 hodin po požití kontaminované potraviny • Symptomy: nausea a zvracení,občas následované průjmem (výsledek požití již utvořeného toxinu: emetoxin ETE). Podobně jako u S. aureus. • Velice časté v Japonsku
Probiotikum • B. cereus soutěží s ostatními mikroorganismy jako je Salmonella a Campylobacter v trávícím traktu tak, že jeho přítomnost redukuje jejich počet. • U hospodářských zvířat : kuřata, králíci a vepři některé neškodné kmeny B. cereus se užívají jako probiotická potravní aditiva ke snížení počtu salmonel ve střevech. Zlepšuje to růst zvířat a zároveň zvyšuje bezpečnost jejich masa pro lidskou výživu.
Vliv stáří kultury na barvení
Kriteria pro B. cereus • Nařízení 1441/2007 Kapitola 2.2 • 2.2.11 Sušená počáteční kojenecká výživa a sušené dietní potraviny pro zvláštní léčebné účely určené pro kojence do šesti měsíců věku plán odběru vzorků limity anal. metoda Bacillus cereus n/5 c/1 m=50 KTJ/g EN/ISO 7932 M= 500 KTJ/g - vyhovující, pokud jsou všechny zjištěné hodnoty ≤ m - přijatelný, pokud nejvýše c/n hodnot nachází mezi m a M a zbývající zjištěné hodnoty jsou ≤ m - nevyhovující, pokud je jedna nebo více zjištěných hodnot > M nebo se více než c/n hodnot nachází mezi m a M.
Identifikace podle ISO normy • ČSN EN/ISO 7932 • Na povrch tuhé selektivní půdy v Petriho miskách se očkuje určený objem zkušebního vzorku, stejně s epostupuje při očkování desetinásobných ředění vzorku. • Plotny se inkubují aerobnw při 30 oC po 18-48 h. • Půda obsahuje kromě živin fenolovou červeň, polymyxin B a žloutkovou emulzi. • Typické kolonie jsou velké, růžové a oobvykle obklopené zónou precipitace (tvorba lecitinasy) • Konfirmace na agaru s ovčí krví – hemolytická reakce
Biochemická charakteristika •
Identifikačním znakem pro B. cereus, B. thuringiensis, B cereus var. mycoides a v menší míře B. anthracis je schopnost syntetizovat lecithinasu, která způsobuje zamlženost ve žloutkovaječném bujónu a neprůhledné zóny opalescence okolo kolonií na tomto typu agaru. • Stejně jako lecithinasa (α-toxin) druhu Clostridim perfringens, jsou tyto enzymy aktivovány Ca2+ a Mg2+ ionty, vykazují určitou termostabilitu, dávají Naglerovu reakci v lidském séru, lyzují erythrocyty a jsou neutralizovány specifickým sérem. • Lecithinasovou reakci na žloutkovaječném agaru, avšak mnohem slabší a omezenou, vykazují i jiné druhy (B. laterosporus, B. polymyxa a B. macerans). K této reakci dochází v místě hned pod kolonií, a proto je viditelná pouze při odstranění narostlého mikroorganismu.
B.cereus produkuje • fosfolipáza C • hemolyzin - oxigenlabilní cereolysin, letální pro myš • oxigenstabilní hemolysin • enterotoxin - mimo jiné zvyšuje permeabilitu cév • emetický toxin - termostabilní, odolný vůči pH, proteázám
• Různé druhy z rodu Bacillus, zvláště ty z 1 morfologické skupiny, produkují hemolysiny. • Primární hemolysin B. cereus, cereolysin, je oxygenlabilní, aktivuje se thioly a inaktivuje se cholesterolem a antistreptolysinem a je blízce příbuzný, není-li identický, s hlavním hemolysinem B. thuringiensis, thuringiolysinem. B. megaterium produkuje hemolysin podobný αhemolysinu Staphylococcus aureus
Virulenční faktory • •
•
• •
Diarhetické syndromy u pacientů jsou výsledkem účinku tří toxinů Hbl, Nhe a CytK. Geny nhe/hbl/cytK jsou lokalizovány na chromosomu bakterie. Transkripce těchto genů je řízena PlcR. Tyto geny se vyskytují také v taxonomicky příbuzných B. thuringensis a B. anthracis. Tyto enterotoxiny se tvoří v tenkém střevu hostitele, tak jsou chráněny před trávícími enzymy hostitele. Toxiny Hbl a Nhe mají porační aktivitu podobnou jako E. coli. Mají konformaci "beta-barrel" tak mohou pronikat do buněčných membrán vzhledem k hydrofobnímu exteriéru, tvoří póry s hydrofilním vnitřkem (interiérem). Výsledkem je ztráta buněčného membranového potenciálu a případně smrt buňky. CytK je pory tvořící protein příbuzný ostatním hemolysinům.
