Az ischaemia tolerancia növelésének lehetőségei a májsebészetben

Az ischaemiatolerancia növelésének lehetőségei a májsebészetben Doktori értekezés

Dr . Szijár tó Attila Semmelweis Egyetem Multidiszciplináris (patológia) Doktori Iskola

Témavezetők: Dr. Schaff Zsuzsa D.Sc., egyetemi tanár Konzulens: Dr. Kupcsulik Péter D.Sc., egyetemi tanár Hivatalos bírálók: Dr. Oláh Attila Ph.D.., egyetemi magántanár Dr. Glasz Tibor Ph.D., egyetemi adjunktus Dr. Bursics Attila Ph.D., egyetemi adjunktus Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Fehér János D.Sc., egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Bálint András egyetemi docens, Ph.D. Dr. Forgács András osztályvezető főorvos, Ph.D.

Budapest 2006

.

Szijár tó Attila: Az ischaemiatoler ancia növelésének lehetőségei a májsebészetben Semmelweis Egyetem, Doktor i Iskola, Doktor i ér tekezés 2006

.

TARTALOMJ EGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK ............................................................................................... 2 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE........................................................................................ 5 1. BEVEZETÉS............................................................................................................ 7 1.1. Kirekesztések ..................................................................................................... 8 1.1.1. Részleges kirekesztések ............................................................................... 9 1.1.1.1. Pringlemanőver, Báronféle műfogás................................................... 9 1.1.1.2. Hemihepatic vascular occlusion .......................................................... 10 1.1.1.3. Ballon katéter szelektív okklúzió......................................................... 10 1.1.2. Teljes kirekesztés....................................................................................... 10 1.1.2.1. Total hepatic vascular occlusion.......................................................... 10 1.1.2.2. Ex situ májresectio, májtranszplantáció ............................................... 11 1.2. A máj vérellátása, szövettani szerkezete ........................................................... 11 1.2.1. Klasszikus májlebenyke (lobulus hepatis) .................................................. 12 1.2.2. Portalis lebenyke (lobulus portalis) ............................................................ 13 1.2.3. Rappaportféle májacinus .......................................................................... 13 1.3. Az ischaemiásreperfúziós károsodás ............................................................... 15 1.3.1. Ischaemiás sejtkárosodás ........................................................................... 15 1.3.1.1. Az ischaemiás károsodás sejtszintű mechanizmusa ............................. 16 1.3.1.2. Hypoxia jelpálya, a HIF1 szerepe ...................................................... 17 1.3.2. A (paradox) reperfúziós károsodás............................................................. 17 1.3.3. Ischaemiareperfúzió – mikrocirkuláció – endothel dysfunctio................... 18 1.3.3.1. Arteriolák ........................................................................................... 19 1.3.3.2. Kapillárisok ........................................................................................ 20 1.3.3.3. Venulák .............................................................................................. 21 1.3.4. A reperfúzió dinamikája ............................................................................ 22 1.4. Az ischaemiásreperfúziós károsodás effektor mechanizmusai ......................... 23 1.4.1. Oxidatív és nitrózatív stressz ..................................................................... 23 1.4.1.1 Szabadgyökök keletkezése ................................................................... 25 1.4.1.2. Szabadgyökök eliminációjáért felelős mechanizmusok ....................... 27 1.4.2. A lokális gyulladásos reakció résztvevői.................................................... 28 1.4.2.1. Leukocyták ......................................................................................... 28 1.4.2.2. Kupffer sejtek ..................................................................................... 29 1.4.2.3 Citokinek ............................................................................................. 29 1.4.3. Nitrogénmonoxid endothelin egyensúly ................................................. 30 1.5. Sejthalál: necrosis vagy apoptózis..................................................................... 31 1.5.1. Necrosis ischemiásreperfúziós károsodások kapcsán ................................ 31 1.5.2. Az apoptózis.............................................................................................. 32 1.5.2.1. A hepatocellularis apoptózis mechanizmusa........................................ 33 1.5.2.2. Az apoptózis kimutatása, szöveti reakciók .......................................... 34 1.5.2.3. Az apoptózis májszöveti ischaemiareperfúzió során........................... 35 1.5.3. Necrapoptózis............................................................................................ 36 1.5.4. Az IP és az apoptózis ................................................................................. 37 1.6. A PARP fiziológiás és patológiás szerepe az IR károsodásban ........................ 37 1.6.1. PARP szerepe a DNSkárosodások kijavításában...................................... 38 1.6.2. A PARP szerepe a szignáltranszdukcióban, és a génexpresszióban ............ 38 1.6.3. A PARP szerepe a sejthalálban .................................................................. 39

2. oldal

.


.

1.7. Glutamin szerepe az IR károsodásban ............................................................. 41 1.8. Az IR károsodás csökkentésének lehetséges módszerei ................................... 42 1.8.1. Ischaemiás preconditionálás (IP)................................................................ 43 1.8.1.1. IPsal szerzett evidenciák meleg ischaemiában.................................... 44 1.8.1.2. IPsal szerzett evidenciák hideg ischaemiában..................................... 45 1.8.1.3. IPsal szerzett evidenciák izolált hepatocytakultúrán.......................... 46 1.8.1.4. IP feltételezett patomechanizmusa....................................................... 46 1.8.1.5. IP dinamikája...................................................................................... 50 1.8.1.6. IP szerepe a klinikai gyakorlatban....................................................... 51 1.8.2. PARP inhibitorok ...................................................................................... 52 1.8.3. Glutamin ................................................................................................... 52 1.8.4. Kémiai és fizikai módszerek ...................................................................... 52 1.9. Szöveti áramlásmérés és a mikrocirkuláció jellemzése...................................... 53 1.9.1. Szöveti áramlásmérés alapjai ..................................................................... 53 1.9.2. Direkt áramlásmérési technikák ................................................................ 53 1.9.2.1. Direkt katéteres áramlásmérések ......................................................... 53 1.9.2.2. Plethysmographia................................................................................ 54 1.9.2.3. Transzlumineszcenciás vizsgálatok ..................................................... 54 1.9.2.4. Flowmeterek ....................................................................................... 54 1.9.2.4.1. Elektromágneses flowmeter ............................................................. 54 1.9.2.4.2. Ultrahangon alapuló áramlásmérés................................................... 55 1.9.2.4.3. Laser Doppler flowmérés ................................................................. 55 1.9.2.5. Hőmérsékletváltozáson alapuló technikák ........................................... 57 1.9.3. Indirekt technikák ...................................................................................... 57 2. CÉLKITŰZÉS ........................................................................................................ 58 2.1. Célkitűzés ........................................................................................................ 58 2.2. A témaválasztás indoklása ................................................................................ 60 3. MÓDSZEREK........................................................................................................ 61 3.1. A máj mikrocirkulációjának mérése laser Doppler flowmeterrel....................... 61 3.2. Szövettan.......................................................................................................... 68 3.3. Immunhisztokémia ........................................................................................... 69 3.3.1. TUNEL ..................................................................................................... 69 3.3.2. Aktív kaszpáz3 immunhisztokémia .......................................................... 69 3.3.3 Poli(ADPribóz) immunhisztokémia.......................................................... 70 3.4. TNFα szint ...................................................................................................... 70 3.4.1. TNFα szint vitalitáspróbával ................................................................... 70 3.4.2. TNFα ELISA............................................................................................ 71 3.5. Laboratóriumi paraméterek............................................................................... 71 3.6. Oxidatív stressz vizsgálata................................................................................ 72 3.6.1. Luminometriás összscavanger kapacitás mérés......................................... 72 3.6.2. Redukálóképesség meghatározása.............................................................. 72 3.6.3. Hidrogéndonor aktivitás meghatározása ................................................... 73 3.6.4. Szabad szulfhidril (SH) csoportok meghatározása .................................... 73 3.6.5. Biológiai minták fehérjetartalmának meghatározása .................................. 74 3.7. Kísérleti elrendezés, műtéttechnika................................................................... 74 3.7.1. Törvényi háttér .......................................................................................... 74 3.7.2. Csoportbeosztás......................................................................................... 74 3.7.2.1. I. Kísérlet: Ischaemiás preconditionálás – ischaemiareperfúzió .............. 74

3. oldal

.


.

3.7.2.2. II. Kísérlet: Kémiai előkezelések – ischaemiareperfúzió ........................ 75 3.7.3. Az operáció ............................................................................................... 75 3.7.3.1. Az I és II. kísérletoperáció közös részei ............................................. 75 3.7.3.2. I. kísérlet részletes leírása.................................................................. 77 3.7.3.3. II. kísérlet részletes leírása ................................................................. 78 3.8. Statisztikai feldolgozás ..................................................................................... 81 4. EREDMÉNYEK ..................................................................................................... 82 4.1. I. kísérlet eredményei ....................................................................................... 82 4.1.1. Haemodinamikai paraméterek.................................................................... 82 4.1.2. Mikrocirkuláció ......................................................................................... 82 4.1.3. Szövettani feldolgozás ............................................................................... 85 4.1.3.1. A nem preconditionalt IR csoport ...................................................... 85 4.1.4. TNFα szintek............................................................................................ 87 4.1.5. Laboratóriumi vizsgálatok: seBi, ALT, LDH ............................................. 87 4.1.6. Túlélés a 7. posztoperatív napon ................................................................ 88 4.2. II. kísérlet eredményei ...................................................................................... 89 4.2.1. Haemodinamikai paraméterek.................................................................... 89 4.2.2. Mikrocirkuláció ......................................................................................... 90 4.2.3.Szövettani feldolgozás ................................................................................ 91 4.2.3.1. Hematoxilyneosin festés ................................................................... 91 4.2.3.2. TUNEL reakció .................................................................................. 94 4.2.3.3. Aktív kaszpáz3 immunhisztokémia.................................................... 95 4.2.3.4 Poli(ADPribóz) (PAR) immunhisztokémia ......................................... 96 4.2.4. TNFα szintek............................................................................................ 96 4.2.5. Laboratóriumi vizsgálatok: AST, ALT....................................................... 97 4.2.6. Antioxidáns státusz.................................................................................... 97 4.2.6.1 Luminometriás összscavanger kapacitás ............................................. 98 4.2.6.2. Redukálóképesség............................................................................... 98 4.2.6.3 Hidrogéndonor aktivitás ......................................................................... 99 4.2.6.4 Szabad szulfhidril (SH) csoportok meghatározása............................... 99 4.2.7. Májlebenyek tömegei............................................................................... 100 5. MEGBESZÉLÉS .................................................................................................. 100 6. KÖVETKEZTETÉSEK ........................................................................................ 109 7. ÖSSZEFOGLALÁS.............................................................................................. 112 8. SUMMARY.......................................................................................................... 113 IRODALOMJEGYZÉK............................................................................................ 114 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE....................................................................... 131 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ................................................................................... 133

4. oldal

.


RÖVIDÍTÉSEK J EGYZÉKE A szövegben ismétlődő rövidítések megjelenésük sorrendjében: a. ADP AIF ALT APAF1 ASE AST ATP DAB DAG DNS eNOS ET Gln GSH GSSG H 2O 2 HIF1 HRE HSP / HSPs IAP IC ICAM IL iNOS IP IP3 IR LDF LDH LTB4 MAPK MPTP MPTP NAD NADP NFκB NO NOS O 2 •– ODFR OH •

arteria AdenozinBifoszfát Apoptózisindukáló Faktor Alanin Aminotranszferáz Apoptosis Activating Factor–1 Aszkorbinsav ekvivalens Aszpartát Aminotranszferáz AdenozinTrifoszfát Diaminobenzidin Diacetil Glicerol Dezoxiribonukleinsav Endothelialis NOS Endothelin Glutamin Redukált Glutation Oxidált Glutathion HidrogénPeroxid Hypoxia Inducible Factor1 Hypoxia Responsible Element Heat Shock Protien / Proteins = Hősokk Fehérje / Fehérjék Inhibitor Apoptózis Protein Intracellularis Intracellular Cell Adhesion Molecula = Intercelluláris Sejtadhéziós Molekula Interleukin Indukálható NOS Ischaemiás Preconditionálás Inozitol Trifoszfát IschaemiaReperfúzió Laser Doppler Flowmeter Laktát Dehidrogenáz Leukotrién B4 Mitogén Aktivált Protein Kinázok Mitochondrial Permeability Transition Pore Mitochondrial Permeability Transition Pore NikotinamidAdeninDinukleotid NikotinamidAdeninDinukleotidFoszfát Nuklearis FaktorκB Nitrogén Monoxid Nitrogén Oxid synthase = NOSzintáz Szuperoxid Anion Oxigen Derived Free Radicals Hydroxil Gyök

5. oldal

.

.


ONOO PAF PAR PARP PGI 2 PKC PKG PLC PM PTCA RLU RMI ROS RT SOD TNFR I & II TNFα TUNEL TxA2 UW v. VEGF XO

.

Peroxynitrit PlateletActivating Factor Poli(ADPRibóz) Poli(ADPRibóz)Polymeráz Prosztaciklin Protein Kináz C Protein Kináz G Foszfolipáz C Plató Maximum Percutanous Transluminal Coronary Angioplasty Relative Light Unit Reperfúziós Maximális Idő Reactive Oxigen Species Reperfúziós Terület Szuperoxid Dizmutáz Tumor Necrosis Faktor Receptor I & II Tumor Necrosis Faktor–alfa Terminal Deoxyribonucleotidyl Transferase Mediated Dutp Digoxigenin NickEnd Labeling Tromboxán A2 Univesity Of Wisconsin véna Vascular Endothel Growth Factor Xantin Oxidáz

Megjegyzés: A dolgozatban az idegen szavak latinos és magyaros írásmódja Fábián Péter és Magasi Péter szerkesztette Orvosi helyesírási szótár [Akadémia Kiadó, Országos Információs Intézet és Könyvtár, 1992] elveit követik.

6. oldal

.


.

1. BEVEZETÉS A májresectiók kapcsán az ischaemiásreperfúziós károsodás minden beavatkozás során megjelenik, ahol a máj afferens ereinek időleges okklúziójára van szükség, mivel a parenchyma sérülése jelentős vérvesztéshez vezethet. A vérvesztés mértéke – különösen portális hypertensio esetén – életet veszélyeztető lehet. Hasonló problémával kell számolnunk májtraszplantáció kapcsán is. A műtéti és posztoperatív halálozás, illetve a posztoperatív szövődmények megjelenése szoros összefüggést mutat az ischaemiás idővel, a vérvesztés mértékével, illetve a posztoperatív transzfúziók mennyiségével. A posztoperatív halálozás major májresectiót követően, egészséges máj esetén, 3,27%. Ezen érték akár 32%ig is emelkedhet cirrhosis kapcsán. [1] Az okklúziós technikát hagyományosan „kirekesztés”nek nevezzük, melynek számos típusa alakult ki az évek során. Kirekesztési eljárások használatára van szükség tompa hasi sérülést követő májruptura sebészi ellátása esetén, májtranszplantáció illetve nagy májresectiók során. A fentebb felsorolt műtéti beavatkozások mindegyikében közös, hogy a máj többkevesebb ischaemiás, hypoxiás károsodást, majd a vérellátás helyreállásával paradox módon egy másodlagos, további sejtkárosodát kiváltó reperfúziós hatást szenved. Az ischaemiareperfúzió (IR) során megjelenő celluláris és subcelluláris mechanizmusok aktiválódása nagyban meghatározza a máj ischaemiás toleranciáját és a posztoperatív regenerációját, és ezzel a betegek életkilátásait. A károsodás csökkentése fontos sebészi cél. Mind hazai [24], mind nemzetközi [58] kutatások hosszú évtizedeken át számtalan, a mindennapos napi klinikai gyakorlat számára alkalmas vegyületet, illetve módszereket vizsgáltak, melyek az IR károsodás mértékét csökkenteni tudták. Ugyanakkor sokáig senki nem gondolt arra, hogy éppen ischaemiával és reperfúzióval mérsékelni lehet az IR károsodást. Murry és munkatársai 1986ban publikálták korszakalkotó felismerésüket, amire egy ischaemiás toleranciát vizsgáló kísérlet meglepő eredményeként jutottak. Tapasztalataik szerint rövid ischaemiás epizódok alkalmazásával a myocardium toleránsabbá tehető egy hosszabb ischaemiás állapottal szemben [9]. A jelenség ischaemiás preconditionálásként (IP) vált ismertté. Az ischaemiás preconditonálásban rejlő potenciális lehetőségek számos kutatást indítottak el. Hatását nem csak szíven, hanem májon, vesén, vázizmon, bélen és a központi idegrendszeren is vizsgálták. Későbbiekben a molekuláris mechanizmusok

tisztázása került az érdeklődés középpontjába, melyek megismerése farmakológiai

7. oldal

.


.

beavatkozási pontokra világít rá. A preconditionálás egyik kulcspontja a később részletezendő subcelluláris jelátviteli mechanizmusok aktiválódása, illetve transzlációs folyamatok megindulása. A kaszkádok, molekuláris utak pontos ismerete a kémiai

előkezelés, esetleg preconditionálás lehetőségét vetik fel, ami megoldást jelenthet olyan kórállapot esetében is, ahol az ischaemiás preconditionálás technikailag nem, vagy nehezen kivitelezhető. Az IP akkor alkalmazható ideálisan, ha az ischaemiás állapotot tervezetten hozzuk létre. Ennek a feltételnek jelenleg sebészi beavatkozások felelnek meg, így az IP vascularis kirekesztéseknél és transzplantációknál jelenthet hatékony eszközt az IR károsodás csökkentésére. A következőkben kísérleteim problémafelvetésének, illetve eredményeinek és a levonható következtetések könnyebb megértéséhez az alapvető háttérinformációk kerülnek felsorolásra, az elmúlt évek irodalmi adatainak összefoglalásával.

1.1. Kir ekesztések Az ép emberi máj pontos ischaemiás tűrőképessége nehezen ítélhető meg. Leginkább retrospektív adatokból következtethetünk a tűrőképességre. Jelentős egyéni különbségek is megfigyelhetőek, amelyek leginkább a májszövet aktuális állapotától függnek (steatosis hepatis, cirrhosis hepatis stb.). Habár beszámoltak már rutinszerűen alkalmazott egy órás kirekesztésről is [10], a gyakorlatban mégis a következő eljárás használatos: a máj egyszeri, biztonságos kirekesztésének tartama 30 perc, majd 510 perc keringéshelyreállítás után 30 percre ismét vértelenné tehető a máj. [11;12] Ilyen intermittáló kirekesztéssel több órás teljes okklúzió érhető el. Az intermittáló kirekesztések okozta patofiziológiai folyamatokat, illetve annak klinikai hatásait tanulmányok részletesen vizsgálták. [13;14]. Igaz, hogy a teljes vascularis kirekesztéssel jelentős vérvesztés megelőzhető, ugyanakkor az anheptikus fázis kiszámíthatatlan haemodinamikai változásokat eredményezhet, mely a morbiditás és mortalitás növekedéséhez vezet [13]. Prospektív vizsgálatok alapján elmondható, hogy májresectiók kapcsán az intermittáló kirekesztés korai és késői hatásái kedvezőbbek, mint a teljes vascularis okklúzió hatásai. Az intermittáló kirekesztések hatására a posztoperatív időszakban mérsékeltebb heptocellularis károsodás, transzamináz enzim, illetve [15], bilirubin szint emelkedés volt megfigyelhető, ugyanakkor az intraoperatív vérvesztés szignifikánsan magasabb volt [14;15]. Ugyanakkor a májparenchyma

8. oldal

.


.

ischaemia toleranciája a megnövekedett vérvesztés és az esetlegesen hosszabb műtéti idő ellenére is nőtt. Az ideális protektív stratégia a májműtétek kapcsán a vértelenségben, illetve vérvesztés nélkül végezhető parenchymális transsectiok lennének, olyan körülmények közt, ahol az ischaemiatolerancia maximális. Teoretikusan az ischaemiás preconditionálás vagy ezen protektív védelmi rendszert felépítő kémiai anyagok biztosíthatják a megnyúlt ischaemiás tolerancia felépülését, ezzel az egyszeri kirekesztések ideje megnyújtható. 1.1.1. Részleges kirekesztések Részleges kirekesztésnek nevezzük a vena portae, arteria hepatica időleges okklúzióját, nem érintve a vena hepaticakat. Az alábbi lehetőségek tartoznak ide [16;16]: 1.1.1.1. Pringlemanőver, Báronféle műfogás Az eljárás a ligamentum hepatoduodenale ideiglenes okklúzióját jelenti. (1. ábra) Így a vena portae és az arteria hepatica propria elzárásával a máj afferens vérellátása időlegesen megszakad. Az eljárást a elsőként talán a magyar Báron Sándor alkalmazta („Báronféle műfogás”) a huszadik század elején, azonban a nemzetközi szakirodalomban, a „Pringle manoeuvre”

elnevezés

terjedt

el,

tekintve, hogy Báronnál néhány évvel korábban a skót Pringle és munkatársai is leírták ezt a technikát, amit traumás 1. ábra: Priglemanőver: a ligamentum hepatoduodenale képleteinek okklúziója

májruptura kapcsán alkalmaztak először. „ While small lacerations of the liver

substance may be, and no doubt are, recovered from without operative interference: if lacerations be extensive and vessels of any magnitude are torn, haemorrhage will, owing to the structural arrangement of the liver, go on continuously.” [17] Az eljárás előnye, hogy gyorsan, és egyszerűen kivihető. Hátránya, hogy befolyásolja a szervezet haemodinamikáját: vérnyomás, pulzusemelkedés, cardiac output csökkenés, splanchnikus pangás.

9. oldal

.


.

1.1.1.2. Hemihepatic vascular occlusion Ezen kirekesztés során a lig. hepatoduodenale képleteinek oszlás feletti izolálása után a rezekálandó terület érképleteinek szelektív, intermittáló leszorítása történik. Gyenge általános állapotú betegeknél, illetve cirrhoticus máj esetén alkalmazott eljárás. Használatával csökkenthető a haemodinamikai változás, a splanchnikus pangás és a máj ischaemiának kitett területeinek nagysága. Technikai kivitelezése nehéz. 1.1.1.3. Ballon katéter szelektív okklúzió A katéter a v. portaen keresztül kerül bevezetésre és így az oszlás utáni kisebb érág szelektív okklúziójára van lehetőség a ballon felfújásával. Kivitelezése hasonlóan nehéz, mint az előbb említett technika alkalmazása, továbbá az a. hepatica ágaiból vérzés állhat elő. Előnyös azonban, mert csökkenthető a splanchnikus pangás, a haemodinamikai változások és az ischaemiás májterület. 1.1.2. Teljes kirekesztés Teljes kirekesztésnek nevezzük a vena portae, arteria hepatica, illetve a vena

hepaticae egyidejű okklúzióját. A gyakorlatban az alábbiak alkalmazhatóak [16]: 1.1.2.1. Total hepatic vascular occlusion A módszer a vena cava inferior infra és suprahepaticus szakaszának leszorítását, és a portális erek okklúzióját jelenti. (2. ábra) Nehéz kivitelezése miatt csak a májparenchyma cava inferior körülvevő részét, érintő, illetve a vena cava inferiort infiltráló tumorok sebészi megoldásánál terjedt el. Ugyanakkor előnyös tulajdonsága a technikának, hogy a műtéti terület vérzése gyakorlatilag nulla, és a légembolizáció esélye is csökken. Ennek az eljárásnak egy kibővített változata az in situ hypothermiás

májperfúzió, teljes vascularis kirekesztéssel. Az eljárás használata veszélyei és viszonylag bonyolult kivitelezése miatt korlátozott azokra az esetekre, amikor a máj major resectiójára, a vena portae és a vena hepatica disszekciójára majd rekonstrukciójára van szükség. A vena portaen keresztül bevezetett katéteren keresztül 4 o Cos Ringerlaktát oldatot perfundálunk, amelyet a vena cavaból visszanyerünk, vagy venovenosus extrakorporális bypass technikát alkalmazunk. Előnyei, hogy akár 4 órás ischaemia is fenntartható különösebb károsodás nélkül, ill. ilyen technika alkalmazása

10. oldal

.


