BAB 3
PERCOBAAN
3.1
Bahan
NaCl fisiologis, metilen biru, CMC-Na, trimetoprim (PT Meprofarm), kloroform, etanol, kalium hidroksida, hidrogen peroksida, alizarin merah, gliserin, asam pikrat, formaldehid, asam asetat glasial, asam sulfat, toluena, etil asetat, pereaksi Dragendroff, pereaksi Mayer, serbuk Mg, amil alkohol, Na-asetat, FeCl3, larutan gelatin, NaOH, larutan amonia 25 %, eter, dan pereaksi Liebermann- Burchard.
3.2
Alat
Kaca objek, mikroskop, sonde oral, peralatan bedah, kaca pembesar, pinset, pisau silet, pipa kapiler, krus silikat, cawan penguap, kertas saring, gelas piala, labu Erlenmeyer, batang pengaduk, pipet tetes, labu bersumbat, tabung reaksi, dan botol timbang.
3.3
Hewan Uji
Mencit Swiss-Webster betina dewasa dengan bobot badan 25-35 g yang diperoleh dari Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung.
3.4
Pemeriksaan Kandungan Kimia Ekstrak Bawang Putih dan Kunyit
Pemeriksaan kandungan ekstrak bawang putih dan kunyit meliputi pemeriksaan terhadap golongan senyawa alkaloid, flavonoid, saponin, kuinon, tanin, dan steroid/triterpenoid.
3.4.1 Pemeriksaan Alkaloid Sebanyak 2 g ekstrak dilembabkan dengan 5 mL amonia 25 %, digerus dalam mortir, kemudian ditambah 20 mL kloroform dan digerus kuat-kuat. Campuran disaring, filtrat diteteskan pada kertas saring kemudian ditetesi pereaksi Dragendorff. Hasil uji dinyatakan positif jika terbentuk warna merah / jingga. Filtrat yang sama diekstraksi dua kali dengan larutan asam klorida 10 %, dimasukkan ke dalam dua tabung masing-masing 5 mL. Diuji dengan pereaksi Mayer dan Dragendorff. Hasil positif jika terbentuk endapan jingga / merah bata dengan pereaksi Dragendorff atau endapan putih dengan pereaksi Mayer.
13
14 3.4.2 Pemeriksaan Flavonoid Sebanyak 1 g ekstrak ditambah 100 mL air panas kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 5 mL filtrat (filtrat A) ditambah dengan serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 5 mL amil alkohol kemudian dikocok kuat. Terbentuknya warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.
3.4.3 Pemeriksaan Saponin Sebanyak 10 mL filtrat A dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dikocok vertikal selama 10 detik. Jika busa yang terbentuk stabil selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm dan busa tidak hilang pada penambahan asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin.
3.4.4 Pemeriksaan Kuinon Sebanyak 5 mL filtrat A ditambahkan dengan beberapa tetes larutan natrium hidroksida 1 N. Terbentuknya warna merah menunjukkan adanya golongan senyawa kuinon.
3.4.5 Pemeriksaan Tanin Filtrat A dimasukkan ke dalam tiga tabung reaksi masing-masing 5 mL. Tabung pertama ditambahkan beberapa tetes larutan besi (III) klorida 1 %. Jika terbentuk warna biru tua atau hitam, maka ekstrak positif mengandung tanin. Tabung kedua ditambah beberapa tetes larutan gelatin. Jika terbentuk endapan putih,maka ekstrak positif mengandung tanin. Tabung ketiga ditambah dengan beberapa tetes pereaksi Steasny dan dipanaskan dalam penangas air bersuhu 90°C. Terbentuknya endapan warna merah muda menunjukkan adanya tanin katekat. Kemudian endapan dipisahkan dan filtrat dijenuhkan dengan natrium asetat, ditambahkan beberapa tetes larutan besi (III) klorida 1 %. Terbentuknya warna biru tinta menunjukkan adanya tanin galat.
3.4.6 Pemeriksaan Steroid/Triterpenoid Sebanyak 1 g ekstrak dimaserasi dengan 20 mL eter selama 2 jam. Hasil maserasi disaring dan diambil filtratnya. Sebanyak 5 mL filtrat diuapkan dalam cawan penguap hingga diperoleh residu. Residu tersebut ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes
15 asam sulfat pekat. Terbentuknya warna biru-hijau menunjukkan adanya golongan senyawa steroid dan warna merah-ungu menunjukkan adanya golongan senyawa triterpenoid.