PlcR • • • •
•
PlcR je regulátor transkripce u Bacillus cereus, který aktivuje genovou expresi tak, že se váže na sekvence nukleotidů označované jako ‘PlcR box’. Ke zjištění seznamu všech genů obsažených v PlcR regulonu byly pomocí mutagenese identifikovány shodné sekvence. Referenční kmen ATCC14579 byl kompletně sekvenován, shodné sekvence byly vyhledány a utvořen virtuální regulon. PlcR kontrola těchto genů byla potvrzena porovnáním genové exprese u referenčního kmene a jeho isogenního mutanta Δ-plcR využitím DNA chipů (microarray), lacZ fuzemi a dalšími metodami proteomiky. Výsledný seznam obsahoval 45 genů kontrolovaných v 28 PlcR boxech. Čtyřicet proteinů řízených PlcR bylo exportováno,z nich 22 bylo sekretováno do media a 18 bylo vázáno nebo zachyceno na struktury buněčných obalů (membrána nebo peptidoglykanová vrstva).
Transkripční regulátor PlcR ( Phospholipase C regulator) kontroluje expresi většiny známých faktorů virulence.
Proteiny řízené PlcR • Funkce těchto proteinů mají souvislost s výživou (fosfolipasy, proteasy, toxiny), s ochranou buňky (bakteriociny, toxiny, transportery, bioegenese buněčné stěny) a reakce na prostředí (dvou složkové sensory, proteiny chemotaxe, GGDEF regulátory). Ćtyři geny kódují cytoplasmatické regulátory. • PlcR regulon zřejmě integruje velký počet environmentálních signálů, včetně nedostatku živin a reguluje transkripci genů umožňujících překonat tyto překážky, které brzdí růst B. cereus v hostiteli: dodávka živin, ochrana hostitele, jeho imuní obrana, a soutěž s ostatními druhy bakterií. • PlcR je klíčovou složkou účinné adaptace B. cereus v prostředí hostitele.
Přehled PlcR regulonů
Vliv konservačních látek • Růst je inhibován 0,26% sorbové kyseliny při pH 5,5 a 0, 39% sorbátem draselným při pH 6,6 • Přídavek 0,2% propionátu vápenatého zabraňuje klíčení spor B .cereus v chlebu • Nisin je běžně užíván k potlačení klíčení spor a růstu v tavených sýrech, mléčných desertech, konservách, uzeném mase a v pekárenských výrobcích s vysokou vlhkostí (3.75 μg/g)
Staphylococcus aureus úvod Byl popsán před více než 140 lety jako původce abscesů a o několik desítek let i jako původce alimentárních intoxikací. V patogenezi infekčních onemocnění lidí a zvířat se uplatňují i jiné druhy, SA má u stafylokokových infekcí a intoxikací dominantní postavení. Patogenita a virulence SA je způsobena schopností kmenů produkovat biologicky aktivní proteiny: syndrom toxického šoku • exfoliativní toxiny • enterotoxiny •
Koagulasa-pozitivní stafylokoky Staphylococcus aureus • • • • • • • •
Domain:Bacteria Říše: Eubacteria Kmen:Firmicutes Třída:Bacilli Řád:Bacillales Čeleď:Staphylococcaceae Rod:Staphylococcus Druh:aureus
Staphylococcus aureus
Stafylokoky tvořící hemolýzu
Výskyt • Staphylococcus aureus je přirozenou součástí mikroflóry lidského těla. Člověk je stafylokoky kolonizován od prvních dnů života. Nejvíce jsou kolonizována kůže na rukou, perinea a sliznice dýchacího a zažívacího ústrojí. Přítomnost S. aureus lze prokázat v horních cestách dýchacích u 20 – 50% populace. Jejich přenašeči mohou být i zdraví jedinci, u kterých není vyvoláno žádné onemocnění. Nosičství stafylokoků organismus nijak nepoškozuje, ale naopak vede k poměrně dobré odolnosti vůči infekci. K onemocnění dochází jen při oslabení imunitního systému. • S. aureus rovněž kolonizuje dýchací trakt hospodářsky významných zvířat. Nejčastěji se jedná o domácí prasata a drůbež. Vyskytuje se také u řady divoce žijících druhů.