.

mellett a légembólia és a vérzés veszélye minimális. Hátránya, hogy a rendszer nagyon bonyolult és drága. A teljes vascularis okklúzió haemodinamikai hatásai igen jelentősek, így szoros megfigyelés mellett is nehéz lehet a megfelelő haemodinamikai stabilitás fenntartására. Hatását, a Pringle manőverrel összehasonlítva az intraoperatív vérvesztés, és az intraoperatív transzfúziók számának csökkenésében figyelték meg, ugyanakkor 2. ábra: Total hepatic vascular occlusion sematikus képe

gyakrabban

jelentkeztek

pulmonalis szövődmények, és subphrenicus folyadék.

1.1.2.2. Ex situ májresectio, májtranszplantáció A Pichlmayr [18] által leírt komoly jártasságot és felszereltséget igénylő műtét során az érellátás teljes megszakítása után a májat eltávolítják. Ezután alacsony hőmérsékletű prezerváló oldat extrakorporális keringtetésével a szervet lehűtik, majd a testüregen

kívül

az

érintett

májsegmentumot

rezekálják,

végül

a

máj

re/autotranszplantációjára kerül sor. A májtranszplantáció során a graft vérellátás nélküli állapotba kerül mindaddig, amíg a recipiens szervezetbe beültetve nem kap újra vért. A májgraftokat általában alacsony hőmérsékletű UW (Univesity of Wisconsin) vagy Viaspan konzerváló oldattal lehet átmosni az aortán vagy a v. portaen keresztül.

1.2. A máj vér ellátása, szövettani szer kezete Két ér táplálja a szervet: a lig. hepatoduodenale útján éri el a májat a v. portae és az a. hepatica propria. A perctérfogat jelentős mennyisége a szerv ellátására fordítódik, a májon percenként kb. 1500 ml vér áramlik keresztül, melynek átlag 75%a származik a vena portaeból, a maradék részét az arteria hepatica propria biztosítja. A máj keringésének állandóságát a két keringés dinamikus, reciprok szabályozása biztosítja, mely nem minden esetben következetes. Ugyanakkor egyes irodalmi adatok szerint az arteria hepatica és vena portae intraoperatív ultrahangvezérelt áramlásmérése nem minden esetben követi ezen szabályszerűséget. A vizsgálatban, míg a vena porta szelektív okklúziója növelte az artériás beáramlást, addig – nem ismert okoknál fogva –

11. oldal

.


.

az arteriás kirekesztést nem követte portalis flow növekedés [19;20]. A probléma hátterében vélhetően a Lautt [21;22] által leírt „adenosin washout theory” áll. A két ér keringését befolyásoló intrinsic és extrinsic mechanizmusok főként az a. hepatica keringését befolyásolják. A máj kiáramlási erei, a három v. hepatica a máj hátsó felszínén, vagy a máj állományában futó v. cava inferiorba ömlik. Goldsmith és Woodburne (1957) tanulmányai alapján a máj a vena portae oszlása és a v. hepaticak elhelyezkedése szerint osztható szegmentumokra [23]. A három vena hepatica négy szektorra tagolja a májat, és minden szektor egyegy portális főágat is kap egy ún. bilio vascularis nyélen keresztül. Egyegy biliovascularis rendszer mindkét májfélben négy négy szegmentumba hatol be, amelyeket egytől nyolcig római számokkal jelölünk. A máj ma általánosan elfogadott szerkezeti modelljét a francia Couinaud (1954) dolgozta ki korróziós preparátumok alapján [24]. A máj mikroszkópos felépítésének meghatározó tényezője, hogy a máj parenchymájának 7880%át alkotó hepatocyták és a kis érképletek (v. centralis, a. interlobularis, v. interlobularis, kis epeutak) májsejtcsoportokba, lebenykébe (lobulusokba) rendeződnek. A kis lebenykék egy olyan háromdimenziós hálórendszerben helyezkednek el, melynek hálószemeit, a májat körülvevő tömött rostos kötőszövetnek a szerv mélyébe törő finom kötőszöveti rostjai alkotják. Funkcionális és patológiai megfontolások alapján több májlebenykefelosztást ismerünk, a májsejteknek az erekhez viszonyított helyzete alapján, melyek áttekintése az ischaemia által okozott szövettani elváltozások megértéséhez elengedhetetlen. 1.2.1. Klasszikus májlebenyke (lobulus hepatis) A leggyakoribb felosztás, ami a májlebenyke központjába a v. centralist helyezi. A körülbelül 11,5 mm átmérőjű, és 2 mm hosszú képződmény átmetszetben hatszögletű, ennek szögleteiben halad a portális, vagy más néven Glissontriász (egyes könyvek szerint portalistriád). A képződmény térbeli alakja körtéhez hasonló. A portális triász három alkotórésze az a. hepatica propria kis ága az a. interlobularis, a v. portae kis végága a v. interlobularis, és az epeductulus (ductus biliferi interlobularis). A májlebenykében a v. centralis, mint centrum körül radier helyzetű, 12 sejtvastagságú, lyukacsos májsejtgerendák vannak. A májsejtgerendák közeit a máj különleges mikrovaszkuláris rendszere, a májsinusok rendszere tölti ki. A sinusok többségükben szintén radier helyzetűek, azonban a gerendák hézagjain keresztül egymással közlekedő,

12. oldal


.

.

összefüggő rendszert hoznak létre. A sinusok falát nem folytonos, átlyuggatott endothelsejtek alkotják, az anyagkicserélődés intenzitása ezáltal fokozottabb. Az endothelsejtek alatt normális élettani körülmények között nem található bazális membrán, ez a könnyebb anyagkicserélődés szolgálatában áll. A sinusok széli részébe ömlik az arteria és véna perilobularis vére. Az a. perilobularis oxigéndús vére az arteria hepaticából származik. A v. perilobularis (v. portae ága) a bélből származó, tápanyagban gazdag vért, és a lépből, pancreasból származó vért szállítja a májsejtekhez. A máj mikroszkópos vizsgálatai alapján látható, hogy a beáramló vér, és az általa szállított szubsztrátok a sinusokon keresztül, mintegy körbeveszik a hepatocyták alkotta májsejtgerendákat. A hepatocyták a vérben „úszva” látják el metabolizáló, felszívó, és szekretoros feladataikat. A sinusokból ezután a v. centralisba, később a v. sublobularisba, v. hepaticába, és végül a v. cava inferiorba kerül a vér. 1.2.2. Portalis lebenyke (lobulus portalis) A lobulus portalis (4. ábra) az a. és v. interlobularis ellátási területe. A lebenyke háromszög alakú, melynek központjában a Glissontriász, a szögleteiben a v. centralisok találhatók.

1.2.3. Rappaportféle májacinus Számos szerző patológiai és biokémiai megfigyelések alapján a májacinust fogja fel, mint a máj funkcionális egységét. A májszövet ischaemiás/hypoxiás, illetve toxikus károsodása is ezen modell segítségével magyarázható a legjobban. A májacinus az a. perilobularis (a. hepatica ága), és a v. perilobularis (v. portae ága) ellátási területe. A rombusz alakú lebenyke kisebbik átlójában húzódik ez a két kis ér, és rendre minden második csúcsát a v. centralis illetve a Glissontriász alkotja. Funkcionális szempontból így

a

májlebenykében

három

zónát

különböztethetünk

meg,

amelyek

elektronmikroszkópos, és kórélettani megfigyelések alapján különböznek egymástól. A lebenykét a friss vér az a. és v. perilobularisok felől éri el, ennek megfelelően a májsejtek oxigén és tápanyag ellátottsága az erektől távolodva fokozatosan csökken (3. ábra). Az I. zóna sejtjei jutnak a legnagyobb tápanyag és oxigénkoncentrációjú vérhez. A III. zóna a v. centralishoz közeli májsejtekből áll, amelyek tápanyagban és oxigénben jóval szegényebb vérhez jutnak, mivel a vért a májacinus centrálisan elhelyezkedő

13. oldal

.


.

sejtjei már részlegesen kimerítették. A II. zóna sejtjei az I. és III. zóna közötti átmenetnek felelnek meg. A zonális felosztás jól egybeesik a májlebenyke sejtszerkezeti, és biokémiai felépítésével. Jól ismert, hogy az egyes zónák másként, és másmás sorrendben reagálnak a tápanyaghiányra, ischaemiás károsodásra és a toxikus károsodásokra. Emellett a zónákat alkotó sejtek enzimösszetétele is jól korrelál a zonális felosztással. Az egyes zónák sejtjeinek felépítésbeli és enzimaktivitásbeli különbségeit a

3. ábra: Májlebenykék főbb típusai

4. ábra: A májlebenykék vérellátása

következőekben foglalhatjuk össze: Az I. zóna sejtjei rendelkeznek a legjobb vérellátással, sejtjeinek anyagcseréje ezért a zónák sejtjei közül a legélénkebb. A sejtek enzimösszetételét vizsgálva dominálnak az oxidatív anyagcsere, és a glükoneogenezis enzimjei. Étkezés után ebben a zónában szaporodik fel leggyorsabban a glikogén, ugyanakkor a cukor leadása ebből a zónából történik utoljára. Oxigénmentes állapotban ezen zóna sejtjei pusztulnak el legkésőbb, és regenerálódnak a leggyorsabban, ugyanakkor toxikus károsodáskor (gyógyszerek, mérgek, baktériumtoxinok) e zóna sejtjeinek pusztulása a legszembetűnőbb. A II. zóna közepes vérellátottságú. Sejtjei mind működésben, mind enzimprofilban átmenetet képeznek az I. és III. zóna között. A III. zóna vérellátása a legrosszabb. Ennek megfelelően a glikolízis és a glukoneogenezis enzimjei az uralkodóak a sejtek enzimprofiljában. Szubsztrát túlkínálat esetében, ebben a zónában is igen nagy mennyiségű glikogén halmozódhat fel. Éhezésben ebből a zónából mobilizálódik először a glükóz. A sejtek elektronmikroszkópos vizsgálatánál szembetűnő a sima felszínű endoplazmás retikulum nagy mennyisége, melynek enzimjei a xenobiotikumok transzformációjában (pl.:

14. oldal

.


.

konjugációs enzimek), és a lipidszintézisben vesznek részt (pl.: koleszterinszintézis). Ischaemia esetén a III. zóna sejtjei pusztulnak el leghamarabb, és regenerációs képességük is a legalacsonyabb. A mérgező anyagok károsító hatásának azonban jobban ellenállnak ennek a zónának a sejtjei, mint az I. zóna sejtjei, mivel a károsító ágensek koncentrációja a III. zóna környezetében már alacsonyabb. Összefoglalásként elmondható, hogy a máj vérellátásának megszakítása során a Rappaportféle májacinus III. zónájában található sejtek károsodnak leginkább, illetve az I. zóna sejtjeinek regenerációs képessége a legjobb.

1.3. Az ischaemiásr eper fúziós kár osodás 1.3.1. Ischaemiás sejtkárosodás Ischaemiának nevezzük a vérellátás akadályozottságát, hypoxián az oxigénellátás elégtelenségét, anoxián pedig annak teljes hiányát értjük. A hypoxia/anoxia előállhat ischaemia hatására is, azonban megjelenhet akkor is, ha a vér O2szállító kapacitása lecsökken (anaemia). A sejtműködéshez szükséges ATP glikolízis, illetve az ADP oxidatív foszforilációja kapcsán keletkezhet. Hypoxia esetén a sejt a glikolízis révén is termelhet energiát, ez azonban rendkívül rossz hatásfokú energianyerés, és az ischaemia miatt a szükséges szubsztrátutánpótlás is nehezített. Az ischaemia okozta szerkezeti és működésbeli károsodások egy határig helyreállíthatóak, a károsodás reverzibilis, ha a vérellátás spontán, vagy terápiás beavatkozás (pl.: PTCA, portalis érképletek kirekesztésének megszüntetése) hatására helyreáll (reperfúzió). Más esetben az ischaemia hosszabb fennállásakor a károsodás fokozatosan irreverzibilissé válik („point of no return”). Az irreverzibilis károsodást okozó ischaemiaidőtartam hosszát döntően befolyásolja, hogy az ischaemia egészséges, vagy már károsodott szövetet érint. Ezzel magyarázható pl. a steatotikus és cirrhotikus máj csökkent ischaemiás tűrőképessége. Paradox módon az ischaemiás szakaszt átvészelő sejtek a reperfúzió során szenvednek el olyan mértékű károsodást, ami a sejtek pusztulásához vezethet. Ebben a reperfúziós károsodásban kulcsfontosságú az oxigén tartalmú reaktív szabadgyökök (ODFR) jelenléte, melyek az oxigenizáció helyreállítása után nem enzimatikus láncreakciók hatására keletkeznek (ld. 1.4. fejezet).

15. oldal

.


.

1.3.1.1. Az ischaemiás károsodás sejtszintű mechanizmusa A májsejtek elhalásának (necrosis/apotózis) folyamata részleteiben a 1.5 fejezetben kerül bemutatásra. Követezőkben az ischaemia okozta celluláris, subcelluláris fontosabb eltéréseket sorolom fel, melyek végül necrosishoz vezetnek [25]. A máj ischaemiás károsodásai leginkább a III, azaz centrilobularis, pericentralis zónában észlelhetőek. Az ischaemia hatására csökken a sejt ATP tartalma, ezzel párhuzamosan csökken a membránok Na + /K + ATPáz aktivitása, károsodnak a transzmembrán fehérjék. Fokozódik a K + kiáramlás, ioneloszlási zavarok jönnek létre. A mitochondriális mátrix felhígul, vesicula dilatáció és kismértékű cytoskeleton átrendeződés figyelhető meg. A sejtmag ekkor még sértetlen. Felerősödik a glikolízis, a pH csökkenni kezd és a sejt kifejezetten hypoxiássá válik. A fokozódó Na + és Ca 2+ beáramlás miatt radikálisan megváltozik a sejt ionháztartása. A növekvő víztartalom miatt a sejtek duzzadni kezdenek. Csökken az RNS szintézis, eltűnnek a membrán finomszerkezetei, a sejt vázában aktinfilamentkeresztkötések alakulnak ki, melyek a cytoskeleton megroppanását eredményezik. A mag szerkezetében megjelennek az első visszafordíthatatlan reakciók. Ezt követően a membránok irreverzibilis károsodását, „kilyukadását” követő fokozott Ca 2+ és vízbeáramlás, valamint Mg 2+ vesztés jellemző. Megszűnik a proteinszintézis, a sejtek fehérjéi koagulálódnak, a cytosolban emelkedik a zsírsavkoncentráció. Az irreverzibilis károsodások miatt a sejtpusztulás elkerülhetetlen (point of no return). Megváltoznak a sejtfelszíni antigének, a sérült lysosomákból kiáramló emésztőenzimek szétrombolják a makromolekulákat. Megkezdődik a piknózis és a kariolysis, a sejtmag feloldódik („eltűnik”). A sejt szerkezete szétesik és beáll a sejthalál. A nekr ózis morfológiai jelek alapján koagulációs típusú. Végeredményben az intracitoplazmatikus anyagok, enzimek (ALT, AST, LDH stb.) kikerülnek az intercelluláris térbe. Kísérletesen is igazolt, hogy ezen enzimek szérum és szöveti megjelenése egy szintig arányos az ischaemiás károsodás mértékével [2629]. A fenti folyamatot követi a gyulladásos sejtek megjelenése, érfalhoz való kitapadása. A nekrotizált hepatociták környezetében a máj fagocita funkcióval bíró sejtjei, a Kupffer sejtek aktivációja következik be. A Kupffer sejtek amellett, hogy eliminálják a degenerálódott

sejtmaradványokat,

gyulladásos

szecernálásával erősítik a lokális gyulladásos folyamatot.

16. oldal

faktorok

termelésével

és

.


.

1.3.1.2. Hypoxia jelpálya, a HIF1 szer epe Hypoxia hatására a sejtben fellépő számos biológiai válasz egyike az angiogenesis. A daganatos szövetek kísérletes vizsgálatánál figyeltek fel az úgynevezett O2szenzitív gének jelentőségére. A daganatok növekedése olyan gyors ütemű, hogy a szövetet ellátó erektől egyes daganatsejtek távol kerülnek, így azokban relatív hypoxia alakul ki. A sejtekben átíródó O2szenzitív gének termékeinek szerepe kettős: 1. az angiogenesis serkentése (VEGF = vascular endothel growth factor) 2. metabolikus adaptálódás az oxigénmentes állapothoz: az anaerob glikolízis enzimjeinek, és az LDH termelődése nő, illetve nő GLUT2 glukóz transzporterek száma. Jelen megközelítésben számunkra ezen utóbbi hatás ismerete fontos. Hypoxia hatására beinduló transzdukciós kaszkád eredményeként egy transzkripciós faktor („a folyamatok végső közös pontja”), a HIF1 (hypoxia inducible factor) aktiválódik, és a DNS számos részén elhelyezkedő HRE (hypoxia responsible element) promoter régiókhoz kötődik, indukálva ezáltal az O2szenzitív gének transzkripcióját. A HIF1 egy dimer szerkezetű molekula, melynek HIF1β része konstitutívan jelen van a sejtben, míg a HIF1α egy oxigénhiányra indukálódó protein aszparagin , és prolin– hidroxilázok hatására [30]. A hypoxiás sejtben, a HIF1α aktív dimert képez a HIF1β val és az így kialakuló dimer bejut a sejtmagba és indukálja az O2szenzitív gének átírását. Ezt a transzkripciós faktort először a hypoxia hatásra fokozódó erythropoetin termeléssel [31], valamint a daganatokban kimutatható VEGF expresszióval [32] kapcsolatban írták le. Ma már ismert, hogy target génjei közé tartoznak egyes glikolitikus enzimek (pl. LDHA), a GLUT2 glukóztranszporter, az angiogenesisben szerepet játszó VEGF, iNOS génje, valamint az apoptózisban szerepet játszó p53. Látható tehát, hogy ez a jelpálya is több irányba viheti tovább a sejt sorsát [33]. A hypoxia jelpályának újabb kutatások központi szerepet tulajdonítanak az ischaemia mediálásában, illetve az ischaemiás preconditionalás során felépülő védelmi rendszernek.

1.3.2. A (paradox) r eperfúziós károsodás Reperfúziós károsodásnak nevezzük, amikor a szerv keringése spontán, vagy terápiás beavatkozás hatására helyreáll, és paradox módon a szervkárosodás fokozódik.

17. oldal

.


.

A reperfúzió nélkülözhetetlen az ischaemiás károsodásból való felépüléshez. Helyreállítja a szövet oxigén és energiaellátását, valamint elszállítja a felhalmozódott toxikus metabolitokat. Ezzel egyrészt megmentheti az ischaemia során reversibilisen károsodott sejteket [25], másrészt paradox módon a sejtek további károsodásához vezet, ezt a jelenséget „oxygenparadox”ként tárgyalja az irodalom [34;35]. Ismert, hogy az ischaemiás szövetekben felszaporodó purin és az elégtelenné váló antioxidáns mechanizmusok, az újrainduló oxigenizáció során kedveznek a reaktív szabadgyökök kialakulásának, felszaporodásának. Az szabadgyök makromolekulák (pl.: DNS, membránok lipid és fehérjekomponensei) károsításával olyan láncreakciókat (pl. lipidautoperoxidáció) indít el, melyek szintén a sejtek integritásának megbontásához, sejthalálhoz vezethetnek. Mindezek mellett igen kifejezett intracelluláris Ca 2+ felszaporodás tapasztalható, mely az egyik legfontosabb meghatározója az IR károsodásnak [35]. A mitochondriumok a kalciumot aktív transzporttal veszik fel. A szükséges energiát az elektrontranszport fedezi. A kalcium molekuláris oxigén és vas jelenlétében elősegíti a mitochondrium belső membránjának károsodását, ezáltal mintegy felerősíti a mitochondrialis szabadgyökképződést. E hipotézis szerint a Ca 2+ ionok aktiválják a foszfolipáz A2 enzimet, amely a membránfoszfolipidek hasítását követően fellazítja a lipidfehérje kölcsönhatásokat. A mitochondriális univalens elektronszivárgás következtében a folyamatosan képződő szuperoxid anion, ezáltal bejut a mátrix térbe. Így az extrém mértékű szabadgyökkínálat miatt az antioxidáns védekezőmechanizmusok kimerülnek, továbbá az O2 és a H2O2 vas jelenlétében OH – gyököt termel. A képződött – OH gyök a belső membrán proteinjeinek, azaz a respirációs lánc alkotóinak SHcsoportjait megtámadja, azok részleges aggregációját okozza az –S S keresztkötések kialakulása miatt. A vas Ca 2+ jelenlétében mobilizálódni képes kötött formájából, így a folyamat felerősödik. A mitochondrium belső membránjában úgynevezett lyukak, pórusok (MPTP) nyílnak meg, melyek hozzájárulnak az energiatermelő folyamat teljes dezorganizációjához [36], illetve a necrosis vagy apoptózis megjelenéséhez (ld. 1.5. fejezet). 1.3.3. Ischaemiar eperfúzió – mikrocir kuláció – endothel dysfunctio Míg korábban a parenchymasejtek halálos reperfúziós károsodása volt az érdeklődés középpontjában, fontosságuk a szervi dysfunctiók szempontjából ma már megkérdőjelezett a. Jelenleg a kiserek falát szegélyező endothelsejtek szerepét tartjuk

18. oldal

.


.

meghatározónak, mely sejtek különösen érzékenyen reagálnak hypoxiából és reoxigenizációból eredő károsító hatásokra egyaránt [37]. Az erek belső felszínét bélelő endothelsejtek élő és dinamikus struktúrát alkotnak, mely alapvető fontosságú a vascularis homeosztázis fenntartásához. Elhúzódó hypoxia hatására megváltozik a membránpotenciál, ion, illetve folyadékeloszlási zavar jön létre, megnő a sejttérfogat, csökken a membrán fluiditása és gátlódik a cytoskeleton szerveződése. Az energiaraktárak kimerülése mellett egyes bioaktív anyagok (pl.: PGI2, NO) csökkent, mások (pl.: ET, TXA2) fokozott termelődése jön létre. A hypoxiás környezetben bizonyos gének (pl.: adhéziós molekulák, cytokinek) indukciója, míg mások (pl.: eNOS, thrombomodulin) szuppressziója alakul ki bennük [38]. Az így kialakult állapotot összefoglalóan endotheldysfunctionak nevezzük. A reperfúzió során említett elváltozások nagy része súlyosbodik a hirtelen megnövekvő oxigénkínálatból eredő nagy mennyiségű szabadgyökképződés miatt [39]. A reperfúziót követő időszakban hirtelen alakul ki súlyos endothelialis dysfunctio anélkül, hogy kezdetben a sejtek morfológiai károsodása észlelhető lenne. A morfológiai jelek kialakulásához relatíve hosszabb idő szükséges. Ide soroljuk a sejtek duzzadását, a piknocitikus vezikulák elvesztést, az endothel sejtek elemelkedését a basalis membránról és aktivált neutrophilek kitapadását a sejtek felszínéhez [25]. Annak ellenére, hogy a sejtek a mikrocirkuláció egész területén egyformán ki vannak téve az IR károsító hatásának, a dysfunctiojuk elhelyezkedésükre jellemző módon jön létre [40]. Az arteriolák, a kapillárisok és a venulák egymástól eltérően reagálnak ebben a helyzetben.