3.5
Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan cara destilasi. Tabung penerima pendingin dibersihkan dengan asam, dibilas dengan air, lalu dikeringkan. Ke dalam labu kering dituangkan 200 mL toluena dan 2 mL air, disuling selama 2 jam, didinginkan selama 30 menit, kemudian volume dibaca dengan ketelitian 0,05 mL. Hasil yang diperoleh disebut sebagai volume destilat pertama. Ekstrak yang diperkirakan mengandung 2 sampai 4 ml air dan batu didih dimasukkan ke dalam labu destilasi kemudian dipanaskan perlahan hinggá mendidih. Kecepatan penyulingan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik, setelah sebagian besar air tersuling, kecepatan penyulingan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin dicuci dengan toluena, penyulingan dilanjutkan selama 5 menit. Tabung penerima dibiarkan mendingin hingga suhu kamar dan air yang menempel pada tabung penerima dilepaskan dengan mengetuk-ngetuk tabung. Lapisan air dan toluena dibiarkan memisah, kemudian dibaca volume airnya. Volume yang terbaca disebut sebagai volume destilat kedua. Kadar air dinyatakan dalam persen dengan persamaan : Kadar air (%) =
100 (n 1 − n ) W
Dengan W sebagai berat ekstrak (g), n1 sebagai volume destilat kedua atau volume total air dan n sebagai volume destilat pertama atau volume air setelah penyulingan pertama (Depkes RI, 2000).
3.6
Penetapan Kadar Sari Larut Air
Sebanyak 5 g ekstrak dimaserasi dengan 100 mL air-kloroform (larutan 1 mL kloroform P dengan air hingga 100 mL) selama 24 jam menggunakan labu bersumbat sambil berkalikali dikocok selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Setelah selesai, disaring dengan kertas saring dan 20 ml filtratnya diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Kemudian cawan tersebut dipanaskan pada suhu 105°C hingga bobot tetap. Kadar sari larut air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 2000).
16
3.7
Penetapan Kadar Sari Larut Etanol
Sebanyak 5 g ekstrak dimaserasi dengan 100 mL etanol 95 % selama 24 jam menggunakan labu bersumbat sambil berkali- kali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam. Hasil maserasi disaring cepat dan 20 mL filtratnya diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Kemudian cawan tersebut dipanaskan pada suhu 105°C hingga bobot tetap. Kadar sari larut etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 2000).
3.8
Penetapan Susut Pengeringan
Sebanyak 1 g ekstrak dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumya telah dipanaskan pada suhu 105°C selama 30 menit dan telah ditara. Ekstrak diratakan dalam botol timbang dengan menggoyangkan botol hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm. Kemudian dimasukkan ke dalam oven dengan tutup terbuka pada suhu 105°C hingga bobot tetap (Depkes RI, 2000).
3.9
Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 g ekstrak dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara kemudian diratakan. Krus berisi ekstrak dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang dikeringkan di udara (Depkes RI, 2000).
3.10 Pola Kromatogram Pemantauan pola kromatogram lapis tipis ekstrak bawang putih dilakukan dengan pengembang butanol-asam asetat glasial-air (4: 3: 3) dan penampak bercak sinar UV λ 366 nm dan H2SO4 10 % dalam metanol. Pemantauan pola kromatogram lapis tipis ekstrak kunyit dilakukan dengan pengembang kloroform-etanol-asam asetat glasial (95: 5: 1) dan penampak bercak sinar tampak dan H2SO4 10 % dalam metanol (Rustyawati, 2004; Wagner, 1996).
3.11 Perlakuan terhadap Hewan Percobaaan 3.11.1 Penyiapan Hewan Percobaan Proses adaptasi dilakukan pada mencit selama satu minggu. Pada mencit betina, dilakukan pemeriksaan apusan vagina. Larutan NaCl fisiologis dimasukkan ke dalam vagina dengan
17 menggunakan pipet berujung tumpul kemudian dihisap kembali. Sekret vagina yang terhisap diteteskan pada kaca objek, diwarnai dengan larutan metilen biru 0,1 % lalu diamati di bawah mikroskop. Mencit betina yang berada pada masa subur (ditandai dengan adanya sel tanduk pada apusan vagina) dikawinkan dengan mencit jantan selama satu malam. Hari ke-0 ditentukan saat terjadi sumbat vagina atau adanya sperma pada pemeriksaan apusan vagina keesokan harinya.
3.11.2 Dosis dan Hari Pemberian Digunakan tiga variasi dosis kombinasi ekstrak bawang putih dan kunyit yaitu 100-100, 500-500, dan 1000-1000 mg/kg bobot badan. Kombinasi ekstrak diberikan pada mencit yang telah hamil secara oral pada hari ke-6 sampai hari ke-15 kehamilan. Pada kelompok kontrol, kombinasi ekstrak diganti dengan CMC-Na 0,5 % sedangkan pada kelompok pembanding, diganti dengan trimetoprim (1000 mg/kg bb).