Patogenita • Stafylolyziny - patří sem hemolyzin alfa, beta, gama, delta. Jsou to cytotoxiny, které poškozují nejen erytrocyty, ale i buňky různých tkání. S. aureus a haemolyticus způsobují beta-hemolýzu. • Leukocidin - zvyšuje permeabilitu membrány leukocytů • Exfoliatin - je epidermolytický toxin typický pro S. aureus. Způsobuje syndrom opařené kůže (SSSS, Ritterův syndrom), což je toxická epidermolýza. Jedná se o těžké poškození kůže, při němž vznikají vodnaté puchýře, které postupně praskají a kůže se pak olupuje. Tekutina v puchýřích je sterilní.
Další faktory patogenity • TSST-1 (toxic shock syndrome toxin) - jedná se o toxin syndromu toxického šoku, jehož hlavním projevem je multisystémový efekt ( horečka, difúzní erytrém, průjmy, hypotenze, selhání funkce jater a ledvin). Zvyšuje propustnost endotelu • Enterotoxiny - způsobují stafylokokovou enterotoxikózu. Vyskytují se i v infikovaných potravinách, jsou termostabilní a odolné vůči kyselině chlorovodíkové v žaludku.
Další faktory patogenity • •
• • • •
Plazmokoaguláza (volná) - sráží fibrinogen. Vytváří ochranný fibrinový obal a napomáhá tím k tvorbě abscesů. Hyaluronidáza - je faktor invazivity. Napomáhá tvorbě flegmóny. Štěpí kyselinu hyaluronovou a pomáhá pronikání stafylokoků do mezibuněčných prostor. Stafylokináza - je fibrinolyzin, který rozpouští fibrinové sraženiny. Lipázy - hydrolyzují lipidy a způsobují tak lepší šíření do podkoží. Nukleáza - její úloha je zatím v patogenezi nejasná. Využívá se v laboratorní diagnostice. Penicilináza - je beta-laktamáza kódovaná plasmidem. Rozkládá betalaktamový kruh betalaktamových antibiotik.
Enterotoxiny • Stafylokokové enterotoxiny jsou bazické proteiny rezistentní k proteolytickým enzymům zažívacího traktu. Odolávají účinkům varu po dobu 30 minut. • Svými strukturními a biologickými vlastnostmi náležejí do skupiny stafylokokových a streptokokových pyrogenních toxinů označovaných jako superantigeny, které jsou schopny stimulovat větší množství T-lymfocytů než běžné antigeny. Superantigeny jsou aktivovány ve střevech, kde navodí odezvu, což je příčinou gastroenteritid spojených s dehydratací. • Stafylokokové enterotoxiny jsou jednou z příčin bakteriální virulence, vyvolávají zvracení a mohou také zapříčinit toxický šok.
Typy enterotoxinů • S. aureus produkuje 11 typů enterotoxinů (SE), přičemž doposud bylo identifikováno 20 sérologicky odlišných typů. Jedná se o malé jednořetězcové polypeptidy o velikosti 26 – 30 kDa. • Syntéza je řízena chromozomálními nebo plastidovými geny. Enterotoxiny SEA, SEB, SEC, SED a SEE byly popsány již dříve, zatím co SEG, SEH, SEI a SEJ, jsou nověji popsané enterotoxiny.