1.3.3.1. Arteriolák Ezen az érterületen elsősorban a vazodilatáció válik elégtelenné az endothel dysfunctio következtében. A jelenség oka, hogy a nitrogénmonoxid (NO) mediálta relaxáció elégtelensége miatt a simaizomzat vasodilatatorokra adott válaszkészsége csökken [40]. A exogen adagolt, endothelfüggetlen relaxáló ágensekre (pl: nitroprussidNa) adott válasz az ischaemiát követően is megtartott marad, ami arra utal, hogy a vasodilatatio csökkenése nem a simaizom elégtelen működésére vezethető vissza. Az endothelsejtek NO termelése fiziológiásan 23 nagyságrenddel meghaladja a szuperoxid anion (O 2 ) képződés mennyiségét, IR hatására azonban az O 2

19. oldal


.

.

túlprodukciójával egyidejűleg az NO képzése csökken. Reaktivitásuknak köszönhetően a két molekula gyorsan reagál egymással, ami még toxikusabb peroxynitrit (ONOO ) kialakulását eredményezi. Az utóbbi számos károsító hatása mellett ez a reakció a NOt gyakorlatilag teljesen elvonja biológiai funkciójától [37]. Amennyiben a szuperoxid anionok túlsúlyát az NOval szemben szuperoxid dizmutáz (SOD), illetve antioxidánsok segítségével sikerül megszüntetni, a vasodilatatio helyreáll. A lokális gyulladás következtében kitapadó aktivált fehérvérsejtek a szuperoxid anionok további fontos forrásai lehetnek. Ezzel hozzájárulnak a NO reperfúziót követő inaktiválódásához, illetve az igen agresszív ONOO té alakulásához [40]. 1.3.3.2. Kapillárisok Az IRnak kitett kapillárisokban megnő az endothel barrier áteresztőképessége, ami a folyadékkiáramlás jelentős fokozódásában nyilvánul meg [2;41]. A kapilláris dysfunctio másik eleme, az átáramoltatott kapillárisok számának csökkenése,

shuntkeringés kialakulása . Ez utóbbi jelenség még inkább egyenlőtlenné teszi az interstitialis oedema miatt már károsodott szöveti perfúziót. Feltételezik, hogy az NO csökkent hozzáférhetőségének szerepe van a barrier funkció elégtelenné válásában [37]. Az NOszintáz (NOS) kísérletes gátlásával normál kapillárisok filtrációja is növelhető, ami arra utal, hogy a NOdeficitnek patológiás körülmények között is jelentősége lehet [38].

Mikr o embolia

5. ábra: Kapillárisok szerepe a reperfúzióban

Számos IRnak kitett szervben leírták az átáramoltatott kapillárisok számának a csökkenését és az ebből eredő szöveti hypoxiát. Ennek másmás oka lehet az egyes

20. oldal

.


.

szövetekben. A májban a fenti stimulusra aktivált, nehezen deformálható fehérvérsejtek, megduzzadt, részben levált endothelsejtek és a lumenbe türemkedő Kupffer sejtek képeznek áramlási akadályt a sinusoidokban, nyomásgrádienst okozva a sinusoidalis postsinusoidalis oldalon. Ismerve azt a tényt, mely szerint a Dissetér két oldalán a sinusiodokban a fenesztrált endothelek miatt a fehérjekoncentráció, illetve az ezzel összefüggésben álló onkotikus nyomás azonos, így minimális nyomáskülönbség hatására is jelentős mennyiségű folyadékfiltráció indul meg. Ezt bizonyítják azon korábbi kísérletek is, melyek szerint az izolált perfundált anoxiás patkánymáj ascitest termel, melynek mennyisége az ischaemia hatására többszörösére fokozódik [2;41]. Ezt követően

a

postcapillaris

venulák

területén

megnövekedett

fehérje

és

folyadékkiáramlás kapilláris kompresszióhoz vezet, csökkentve ezáltal bennük a véráramlást. A filtráció ilyen mértékű növekedésében már a gyulladásos endothel károsodásnak is szerepe van. A leukocyták kitapadása, valamint aktiválódása mindkét mechanizmus során kulcsfontosságú. A különbség inkább abban nyilvánul meg, hogy a mechanikai akadály, vagy a szuperoxid termelés és a lokális gyulladás kape nagyobb szerepet az obstructio létrehozásában, ami a véráramlás újraindulását tovább késlelteti. A fent ismertetett kapilláris dysfunctio „noreflow” jelenségként vált ismertté az irodalomban. Fontosságát az adja, hogy a reperfúzió során továbbra is fenntartja az ischaemiáshypoxiás állapotot, ráadásul teljesen kiszámíthatatlan eloszlásban és rosszul megjósolható ideig (5.ábra). 1.3.3.3. Venulák Az érterület válaszreakciójára jellemző a leukocyta adhézió, aktiválódás és migráció, a thrombocyta aggregáció, valamint az albumin fokozott extravazációja [40]. Az IRhoz kapcsolódó gyulladásos válaszreakció jelentős része ezen az mikrocirkulációs szakaszon zajlik. Az interstitiumban mindenkor jelen lévő macrophagok és hízósejtek, ischaemia alatt a kapillárisok környékére vándorolnak, aktiválódnak és mediátorokat szabadítanak fel. Ezek diffúzió útján jutnak el az endothelsejtekhez, ahol erősítik az beinduló gyulladásos kaszkádot. A folyamat egyik meghatározó lépése, az aktivált leukocyták migrációja az érfalon keresztül. Ebben az eseménysorban számos adhéziós molekula részvételére van szükség, mind az endothelsejtek, mind pedig, a leukocyták részéről [40;42]. Első lépésként a

21. oldal

.


.

marginalizálódott neutrophilek és az endothelsejtek között Pselectin segítségével laza kapcsolat alakul ki, amely még nem gátolja a görgést (ún. rolling). Az érpályából való kilépést megelőzően stabil kapcsolat jön létre [43], melyben a neutrophilek β2 integrinje az endothelialis intercellularis adhéziós molekulák 1es típusához (ICAM1) kapcsolódik [42]. Az ICAM1 kis mennyiségű konstitutív expressziója fennáll az endothelsejtekben, de fiziológiás körülmények között legtöbbjük felszínéről teljesen hiányzik, vagy nem hozzáférhető. Lokális gyulladásos reakció hatására azonban, rapidan megemelkedik, majd a gyulladás progressziója során „upregulálódik” az ICAM1 expressziója [43], ami további fehérvérsejtek (monocyták, eosinophilek, lymphocyták) toborzásához vezet. Az ICAM1 expressziója, kisebb mértékben ugyan, de a nem ischaemizált májlebenyekben is megemelkedik, mely arra enged következtetni, hogy az indukcióban szisztémásan ható mediátorok játszanak szerepet, melyek az aktivált Kupffer sejtek, illetve endothelsejtek termékei lehetnek [25]. Szabadgyökök a postcapillaris venulák területén, tehát több forrásból is felszabadulnak, ezért az oxidatív stresszhatás itt a legintenzívebb. Az endothelsejtekből felszabaduló szuperoxid (O2 ˙) és hidrogén peroxid (H2O2) kialakulásában szerepet játszó egyik legfontosabb enzim a xantin oxidáz (XO). (ld. később) Az IR hatására megnövekedett vascularis permeabilitás fokozódás a venulák területén, az egész kérdéskör legszerteágazóbban vizsgált eleme. Kialakulásának alapja az endotheliális barrier elégtelensége, mely a plazmafehérjékre nézve nagymértékben megnövekedett áteresztőképességet jelent. Természetesen a dysfunctio ezen eleme is szervesen kapcsolódik a gyulladásos reakció többi részéhez. Kísérletes adatok vannak arra, hogy az albuminkilépés mértéke egyértelműen korrelál az odavándorló, valamint kitapadó fehérvérsejtek számával, tehát a terület leukocytaforgalma határozta meg a kialakuló interstitialis oedema mértékét [44]. Az összefüggések szorosságának további bizonyítékai azok a kísérletek, melyekben az endothel ODFR termelését, illetve a leukocyták kitapadását gátló kémiai anyagokkal a permeabilitás fokozódása is mérsékelhető volt [38]. 1.3.4. A reper fúzió dinamikája Vizsgálatok alapján egyértelművé vált, hogy szövettípustól és szerkezettől függően másmás dinamikával, de általánosságban hasonló időbeli lefolyással jön létre sejtpusztulás. Különbség van azonban a pusztán ischaemiás és az ischaemiás

22. oldal


.

.

reperfúziós körülmények okozta sejtpusztulások dinamikája közt. A kezdeti azonos mérvű sejtpusztulás, egy, szövetenként változó hosszúságú idő után exponenciális növekedést mutat. Ugyanezen rendszerben a reperfúziós periódus, az oxidatív és nitrózativ stressz következtében ugrásszerű sejtpusztulást eredményez, majd ezt követően, a védelmi rendszerek jótékony aktivációjának eredményeként egy platófázist ér el (6. ábra). Az egyes Is ch ae m ia

sejttípusok

Is ch ae m ia + Re p e r ú zió

ischaemiás

reperfúziós érzékenységében Sejtpusztulás %

leírt különbségek, elsősorban a

létrejövő

elváltozások

mértékében és nem annyira az elváltozás típusában mutat koznak meg. A leginkább

m in

6. ábra: A sejtpusztulás dinamikai különbségei ischaemia és IR során

szélsőséges

eltérések

két

szövettípus

között

a

reperfúziós károsító hatások intenzitásában jelennek meg, mely alapvetően a jelenlévő

sejtféleségek tulajdonságaitól és arányától függ, de folyamatot mégis ugyanazok a mechanizmusok képezik. Különösen érvényes ez a reperfúzió utáni 0,5 4 óra eseményeire, melyek az IR károsodás korai fázisának tekinthetőek. Az ilyenkor felszabaduló, ún. korai, lokális mediátorok teremtik meg a késői (az IR után 624 óra múlva kialakuló) károsodás alapját, amikor már a gyulladásos folyamatok dominálnak. Ebben a fázisban a vérpályából kilépő leukocyták, tehát az odavándorló sejtes elemek, játszanak meghatározó szerepet. Mivel a gyulladás kaszkádjellegű folyamatsor, a reakció mértékét a korai mediátorok mennyisége lényegesen befolyásolja.

1.4. Az ischaemiásr eper fúziós kár osodás effektor mechanizmusai 1.4.1. Oxidatív és nitrózatív stressz A szabadgyökök (ODFR vagy ROS) – egy vegyértékkel rendelkező molekulák vagy molekulafragmentumok – külső elektronhéjukon párosítatlan spinű elektront

23. oldal

.


.

tartalmaznak, melyek rendkívül hajlamosak a párképződésre. A szabadgyökök instabilak, és igen reaktívak, az általuk elindított reakciók nem enzimatikus láncreakciók. A szabadgyökök féléletideje igen rövid, szinte azonnal reakcióba lépnek a szervezetben található makromolekulákkal. Reaktív oxigéntartalmú szabadgyökök a szervezetben élettani körülmények között is keletkeznek kis mennyiségben. Az igen reaktív gyököket antioxidáns enzimek és antioxidáns anyagok folyamatosan inaktiválják.

Oxidatív

stressznek

nevezzük azt az állapotot, amikor aktuális szabadgyök antioxidáns

arány

megnövekszik.

A

kontrollmechanizmus kiszabadult

alól

szabadgyökök

megtámadhatják a tiol, és amintartalmú 7. ábra: ODFR koncentráció változása ischaemia és reperfúzió során

peptideket.

Különösen érzékenyek azok a fehérjék, funkciós

melyek

szabad csoporttal

rendelkező aminosavakat tartalmaznak. A makromolekulák ennek következtében polimerizálódhatnak, aggregálódhatnak, fragmentálódhatnak, így az enzimfunkcióval rendelkező fehérjék inaktívvá válhatnak. A szabadgyökök kifejezett DNSkárosító hatással is rendelkeznek. A DNS károsodása létrejöhet a cukorrészen, ami egyértelmű láncszakadáshoz vezet, a legjellemzőbb károsodás az egyszálú lánctörés, amely különféle repair komplex, így a PARP (poly(ADPribóz) polimeráz, (ld. később) aktiválásával jár, mely eredményeként a sejtek apoptotizálnak vagy nekrotizálnak. A telítetlen kettős kötéseket tartalmazó lipidek, koleszterin és zsírsavak oxidatív bomlása, illetve a beinduló autokatalitikus lipidperoxidáció kapcsán megváltoznak a membránok permeabilitási tulajdonságai A lipidperoxidok a légzési láncot is károsítják [45;46]. IR alatt keletkező ODFRk fő forrása a xantinoxidáz, illetve a mitochondriális légzési lánc, főként az I. komplex [45]. ODFR szintjének kis emelkedése figyelhető meg ischaemia alatt, míg a keringés helyreállításának harmadiknegyedik percében

24. oldal


.

.

óriási mennyiségű ODFR keletkezik (7. ábra). A jelenség a „respiratory burst” [36;45;46], mely reakciói energiaigényes folyamatok. Ezen killing mechanizmusok során a phagocyták oxigénfogyasztása a sejteket ért stimulus hatására hirtelen megnő. E fokozott légzés nem gátolható cianiddal, ami arra utal, hogy benne a mitochondrialis oxigénfogyasztáson túl más mechanizmusok is szerepet játszanak [47], a folyamatban O 2 –anion szabadul fel [48;49]. A fenti mechanizmusban résztvevő enzimek: NADPH oxidáz, L és Daminosav oxidázok, mieloperoxidázhidrogénperoxidhalid rendszer. A tökéletlenül redukált oxigénszármazékok közé tartoznak a következő molekulák: (1) O 2 •–

szuperoxid anion; enzimatikus, és nem enzimatikus úton is keletkezik; (2) OH •

hidroxilgyök; természetes (kozmikus sugárzás), vagy mesterséges (gammasugárzás) hatására víz hasításával képződik; (3) NO: nitrogénmonoxid; melyből ONOO peroxynitrit képződhet. (4) A spontán és enzimatikus úton keletkező, de a fenti definíció szerint nem szabadgyök az igen reaktív H 2O 2 (hidrogén peroxid), kémiai reaktivitása és szabadgyök prekurzor tulajdonsága miatt a szabadgyökök közé soroljuk. 1.4.1.1 Szabadgyökök keletkezése ODFRk keletkezhetnek mind (A) nemenzimatikus, mind (B) enzimatikus, spontán reakciók hatására. Ezen fejezet részletes megbeszélése a kísérleteim során felhasznált metodikai lépések megértése miatt elengedhetetlen. (A) ODFRk képződése nem enzimatikus úton: A folyamatban a vas atom fontos szerepet játszik. Különböző Fe 2+ komplexek, így nukleotid Fe 2+ komplexek (pl. ADP Fe 2+ ) oxigénnel reagálva hoznak létre tökéletlenül redukált oxigénszármazékokat. A belélegzett levegő O2je 13%ban O2 •– ná alakul, mivel a légzési láncban a normális körülmények között is képződik szuperoxidanion. Fő képződési helye a koenzimQ (I. komplex), itt termelődik az összes szabadgyök mintegy 2/3 része. Az emlősök mája megközelítőleg 24 nmol O2 •– /min/g mennyiségben képez szuperoxidaniont. A mitochondrium O2 •– „steady state” szintje 10 11 M a szuperoxid dizmutáznak köszönhetően. A „normális” O2 •– termelés évente kb. 2 kg [50]. (B) ODFRk képződése enzimatikus úton: Enzimatikusan O2 •– és H2O2 termelődhet. · Fagocitózisra képes sejtekben található, cianiddal nem gátolható NADPHoxidázt, oxigénfogyasztása a respiratory burst során hatszor több mint a többi oxidázé. Ischaemiareperfúzió során a NADPHoxidáz aktivitásának növekedését figyelték meg.

25. oldal

.


.

· Hypoxiában az ATPből ADP, majd xantin keletkezik, amely reakciót a FAD tartalmú xantinoxidáz (XO) katalizálja [51]. Ennek a reakciónak mellékterméke O2 •– és H2O2. Az enzim nagy mennyiségben található az endothelsejtekben, ahol hypoxia, illetve ischaemia hatására a xantindehidrogenáz xantinoxidázzá alakul át [37]. A hypoxia során az ADP lebontása is bekövetkezik, amely reakciósor végtermékeként

hypoxantin halmozódik fel. A XO szubsztrátjaként az enzim nagy mennyiségű O2 •– termelését teszi lehetővé, amikor a reperfúzió során hozzáférhetővé válik a működéséhez szükséges O2. A XO elsősorban a reperfúziót követő első percekben felelős az ODFR termeléséért, addig, amíg vissza nem nyeri dehidrogenáz funkcióját. Az ezt követő, jóval nagyobb mértékű oxidatív stressz forrása a sok kitapadó, aktivált fehérvérsejt. A XO aktivitása és az adhézióra képes fehérvérsejtek toborzása közötti kapcsolat bizonyítottnak látszik, tehát az XOnak mintegy iniciátor szerepe van a folyamatban, így ennek allopurinollal való gátlása kedvező hatású lehet [2;34;37;38]. · Prooxidáns enzimnek tartják a konstitutív és indukálható izoformával rendelkező nitrogénmonoxidszintázt (NOS). A nitrogénmonoxid (NO) rövid féléletidejű jelátviteli molekula, melyet ereken kifejtett biológiai hatása miatt először EDRFnek (endothel derived relaxing factor) nevezték. A NOt az endothelsejtek termelik, és a vascularis simaizomsejtek relaxációját okozza: IC cGMPszint növelését követő protein kináz G (PKG) aktiváción át IC Ca 2+ szint csökkentéssel. A NO szintézise enzimatikus úton történik Largininből a NOszintáz (NOS) által katalizált reakcióban. Az enzimnek több izoformája ismert: (1) konstitutív formája van jelen, mely a bazális NO szintézist biztosítja pl. eNOS = endothelialis NOS. (2) Sokkal aktívabb indukálható NOS (iNOS) különböző jelátviteli utak hatására expresszálódik. Az enzim szintéziséhez kb. 68 órára van szükség, így az IR károsodás korai szakában nem játszik szerepet [52;53]. Ezt követően viszont 2448 órán keresztül fennmarad aktív formában és nagy mennyiségű NO termelésére képes. Az IR során a NO aktuális biológiai hozzáférhetősége mind a mikrocirculációra, mind a gyulladásos válaszra hatással van [54]. Ischaemia alatt az endothelsejtekben lecsökken a NO szintézis kofaktorainak (O2 és NADPH) a szintje. Ezzel egyidejűleg fokozódik az argináz aktivitása és lebontja a szintézishez nélkülözhetetlen Larginint. Az eNOS tehát, a postischaemiás szövetekben még gátolt állapotban van, amikor a reperfúzió során hirtelen megemelkedik a szuperoxid termelése a respiráció újraindulása

26. oldal


.

.

következtében [52]. Normál körülmények között a NO termelődése jóval meghaladja a szuperoxidanion termelődés mértékét. Ez a két reaktív molekula igen nagy affinitással, nem enzimatikus úton reagál egymással: NO + O2 •–

→ ONOO – . A képződött

peroxynitrit (ONOO – ) kifejezett citotoxikus hatással rendelkezik [55]. Annak ellenére, hogy a peroxynitrit az egyik legagresszívebb szabadgyök, fiziológiás körülmények között az antioxidánsok semlegesítik és nem ér el toxikus koncentrációt [56]. Kísérletek bizonyítják az exogén NOdonorok protektív hatására. Ugyanakkor ismeretes, hogy a későn (kb. 6 órával a reperfúzió után) adott NOdonorok, a károsodást növelték. Ez azzal magyarázható, hogy ekkorra már bekövetkezik az iNOS termelése és ez az aktivitás a donorokkal együtt a NO koncentrációt toxikus mértékben megemeli [54;56;57]. Az ún. kettős hipotézis: eszerint az alacsony NO szint – amit a sinusoidális endothelben az eNOS termel – protektív a májsejt necrosis és apoptózis ellen, továbbá fenntartja a szöveti perfúziót. A magas NO szint – amit a hepatocytákban lévő iNOS termel – kompenzatorikus és proapoptotikus hatású [55] . 1.4.1.2. Szabadgyökök eliminációjáért felelős mechanizmusok (A) ODFReliminálás enzimatikus úton: ·

A mitochondriumokban és microsomákban megtalálható szuperoxiddizmutáz

(SOD) a szuperoxidanionok semlegesítését végzi: O2 •– + O2 •– + 2 H + → H2O2 + O2 . [58] A keletkező H2O2–ból Fe 2+ jelenlétében OH gyökök keletkezhetnek, mely gyökök ellen közvetlen enzimes védekezés nincs, a szervezet úgy védekezik a hidroxilgyökök ellen, hogy prekurzorát, a hidrogénperoxidot eliminálja. · Az említett H2O2 eliminálásában játszik szerepet a peroxiszómák 40%át adó, haemtartalmú enzim, a kataláz: 2 H2O2 → 2 H2O + O2 · A H2O2ot, és a lipidperoxidokat a peroxidáz enzim vízzé redukálja. A szelén tartalmú glutationperoxidáz esetében az elektron/hidrogén donor a glutation, mely a sejtek redoxstátuszában szulfhidril pufferként viselkedik. A glutation két formában van jelen a sejtekben, a redukált tiol formában (GSH) és az oxidált formában (GSSG), amely egy diszulfidkötéssel összekapcsolt két tripeptidből áll. A GSSGt a glutation reduktáz redukálja GSHvá. GSH/GSSG arány a sejtekben több mint 500. (B) ODFReliminálás nem enzimatikus úton: Felsorolás szintjén: Evitamin: A lipidperoxidáció gátlómolekulája. 1 molekula Evitamin kb. 1000 lipidmolekulát képes

27. oldal

.