3.12 Pemeriksaan Efek Teratogen Pada hari ke-18 kehamilan, induk mencit dianestesi dengan kloroform lalu dilakukan laparaktomi untuk mengeluarkan janinnya. Jumlah janin yang hidup, resorpsi, dan kelainan morfologis dicatat. Sepertiga janin dari masing-masing induk direndam dalam larutan alizarin merah untuk pengamatan kerangka dan dua pertiga bagian janin lainnya direndam dalam larutan Bouin untuk pengamatan organ bagian dalam dan bagian luar.
3.12.1 Pemeriksaan Kerangka Janin Janin yang telah ditimbang dan difiksasi dalam larutan etanol 90 % sekurang-kurangnya 12 minggu diambil dari botol fiksasi dan dikeringkan menggunakan kertas tisu. Setelah janin dikuliti sempurna, mata serta gumpalan lemak di tengkuk dan bawah kulitnya dilepaskan dan trakhea dipotong. Selangkang kaki dan ketiak disayat agar tidak menempel pada badan, dinding perut disobek dan jenis kelamin janin diperiksa. Setelah dikuliti dan dibuang organ bagian dalamnya, janin dikembalikan ke dalam botol fiksasi. Pewarnaan kerangka perlu dilakukan agar tulang rangka terlihat jelas sehingga memudahkan pengamatan dan penghitungan. i) Penjernihan Setelah seluruh janin dalam botol fiksasi selesai dikuliti dan dibuang organ bagan dalamnya, etanol 90 % diganti dengan kalium hidroksida 0,5 % selama lebih kurang
18 satu hari sambil beberapa kali menggoyang janin agar udara keluar dari rongga dada. Penjernihan dianggap sempurna jika kerangka terlihat diantara jaringan sekitar yang jernih. ii) Pemutihan Setelah penjernihan sempurna, larutan kalium hidroksida 0,5 % dibuang, janin dibilas dengan air, dan sisa jaringan lemak dibuang. Air diganti dengan larutan hidrogen peroksida 1 % selama 2-3 jam sambil beberapa kali menggoyang janin agar udara keluar dari rongga dada. Pemutihan dianggap sempurna jika bagian dalam tulang berwarna putih. iii) Pewarnaan Setelah pemutihan sempurna, janin digoyang untuk mengeluarkan udara dan larutan hidrogen peroksida 1 % dibuang. Janin dibilas dan direndam sekitar 10 menit dalam air lalu diganti dengan pewarna alizarin merah. Janin dibiarkan tenggelam dalam larutan selama tidak lebih dari 24 jam. Pewarnaan dianggap sempurna jika kerangka telah terlihat jelas. iv) Pembersihan akhir Setelah pewarnaan sempurna, larutan alizarin merah dibuang, janin dibilas dengan air beberapa kali kemudian direndam secara bertahap dalam larutan gliserol 5 %, 20 %, 40 %, 80 %, dan gliserol murni masing-masing selama satu minggu. v) Penilaian kerangka Penilaian kerangka dilakukan setelah preparat direndam dalam gliserol 80 % selama paling sedikit seminggu. Mula-mula kerangka diamati bagian belakangnya : tulang tengkorak, tulang belakang, dan tulang rusuk diperiksa. Kerangka dibalik lalu diamati bagian depannya : kerangka rongga mulut, tulang yang melingkari bahu dan pinggul, anggota bagian depan, dan anggota bagian belakang. vi) Penyimpanan kerangka Kerangka yang telah dinilai disimpan dalam gliserol murni dan bila mungkin ditambahkan sedikit kristal timol untuk mencegah pertumbuhan jamur.
3.12.2 Pemeriksaan Organ Janin Setelah janin difiksasi dalam larutan Bouin selama 1-2 minggu, janin dari satu induk dipindahkan dalam gelas piala berisi air. Satu janin diangkat, dikeringkan dengan kertas tisu, kemudian disayat dengan pola tertentu. Kepala bagian atas di antara kedua rahang dan di sebelah bawah telinga dipotong dengan pisau silet, dan permukaan langit-langit
19 diperiksa. Kemudian permukaan langit-langit diletakkan di sebelah bawah dan sayatan melintang kepala dibuat dari hidung berurutan ke arah belakang dengan jarak maksimum 1 mm. Sayatan-sayatan diletakkan secara berurutan dalam pelat tetes yang berisi air secukupnya hingga sayatan terendam. Kulit di sekitar perut ditoreh dengan pisau silet, bagian depan dipotong dan dibuang, organ di dalam rongga perut dikeluarkan secara hatihati. Hasil pengamatan dibandingkan dengan janin yang berasal dari induk kelompok kontrol.