Antigenní struktura •
• •
•
•
peptidoglykan - je složka buněčné stěny. Navozuje v těle tvorbu interleukinu-1 a opsonizačních látek. Aktivuje komplement, má endotoxinovou aktivitu a působí jako chemotaktický faktor. Na peptidoglykanu je navázána kyselina teichoová a protein A. kyselina teichoová - navozuje tvorbu protilátek. protein A - se váže na Fc fragment IgG, čehož se pak užívá v diagnostice u tzv. koaglutinační reakce. Dále inhibuje opsonizaci a fagocytózu - má antifagocytární a antikomplementární účinek. adheziny - jsou kolonizační faktory. Způsobují adhezi stafylokoků na mezibuněčné nebo buněčné struktury (např. fibrinogen, fibronektin, kolagen, sialoprotein) BIOFILM vázaná koaguláza - je shlukovací faktor a zprostředkovává vazbu na fibrinogen.
Stafylokoková enterotoxikosa • Koagulasa enzym tvořený bakteriemi, zvláště Staphylococcus aureus, který napomáhá tvorbě fibrinu z fibrinogenu při tvorbě sraženin (krevních). • Test používá králičí fibrinogen.
Koagulasa •
Plazmakoaguláza je určujícím znakem druhu a obecně známkou patogenity. Jednoduchý protein přeměňující fibrinogen na fibrin. Srážení vyvolané koagulázou vede k akumulaci fibrinu okolo bakteriální buňky a ztěžuje tak hostitelským obraným agens zkontaktovat se s ní a zabránit tak fagocytóze. Plazmakoaguláza může přispívat k ohraničení zánětlivé reakce vytvořením fibrinového lemu kolem léze, která se přeměňuje ve stafylokokový absces.
Podle produkce plazmakoagulázy se stafylokoky rozdělují do dvou velkých skupin: koaguláza pozitivní a koaguláza negativní stafylokoky. Koagulázový test se používá pro rozlišení S. aureus a S. epidermidis, který je koaguláza negativní.
Patogeneze Toxická dávka 0,1-1 µg enterotoxinu je schopna vyvolat onemocnění. Inkubační doba se pohybuje od 1 do 7 hodin. Nástup klinických příznaků je velmi rychlý a dramatický, bolesti hlavy, zvracení, bolesti břicha, vzácněji průjem. Úzdrava je rychlá, do 2 dní. Předpokládá se, že enterotoxiny stimulují lokální neuroreceptory v trávícím traktu, které prostřednictvím vagu stimulují centrum pro zvracení v mozku.
19 95 19 96 19 97 19 98 19 99 20 00 20 01 20 02 20 03 20 04 20 05 +
počet hlášených případů
Bakteriální intoxikace
1200
1000
800
600
400
200
0
Kriteria pro St. aureus • Nařízení 1441/2007 EU • Kapitola 1. Kriteria bezpečnosti potravin • 1.21 Sýry, sušené mléko a sušená syrovátka podle kritérií pro koagulázopozitivní stafylokoky , viz kapitola 2.2 • Stafylokokové enterotoxiny: n = 5, • Neprokázány ve 25 g, podle metody referenční laboratoře Společenství pro koagulázopozitivní stafylokoky
Kriteria pro St. aureus • Kapitola 2.2 Mléko a mléčné výrobky • 2.2.3 Sýry vyrobené ze syrového mléka • 2.2.4 Sýry vyrobené z mléka , které bylo podrobeno nižšímu tepelnému ošetření než pasterizaci a zrající sýry vyrobené z pasterizovaného či silněji tepelně ošetřeného mléka nebo z pasterizované či silněji tepelně ošetřené syrovátky • 2.2.5 Nezrající měkké sýry (čerstvé sýry) vyrobené z pasterizovaného či silněji tepelně ošetřeného mléka nebo z pasterizované či silněji tepelně ošetřené syrovátky • 2.2.7 Sušené mléko a sušená syrovátka