.

megvédeni a lipidperoxidációban [5;59]. Cvitamin: lánctörő antioxidáns. A Cvitamin az Evitamin koantioxidánsa. A mitokondriális ubikinon (koenzimQ, CoQ) redukált formája (az ubikinol) fontos antioxidáns [6062]. Flavonoidok: silymarin, mely kiváló antioxidáns hatású, növeli a lymphocyták SOD aktivitását.[6;63] Glutation (GSH): A máj igen fontos a GSH szintézisben, ahol egy komplex, ciszteint, glutamátot és glicint is, mint köztiterméket, magába foglaló bioszintetikus út ér véget. Külön említést érdemel a glutamin (Gln): A glutamin protektív hatása a csökkent szabadgyökprodukción keresztül valósul meg. A májban a glutamin, a GSH bioszintézisében esszenciális fontosságú. A GSH szintézisének egyik lehetősége a májban lejátszódó aminosavtranszportfolyamatokkal függ össze. A gammaglutamil ciklus során a redukált GSH (glutamilciszteinglicin) glutamil gammakarboxil csoportja és egy transzportálandó aminosav aminocsoportja között kötés jön létre a sejtmembránban, és így egy külső aminosav a sejt citoszoljába kerül, ahol aztán felszabadul. A ciklus további része a hidrolizált GSH reszintézisét szolgálja. Egy ciklus végbemeneteléhez 3 ATP szükséges. A folyamat egyrészt aminosav sejtszintű felvételét és másrészt az antioxidáns glutation szintézist szolgálja. Kísérletek igazolták, hogy a glutaminban gazdag enterális táplálás eredményeként a NO szintézis csökkent, ezáltal csökkent a nitrózativ stressz. A glutamin önmaga nem gátolja a NOSt, de a glutamin metabolizmus, még nem pontosan ismert úton, dózisdependens módon befolyásolja az endothelialis NO produkciót [64]. A glutamin, a fentiek mellett az apoptózisban is fontos szerepet tölt be [65]. 1.4.2. A lokális gyulladásos reakció résztvevői 1.4.2.1. Leukocyták A leukocyták I–R károsodásban betöltött szerepéről már részben szóltam a microvascularis dysfunctioval, illetve a szabadgyök képzéssel kapcsolatban. Az általuk kiváltott hatások és a belőlük felszabaduló mediátorok, illetve enzimek a gyulladásos reakció szerves részét képezik. A leukocytákat számos kemotaktikus anyag vonzza a károsodás területére. Közülük sejtes eredetűek a LTB4, a PAF, az IL–1, a TNFα és az IL–8, valamint különböző sejtvonalak növekedési faktorai. A plazma eredetű a komplement kaszkád elemei: C3a, C4a és C5a. Az említett vegyületek hatására az aktivált neutrophilek szuperoxidot és hidrogénperoxidot termelnek, illetve myeloperoxidázt szekretálnak: OCl + H2O2 → Cl + H2O + 1 O2

28. oldal

.


.

Több lépéses folyamat teszi lehetővé a neutrophileknek a sinusoidális endothelsejtekhez való adhézióját. Az Lselectin hatására a neutrophilek megtapadnak lassú, érfal melletti szoros áramlás jön létre, majd sejtadhéziós β2integrin receptorok upregulálódnak. A aktivált neutrophilek a lassan gördülőnek (rolling) az érfalon. A β2 integrin ligandja az endothelialis ICAM1 (intercelluláris adhéziós molekula1). A molekulák kapcsolódásával a neutrophilek kitapadnak, migrálódnak [66]. Az ICAM1 emelkedett expresszióját normál epitheliális és endotheliális cytokinek (TNFα, IL1) indukálják [67], így nem meglepő, hogy az IR emelkedett ICAM1 expresszióval jár [68]. A folyamat eredménye: leukostasis azaz a fehérvérsejtek lassult keringése, mely akadályozza a mikrokeringést. A kitapadó fehérvérsejtek nem tömeszelik el teljesen a sinusoidealis keringést, azonban az áramlásuk lelassulása nagyban hozzájárul a reperfúzió utáni mikrokeringés elégtelenségének (noreflow jelenség) kialakulásához. 1.4.2.2. Kupffer sejtek 1876os felfedezésük (von Kupffer) óta tudjuk, hogy a májsinusoidokban elhelyezkedő Kupffersejtek teszik ki szervezetünk szöveti macrophagjainak legnagyobb hányadát [69]. Aktiválódásukkal nagy mennyiségű gyulladásos mediátort és szabadgyököt termelnek. A reperfúzió során észlelt aktivációjuk jeleit elektronmikroszkópos vizsgálatokkal tették láthatóvá [70], amelyek összefüggést mutattak a májparenchyma károsodásával. Gadolíniumkloriddal – Kupffersejt inhibitorral – előkezelt patkánymájak IR károsodása csökken [70]. A Kupffersejtek és az endothelsejtek sokkal ellenállóbbak a hypoxiára , mint a hepatocyták, míg a reperfúzió az endothelsejtek károsodást jobban fokozza, a nyugalomban lévő Kupffer sejteket és a hepatocytákat kevésbé [7]. 1.4.2.3 Citokinek Az ischaemiareperfúzió során egy komplex gyulladásos kaszkád aktiválódik, melynek indukálásában és fenntartásában fontos szerepet játszanak a citokinek (TNFa, IL1, IL6). Lokális gyulladást elősegítő hatásuk fokozottan érvényesül az IR során megjelenő mikrocirkulációs zavar hatására. A csökkent véráramlás miatt a citokinek kimosódása a szövetből csökken, így nagy koncentrációt érnek el a károsodott szövetben. A tumor necrosis factoralpha (TNFα) és az interleukin1 (IL1) a két legfontosabb proinflammatikus citokin az IR károsodás patogenezisében. Mindkét

29. oldal

.


.

citokin indukálja a kemotaktikus hatású interleukin8 (IL8) szintézisét [11] és fokozza az adhéziós molekulák (pl. Lszelektin, βintegrin) expresszióját. Kísérleteim szempontjából kiemelendő a Tumor Necrosis Factoralpha (TNFα) számos immun és nemimmun sejtben termelődik. A TNFα és β közös molekulacsaládba tartozik; a TNFα 25 kDa molekulatömegű II. típusú sejtmembránfehérjeként szintetizálódik, amiből proteolitikusan hasad le a 17 kDa méretű szekretált forma, amely stabil homotrimereket alkot. A TNFα elsősorban aktivált macrophagokból, a TNFβ (más néven limphotoxinα – LTα) pedig aktivált T sejtekből származik. A TNFαt először tumorsejteket ölő és általános leromlást (cachexiát) okozó hatása alapján írták le (ez utóbbi miatt „kahektin”nek is nevezték). Máj IR során a TNFα elsődleges forrásai a neutrophil és Kupffer sejtek. A kialakuló gyulladásos válasz indukciójában van fontos szerepe a TNFαnak, mivel koncentrációja gyorsan növekszik a károsodott szervben, és sok más citokin termelését fokozza (IL1, IL6, IL8). A TNFα nagyon erős kemotaktikus hatással rendelkezik, és szabadgyökök termelését fokozza. A sinusoidealis endothel és a neutrophil sejtek közötti kapcsolatok száma növekszik TNFα jelenlétében, mivel az adhézióban jelentős ICAM1 és Eszelektin expresszióját segíti elő. 1.4.3. Nitrogénmonoxid endothelin egyensúly Korábban említett vazodilatátor, prooxidáns prekurzor NO molekula keletkezésére, tulajdonságaira hivatkozok a fenti fejezetre (1.4.1.1 ODFRk keletkezése), itt csupán a mikrocirkulációs zavarban betöltött hatásáról szóló evidenciák kerülnek ismertetésre. A NO koncentráció a reperfúzió első 46 órájában alacsony. Ez az ischaemiás szakasz után megfigyelhető alacsony kofaktor (O2, NADPH) szint, valamint az argináz enzim jelentős mennyiségének felszabadulása miatt következik be. Igazolja ezt, hogy orthotopicus májtranszplantáció során a máj reperfúziója után közvetlenül nagy mennyiségű argináz szabadul fel a graftból, amely 30 perccel a reperfúzió beállta után az Larginin szintjének csökkenését vonja maga után [71]. Nem valószínű, hogy szignifikáns NO produkció a reperfúziót követő első 6 órán belül bekövetkezik, mivel ehhez az iNOS indukciója szükséges, amely 46 órát vesz igénybe [72]. Ennek következtében – farmakológiai értelemben – a máj hasznot húzna az exogén NO koncentráció emeléséből a reperfúzió korai szakaszában. Bizonyítják ezt azzal is, hogy

30. oldal

.


.

állatmodellben az iNOS gátlása jelentős májkárosodást okozott [73]. Az exogén úton bejuttatott NO hatása időfüggő (ld. 1.4.1.1. fejezet) [74]. Az endothelin–1 (ET1) vasokonstriktor, hatását a simaizmokon található, kizárólagosan érszűkületet okozó ETA receptoron és különböző sejteken található, változatos hatású ETB receptorokon fejti ki. Az ETB receptor két izoformája ismeretes: az ETB1 receptor az endothelsejtekben az eNOS serkentésén keresztül relaxációt okoz, amíg az ETB2 vasokonstrikciót. Az ET1 sinusoidon kívül is hat, azonban a sinusoidok belseje a fiziológiásnál jóval alacsonyabb koncentrációra is érzékeny [75]. Az endothelin (ET) a májreperfúzió korai fázisában a plazmában és a májparenchymában is emelkedett koncentrációt mutat, ami korrelál a csökkent májáramlással [76]. Egy IR patkánymodellben bosentannal (ETreceptor antagonista) előkezelt állatok mérsékelt károsodást mutattak, hasonlóképpen mint exogén NO bevitelkor [77]. Más vizsgálatokban azt találták, hogy az endothelin1 dózisdependens módon okozza az Ito sejtek aktivációját – vasokonstrikciót eredményezve, addig a nitroprussid–Na ezek inaktivációját okozza [35], így feltételezhető, hogy az IR károsodás az ET és a NO egyensúlyának felborulása miatt következik be a reperfúzió alatt [77].

1.5. Sejthalál: necr osis vagy apoptózis Az IR károsodás számos reakciósor egymásba kapcsolódó láncolata. A szabadgyökök megjelenése, a pH eltolódása, noreflow jelenség, illetve a gyulladásos válaszjelenség kialakulása számos mediátor részvételével határozza meg a károsodott sejtek további sorsát: túlélés vagy sejthalál. Az irodalomban az elmúlt évtizedben egyre szélesebb körben jelentek meg közlemények, melyek szerint a májban lejátszódó anoxiát követő reperfúzió után nem csupán az energiadeficitből adódó sejtelhalás, necrosis, hanem programozott sejthalál, apoptózis is előfordul. Ezen fejezet hivatott bemutatni ezen jelenségek patofiziológiáját, ezzel könnyebb érthetőséget biztosítva a kísérletes modell eredményeihez. 1.5.1. Necrosis ischemiásreper fúziós károsodások kapcsán Az ischaemiában megjelenő hypoxia eredményeként a szövetekben csökken a mitochondriumok által termelt ATP szint. Ez a sejtek és a mitochondrium duzzadásához, gömbölyűvé válásához, az endoplazmatikus retikulum dilatációjához, majd végül a plazmamembrán protrúzióból létrejött ún. „bleb”ek kialakulásához vezet

31. oldal

.


.

[78;79]. A „bleb”ek megjelenése egyértelműen az ATP hiány következtében kialakult megváltozott sejtvolumen és a cytoskeleton architektúrájának felborulásából fakad. Egy rövid ideig tartó anoxia/ischemia után jött reperfúzió a blebképződés gyors megszűnéséhez vezet. A sejthalál előtti pillanatban a hepatocyták és a sinusiodalis endothel sejtek metastabil állapotba kerülnek, mely jellemzői: a mitochondrialis permeabilitás növekedése, a lysosomák disruptioja, a „bleb”ek növekedése és egybeolvadása, sejtduzzadás, illetve az anionos komponensek szivárgása. Ezzel egyidőben a fokozott intracelluláris Ca 2+ beáramlás tovább súlyosbítja a mitochodriumok működését [80]. Az anionok megnyílt csatornákon való kiáramlása vezet további sejtduzzadáshoz, majd a „bleb”ek, ezzel a sejtmembrán, majd így sejt ruptúrájához. A fenti vacuolizációval, kariolysissel, majd gyulladásos jelenségekkel járó folyamatot necrosisnak, újabb nomenklatúrák szerint oncosisnak, oncotikus necrosis nak nevezzük [81]. A sejtes elemek extracelluláris térbe való kilépése gyulladásos válaszjelenséget indít meg a reperfúzió alatt. Ezt követően a későbbiekben macrophagok bekebelezik a sejtfragmentumokat és sarj, majd kötőszövet foglalja el az érintett területet. 1.5.2. Az apoptózis Az apoptózisban résztvevő sejteket morfológiájuk alapján különböztetjük meg [82]. Az apoptózis klasszikus jelei: a sejt zsugorodása, a sejtmag kondenzálódása, a kromatin marginalizációja, a mag és a citoplazma apoptotikus testecskékben (apoptotic body) való fragmentációja, melyeket a környező sejtek fagocytálnak. Az apoptózis eredeti definíciója szerint az apoptózisban részt vevő sejtek citoplazma organellumai az egészségeshez hasonló morfológiát mutatnak, szemben a necrosissal. Ugyanakkor az utóbbi időben tanulmányok számolnak be arról, hogy az apoptózis folyamatában a mitochondriumok megduzzadnak, az endoplazmatikus retikulum struktúrájában változások állnak be [83]. Ugyanakkor fontos jelenség, hogy az apoptózist nem kíséri gyulladásos válasz. A degradálódott sejteket a környező phagocytosisra alkalmas sejtek távolítják el, következményes gyulladás nélkül. Elmondható továbbá, hogy az apoptózis jelensége inkább izolált sejteket érint, ritkábban egyes véletlenszerű sejtcsoportokat, de egyértelműen nem összefüggő területeket, mint a necrosisban. Előfordul az is, hogy az apoptózis programjába belépő sejt nem megy végig a fenti úton. Egy következményes, másodlagos necrosis lép fel, mely gyulladásos jelenségekkel kísért (ld. necrapoptozis).

32. oldal

.


.

1.5.2.1. A hepatocellularis apoptózis mechanizmusa Az apoptózis mechanizmusában a két legfontosabb jelátviteli út ismert: (A) külső, ún. halálligand halálreceptor út, valamint a (B) belső, ún. mitochondriális út. (A) I. típusú, extrinsic vagy halálligandhalálr eceptor út A halálligandok (pl.: TNFα, Fas ligand) olyan cytokinek, melyek specifikus receptoraikhoz kapcsolódva elindítják az arra érzékeny sejtek apoptózisprogramját. Ilyenkor instruktív apoptózisról beszélünk. A TNF két ismert receptora TNFRI és a TNFRII az apoptotikus folyamatok indukálásában van szerepe. A halálreceptorok intracitoplazmatikus részükön haláldomént tartalmaznak a jelátvitel elindításához. Az apoptózis programját a stimulust jelentő ligand és receptorának kapcsolata indítja el. Az intracelluláris haláldoménen keresztül adaptorfehérjék, rajtuk keresztül pedig, iniciátorkaszpázok kapcsolódnak hozzájuk aktivációs komplexet hozva létre. A kaszpázok proteázok, proenzimformában találhatóak a sejtek citoplazmájában. Az apoptózis folyamataiban elsősorban a kaszpáz3, 6, 7, 8, 9 és 10 játszanak fontos szerepet. A leggyakoribb iniciátorok a kaszpáz8 és 9, míg a végrehajtásban a kaszpáz 3é a legfontosabb szerep [84]. (B) II. típusú, intrinsic vagy mitochodrialis út Amellett, hogy az apoptózishoz szükséges energiát a mitochondriumok szolgáltatják, részt vesznek az apoptózis megindításában is. Általánosságban elmondható, hogy a hepatocytákban a II. típusú, mitochondriumokon keresztül lejátszódó apoptózis indul meg gyakrabban. Általában olyankor kell a mitochondrialis út iniciátor szerepével számolni, amikor DNSkárosodás miatt jön létre az apoptózis. Ezen az úton a receptorligand kapcsolódás után aktiválódó kaszpáz8 fragmentumok a Bcl2 családba tartozó Bid fehérjéhez kötődnek, aktiválva ezzel azt (tBid), és így megteremtik a mitochondrialis transzlokáció feltételeit. Ezt követően a MPTP (mitochondrial permeability transition pore) jelenlétén keresztül egyes molekulák mitochodriális intermembrán térbe való kijutása jöhet létre [85]. Az oxidatív stressz, adeninnukleotid hiány, foszfátszint emelkedés és a mitochondrium depolarizáció érzékenyítik a MPTPt Ca 2+ iránt. A Mg 2+ és pH szint csökkenése antagonizálják a Ca 2+ kötődést, ezáltal a MPTP nyílást. Reperfúzió során viszont fokozza az MPTP nyitás feltételei, mivel ilyenkor néhány percen belül az alacsony pH gátló hatása is megszűnik [86]. Az MPTP nyitás következménye egyrészt, hogy az intermembrán térben

33. oldal

.


.

fenntartható protongrádiens megszűnik, szétkapcsolódik az oxidatív foszforiláció. Másrészt, az MPTPokon keresztül citokrómcn kívül prokaszpázok, IAP (inhibitor apoptózis protein)gátló és egy apoptózis indukáló faktor (AIF) is a citószolba jut (8. ábra). Az AIF hatására a mitochondrium

membrán

depolarizációja, a kromatin állomány

kondenzációja,

hosszanti duzzadása és a plazmamembrán foszfatidil 8. ábra: Az apoptózis szignáltraszdukciója májsejteben. Forrás: Jaeschke H, Gastroenterology. 125(4), p1248; 2003

szerinjeinek a külső rétegbe való áthelyeződése figyelhető

meg, így a sejt környezete felismeri az apoptótikus sejtet. A citoplazmában a citokrómc az ún. apoptoszóma kialakításában vesz részt, APAF1 (apoptosisis activating factor – 1), a prokaszpáz9el együtt, ami ennek aktiválásához vezet, ami kaszpáz3 aktivációt eredményez. A kaszpáz3, mint végső iniciátor, megindítja az effektorválaszban résztvevő enzimek aktiválását, úm: DNázok, transzglutaminázok, proteázok. Érdekes

megfigyelés

volt,

hogy

a

halálreceptorok

által

beindított

szignáltranszdukciók a sejt túlélését is közvetíthetik. A TNFα receptorasszociált factor képes aktiválni az NFκB (nukleáris faktorκB)t, egy olyan transzkripciós faktort, mely számos gén promoteréhez képes kapcsolódni és antiapoptotikus lehetőségnek tekinthető [87]. 1.5.2.2. Az apoptózis kimutatása, szöveti r eakciók Az apoptózis kimutatására használt leggyakoribb módszerek [88]: § Sejtmag morfológia vizsgálat szövettani metszetek és fluorescens festéssel (DAPI, propidium jodid) kimutatható DNS töredezettség § TUNEL (Terminal deoxyribonucleotidyl transferase mediated dUTPdigoxigenin nickend labeling) és ehhez kapcsolódó módszerek (DNS lánctörések in situ kimutatása) § Annexin V (foszfatidilszerin externalizáció kimutatása)

34. oldal

.


.

§ Kaszpázok kimutatása: (1) enzim reakciók; (2) immunhisztokémia speciális antitestekkel; (3) Western blot az aktív fragmetumok növekedésének, illetve a prokaszpáz szint csökkenésének kimutatására § Magfestési eljárások szupravitális festésekkel (trypan blue, propidium iodide) § Mitochondrialis depolarizáció kimutatása (rhodamine 123) § Cytochromc IC kimutatása pl. Western blottal vagy immunhisztokémiával § Proapoptotikus fehérjék (Bax, Bid stb) mitochondrialis transzlokációjának kimutatása. Kiemelendő, hogy az apoptózis során lejátszódó események egymás láncolataként, egyben vizsgálva értelmezhetőek, csupán egyfajta sejtszintű változás nem jelent apoptózist [89]. Úgy tűnik, hogy a kaszpáz3 kimutatás a leghatékonyabb apoptózis

kimutatására , ugyanakkor ismerni kell azt a tényt is, hogy nem minden apoptózisban jelenik meg törvényszerűen. Necrosis során szintén létrejön random módon DNS fragmentáció, mely nem internucleosomalis és túlnyomó többségében nem 190 bázispárnyi. Gélelektroforézissel a fragmentumok nagysága kimutatható. Ugyanakkor, egyes megfigyelések [90;91] szerint a TUNEL reakció nem képes érzékenyen differenciálni az apoptózis jelenlétét, mivel internucleosomalis DNS fragmentációk és a moderált necrosis során létrejött DNS töredezettség hasonló jelenséget mutathat. Összességében elmondható, hogy az apoptózis identifikálására használt legmegbízhatóbb módszer a morfológiai vizsgálat, mely, ha felveti az apoptózis jelenlétét, továbbiakban kiegészíthető a fent említett vizsgálati elemekkel. 1.5.2.3. Az apoptózis májszöveti ischaemiareper fúzió során 1996ban született az első közlemény, mely IR alatt bekövetkezett apoptózisról számol be májban [92]. A kísérletben 60 perces meleg ischaemiát és 24 órás reperfúziót követően növekedett a morfológiai jelek alapján apoptotikusnak tartott sejtek száma. Más tanulmányok TUNEL reakció segítségével bizonyították az apoptózis számának növekedését hepatocytákban humán májtranszplantációkat követően [93]. További, hasonló metodikával készült (TUNEL, elektronmikroszkópia) kísérletekkel igazolták, hogy a hideg IR károsodás után reperfúzió 6. órájában elsősorban a sinusoidealis endothelsejtekben (6080%) jött létre apoptózis [94]. A folyamat indukciójáért elsősorban a Kupffer sejtekből felszabadult mediátorokat (TNFα) tartották felelősnek. A növekvő irodalmi adatok alapján megállapíthatjuk, hogy a májban a meleg IR

35. oldal

.


.

károsodásokat követően a necrosis dominál elsősorban, mely transzamináz eltérésekkel kísért. Ezen állítással szemben, egyes szerzők állítása szerint ischaemia, TNFα indukálta apoptózis a májsejtek 1530%ban jelenik meg, 1020szoros caspase3 aktivációt

eredményezve

[95;96].

Mások,

hasonló

feltételezések

alapján,

kaszpázinhibitorokkal szerzett protektív hatásról számolnak be máj IR során [97;98]. Hideg ischaemiás károsodás (traszplantációs tárolás) kisebb hepatocyta elhalást és csökkent transzamináz felszabadulást okoz, viszont jelentősen fokozódik az endothelsejt pusztulás [91]. Fontos megjegyezni, hogy amíg a necrosis tipikusan összefüggő területeket érint, főként a pericentralis vagy II. zónában, addig az apoptózis individuálisan, sejtenként jelenik meg. Ha nagyobb sejtcsoportok mutatnak összefüggő, apoptózisra jellemző mintázatot, az in vivo létrejött TNFα, Fas aktivációval magyarázható [88].

1.5.3. Necrapoptózis Az apoptózis és a necrosis részben egymástól jól elkülöníthető, részben egymást átfedő jelenség. A MPTP csakúgy, mint az apoptózisban, necrosisban is jelentős szerepet játszik. Ischaemia alatt az anaerob glikolízis és az ATP hidrolízis kapcsán rapidan csökkenő pH erős védőmechanizmus a necroticus sejtpusztulás ellen, szemben a csökkenő ATP szinttel. Ugyanakkor a reperfúzió során a fiziológiás pH visszatér, beindul egy ún. pHdependens sejthalál, melynek központi lépése a MPTP aktivációja, mely 7 alatti pH esetén egyébként gátolt [25;86;99]. Az MPTP aktivációja következtében a mitochondriumban az energiatermelő folyamatok szétkapcsolása jön létre, mely további ATP deplécióhoz, majd sejthalálhoz vezet [86]. Jogosan merül fel a kérdés: hogyan lesz a folyamat vége apoptózis vagy necrosis, ha a központi lépést ugyanaz a molekula (MPTP) irányítja? A válasz az ATP szintben rejlik. Úgy tűnik, hogy a magas energiatartalmú foszfátok koncentrációja határozza meg az utat az apoptózis és necrosis között. Amikor a reperfúzió egyszerre jár ATP deplécióval és MPTP aktivációval, akkor az apoptózis szignálútjai gátlódnak apoptosoma szinten és necrosis következik be (necrapoptózis). Azon esetben, ha a glikolízis szubsztrátjai elérhetőek és elegendő koncentrációban vannak jelen, nem következik be ATP depléció és következményes necrosis. Ehhez, a normoxiás májsejteknek körülbelül 10 % „szabadATP” koncentrációval kell rendelkezniük. Ezért az az ATP szint (1520 %a a

36. oldal

.


.

normoxiás sejt ATP tartalmának), mely elegendő a necrosis kivédésére, már több mint elég a cytochrom c–dependens kaszpáz aktivációhoz. [100]. Ugyanakkor a klasszikus apoptózis folyamata necrosisba fordulhat, ha a fogyatkozó ATP szint miatt zavar keletkezik a plazmamembrán barrier funkciókban. Így az apoptózist egy secunder necrosis követi [101]. Ezen fenomén leírására született a necrapoptozis vagy aponecrosis kifejezés, mely jól tükrözi, hogy a folyamatok egymásba konvertálódhatnak. Közös pont a folyamatban az MPTP aktiváció, mely ATP dependens módon irányítja a folyamatot. 1.5.4. Az IP és az apoptózis Az ischaemiás preconditionálás és az apoptózis összefüggése nem egyértelmű. Tények alapján elmondható, hogy a NO csökkenti az apoptózist az endothelsejtekben [102]. Kísérleti modellben, parciális májischaemia előtt alkalmazott IP gátolta az apoptózis kialakulását hepatocytákban és sinusiodealis endothelsejtekben. A jelenséget a kaszpáz–3 inaktivációjával hozták összefüggésbe [103]. A kapcsolat az IP és a kaszpázok csökkent aktivitása közt csupán spekulatív. Kimutatták, hogy a NO kaszpáz gátló hatással rendelkezik in vitro. Ezen elképzelés szerint [104] a NO antiapoptotikus hatása a megnövekedett cGMP szinttel, a Bcl2 upregulációjával, illetve fokozott HSPs termeléssel lenne kapcsolatban [105]. Fentiek alapján vélhetően a májban az IP antiapoptotikus hatása NO mediált.

1.6. A PARP fiziológiás és patológiás szer epe az IR kár osodásban A poli(ADPribóz) polimerázok (PARPok) számos sejtfunkció regulálásában vesznek részt. A sejtmag enzimjeinek nagy részét a PARP molekulák teszik ki. Számos izoformáját leírták, a sejtben a legnagyobb mennyiségben PARP1 izoforma fordul elő. A PARP1 molekula három fő hatása: (1) szerepe van a DNS károsodások kijavításában; (2) működése során a sejt energiaraktárait depletálhatja; (3) proinflammatorikus gének transzkripcióját serkenti. A PARP1 116 kDaos fehérje; a Cterminális régión elhelyezkedő katalitikus domént követi egy auto modifikációs köztes domén, végül az Nterminális végén találhatók a DNS kötődésért felelős cinkujjak. A PARP1 molekula két fő szerepe a DNS károsodás felismerése (szenzor funkció) és a repairkomplexek működésének elősegítése (szignál funkció). A DNSkötő régió a DNS szabadgyökök, ionizáló

37. oldal

.


.

sugárzás, alkiláló szerek, hypoxia hatására létrjött egyszálú, illetve kétszálú lánctöréseit érzékeli. Az aktivációt követően a katalitikus domén működésének eredményeként az energia metabolizmusban esszenciális szerepet betöltő NAD + ot (nikotinamidadenin dinukleotid) elhasítja nikotinamiddá (NA) és ADPribózzá. Az utóbbi szolgál építőkőként egy polinukleotid polimerhez, a poli(ADPribóz)hoz (PAR), ami kovelensen képes kötődni az akceptor fehérjékhez. A PARP aktivációja, működése során tehát csökkenti szubsztrátjának, a NAD + nak a szintjét. Később említendő biokémiai lépések eredményeként végső soron a PARP működésének hatására a sejt energiaszintje csökken, ami az enzim túlaktiválódása esetén a sejt nekrózisát okozhatja. Nehezen meghatározható a PARP1 bazális aktivitása normál, élettani körülmények között. A irodalom erre vonatkozó adatai ellentmondóak. A bazális aktivitás megbecslésénél figyelembe kell venni a DNS lánctörések relatív alacsony szintjét, és az oxidatív foszforiláció és egyéb anyagcsereutak melléktermékeként normális, élettani körülmények között is keletkező szabadgyök molekulák szintjét [106]. 1.6.1. PARP szerepe a DNSkárosodások kijavításában A PARP1 elengedhetetlenül fontos a genom integritásának megőrzésében, a DNS károsodások

kijavításában.

A

DNSrepair

lépéseiben

a

kromatinállomány

dekondenzációjáért, és számos repairenzim serkentéséért felelős. A sejt DNSének védelmében betöltött szerepét de Murcia és mtsai bizonyították [107]. A DNSsérülés helyén a kromatinállomány fellazul, dekondenzálódik, így a PARP javítja a sérült terület hozzáférhetőségét a repairenzimek számára. A PARP számos repairenzim aktivitását fokozza, többek között a sérült láncdarab kitöltéséért („gap filling”) felelős DNSpolimerázt, és a láncok összekapcsolásáért („ligáció”) felelős DNS ligáz IIIt. [106]. A poli(ADPribóz) lánc energiát is szolgáltat a repair enzimek számára. Ennek folytán energiatranszport molekulá nak is tekinthetjük a PARt, ami a citoplazma energiaraktárainak felhasználásával (NAD + bontása) energiát szolgáltat a sejtmagban zajló DNSrepair számára [108]. Patológiás körülmények között a PARP túlaktiválása a citoszól energiaraktárainak depletálásával okozza többek között a sejt halálát. 1.6.2. A PARP szer epe a szignáltranszdukcióban, és a génexpresszióban A PARP fiziológiai szerepe – ami mind patofiziológiai, mind terápiás szempontból releváns – a transzkripció regulálása , befolyásolva ezzel számos fehérje intracelluláris

38. oldal


.

.

szintjét. A transzkripció szabályozása három szinten valósulhat meg: (1) hisztonfehérjék eltávolítása a DNS láncról; (2) PARP szerepe a DNSmetiláció szabályozásában; (3) PARP részvétele enhancer/promoter komplexekben. Ezen utóbbi jelentőségét az adja, hogy a PARP1 szerepet játszik az NFκB mediált transzkripciós folyamatok finomszabályozásában. Annak ellenére, hogy a PARP1 általában serkenti az NFκB dependens transzkripciós folyamatokat [109], leírtak olyan géneket is, amelyek expressziója PARP1 hatására csökken. A PARP1nek szerepe van számos, gyulladáshoz

kapcsolódó transzkripciós faktor aktiválásában, így patológiás körülmények között egy olyan önmagát erősítő folyamat indul be, melynek során a gyulladásos mediátorok túlzottan felszaporodnak, fokozva ezzel a szerv károsodását [110]. 1.6.3. A PARP szer epe a sejthalálban A

PARPnak

szerepe van mind az apoptózis, mind a nekrózis

folya

matában. A PARP1 az egyike volt azon molekuláknak, mely ről

bizonyították,

hogy az apoptózis folyamatában kulcs fontosságú

kaszpá

zoknak a szubsztrátja.

9. ábra: A DNSkárosodások fajtái súlyosság szerint Forrás: Virág L, Szabó C Pharmacol.Rev. 2002

Az apoptózisban a PARPnak nincs aktív szerepe, hanem bizonyos kaszpázokhoz kapcsolódik, mely a PARP inaktiválódásával jár. A sejtek ischaemiareperfúziós károsító hatásra apoptózissal vagy nekrózissal válaszolhatnak. Ez nagymértékben függ a DNS– károsodás mértékétől [8;106]. Eszerint a modell szerint a károsító hatásnak kitett sejt számára háromféle út lehetséges (9. ábra):

39. oldal

.


.

1. lehetőség: Ha a DNS károsodás enyhe fokú, akkor a PARP enzim aktiválódik,

ennek

hatására

a

kromatin dekondenzálódik, a repair enzimek

hozzáférnek

a

sérült

szakaszhoz, ezenfelül aktivitásuk is növekszik PARP jelenlétében, végső soron

a

károsodott

szakasz 10. ábra: PARP fiziológiás szerepe Forrás: Jagtap P, Szabo C: Nat.Rev.Drug Discov. 2005

kijavításra kerül, a sejt túlél. Valójában ez a PARP fiziológiás szerepe (10. ábra).

2. lehetőség: A sejt DNSének sérülése a p53 fehérje megjelenését váltja ki, ami felfüggeszti a sejtciklust addig, amíg a DNS ki nem javítódik. Ha azonban a DNS károsodás olyan nagy mértékű, hogy a repair rendszer a hibát nem tudja kijavítani, tehát a repair komplexek javítókapacitását a sérülés nagysága meghaladja, akkor a p53 mint transzkripciós faktor, a bcl2 és bax génekre hatva beindítja az apoptózis programját. Tehát nagyfokú DNSkárosodásra a sejt válasza apoptózis, amely endogén szabályozó faktorok (p53, AIF) hatására játszódik le. 3. lehetőség: Igen nagy mértékű, excesszív DNS károsodás esetén a PARP túlaktiválódik. Az oxidatív és nitrózatív stressz hatására ilyen nagy mértékű DNS károsodás jön létre a hepatocytákban (fokozott mértékben a

májlebenykék

centrolobularis

régiójában) ischaemia reperfúziós 11. ábra: PARP túlaktiválódása Forrás: Jagtap P, Szabo C: Nat.Rev.Drug Discov. 2005

károsodás során. A PARP túlzott működése során – mely a DNSlánc hibáinak kijavítására irányul – a

szubsztrátként szolgáló NAD + ot fokozottan bontja, a sejt NAD + poolja drámaian lecsökken. Ebből következik, hogy a NAD + dependens energiatermelő celluláris folyamatok, úgymint az anaerob glikolízis, a citrátkör leállnak. A citrátkör

40. oldal

.


.

működésének felfüggesztésével együtt jár, hogy a citokrómokból álló mitochondriális légzési lánchoz nem érkezik elegendő elektron, ami mitochondriális diszfunkcióhoz, a mitochondriális membrán depolarizációjához vezet. Ennek eredményeképpen az ATP szintáz enzim ATPázként kezd működni, tovább csökkentve ezzel a sejt energiaraktárait.

A

sejt

a

NAD + –készleteit

is

igyekszik

regenerálni

(nikotinamid→nikotinmononukleotid→NAD + úton), azonban ez is fokozott ATP felhasználással jár. ATP hiányában az energiaigényes folyamatok leállnak, mint például a membrán integritásáért felelős Na + /K + pumpa, a membrán szétesik, az intracelluláris enzimek „kiömlenek” a sejtből. Az ATP hasításából ADP és inorganikus foszfát keletkezik (Pi). Az egyre nagyobb mennyiségben felhalmozódó Pi indukálja az MPTP megjelenését a mitochondriális membránban, ennek hatására a mitochondrium membrán depolarizálódik, működése felfüggesztődik [88]. Tehát az excesszív károsodást szenvedett, energetikai krízisbe kerülő sejt nekrózissal pusztul el, elősegítve ezzel a lokális gyulladás kialakulását. A nekrotizált sejtek bekebelezéséért felelős makrofágok további proinflammatorikus és kemotaktikus molekulák termelésével fokozzák a gyulladásos választ. Az enzim gátlásának köszönhetően a sejt energiaraktárai nem fogynak el, elegendő energiát biztosítva ezáltal az apoptózis ATPt igénylő lépéseihez, és a membrán integritásának fenntartásához (Na + /K + pumpa).

1.7. Glutamin szer epe az IR kár osodásban A szervezetben megtalálható thiolok a reaktív gyökökkel szemben nagyfokú védelmet jelentenek. A glutation (GSH) a legnagyobb mennyiségben jelenlévő alacsony molekulasúlyú intracelluláris thiol, antioxidáns vegyület. Anup [111] kísérleteiben leírta, hogy önmagában a sebészi beavatkozás is fokozza az ODFR képződését. Mérései szerint a májból mobilizált GSH plazmakoncentrációja 30 perccel a laparotomia után emelkedett és csak 24 óra múlva normalizálódott. Az antioxidáns poolok kialakításában fontos szerepe van az élettani körülmények között nem esszenciális aminosavnak, a glutaminnak. Egyes közlemények szerint a glutamin protektív hatása a csökkent szabadgyökprodukción keresztül valósul meg. A májban a glutamin a GSH bioszintézisében esszenciális fontosságú. A máj igen fontos a GSH szintézisben, ahol egy komplex, ciszteint, glutamátot és glicint is, mint köztiterméket magába foglaló bioszintetikus út ér véget. A máj GSH raktárainak depléciója figyelhető meg sepsisben,

41. oldal

.


.

több szervet érintő traumában, drogok és gyógyszerek indukálta oxidatív stresszállapotokban, illetve hypovolaemias shockban. A máj által szintetizált GSH aktív transzport útján jut el egyéb szervekbe. A GSH szintézisének egyik lehetősége a májban lejátszódó aminosavtranszportfolyamatokkal függ össze. A gammaglutamilciklus során a redukált GSH glutamil

gammakarboxil

csoportja

és

egy

transzportálandó aminosav aminocsoportja között kötés jön létre a sejtmembránban, és így egy külső aminosav a sejt citoszoljába kerül, ahol aztán felszabadul. A ciklus további része a hidrolizált 12. ábra: Glutamin szerepe apoptózisban Roth E, Nutrition 2002 alapján

GSH reszintézisét szolgálja. Egy ciklus végbementéhez 3

ATP

szükséges.

A

folyamat egyrészt aminosav sejtszintű felvételét, másrészt az antioxidáns glutation szintézist szolgálja. A glutamin, a fentiek mellett az apoptózisban is fontos szerepet tölt be (12. ábra). Feltételezések szerint a glutamin az alábbi módon az apoptózist befolyásolja: az extrinsic apoptózist gátolja, míg az intrinsic úton meginduló apoptózist serkenti. Ezen energiaigényes folyamatnak igen fontos szerepe van a posztoperatív időszakban kialakuló gyulladás csökkentésében, hiszen az apoptózis hiányában/helyett a sejtek necrosis felé „indulnak”. A glutamin adása megnöveli, és megőrzi a szervezet glutation poolját. A glutation fontos antioxidáns anyag, mely kulcsszerepet játszik a redoxstátus szabályozásában.

1.8. Az IR kár osodás csökkentésének lehetséges módszer ei A teljesség igénye nélkül az irodalomban talált lehetséges módszereket foglaltam össze, külön hangsúlyt fektetve a kísérleteimben alkalmazott ischaemiás preconditionálás eljárás, illetve kémiai vegyületek (PARPinhibitorok, glutamin) bemutatására.

42. oldal

.


.

1.8.1. Ischaemiás preconditionálás (IP) A több ciklusban alkalmazott rövid, ischaemiásreperfúziós periódusokból álló

ischaemiás preconditionálás (IP) védő hatását először myocardiumban írták le 1986 ban Murry és munkatársai. Megfigyeléseik szerint állatmodellben, a többszörösen, rövid ideig alkalmazott ischaemiás periódusok megóvták a szívizomzatot egy ezt követő hosszabb ischaemiás periódustól: „ Thus, we proposed that multiple brief ischemic

episodes might actually protect the heart from a subsequent sustained ischemic insult” [9]. Miután eme módszer hatásossága kutyaszíven, majd más állatfajokon is igazolódott, így 1993ban megkezdődtek az első humán alkalmazások [112]. Ezt követően hamarosan az eljárás hatásos voltát, illetve kísérletes alkalmazhatóságát vázizmokban [113], agyban [114], vesében [115], bélben [116] és 1993ban májban [117] is felismerték. Ugyanakkor, a tapasztalati tényeken kívül, az IP pontos patomechanizmusa nem volt kellően tisztázott. Az IPt úgy jellemezték, mint egy olyan adaptív mechanizmust, mely során a rövid ideig tartó IR periódusok még nem okoznak szervkárosodást, viszont kellő triggerként aktiválják a szövetek endogén védelmi rendszerét [9]. A korai vizsgálatok alapján ígéretes lehetőségnek bizonyult a preconditionálás a máj, illetve egyéb szövetek transzplantációja, illetve hosszan tartó, kirekesztéssel járó beavatkozások klinikai alkalmazása kapcsán. Ugyanakkor a pontos biokémiai, (pato)fizilógiai háttér ismerete elengedhetetlen volt az egyes lépések esetleges farmakológiai befolyásolásához. A legpontosabb és mélyrehatóbb információink a szívizmon végzett, ún. „tiszta, klasszikus formájú” preconditionálásról vannak, a májban lejátszódó folyamatok szereplőiről, pontos dinamikájáról csupán szórványos irodalmi adatok állnak rendelkezésünkre. További nehézséget okoz az alább felsorolt irodalmi adatok áttekintésekor, hogy a módszerek, illetve a kísérleti állatok nem minden esetben egyformák. Sőt, egyes közlemények az IP hatásosságát megkérdőjelezik, tekintve, hogy vizsgálataik során a hideg ischaemia előtt alkalmazott IP növelte a repefúziós károsodásokat [118]. A teljesség kedvéért a kifejezés magyar vonatkozásában egy – az angol fordításból adódó – szemantikai megjegyzéssel kell élnem. A „preconditioning” jelentése: előkészítés (az angol műszaki nyelvben az anyag előkészítését jelenti). Ellenben a preconditionálás szótöve, a „conditio” a latin nyelvben befőzést, fűszerezést (!) jelent – aligha gondolunk erre a kifejezésre használatakor. Viszont a latin szótárban, a

43. oldal

.


.

szomszédságban található „condicio” – feltétel, helyzet, körülmény, állapot – már inkább alkalmas a megfelelő asszociációra. A gyakorta használt magyaroslatinos orvosi írásmódunk során későbbiekben célszerűbb lenne inkább így írni: precondicionálás, illetve még helyesebben praecondicionálás. 1.8.1.1. IPsal szer zett evidenciák meleg ischaemiában Az első, 1993ban leírt, máj ischaemiás preconditionálásról szóló közlemény óta (LlorisCarsi és mtsai [117]) közel 250 közlemény található az elektronikus keresőfelületeken, melyek a legszűkebb körben foglalkoznak a máj ischaemiás preconditionalásának patomechanizmusával. A fent említett 1993as közlemény szerint, a patkánymáj afferens ereinek 5 perces okklúzióját követő 10 perces reperfúzióval az állatok túlélése növelhető volt, illetve a transzamináz szintek csökkentek egy 90 perces ischaemiás modellben. Ezt követően Hardy és munkatársai [119] patkányokon végeztek májresectiót 45 perces ischaemiával, melyet a fenti séma szerint egy 5 perces ischaemia, illetve 10 perces reperfúziós ciklus előzött meg. Az IP eredményeként javuló túlélésről számoltak be. Hasonlóképpen, Yoshizumi kutatócsoportja bebizonyította, hogy IP után végzett májresectiok során a szöveti ATP szint magasabb a kontroll csoporthoz képest [120]. Ezt követően számtalan, az IP feltételezett lépéseinek különbőző aspektusait is figyelembe vevő tanulmány született, melyek végeredményeként elmondható, hogy a meleg ischaemiát megelőzően alkalmazott IP csökkenti a hepatocellularis károsodás fokát [121], növeli a szöveti ATP szintet [120], csökkenti a TNFα [122;123] és IL6 szintet [122], ezzel párhuzamosan csökkenti a leukocyta/endothelsejt interakciók gyakoriságát [124], növeli a májsejtek intracellularis oxygenizációját [125], javítja a mikrocirkulációt [126;126;127]. Igaz, ezen utóbbi paraméter vizsgálata során számos ellentmondás született a mérési metodika hiányosságaiból. Ugyanakkor nem született tanulmány, amely IPt követő különböző idejű ischaemiás idők hosszát, illetve a mikrocirkulációs változásokat vetné össze. A fentiek szerint elmondható, hogy a vizsgálatok által megalapozott evidenciák szerint az IP csökkenti az IR indukálta májkárosodás mértékét állatkísérletekben. Ezen felbuzdulva született meg az első humán alkalmazás is (Clavien és mtsai; 2000), mely bizonyította, hogy hemihepatectomian átesett betegek sinusiodealis endothel sejt apoptózisa a reperfúzió 30. percében gátolható volt ischaemiás preconditonálással. További kérdésként vetődött fel a zsírmáj előkezelések hatékonysága. Serafin és mtsai bebizonyították [128], hogy

44. oldal

.


.

rágcsálókban, a stetatosisban végezett IP szintén képes növelni az IR károsodásokkal szembeni ellenállóképességet. Ezen felismeréseknek további hasznos klinikai következményei lehetnek, tekintettel a növekvő traszplantációs igényre. Más, nagyállatokon végzett kísérletek egyértelművé tették, hogy az IP csupán „funkcionális” védelmet tud nyújtani reverzibilis ischaemiás periódusok ellen, de elveszti protektív hatását elnyújtott ischaemiás periódusok alatt. 1.8.1.2. IPsal szer zett evidenciák hideg ischaemiában Az IP protektív hatása nem csupán meleg ischaemiára korlátozódik, hanem ugyanolyan hatékonysággal csökkentette a reperfúzió okozta károsodást a hidegben prezervált szervek ischaemiásreperfúziós károsodása kapcsán. Az endothelsejt károsodás, illetve a Kupffersejt aktiváció tipikus jellemzője a tárolási és reperfúziós károsodásnak, melyek graftelégtelenséghez vezethetnek. Kísérletek során kis, és nagyállatokban a máj University of Wisconsin (UW) oldatba helyezése előtt IPt alkalmaztak, mely eredményeként a 30. órában mért Kupffer, és sinusiodalis endothelsejt aktiváció szignifikánsan csökkent, illetve egy órával az UWoldat alkalmazását követően csökkent az endothelsejtek apoptózisa, illetve fokozódott a mátrix metalloproteázok aktivitása [129]. További megfigyelés volt, hogy patkányokon végzett májtranszplantációk során az IP növelte a graft életképességét, csökkentette a posztoperatív morbiditást. Egy 2001ben publikált közlemény szerint [130] a hidegben (UW oldat) prezervált patkánymájban az IP kedvező hatása 30 óra után csökkentette a nonparenchymális killing mechanizmusokat. Továbbá, ha a májszövet fele volt csupán IPsal előkezelve, akkor a kedvező hatás nem csupán az ipsilateralis lebenyt érinti, hanem a contralateralis lebenyt is, javítva ezzel a graft túlélést orthotopicus májtranszplantácio során. Észrevételük szerint az így előkezelt máj, átültetés után, a recipiensben csökkentette a TNFα koncentrációt, növelte a túlélést. Tehát az ún. „heterológ”, különböző eredetű, eltérő affrentációjú IP új jelentéssel ruházza fel az eljárást: Eszerint a májszövet egy jelentős része védhető az IR károsodások ellen anélkül, hogy az ischaemia hatását kifejtené a szöveten [131]. Megállapítható, hogy az IP okozta, sinusiodalis endothelsejteken kifejtett protektív hatás elsősorban a traszplantációs kísérletekben bekövetkező károsodások ellen jelent védelmet, tekintve, hogy a sinusiodalis endothelsejtek sokkal érzékenyebben reagálnak

45. oldal

.