Limity • • • • • •
n=5 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.7
c=2
m
104 KTJ/g 100 KTJ/g 10 KTJ/g 10 KTJ/g
M 105 KTJ/g 1000 KTJ/g 100KTJ/g 100KTJ/g
Pokud jsou hodnoty > 105 KTJ/g musí být příslušná partie sýra vyšetřena na stafylokokové enterotoxiny. • Kapitola 2.4 Produkty rybolovu • 2.4.1 Krunýře a lastury zbavené výrobky z vařených korýšů a měkkýšů se schránkami • 100 KTJ/g 1000 KTJ/g
ČSN EN ISO 6888-1 • Horizontální metoda stanovení počtu koagulázopozitivních stafylokoků • Část 1: Technika s použitím agarové půdy podle Baird-Parkera • Kultivace na živné půdě s K2TeO3 a žloutkovou emulzí. • Typické černé nebo šedé kolonie obklopené zónou ptojasnění se konfirmují na přítomnost koagulasy
Vazba na potraviny • Malá množství téměř na všech typech masa a drůbeže • Uzenářské výrobky, šunka • Mléko a mléčné výrobky • Tvrdé sýry • Zákusky, v Japonsku rýžové kuličky, zmrzlina (Maďarsko)
Vliv technologií Bakterie SA jsou velmi odolné k vnějšímu prostředí. Dobře přežívají v: • suchém i kyselém prostředí, snáší vysoký obsah kuchyňské soli, • chladírenské i mrazírenské teploty, • aerobní i anaerobní prostředí. • Nepřežívají sterilační ani pasterační teploty. Toxiny jsou velmi rezistentní!
Indikátorové mikroorganismy • Indikace kontroly účinnosti antimikrobiálních technologických zákroků a hygieny prostředí • Indikace fekálního znečištění • Koliformní bakterie –- zkvašují laktosu za vniku kyseliny a plynu • Enterobacteriaceae – zkvašování glukosy ukazatel při rozboru pitné vody • Enterokoky
Enterobacteriacae
Standardní a patogenní mikroflora •
• E.
coli • Klebsiella • Enterobacter • Proteus • Serratia
• Salmonella • Shigella • Yersinia • pathogennní E. coli
Všechny jsou Gram negativní Fakultativně anaerobní Fermentují glukosu Oxidasa negativní Nitrát pozitivní
Nařízení 1441/2007 EU • Kapitola 2.1 maso a výrobky z něj • 2.1.1 jatečně upravená těla skotu, ovcí, koz a koňovitých 1,5 – 2,5 log KTJ/cm2 • 2.1.2 jatečně upravená těla prasat 4,0 – 5,0 log KTJ/cm2 • 2.2 Mléko a mléčné výrobky • 2.2.1 Pasterizované mléko a další pasterizované tekuté mléčné výrobky ≤1 KTJ/ml, 5 KTJ/ml • 2.2.7 Sušené mléko a sušená syrovátka 10 KTJ/g (c = 0)
Nařízení 1441/2007 EU • 2.2.8 Zmrzlina a maražené méčné deserty • 10 KTJ/g, 100KTJ/g • 2.2.9 Sušená počáteční kojenecká výživa a sušené dietní potraviny pro zvláštní léčebné účely určené pro kojence do šesti měsiců věku Nepřítomnost v 10 g 2.3.1 Vaječné výrobky 10 KTJ/g nebo ml, 100KTJ/g nebo ml
Media pro identifikaci • Testování na přítomnost nebo celkový počet indikátorových organismů ( coli-aerogenes - koliformní) v potravinách je prováděno standardně. • Media s krystal. violetí, methyl červení, žlučovými solemi a laktosou jsou navržena pro koliformní,t.j. laktosa pozitivní bakterie. VRBA, jsou varianty klasikého MacConkey agaru • Tato media jsou užívaná v posledních 20–30 letech pro počet a izolaci koliformních org. • Nové typy medií jsou pro E. coli založených na βglukuronidasové aktivitě se také užívají pro koliformy.