.

a hideg kiváltotta károsodásokra, szemben a hepatocytákkal, melyek elsősorban a meleg ischaemiareperfúzióval szemben érzékenyek [132]. 1.8.1.3. IPsal szer zett evidenciák izolált hepatocytakultúrán Az ischaemiás preconditionálás hepatoprotektív hatása izolált hepatocyta kultúrákon is kimutatható. Az in vitro vizsgálatok szerint a frissen izolált, preconditionalt májsejtek fokozott ellenállóképeséget mutattak a csökkent oxygénkoncentráción végzett inkubációk során. Továbbá az IP növelte a májsejtek életképességét, optimalizálta az energia felhasználását patkánymájsejtekből kivont kultúrákban normoterm ischaemia alatt [133]. 1.8.1.4. IP feltételezett patomechanizmusa Az ischaemiás preconditionálás pontos mechanizmusa nem kellően ismert. A myocardiumon végzett tanulmányok alapján a preconditionálás ligandreceptorok Gpr oteinekhez kapcsolt r eceptor ok aktívációja

Tr iggerek

Mediátor ok

A1/A3 M2 AT1 B2 δ α1 (adenozin) (acetilkolin) (angiotensin) (bradykinin) (opioidok) (katekolaminok)

PKC

Tirozinkináz

MAPkináz

Foszfor iláció / aktiváció

Végső effektor

Szénhidrát K + ATP/más mF0F1ATPáz anyagcsere ioncsatornák

ecto5’nucleotidáz

Védelem 13. ábra: Az IP feltételezett ” inciális trigger – szignáltranszdukció – effektor” mechanizmus láncolat elemei

mechanizmusa széles körben elfogadott. Az ischaemia alatt felszabadult molekulák receptorokhoz kötődnek, melyek jelpályák útján létrehozzák a preconditionálást, mint válaszjelenséget. A gyakran vizsgált molekulák: az adenozin, a protein kináz C (PKC), nitrogén monoxid (NO), hőshock fehérjék (HSPs), tirozin kinázok, mitogén aktivált

46. oldal

.


.

protein kinázok (MAPK), oxidatív stressz elemei, nukleáris faktor κB (NFκB), illetve az apoptózis kaszkád elemei. A májban a legnagyobb figyelmet az adenozin, a NO, PKC, HSPs kapták. E vegyületek bonyolult, nem kellően tisztázott kapcsolatrendszerén keresztül épül fel egy „iniciális trigger – mediátor, szignáltranszdukció – effektor mechanizmus” láncolat. A triggerek a folyamat beindításában, a mediátorok a jelátviteli folyamatokban, a végső effektorok pedig a sejtek különböző adaptációs, transzkripciós, stb. mechanizmusainak beindításában játszanak szerepet (13. ábra). Alább csupán a májszöveti preconditionalásban szerepet játszó legfontosabb vegyületeket részletezem, úm.: (A) adenozin, (B) PKC, (C) HSPs, (D) NO. Mivel evidencia szintű megállapítások jelenleg nem állnak rendelkezésünkre, így a kísérletes adatokból levonható következtetésekből alkothatunk egységes képet.

(A) Az adenozin: Az adenozin, mint extracelluláris molekula, mind triggerként, mind mediátorként szerepel az IP mechanizmusában. Az ischaemia alatt az ATP bomlásból jelentős mennyiségű adenozin képződik, mely az ischaemiásreperfúziós károsodásban megjelenő leukocyta adhéziót, adhéziós molekula expressziót, illetve a neutrophil és thrombocyta aktivációt gátolja, és ezen lépéseken keresztül csökkenti az ODFR termelődését [134]. Az adenozin, mint vazodilatátor , szintén fontos szerepet játszik a korai IR károsodások kivédésében, de hatása összességében multifaktoriális. Az adenozin különböző receptorokon keresztül eltérő hatásokat vált ki. Az A1receptor stimulálásával megnöveli a toleranciát az ischaemiás periódusban. A1 és A3 receptorok blokkolásával preconditionáló hatása majdnem teljesen felfüggeszthető. Szívnél az A1 és A3 receptorok, máj esetében az A2 receptor játszik fontos szerepet [135]. Megfigyelések szerint, adenozin uptake inhibitorral (dipyridamol) kezelt állatokban, az így megnövelt endogén adenozin koncentráció azonos hatású az IPsal: csökkenti a reperfúzió során észlelt szöveti, mikrocirkulációs károsodásokat [136]. (B) Protein kinázC (PKC) Az adenozin, és más triggerek receptorukhoz kapcsolódva foszfolipáz Chez (PLC) kapcsolt Gproteinek aktivációját idézik elő [137]. A PLC aktiváció hatására membránlipidekből IP3 és DAG szabadul fel. IP3 hatására nő az IC Ca 2+ szint. Ez utóbbi jelenlétében a DAG hozzákötődik a PKC regulációs alegységéhez, a molekula

47. oldal


.

.

aktiválódik A protein kináz C (PKC) bizonyítottan fontos szerepet játszik a preconditonálásban: blokkolása csökkenti, aktivációja növeli [138] az IP protektív hatását. PKC aktiváció csökkenése patkányszíven, 20 perc globális ischaemiát követően teljesen felfüggeszti a szív funkcionális felépülését IP után. PKC inhibitor (chelerythrine) [139] alkalmazásával bebizonyított a PKC fent leírt szerepe máj IP során. Preconditionáló stimulus Adenozin, Bradykinin, Opioidok, stb. PIP2 Extracell. tér

R

G

PLC

Cytosol

AMP IP2

Adenozin

DAG Ecto5’ nucleotidáz

2+

Ca

I. p38 MAPK MAPKAPK2

PKC

HSP27 Cytoskeleton stabilitás nő

PTK

II. P46/54 JNK III. ERK

szerepe kétséges

KATP csatorna

? Mitochondrium

MAPK

ROS VÉDELEM

14. ábra: Az IP celluláris mechanizmusa, effektorai. Rajz: Stang Rita & Szentiványi Zoltán

A PKC aktiváció eredményeként a foszforilált KATP csatornák megnyílnak. A KATP csatornák nyitásával nő a K + kiáramlás, így az akciós potenciál ideje lecsökken [140], ennek következtében csökken a feszültségfüggő Ca 2+ csatornákon beáramló Ca 2+ mennyisége (14. ábra). Az alacsonyabb intracelluláris Ca 2+ szint csökkentheti az ischaemiás károsodást [141]. A mitochondriális csatornák szerepére két hipotézis is

48. oldal

.


.

létezik: (1) A nyílásával csökken a mitochondriális Ca 2+ többlet, ami a mitochondriumok integritását őrzi meg. (2) A másik elmélet a mitochondriumok alakjával magyarázza a jótékony hatást [142]. Az alakjuk megváltozásával javul az energiaáramlás, és az elektrontranszport. A fentiek alapján a szívizomhoz hasonlóan, a májban lévő mitochondriális KATP csatornák kulcs, effektor szerepe kézenfekvő, érthető. (C) Hőshockfehérjék (HSPs) A hőshock fehérjék a frissen szintetizálódott polipeptidláncok harmadlagos térszerkezetének kialakítását segítik a sejtekben. Aktiválódásukra extrém hőhatással kapcsolatos válaszreakciókban figyeltek fel, de szerepük van más sejtkárosodások kivédésében is. A sérült fehérjék térszerkezetének helyreállításán kívül transzkripciós faktorokat aktiválnak, melyek hőshock szekvenciát tartalmazó promoterekhez kötődve fejtik ki hatásukat a génátírásra. A HSP szintén korai emelkedést mutat IR alatt. Az ischaemia alatt a sejt homeosztázisának felborulása után direkt és indirekt módon aktiválódhat, mely utóbbiban hibás térszerkezetű fehérjék szerepét feltételezik. A reperfúzió alatt is megjelenik HSP aktiváció, mivel az oxidatív stressz okozta fehérjekárosodás HSP aktiváló. Az általuk aktivált gének között antioxidánsok, cytokinek, adhéziós molekulák és növekedési faktorok szerepelnek. Kimutatták, hogy a HSPs elsősorban a mitochondrium membránjának integritásának fenntartásáért felelősek [143]. In vitro kísérletben bebizonyították, hogy HSP72 "overexpressziója" kapcsán csökkenthető volt az IR károsodás, csakúgy, mint IPsal [144]. Ezen HSP expozíciója a preconditionálást követően 672 óra múlva is kimutatható, így feltételezhetően a késői IP patomechanizmusában is fontos szerepet játszik. (D) Nitrogén monoxid (NO) A NOval kapcsolatos általános tudnivalókat ld.: 1.4.3.1. fejezetben. Ismertes, hogy az eNOS által állandóan termelődő, illetve hepatocyták és más sejtek által transzkripciós módosulásokkal regulált iNOS által termelt NO kulcsszerepet játszik az IP iniciálásában, illetve mint mediátor szerepel a folyamatban. A NO, mint potens vazodilatátor, hatását mind sinusiodalis, mind presinusoidalis szinten kifejti. A NO mediálta IP jelpályán cGMP változáson át, a végső effektorok a már korábban említett KATP csatornák, melyek a mitochondrium, és így az energiatermelés integritásáért

49. oldal

.


.

felelősek. Egyértelmű, hogy az NO asszociált IP mind hideg, mind meleg ischaemiában működik, jelen van. A pontos mechanizmus nem ismert. Peralta szerint a NOnak az endothelinen történő gátlása okozna preconditionáló hatást [145]. Más vizsgálatok szerint az adenozin „uptake” gátlása és a NO donor egyidejű adagolása IPhoz hasonló állapotot eredményez, mely arra enged következtetni, hogy az A2 receptorok aktivációja és a következményes NO szintézis vezet a májban lejátszódó IPhoz [146]. Kimutatható, hogy az IP hatására megnövekedett mikrocirkuláció és intracelluláris oxigénhasznosítás hátterében a megnövekedett NO szint áll [125]. A NO ugyanakkor képes csökkenteni az apoptózist az endothelsejtekben. 1.8.1.5. IP dinamikája Nem minden időkombinációban végzett preconditionálás hatásos. Körülbelül 35 perces ischaemiát követően minimum 5 perc reperfúzióra van szükség a kiváltásához [9]. Kimutatták továbbá mind szíven mind májban hogy már egy epizód ischaemia is elég a protektív hatás eléréséhez, illetve, hogy a klasszikus, vagy korai preconditionálás gyors adaptációs mechanizmus révén hat. Patkánymáj esetén bizonyított, hogy a preconditionálás kritériumát teljesíti az afferes ereinek 5 perces okklúzióját követő 10 perces reperfúzió [117]. A rövid ischaemia időtartamán és az alkalmazott ciklusok számán kívül az elhúzódó ischaemia előtt megengedett reperfúzió ideje is meghatározó jelentőségű. Amennyiben a tipikusan 5 perces ischaemiát legfeljebb 60 perc reperfúzió követi, a jótékony hatás még tapasztalható. Ha a köztes időintervallum meghaladja az 14 órát, a protektív hatás már nem alakul ki [147]. Ha az IP és az azt követő ischaemia közötti időt 2429 órára növeljük, azt tapasztaljuk, hogy az ischaemiás károsodás ismét csökken [147]. Ez az ún. késői preconditionálás, vagy „second window of protection”. Ekkorra az adaptáció már a génátírás modulálásán keresztül alakul ki. A korai preconditionálással szemben a preconditionálásnak ez a formája alacsonyabb szintű védelmet nyújt, de hatása elhúzódó. A késői preconditionálás elemeit is 3 részre lehet osztani. Triggerei az első ischaemia hatására aktiválódnak. Mediátorai az újonnan expresszálódó fehérjék, melyek az elkövetkező 2472 órában nyújtanak védelmet [148]. Az IP késői hatásai eredményeként javul a postischaemiás sinusoidális perfúzió, az epeelválasztás, valamint csökken a leukocyta infiltráció, illetve az aminotranszferáz felszabadulás. A késői preconditionálás szorosan összefügg a hőshockfehérjékkel [149]. A HSP27 és HSP70

50. oldal

.


.

fontosak, mert kötődnek citokróm chez, APAF1hez, valamint AIFhez és ezáltal megelőzik a kaszpáz aktivációt [121]. Az egyik HSP, a hemoxigenáz (HSP32) up regulációja csökkenti az NFκB aktivációját, így antiinflammatoricus és antiapoptotikus hatású. Gátlásával teljesen felfüggeszthető, serkentésével pedig előidézhető az IP hatás [150]. 1.8.1.6. IP szerepe a klinikai gyakor latban Ahogy az a bevezetőben tárgyalásra került, a májresectiók kapcsán alkalmazott kirekesztések permanens, vagy intermittáló volta sok esetben haemodinamikailag nehezen tolerálható, növelve ezzel a posztoperatív szövődmények számát, a halálozást, illetve a kórházban töltött napok számát. A fentebb említett állatkísérletes tanulmányok alapján az IP, azáltal, hogy a hosszabb idejű ischaemiás periódust az elviselhető, biztonságos időintervallum közé képes szorítani, lehetővé teszi a szövődmények, illetve a mortalitás csökkentését. Az első humán májműtét során alkalmazott IPt Clavien és mtsai [151] alkalmazták hemihepatectomiak során. Ezen vizsgálatban a 30 perces kirekesztést megelőzően 5 perces ischaemiát követő 10 perces reperfúzióval hoztak létre IPt, mely szignifikánsan csökkentette a szérum transzamináz szinteket. Ugyanakkor ezen vizsgálat kapcsán a nem előkezelt, kontroll csoporttal történt összehasonlítás során nem volt különbség a műtéti idő, a posztoperatív intenzív osztályos ápolási napok, illetve a mortalitás között. Májtranszplantációk során fennálló prolongált meleg vagy hideg ischaemia a graft károsodását okozza, melynek eredményeként létrejött korai és késői szövődmények retranszplantációt igényelhetnek. Ezért az IPnak a májsebészet ezen területén is létjogosultsága van. Az IP humán májtranszplantáció kapcsán észlelt kedvező hatásairól először 2006ban jelentek meg közlemények: Wayel Jassem és mtsai [152]. Vizsgálataik eredményeként [153] a preconditionált donor allograft beültetését követően szignifikáns módon csökkent a posztoperatív hepatocyta károsodás, illetve a szérum AST, ALT, LDH szintek 24 órával a transzplantációt követően. Szignifikáns módon csökkenthető volt az intenzív terápiás osztályon eltöltött idő, illetve az akut rejekciók száma is jelentősen (28 % vs. 50%) csökkent az előkezelt csoportban. Tekintve a növekvő igényt az orthotopikus májtraszplantációkra, illetve a potenciálisan alkalmas donorok számának hiányát, a transzplantációs programoknak célcsoportként kellett választaniuk a „határeseti” májszövettel bíró donorokat is. Ebbe a

51. oldal

.


.

csoportba tartoznak a zsírmájjal rendelkező donorok, amely esetekben a kivételkor alkalmazott IP kedvező hatással bírt a posztoperatív szövődmények csökkentésére [154;155]. 1.8.2. PARP inhibitorok A PARP fiziológiás és patológiás szerepe kapcsán (1.6. PARP fiziológiás és patológiás szerepe az IR károsodásban) már említésre került, hogy a PARP inhbitorok alkalmazása képes csökkenteni az IR károsodásokból eredő oxidatív és nitrózatív stresszt, illetve a DNS károsodás mértékétől függően a sejteket apoptózis irányba tereli necrosis helyett. A kifejlesztett PARP inhibitorok száma jelentős, vélhetően a jövőben szervspecifikus inhibitorok állnak rendelkezésre.

1.8.3. Glutamin A korábbi fejezetekben (1.7. fejezet) leírtak alapján összefoglalva elmondható, hogy a glutamin adagolása megőrzi, illetve megnöveli a szervezet glutation poolját. A glutation fontos antioxidáns anyag, mely kulcsszerepet játszik a szervezet redox státuszának szabályozásában, így csökkenteni képes az IR károsodásokat. Kísérletek igazolják, hogy a glutaminban gazdag enterális táplálás eredményeként a NO szintézis csökkent, ezáltal csökkent a nitrózatív stressz. A glutamin önmaga nem gátolja a NOSt, de a glutamin metabolizmus még nem pontosan ismert, dózisdependens módon befolyásolja az endothelialis NO produkciót [64;106;156;157].

1.8.4. Kémiai és fizikai módszer ek Évtizedekre visszamenőleg ismeretes, hogy pl. a glukagon, az aszparaginsav vagy az ATPMgCl2 kísérletes alkalmazása növeli a máj ischaemiatoleranciáját [2;3]. Abból a tényből kiindulva, hogy a reperfúzió során a mikrocirkuláció zavara áll fent, ésszerűnek tűnik vasodilatátorok és vazokonstriktorinhibitorok adása a károsodás csökkentésére. Emellett számos lehetőség kínálkozik az IR patofiziológiai lépéseinek terápiás célzatú befolyásolására. Alább néhány lehetőség, a teljesség igénye nélkül: endothelin1 inhibitor, PAF antagonista, Ca 2+ antagonista, Nacetylcystein, TXA2 szintáz inhibitor, NOdonorok, iNOS gátlás, SOD, scavangerek, vas kelátorok, UW oldat, hűtés.

52. oldal

.


.

1.9. Szöveti ár amlásmér és és a mikr ocir kuláció jellemzése Ebben a fejezetrészben rövid összefoglalásként felsorolásra kerülnek a legfontosabb áramlásmérési technikák, melyek közül – tekintve kísérleteim metodikai szempontjait – a flowmeterek bővebben kerülnek ismertetésre [158163]. 1.9.1. Szöveti áramlásmér és alapjai Egy adott szerv véráramlásának méréséhez alapvető az adott szövet fiziológiájának, illetve biokémiájának ismerete. Bár a végtagok, vese, szív, agy és tüdő véráramlását pontosan le lehet mérni, a máj véráramlásának mérését számos technikai és anatómiai ok komplikálja. A máj kettős vérellátása miatt két áramlásmérés szükséges a teljes májáramlás megméréséhez. Bár a vena hepaticán átfolyó véráramlás egyenlő a két beáramlás összegével, a máj véráramlásának mérése mégis bonyolult ezen keresztül, mert a vena hepatica igen rövid, ennek is jelentős része intraparenchymás elhelyezkedésű és igen közel van a rekeszhez. További probléma lehet, hogy a portális rendszer nehezebb elérhetősége miatt a legtöbb humán méréskor a splanchnikus véráramlást mérik, a máj valódi véráramlása helyett. A májáramlás mérésére használt eljárásokat direkt és indirekt csoportokba soroljuk. 1.9.2. Direkt áramlásmérési technikák A direkt technikák invazívak, magukba foglalják a máj és annak ereinek feltárását, manipulációját. Ezen eljárások kísérleti állatokon vagy humán intraoperatív körülmények közt alkalmazhatók. 1.9.2.1. Direkt katéter es áramlásmérések (A) Intraluminalis eljárások: A májvéráramlás mérésének eredeti módszere szerint az arteria hepaticat vagy a vena portaet kanülálni kell. Markeranyagot vagy levegőt injektálnak az ér proximális szakaszába, melynek továbbszállítódási aránya összefüggésben áll a véráramlással. Rotaméter segítségével lehet mérni az áramlást. Az eljárásnak ma már csak történeti jelentősége van. (B) A máj vénás kiáramlásának időzített gyűjtése: Ezen eljárást kizárólag állatkísérleteknél használják, a vena hepaticából kifolyó vér összegyűjtésével és a vérvolumen meghatározásával az idő függvényében. Az eljáráshoz szükség van a suprahepaticus vénás rendszer kanülálására, az infrahepaticus vénás rendszer lekötése

53. oldal

.


.

mellett. Az innen elfolyó vért egy kanül segítségével a v. jugularisba vezetik. A vena portae áramlása a vena lienalis splenectomiát követő kanülálása és a vena portae májkapunál történő leklippelése után mérhető. Ezek a vérgyűjtő technikák pontosak, de használatuk korlátozott, viszont referenciát szolgáltatnak az indirekt technikák kalibrációjához. 1.9.2.2. Plethysmographia Ezen technikához vénás okklúziót kell alkalmazni, ez a szerv duzzadását eredményezi, mely akut volumenváltozásként jelenik meg. A korai volumenváltozás direkt arányos az artériás beáramlás arányával. Ezen eljárás invazív plethysmographot ill. laparotómiát igényel. 1.9.2.3. Transzlumineszcenciás vizsgálatok A transzlumineszcenciás technikát a hepaticus vasculárisegységek véráramlásának relatív változásainak kimutatására a mikrocirkuláció képi és számszerű jellemzésére dolgozták ki. Altatott kísérleti állatok májszéle alatt kvarcfényt átvezetve, a lumineszkáló részek mikroszkóppal vizsgálhatók, fényképezhetők. A sinusoidok méretét a nagyított fényképen lehet lemérni. Az intrasinusoidalis áramlás fotometriás számlálóval határozható meg, s így az áramlási volumen kiszámítható (mm 3 /sec). Ezen mérés igen demonstratív, de bonyolult és hátránya, hogy csak a sinusoidalis áramlásról szolgáltat információt. 1.9.2.4. Flowmeterek Ezen műszerek egyrészt állatkísérletekben, mint krónikusan beültetett intraluminalis mérőeszközök alkalmazhatóak, másrészt egyszeri mérésekre („akutan”) állatkísérletek és humán vizsgálatokban használhatóak. A tartósan beültetett mérőfejekkel pontos és folyamatos mérés végezhető.

1.9.2.4.1. Elektromágneses flowmeter A mérőfej Faraday elektromágneses indukciós törvénye alapján mér, miszerint a mágneses mezőn áthaladó vér feszültséget indukál, amely két elektróda közt mérhető. A keletkezett feszültség egyenesen arányos a véráramlással. A méréshez a két elektródának az érhez történő rögzítésére van szükség. Ezen elektródákat merőlegesen

54. oldal

.


.

kell az erekre felhelyezni, mivel a merőlegeshez képest akár 10 fokos eltérés már csak 98,5 %os jelet eredményez. Ezért fontos, hogy ezen elektródák a vizsgálat alatt lehetőleg ne mozduljanak el, aminek tartós biztosítása jelentős nehézséget okoz a beültetés során. A technika hátránya, hogy a nem megfelelően elhelyezett vagy túl szorosan illeszkedő mérőfej, érösszehúzódást és/vagy turbulenciát okoz, ezáltal meghamisítja az eredményeket. Az erek külső és belső átmérőjének aránya szintén befolyásolja az áramlásmérést, mivel az érfal vezetőképessége különbözik az áramló vérétől. Az olyan kis átmérőjű erek, mint az arteria hepatica esetén, a véráramlást alábecsülhetjük ezen eljárással. A falvastagságot figyelembe véve a perivascularis elektromágneses mérőfejek ± 5% pontossággal mérnek. Az elektromágneses áramlásmérők gyakori és nagyon alapos kalibrációt igényelnek.

1.9.2.4.2. Ultrahangon alapuló áramlásmérés A Doppler elven alapuló mérőfej a jel leadáson és felvételen kívül az ér átmérőjét is meg tudja határozni. Az áramlás mértéket és a volumenét az áramlás sebességének és az ér átmérőjének szorzata alapján számolhatjuk. Ezzel az eljárással a vena portae áramlása pontosan mérhető, de az arteria hepatica és a vena portae együttes áramlása a jelek interferenciája miatt nem mérhető meg. Ezt a problémát a két ér különkülön végzett áramlásmérésével kerülhetjük ki.

1.9.2.4.3. Laser Doppler flowmérés A laser Doppler technika a Doppler elven alapuló, az alacsony áramlású,

microvasculatura áramlásvizsgálatára alkalmas noninvazív készülék. A vizsgálat előnye, hogy: (1) könnyen kezelhető, (2) folyamatoan látható jelet produkál, (3) a vizsgálat maga nem zavarja a mikrocirkulációt, tekintve, hogy a mérés nem jár együtt a szöveti integritás megbontásával. A vizsgált régióban a szövetvastagság típusosan 1mm, ahol a kapillárisok átmérője átlagosan 710 μm, illetve az áramlási sebesség 0,01 – 10 mm/s közt mozog. A készülék folyamatos Doppler pulzációs lézer jelet állít elő. Ez 2 nW energiájú hélium/neon monokromatikus lézer fény 632,8 nm hullámhosszon. A folyamatos pulzációs szignált két száloptikai érzékelő viszi a mérőegységben elhelyezett fotodetektorokhoz. A visszavert fény részben a szövetek statikus reflexiójából adódik (ez nem hoz létre a Doppler szignálban eltolódást), részben a

55. oldal

.


.

mozgó vörösvértestek által okozott reflexióból. A két reflexió eredőjeként elektromos jeleltolódás észlelhető. A 20 Hz 12 kHz közötti tartományban a frekvencia eltolódás lineáris feszültségváltozást eredményez, amely arányos az áramló vörösvértestek sebességével, illetve a vér szöveti koncentrációjával. Amennyiben a vörösvértest koncentrációt konstansnak tekintjük, a lézer szignál az időegység alatti véráramlással arányos, amit térfogatfluxusnak vagy vérátáramlásnak nevezünk. Nagyon magas áramlásértékek esetén megnövekszik a lézer fotonreflexió és a szöveti hatások közötti interakciók valószínűsége, ezért a lézer flowmérés alulértékelheti a valós áramlást. Az elektronikus korrekció és a mért adatok komputerizált interpretációja ezeket a hibákat kiküszöböli. A laser Doppler flowmérés in vitro modellekben történt ellenőrzése bebizonyította, hogy vörösvértestek időegység alatti térfogatfrakciója a különböző túlnyomásos, ellenőrzött áramlási rendszerekben is a igen tág határok között lineárisan arányos a lézer szignál eltolódásával, azaz a lézer Doppler flowmetria igen jól használható a vörösvértest áramlás vizsgálatára. Az eredeti kísérleti modellekre illesztett lineáris korreláció hibaértéke 0,2 % alatti. A módszer kimeríti a szöveti áramlásméréssel szemben állított kritériumokat és korábban számos tanulámány jelent meg használhatóségéról egyéb gastrointestinalis szervek, bőr, vázizmok vese szöveti perfúziójának méréséről. Ugyanakkor kevés tanulmány foglakozik a LDF májszöveten való alkalmazásával. Számos kritika érte a vizsgálati metodikát, mivel a vizsgálat nagyon érzékeny és in vivo történő mérések során a légzőmozgások okozta szervfelszíni elmozdulások nem engedik a stabil áramlási jelek rögzítését. További kifogás érte a módszert azért is, hogy a máj egy erősen perfundált szerv, mely így magas vörösvértest koncentrációval rendelkezik és így nagyobb az esélye a lézerfény többszörös szóródási valószínűségének, mely ezáltal a valódi áramlást, mérést alábecsüli. Megjegyzésként szerepel az irodalomban, hogy a LDF mérőfeje alatti terület csupán egy kis része a csak a vizsgált szövetnek, így nem használahtó egy olyan kalibrációs faktor, mely segítségéval a perfúzió abszolút értéke meghatározható lenne. Többlépcsős, bonyolult, hím Wistar patkányokon végzett, in vivo tanulmány [164] eredményeként megállapíthatjuk, hogy: 1. A patkánymáj vérellátása homogén, mely jól követhető laser Doppler flowmetriával. Ezt bizonyítja a LDFrel egyidőben végzett, azonos eredményt adó indocianinzöld clearence és 51 Crmikroelem technika.

56. oldal

.


.

2. A többcsatornás (több mérőfejjel egyidőben, különböző helyeken végzett), vizsgáltok megerőstik, hogy a LDFrel regisztrált áramlási értékek adott körülmények között a máj egészére extrapolálhatók. 3. A máj felszínén mért LDF jel a konvencionális elméleteknek megfelelelően viselkedik a máj haemodinamikai változásai során. Az arteria hepatica, illetve a vena portae szelektív okklúziója során kapott áramláscsökkenés értekei százalékos arányban megfelelnek az artéria – vena megoszlási aránynak (16%

vs. 74%), melyet a kísérletben radioaktív mikoszférák megoszlásával mértek. 4. A LDF segítségével a májperfúzió relatív változásait lehet követni, regisztrálni. Ezt bizonyítja a hemihepatectomiák vagy a haemorrhagiás shock áramláskövetése kapcsán jelentkező, más ármalásvizsgálatokkal korreláló eredmények. Ugyanakkor a „nulla” áramláskor mért jellel és az áramlás abszolút értékének megítélésével még problémák vannak. 1.9.2.5. Hőmér sékletváltozáson alapuló technikák Ezen eljárások alapjául az a teória szolgál, miszerint egy forró test hőmérsékletváltozása arányos az őt körülvevő folyadék áramlásával. A mérőfejek a májba vagy a vena hepaticaba implantalhatóak percutan technikával vagy intraoperatívan. Ezen eljárás csak a májáramlás relatív változásait detektálja, az alapáramlás a műszer májbeli helyzetétől függ. A máj metabolikus állapota is jelentősen befolyásolja a hőmérsékletet, mindezek miatt a módszer csak szemikvantitatív áramlásmérésre alkalmas. 1.9.3. Indirekt technikák Az indirekt eljárások lehetnek invazívak, szemi, vagy noninvazívak, mely utóbbiak klinikailag szélesebb körben használhatók. Ezen eljárások közé a különböző festékek, radioaktívan jelzett anyagok vagy markerek clearencének vizsgálata tartozik. Ilyen vizsgáló módszerek a: § Festék dilúciós technika § Clearence eljárások § Inert gáz „washout” § Microsphera frakcionált megoszlási módszere § Radiographiás eljárások

57. oldal

.


.

2. CÉLKITŰZÉS 2.1. Célkitűzés A máj véráramlásának mérése különböző problémákat vet fel: a módszer kiválasztásán túl, nagy körültekintéssel kell megszabni a mérések körülményeit. Az irodalomban számos módszer és eredmény található a máj mikrocirkulációjának vizsgálatáról, amelyek – megfelelő nemzetközi konszenzus hiányában – nehezen összehasonlíthatók. Ezért célul tűzetem ki irodalmi adatok közt jelenleg nem jól definiált fogalmak tisztázását, a szükséges jelenségek számára fogalomrendszer bevezetését, mindezt úgy, hogy magyar kutatók (Kupcsulik P., Kokas P., Faller J., Jakab F. [19;20;165167]) korábbi eredményeit mintegy értékeléseként veszem alapul, és fejlesztem tovább. Továbbiakban ezért célom volt: (a) a szöveti perfúzió, mikrocirkuláció vizsgálatára alkalmas, noninvazív laser Doppler flowmeter (LDF) máj mikrocirkulációs vizsgálatokban való bevezetése, (b) a mérési standardok, (c) hibák kiküszöbölésének, (d) matematikai transzformációkkal végzett és ezáltal statisztikai analízisre alkalmas individuális áramlási görbék kidolgozása, illetve ezek bemutatása. Ezen objektív paraméterek segítségével kívánom bemutatni: (e) állatkísérletes modell kapcsán a máj ischaemiás toleranciájának spektrumát, illetve (f) a különböző idejű ischaemiák előtt alkalmazott IP protektív hatását (I. kísérlet). A fentiekből kapott eredményekből, (g) egy második kísérleti sor (II. kísérlet) kapcsán vizsgálom, a máj számára vulnerábilis ischaemiás periódus előtt alkalmazott IP, PARP inhibitor, illetve a glutamin protektív hatását. Az ischaemias preconditionalás és a kémiai előkezelések (III. kísérlet) által felépített védőhatást a mikrocirkuláció változásának objektív jellemzése mellett a szöveti, illetve immunhisztokémiai reakciók, a szérum és a májszöveti antioxidáns paraméterek, rutin laborparaméterek, citokinszintek (TNFα) változásával mérem; értékelem az apoptózisnecrosis kapcsolatát a fenti rendszerben.

Összegezve tehát, állatkísérleteim alapján, dolgozatomban célul tűztem ki az alábbi problémák megválaszolását:

58. oldal

.


.

I. Kísér let: 1. Milyen standardizálási paraméter és matematikai transzformációk szükségesek a lézer Doppler flowmeter alkalmazása kapcsán, különös tekintettel a máj mikrocikulációjára? 2. Különböző idejű ischaemiás periódusok, illetve ezt kiegészítve, megelőző preconditionálás után milyen elváltozások észlelhetőek: a) LDF regisztrált áramlásgörbéken; b) szövettani vizsgálatok során; c) TNFα szintekben; d) rutin laborparaméter változások kapcsán, illetve e) hogyan alakul az állatok túlélése? 3. A mikrocirkulációs adatok és az állatok túlélése alapján mely ischaemiás időtartamok előtt alkalmazott IP képes protektív hatást kifejteni, illetve vane hatáskülönbség az ischaemiával összefüggésben?

II. Kísérlet Az I. kísérlet alapján, a kritikusnak vélt 60 perces ischaemiás időszak előtt alkalmazott előkezelések, úm. (A) Ischaemiás preconditionálás; (B) PJ34 PARP inhibitor; (C) Glutamin alkalmazása kapcsán, az alábbi kérdésekre keresem a választ:

1. Az előkezelések hogyan befolyásolják a máj mikrocirkulációjának jellemzésére alkalmas laser Doppler áramlásértékeket? 2. Milyen szövettani változások észlehetők: necrosis/apoptózis? 3. Előzőek milyen immunhisztokémiai vizsgálatokkal bizonyíthatóak (TUNEL reakció, caspase3 aktiváció)? 4. Milyen TNFα szint; 5. Milyen rutin laborparaméter; illetve

6. Milyen szérum és májszöveti antioxidáns változások jönnek létre?

59. oldal

.


.

2.2. A témaválasztás indoklása Jelen tanulmány első része elsősorban az IR károsodás kialakulásának mechanizmusát, valamint a preconditionálás patofizilogiáját, a mikrocirkuláció jellemzésére használt metodikákat kívánta bemutatni, összegezve az elmúlt 20 év irodalmi adatait. Az irodalmi adatok áttekintéseiből, illetve a fenti vizsgálatok eredményeinek összegzéséből alább kitűnik, hogy az IP, illetve a kémiai előkezelés klinikai alkalmazási lehetőségei során számos tisztázatlan kérdés van, melyek megválaszolása minden bizonnyal további távlatokat nyit. Ugyanígy nincs konszenzus a máj áramlásának, mikrocirkulációjának megítélésére laser Doppler flowmeter alkalmazása kapcsán. A dolgozat második felében, többlépcsős állatkísérletes modellen keresztül az ischaemia tolerancia növelésében alkalmazható eljárás: (1) az ischaemiás preconditionálás, illetve két, potenciálisan hasonló tulajdonságokkal bíró vegyület: úm. (2) egy, a máj mikrocirkulációra kifejtett hatásai szempontjából még, nem vizsgált a poly(ADP)ribózpolymeráz inhibitor és (3) egy reményeink szerint protektív hatással bíró aminosav, a glutamin alkalmazásával nyert eredmények kerülnek bemutatásra. A értekezés témaválasztását attól érzem megalapozottnak, hogy az irodalmi ismeretek és közlemények a máj tekintetében a fenti eljárásokkal kapcsolatban korlátozottabbak, mint pl. a szív esetében. Különös figyelmet érdemel, hogy nincs korábbi tanulmány az ischaemiás prekondícionálást követő, különböző idejű ischaemiás idők hosszának, ill. a mikrocirkulációs változásoknak az összehasonlításáról. A legfontosabb és legmélyrehatóbb információink a szívizmon végzett, ún. tiszta, klasszikus formájú preconditionálásról vannak, a májban lejátszódó folyamatok szereplőiről, pontos dinamikájáról csupán szórványos irodalmi adatok állnak rendelkezésre. A fentiek mellett a témaválasztást továbbiakban indokolja, hogy az egyes szervekben lejátszódó IR károsodásra adott szöveti szintű válaszreakciók, illetve ezek kivédésére használható szerek spektruma igen eltérő. A szívvel kapcsolatban a preconditionálásról szóló ismereteink a legrégebbiek. Ebben az esetben érvényesül a preconditionálás „tiszta” formája, mivel a myocardiumban speciális szöveti sejtek nincsenek az izomsejteken kívül. A máj esetében sokkal több az ellentmondásos eredmény, bár a preconditionálás jótékony hatása ma már széles körben elfogadottá válik. Ugyanígy az irodalomban csupán szórványos, néhol ellentmondásos

60. oldal


.

.

közlemények jelentek meg a fenti vegyületekkel végzett kémiai előkezeléskről máj ischaemiásreperfúzió

–

mikrocirkulációs

változások

összefüggésben.

A

hatásmechanizmusok tekintetében azonban még különösen sok a tisztázatlan kérdés, mivel májszövet esetén a szervspecifikus sejtek jelenléte (Kupffer, Ito) tovább színezi a képet.

3. MÓDSZEREK A módszerek leírása kapcsán egyes paraméterek meghatározása az I. és II. kísérletben eltérő lehet (ld. pl. TNFα szintek). Itt kerülnek részletezésre a LDF alkalmazása kapcsán bevezetett standardizálási körülmények és matematikai transzformációk, habár újszerűségüket tekintve ezek a dolgozatban didaktikai szempontból inkább az eredmények részbe tartoznának.

3.1. A máj mikr ocir kulációjának mér ése laser Doppler flowmeter r el A máj mikrocirkulációját laser Doppler flowmeterrel (LDF) követtem (MOOR Instruments Ltd. DRT4; kétcsatornás eszköz; λ = 632,8 nm; monokromatikus; 2 mW HeliumNeon Laser). A eszközhöz tartozó 0,5 cm átmérőjű felszíni mérőfejet a máj felett mindig azonos lokalizációba helyeztük: a patkánymáj V. lebenyén, a májszélhez képest 1 cmre, ahol az átlagos szövetvastagság 1 cm. Az eszköz online adatrögzítéssel és számítógépes feldolgozással rögzíti a mérőfej alatti áramlást, a vörösvértest koncentrációt és a hőmérsékletet. A mérések reprodukálhatóságát néhány standardizáló tényezővel biztosítottuk, melyek a befolyásoló tényezők szerepének minimalizálására irányultak: §

Hőmérséklet: Az állatok hőmérsékletét folyamatosan követtük (felszíni mérőfej

méri a májfelszín hőmérsékletét, párhuzamosan rectalis hőmérsékletmérés történt), illetve fűthető műtőasztallal az állatok hőmérsékletét 37,538,5°C között tartottuk. §

Légzőmozgás: Az állatok megfelelő mély anaesthesiája biztosítja a légzési

mozgás ritmusosságát. A görbéken látható áramlási ingadozások a nagyobb erekben meglévő pulzushullámból adódó 12 %os fluxingadozások, artefactumként kezelendők.

61. oldal

.

§


.

Nyomóerő: A máj felszínére kutatócsoportunk által készített rugós rögzítőkar

segítségével, állandó nyomóerő mellett, a mérőfejet lazán helyezettük el a kiválasztott májlebenyre . A mérőfej követi a máj légzőmozgás okozta elmozdulásait, így azonos nyomás mellett ugyanazon területen marad. §

Mérési hely: A mérések során olyan állandó vastagságú szövetet kerestünk a

mérőfej felhelyezéséhez, ahol LDF által azonos vörösvértest koncentrációt mértünk. Így megvalósítható volt, hogy a mérőfej alatt mindig közel azonos Doppler jelet adó szöveti struktúrák helyezkedjenek el. §

Külső fényerő: Az áramlási értékeket befolyásolja a külső fényerősség. Ennek

elkerülésére a mérőfejet leárnyékoltuk.

Az így standardizált mérések eredményeként hőmérsékletre, vörösvértest koncentrációra és szövetvastagságra korrigált fluxot kaptunk, mely a máj mikrocirkuláció változásait az adott terület felett pontosan jelezte.

Visszatérő kérdésként szerepel, mind a nemzetközi irodalomban, mind a tudományos fórumokon, hogy a mérőfej által mért szövetterület áramlása hogyan extrapolálható az egész májra. Válaszként el kell fogadnunk, hogy a máj globális áramalásváltozásait leíró módszer nem létezik. A microcrikuláció jellemzésére szolgáló eljárások a májszövet szerkezeti egységének (májacinus) keringésváltozásait veszik alapul, azaz portalis triad – vena centralis közötti áramlásváltozási fenoménekre próbálnak következtetni. A pontos, állandó területen történő, korábbi kísérleteinkben két vagy több mérőfejjel végzett kísérletek, mérési sorozatok, illetve az ebből származó több száz áramlási görbe elemezése, azt igazolja, hogy (1) a lejátszodó mikrocirkulációs változások bizonyos törvényszerűséget követnek, illetve (2) a máj több pontján hasonló dinamikával játszódnak le. Az előbbi megállapítás részben matematikailag jellemezhető (ld. alább), részben megfigyelésen alapul, tapasztalati tény. Természetesen ismeretes a „noreflow” jelenség a máj tekintetében is, mely ugyanakkor az előbbi állítást abban a tekintetben módosítja, hogy a kapott eredményeket minden esetben fenntartással kell kezelnünk, illetve, hogy a máj mikrocirkulációjának vizsgálatakor kapott, mérési

62. oldal


.

.

hibának tartott gyenge ármalási jelek megfelehetnek ezen jelenség klinikai manifesztációjának. Éppen ezért a máj mikrocirkulációjának globális jellemzésére alkalmas eszköz kifejlesztésére nagy az igény. A laser Doppler flowmeter folymatos méréseiből, a vizsgált területről, egy perc alatt 15ször, azaz 4 másodpercenként rögzítettünk adatot. A LDF által szolgáltatott áramlási adatok arbitrális skálán szerepelnek. Mivel az egyedek alap májszöveti áramlásértékei eltérőek, ezért a görbék nehezen összehasonlíthatóak. Az áramlási adatok, görbék összehasonlíthatóságára ezért munkacsoportunk által a görbék matematikai korrekciója történt [168]. Az áramlási görbe regisztrálása a beavatkozás előtt kezdődött (baseline), majd az ischaemia, illetve a reperfúzió alatt folyamatos volt. A reperfúzió előtti beavatkozás kb. 57 mpes zavaró jeleket idézett elő, amelyek a máj mozgásából adódtak. E periódus jeleit nem értékeltük. Az ischaemia alatti áramlást zajnak vettük (biological zero), és egy új, relatív skála nulla értékeként szerepelt. A máj felszínére, nyugalmi állapotban, az ischaemia előtt elhelyezett mérőfej által regisztrált áramlási alapértéket (baseline) vettük a relatív skála 100as értékének:

T flux =

flux - bz ´ 100 baseline - bz

Tflux: korrigált áramlási érték; flux: mért áramlási érték; bz: biological zero, az ischaemia alatt mérhető áramlás; baseline: normál, alapáramlás az ischaemia előtt. Fenti matematikai korrekciónak köszönhetően a különböző egyedeknél mért áramlási görbék összehasonlíthatók lesznek, és a jel/zaj aránya maximális lesz (15. ábra) . A kapott 0100 %os skálába illesztett görbéken látható egy kiindulási (baseline) 100% os kezdeti, alapáramlás, majd nulla százalék körüli, kb. + 5%os ingadozást mutató ischaemiás periódus. Az ezt követő reperfúzió leírására újabb fogalmakat vezettünk be [168]:

63. oldal

.

§


.

Plató maximum (PM): A reperfúziós áramlási görbe karakterét vizsgálva

látható, hogy egy meredek emelkedést követően az áramlás normalizálódik, csak lassan emelkedik. A vizsgált áramlási görbe lefutásából maximálisnak vált értékkel, értékekkel lehet jellemezni az áramlási maximumot. Ugyanakkor egy több száz (60 perc reperfúzió esetén: 60 x 15 = 900) mérési pontból származó görbe esetén ezen egyetlen szám kiválasztása nem helyes, túlzottan önkényes. Éppen ezért a görbéhez úgy „rendelhetünk” egy áramlási maximumot leíró számot, hogy a reperfúziós szakasz laposodó, stabil áramlást mutató szakaszán tetszőlegesen kiválasztott időintevallumhoz (utolsó mért 5 perc = 75 mérési pont) tartozó szakasz értékeit átlagoltuk. Ezt – önkényesen Plató Maximumnak neveztük. Jogosan merül fel a kérdés, hogy hogyan lehet valami, ami átlag, egyben maximum? Az átlag általában valamely sorozat maximális és nem maximális értékeinek bizonyos középértéke szokott lenni. Ezen esetben viszont Plató Maximumnak önkényes módon a kísérletben egyegy reperfúziós görbe utolsó 5 percében látható stabil áramlási értékek számtani közepét jelenti. Mértékegysége: % baseline

bz

A

B

15. ábra: LDFrel regisztrált áramlási görbék. (A) A különbőző kiindulási fluxok után (baseline) létrehozott ischaemia (bz) majd ezt követő reperfúzió kapcsán egymással nehezen összevethető görbéket kapunk. A fenti képlet használata után látható, hogy az eltérő kiindulású, más bz értékű görbék ugyanazt az áramlási fenomént írják le (B). Ezen utóbbi, azonos lefutású görbék a 0100 % ytengelyben ábrázolva összehasonlíthatóak, ezen esetben identifikusak.

§

Reper fúziós terület (RT): A PM önmagában nem írja le a vizsgált reperfúziós

idő alatti áramlási változások dinamikáját, az adott területen átáramló vér mennyiségét.

64. oldal

.


.

A reperfúziós terület , azaz a reperfúzióhoz tartozó görbe alatti terület jól jellemzi az átáramlott volument. A görbe alatti terület kiszámításánát integrálással végezhetjük el. Ennek eredményeként a 4 másodpercenként felvett áramlási értékekhez tartozó területek összegét kapjuk meg. Így Repefúziós Területnek neveztük az áramlási görbe reperfúziós szakasza alatti területet. §

Reper fúziós Maximális Idő (RMI): A reperfúziós görbe karakterének

jellemzésére, ischaemia

a

mikrocirkuláció

utáni

helyreállásának

leírására szolgál a görbe meredeksége. A görbe felszálló szárára fektetett regressziós egyenes és az önkényesen stabil áramlásúnak leírt (áramlási ingadozás kisebb mind 5%) plató szakasz melynek hossza nem feltétlenül egyezik a PM számításához használt

hosszúsággal

metszéspontjából

kapjuk

– meg

a

Reperfúzióhoz használt Maximális Időt (RMI). A metszéspont a görbe

16. ábra: A reperfúziók jellemzése: a reperfúziós görbe leírására PM, RT, RMI használható. A különbőző reperfúziós görbék összehasonlítása egy ideális reperfúziót alapul véve a területarányokkal végezhető el.

karakterétől függően a görbe alatt vagy felett helyezkedik el (16. ábra). A „noreflow” jelenség, illetve a makroszkóposan látható foltos reperfúzió miatt (ld. később !) az RMI értelmezése bonyolultabb, mint az előbbi két paraméteré (PM, RT). §

K RT : A fenti paraméterek (PM, RT) csupán egyegy görbét jellemeznek. Ezen

adatok egy része (PM) már alkalmas két különböző állatból nyert mikrocirkulációs változások jellemzésére. Ugyanakkor a területintegrálból nyert RT önmagában nem informatív. Két görbe összehasonlításakor a RTek abszolút értékük összevetése csupán a kisebbnagyobb relációra enged következetni, a gyakorlatban nehezen kezelhetőek az intgerál ereményeként megjelent, több ezres nagyságrendű számok. Éppen ezért egy újabb, könnyen számolható és használható arányszámot vezettünk be, amit „KRT”val

65. oldal

.


.

jelöltünk. Ehhez egy hipotetkus modellt, áramlási helyzetet kell felállítanunk. Az ideális egy olyan helyzet lenne, ahol az ischaemiát követő reperfúzió 0. pillanatában már a kezdeti áramlási értékekkel azonos, 100%os áramlási értéket regisztrálnánk. (16. ábra piros áramlási görbe). Ezen görbe reperfúziós területe (RT0) maximális.

KRT értknek az aktuális áramlási görbe reperfúziós területének (RTx) és egy hipotetikus, ideális áramlási görbe reperfúziós területének (RT0) arányát értjük:

K RT =

RT x ´ 100 RT 0

Ezzel az arányszám bevezetése gyakorlati haszonnal jár: két görbe reperfúziós területének összehasonlításakor nem ezres nagyságrendű számokkal kell dolgoznunk, hanem egy könyebben áttekinthető 0100–as skálarendszerben kapunk számokat, százalékban. A kutatócsoportunk által létrehozott, a LDF szoftveréhez illeszkedő, a regisztrált mérési pontokkal dolgozó Excell program segítségével ezen számolás automatikus.

Összefoglalva, továbbiakban az ischaemiareperfúzió laser Doppler flowmeterrel rögzített adatait a következő értékekkel jellemezzük: § PM: Plató Maximum § RT: Reperfúziós Terület § RMI: Reperfúziós Maximális Idő § K RT arányszám: A minta RT–ének ideálishoz való viszonya.

§ Gyakor lati szempontok: Méréseink feldolgozása során további szempontokat kellett még figyelemb vennünk: (1) Minden áramlási görbét egyedileg (is) értékeltünk, úm: grafikus megjelenítés, lefutás, karakter jellemzése, PM, RT, RMI. (2) A kísérleti elrendezés szempontjából egy csoportban tartozó egyedek, 4 másodpercenkét rögzített áramlási értékeit átlagoltuk (17. ábra). Így egy átlag áramlási görbét kaptunk. Tekintve a kísérletek menetét (ld. később) ez 1010 db állat vizsgálatát,

66. oldal


.

.

azaz 1010 db egyéni áramlásgörbe átlagolását jelentette. Ezt követően jelenítettük meg a görbét garfikus formában, majd elvégeztük a fent leírt matematikai transzformációkat (PM, RT, RMI). (3) Megállapítható volt, hogy az átlaggörbéhez tartozó szórás kellően alacsony volt, az elfogadható hibahatáron belül mozogott. Mint ahogy az a görbék egyesével való elemzésekor is általános

%

1 2 0

jelenség volt, hogy a

1 0 0

reperfúziós periódus kb.

8 0

utolsó harmadában az

6 0

áramlás stabilizálódott.

4 0

Így a 10 görbe átlagának

2 0

szórása

0 0

//

sec 2 8 4 4 á t l a g

3 2 4 4

3 6 4 4

á t la g + s z ó r á s

17. ábra: Áramlási görbe szórásokkal. 10 db áramlási görbéből számított átlag szórásokkal

is

egyre

csökkent. Mint később látható,

hosszabb

ischaemiás (90 min) periódusok után ezen

stabilizáció a szöveti architektúra nagyfokú dezorganizációja miatt nem mindig jött létre. (4) A kapott átlag áramlási görbét összvetettük az átlagot adó, 10 db kiindulási görbével. Azon esetekben, ahol az állatból nyert egy–egy áramlási görbe nagymértékben (karakter, PM, RT) eltért a kapott átlag áramlási görbétől azokat a mintákat és állatokat a vizsgálatból kizártuk, a kísérletet megismételtük. Ilyen esetekben, nagy százalékban technikai hibát vettünk észre (nem kellő kirekesztés, az állat oxigenizációjának zavara, teljes testet érintő hypoxia stb.) (5) A dolgozat további részében: § a görbék jellemzésekor a számított paraméterek (PM, RT, RMI) kapcsán csupán az adott kísérleti csoportban kapott átlagot (n=10) tüntetem fel. Nem kerülnek részletezésre az állatok egyedi áramlásgörbéi. (Célszerű lett volna ennek megfelelően minden PM; RT és RMI érték megjelenítésekor, a 10 görbe átlagát jelző „átlag” alsó indexszel is ellátni (pl: PMátlag) de ettől eltekintettünk kerülve a már így is zsúfolt jelölésrendszer tovább bonyolítását).

67. oldal

.


.

§ az ischaemiás időtartam feltüntetésekor a lépték nem folytonos, az xtengelyen lévő törés (//) a kirekesztés idejét jelenti; csupán az ischaemiás periódus első és utolsó 5 perce van ábrázolva.

3.2. Szövettan Minden állatból, műtéttípustól függetlenül, azonos anatómiai helyről, 3 db mintát vettünk. A májszeleteket 10 %os formalinban fixáltuk 24 órán át, majd paraffinba ágyaztuk. A szövettani vizsgálatokat konvencionális fénymikroszkópos elemzéssel végeztünk 35 µmvastag metszeteken, hematoxilyneosin (HE) festést követően. A kiértékelés szemikvantitatív módon, táblázatos regisztráció alapján történt, 5, egymást át nem fedő látótérben. Az alábbi eltéréseket vettük figyelembe: (1) sejtduzzadás, (2)

sinusoidális pangás, (3) vénatágulat, (4) szöveti bevérzés, (5) gyulladásos sejtek jelenléte, (6) necrosis jelei: vacuolizáció,

karyolysis,

karyorrhexis, eosinophilia, (7) apoptózis jelei: sejtzsugorodás, a

kromatin

marginizációja,

kondenzációja, fragmentációja, „apoptotic body” megjelenése (18. ábra). A vizsgáló patológus 18. ábra: Apoptózis szöveti jelei: (1) sejtzsugorodás; (2) kromatin marginalizá ció; (3) kondenzáció és fragmentáció (4)” apoptotic body” k megjelenése. Forrás: Jaeschke H, Gastroenetrology, 2003

a minták jelzését nem ismerte, a csoportbeosztás,

illetve

a

beavatkozás módja és ideje tekintetében

nem

volt

tájékozott. A fenti elváltozások az alábbiak szerint kerültek pontozásra: 0: nincs változás, +: a látótér vagy szöveti struktúra (pl. portális triad, epeút) sejtjeinek kevesebb mint 10%a érintett, ++: 1040 %, +++: több mint 50% érintett. A maximálisan adható pontok összege a fenti szempontok (17) alapján 7 x 3 (azaz: „+++”) = 21 volt. 7 pont alatt a károsodás mértékét enyhének, 714 között középsúlyosnak, 14 pont felett súlyosnak véleményeztük.

68. oldal

.


.

3.3. Immunhisztokémia 3.3.1. TUNEL Az apoptózist jellemző DNS fragmentáció vizsgálatához TUNEL (terminal deoxyribonucleotidyl transferasemediated dUTPdigoxigenin nickend labeling) assay t végeztünk. A módszer lényege, hogy a DNSlánc törések miatt kialakuló szabad 3’ hidroxilvégeket deoxynucleotidiltranszferáz enzim segítségével és jelölt dUTPval detektáljuk. A TUNEL assayhez kereskedelmi forgalomban levő kitet használtunk (ApopTag in situ apoptózis detection kit, Chemicon), és a gyártó által javasolt protokollt követtük. Röviden, a szöveteket neutrál pufferolt formalinban fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk és 4μmvastag metszeteket készítettünk. A deparaffinálást követően 20 μg/ml DNasementes Proteináz Ks (Sigma) emésztéssel végeztünk antigénfeltárást. Az endogén peroxidáz aktivitást 3% H2O2dal blokkoltuk. A DNS szabad 3`OH végeinek jelölésére a metszeteket 1 órán át inkubáltuk terminális deoxynucleotidyl transferáz (TdT) enzimmel és digoxigenindUTPt tartalmazó nukleotid keverékkel. A digoxigeninnel konjugált nukleotidok detektálásához tormaperoxidázzal konjugált antidigoxigenin antitestet és a reakció láthatóvá tételéhez, 3`diaminobenzidint (DAB) alkalmaztunk. A metszeteken metilzölddel (Vector) végeztünk háttérfestést. A TUNEL reakció értékelését fénymikroszkóp (200x nagyításon, Olympus BX mikroszkóp) segítségével végeztük. Tíz egymást nem átfedő területen 1000 sejtet számoltunk meg és a TUNEL pozitív sejtek számát az összes sejt ezrelékében fejeztük ki.

3.3.2. Aktív kaszpáz3 immunhisztokémia A májszövetet neutrál pufferolt formalinban fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk és 4 μm vastag metszetet készítettünk. A deparaffinált szövetet rehidráltuk, az endogén peroxidáz aktivitást 0,6% os hidrogén peroxidban blokkoltuk, majd 10 mMos citrát pufferben (pH 6,0) végeztünk antigén feltárást mikrohullámú sütővel (20 perc). Mosást követően az aspecifikus kötődés megakadályozására a szövetet 1,5%os kecske szérummal blokkoltuk (1 óra, szobahőmérsékleten). Az aktív kaszpáz3 detekciójára a szöveteket poliklonális antitestettel (1:100, Chemicon) egy éjszakán át inkubáltuk 4 o C on. A detekcióhoz biotinált szekunder antitestet, és az ABC módszert használtuk. Kromogénként diaminobenzidint (DAB) alkalmaztunk, majd háttérfestést Gill féle

69. oldal

.


.

hematoxylinnal végeztünk. A reakció értékelését fénymikroszkóp (200x nagyításon, Olympus BX mikroszkóp) segítségével végeztük. Tíz egymást nem átfedő területen 1000 sejtet számoltuk meg és a pozitív sejtek számát az összes sejt ezrelékében fejeztük ki.

3.3.3 Poli(ADPribóz) immunhisztokémia AntiPAR vizsgálatokat csupán az áloperált, IR és PJ34 előkezelt csoportokon végeztünk, igazolandó a PARPinhibitor működésének hatásosságát. A formalinban fixált szöveteket paraffinba ágyaztuk és 4 μm vastag metszeteket készítettünk. A deparaffinált metszeteket 0,6% hidrogénperoxiddal kezeltük, hogy az endogén peroxidáz aktivitást gátoljuk, majd 0,2 M citrát pufferben (pH 3,0) végeztünk antigén feltárást mikrohullámú sütővel. A metszeteket 2% normál kecske szérummal szobahőn blokkoltuk 1 órán keresztül, majd 4 o Con inkubáltuk egy éjszakán át 1:2000 titerben poliklonális nyúl PARellenes antitesttel (Calbiochem). Ezt követően biotinilált szekunder antitesttel (1:200), és ABC reagenssel (Vector) inkubáltuk a metszeteket. A peroxidáz aktivitást DAB kromogénnel detektáltuk, majd hematoxylinnal végeztünk háttérfestést. Tíz egymást át nem fedő területen 1000 sejtet számoltunk meg és a pozitív sejtek számát az összes sejt ezrelékében fejeztük ki.

3.4. TNFα szint 3.4.1. TNFα szint vitalitáspróbával A TNFα szintet életképességteszt szerint határozzuk meg az I. kísérletben a reperfúzió 30. percében. Sejttenyészet: A biológiailag aktív TNFα tartalmat WEHI 163 TNF szenzitív sejtvonal segítségével határoztuk meg. A sejttenyészetet 10% FCS tartalmú DMEM (Dulbecco által módosított MEM,Sigma) tápfolyadékban tartottuk fenn. 24 órás inkubálás után határoztuk meg MTT redukciós teszt segítségével.

Redukciós kapacitás mérése: MossmanHansen szerint [169;170]: a MTT ( 3(4,5 dimetiltiazolil)2,5,difeniltetrazolium) kék színű formazanná redukálódik a sejtek NADH, NADPH tartalmával arányos mennyiségben. A redukált koenzim tartalom jó közelítéssel vethető össze bioszintetikus aktivitásuk mértékével, ezért a módszer alkalmas életképességük mérésére. Optikai denzitás mérése: A sejteket 96 lyukú növesztő tálcán a sejtfolyadékban oldott 0,25 mg/ml MTTvel inkubáltuk 3 órán át

70. oldal

.


.

37 o Cos CO2 termosztátban. A sejtanyagot háromszoros térfogatú savas (0,08M HCl) izopropilalkohollal oldottuk, majd a formazantartalmat 630 nm referencia és 570 nm mérési hullámhosszokon fotometriás úton mértük. Az egyes adatpontokat 8 párhuzamos mérés átlagaként adtuk meg. A kapott optikai denzitás értékekből az aktív TNFα tartalmat ismert koncentrációjú TNFαval készített kalibrációs sor alapján határoztuk meg, pg/mlben adtuk meg.

3.4.2. TNFα ELISA A szérum TNFα szintet szendvics ELISA módszerrel mértük a II. kísérletben, a reperfúzió 6. órájában, a kereskedelmi forgalomban elérhető kit segítségével (TNFα immunoassay kit, R&D Systems, Minneapolis, USA). A mérésnél a gyártó által javasolt eljárást alkalmaztuk, kalibrálási görbét rekombináns egér TNFα hígítási sorával készítettünk. Minden mérést duplikátumban végeztünk. A TNFα ellenes antitesttel bevont ELISA plateet 100 μL szérum mintával szobahőmérsékleten 2 órát inkubáltuk. Ismételt mosást követően a plateet polyclonalis antiTNFαtormaperoxidáz konjugátummal 2 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk. A mosási lépés után hydrogenperoxid és tetrametilbenzidin segítségével színreakciót idéztünk elő. A színváltozást 20 perc múlva leállítottuk kénsav hozzáadásával. Az abszorbanciát 450 nmen mértünk. Az abszorbancia értékekből a rekombináns TNFα standard segítségével készített kalibrációs görbe alapján számítottuk ki a szérum TNFα koncentrációkat, pg/mlben adtuk meg.

3.5. Labor atór iumi par améter ek Az állatokból vett vérminták alvadásgátlását EDTAval hoztuk létre, 10 percig, szobahőmérsékleten centrifugáltuk (3000 r.p.m.), majd a hemolízismentes, sejtmentes felülúszót, szérumot elválasztottuk a sejtes elemektől. Kémiai analízisek elvégzéséig a mintákat 80 o Con folyékony nitrogénben tároltuk. 24 órán belül, 2,5szeresre történt hígitás után spektrofotometrián alapuló, laboratóriumi automatán (Hitachi 747) rutin tesztek felhasználásával elvégeztük a méréseket. A kapott értékeket a hígítási arányból visszaszámoltuk. Szérum alanin aminotranszferázt (ALT), aszpartát aminotranszferázt (AST), laktát dehidrogenáz (LDH), szérum bilirubin (seBi) szintet mértünk.

71. oldal

.


.

3.6. Oxidatív str essz vizsgálata Az antioxidáns státusz vizsgálatát csak a II. kísérletben

végeztük

májhomogenizátumból és szérumból. Májhomogenizátum: A rezekált májszeletek egy részét apró darabokra vágtuk, majd 10%os KCl oldatban többszöri mosással annak vértartalmát csökkentettük. Ezután a májszövet homogenizálását PotterElvehjem készülékkel jeges hűtés mellett (0 –4 o C) végeztük. A májhomogenizátumok fehérjetartalmát 10 mg/mlre állítottuk be, 0,15 M KCloldattal, Lowry szerint. Szérum vizsgálatok: Az állatokból vett artériás vérminták alvadásgátlását EDTA val hoztuk létre, 10 percig, szobahőmérsékleten centrifugáltuk (3000 r.p.m.) majd a hemolízismentes szérumot elválasztottuk a sejtes elemektől. Kémiai analízisek elvégzéséig a mintákat –80 o Con folyékony nitrogénben tároltuk.

3.6.1. Luminometriás összscavanger kapacitás mérés HeideBögl módszer e Blázovics féle módosítással [171]. Az össz scavanger kapacitás mérése a májhomogenizátum mintákból történt. A reakcióelegy hidrogén peroxidot, luminolt és mikroperoxidázt (SIGMA, St. Louis) tartalmazott. A mérés elve: a luminol szabadgyökök hatására gerjesztett állapotba kerül, és fényt bocsát ki, amelyet luminométerrel (Lumat LB9051; Lumat Bertold, Windbad, Germany) detektálni lehet. A fényintenzitást a gyökfogó vegyületek csökkentik. Az eredményeket Relative Light Unit (RLU) egységben adtuk meg. A fényintenzitás (RLU) arányos a mintában található szabadgyökök koncentrációjával. Az alkalmazott eljárások közül ez a legérzékenyebb a redoxstátusz meghatározásában, az antioxidánsok kimutatása nmol nagyságrendben történik.

3.6.2. Redukálóképesség meghatározása Oyaizu [172] módszere szerint a redukálóképesség a szérum és a szövet teljes antioxidáns képességéről informál (antioxidánsok+fehérjék). Korábbi felfogás szerint az oxidáció az oxigénnel való egyesülés vagy a hidrogénelvonás (dehidrogénezés), a redukció az oxigén elvonás, illetve a hidrogénnel való egyesülés volt. Mai felfogásunk szerint az oxidáció elektron leadást, a redukció elektron felvételt jelent.

72. oldal

.

A


vizsgálati

minták

(májhomogenizátum,

szérum)

.

redukálóképességének

meghatározása a Fe 3+ → Fe 2+ redukciós átalakulás alapján történt. A mért színintenzitás egyenesen arányos a vizsgált minta redukálóképességével. Referencia vegyületként aszkorbinsavat használtunk. A minta redukálóképessége aszkorbinsav ekvivalensben (ASE) szerepel. A vizsgálati minta redukálóképessége akkor 1 ASE, ha hatása 1 μmol aszkorbinsav redukálóképességével egyenértékű. A kapott érték fordítottan arányos a minta antioxidáns tulajdonságával.

3.6.3. Hidrogéndonor aktivitás meghatározása A mintákban (májhomogenizátum, szérum) található fehérjéket metanol (MERCK, Darmstadt) hozzáadásával kicsaptuk, így antioxidáns tulajdonságukat megszüntettük. Éppen ezért ez a módszer a fehérjéhez nem kötött antioxidáns kapacitás mértékéről informál. Blois és Hatano [173] módszere szerint 1,1difenil2pikrilhidrazil stabil gyök jelenlétében mértük 517 nmen spektrofotométerrel. Az aktivitás mérésének alapját az 1,1difenil2pikrilhidrazil (DPPH) gyök 517 nmen történő detektálása képezi. A DPPH viszonylagos stabilitása révén megbízhatóan fotometrálható molekulagyök, melynek abszorbancia maximuma 517 nmnél mérhető. Az analitikai reakcióban a molekula Hatomok jelenlétében (melyet a vizsgálandó Hdonor aktivitással rendelkező vegyületek szolgáltatnak) könnyen regenerálódik, mely folyamat eredményeként az abszorbancia csökken. Az eredményt gátlás %ban adtuk meg.

3.6.4. Szabad szulfhidril (SH) csoportok meghatározása A szabad szulfhidril (SH) csoporttal rendelkező anyagok kifejezett antioxidáns tulajdonsággal bírnak. Példaként említhető a fehérje láncok SHcsoport tartalma (cisztein aminosav) és a glutation (GSH) antioxidáns hatása. A szabad SHcsoportok mennyiségének meghatározása Sedlak [174] módszere alapján történt, a fehérjékhez kötött antioxidáns paraméterekről informál. Méréseinket spektrofotométerrel végeztük májhomogenizátumból és szérumból, Ellman reagenssel (5,5ditiobisznitrobenzoesav, SERVA) pH 7,4 Nafoszfát pufferben 512 nmen.

73. oldal

.


.

3.6.5. Biológiai minták fehérjetartalmának meghatározása Lowry [175] szerint a fehérjetartalmat fotometriásan 650 nmen standardként tiszta kristályos bovin szérumalbumint alkalmazva határoztuk meg. A kapott értékek mmol/g protein mértékegységgel szerepelnek. A külön meg nem jelölt felhasznált vegyszerek, oldószerek analitikai tisztaságú Reanal készítmények voltak. Az oldatok készítéséhez minden esetben bidesztillált vizet használtunk. A pufferek pHját Reanal gyártmányú standard pH oldatok segítségével, Radelkis OP264/1 laboratóriumi pH mérővel állítottuk be.

3.7. Kísér leti elr endezés, műtéttechnika 3.7.1. Törvényi háttér Kísérleteink során szigorúan betartottuk az 1998. évi XXVIII. sz. állatvédelmi törvényt, valamint a 243/1998 (XII. 31) Kormányrendelet szerint elvárt követelményeket. Kísérleteimet a 1858/000/2004 számú engedély alapján, a Semmelweis Egyetem EÁB által kiállított, állatkísérletek végzésre feljogosító 27/2000 sz. bizonyítvány megszerzése után végeztem el. A Semmelweis Egyetem I. sz. Sebészeti Klinikáján 1997 szeptemberétől a T/022466 sz. OTKA kutatási program keretében folynak a májmikrocirkulációs vizsgálatok. Az I. kísérletet felölelő anyagot az OTKA bírálóbizottsága „kiváló”nak minősítette. A II. kísérlet a Magyar Mesterséges Táplálásért Alapítvány és az Inotek Pharmaceuticals Corporation (Massachusetts, Beverly, USA) segítségével jött létre.

3.7.2. Csoportbeosztás 3.7.2.1. I. Kísérlet: Ischaemiás preconditionálás – ischaemiar eperfúzió Ebben a kísérletben a 30, 45, 60 és 90 percig tartó ischaemiás periódusokat követő 30 perces reperfúzió utáni mikrocirkulációs, szövettani, rutin labor és TNFα szint (korai oxidatív stressz) változásokat vizsgáltuk, 1 hetes túlélést követve, csoportonként 1010 állaton.

74. oldal

.


.

30 perc

45 perc

60 perc

90 perc

ischaemia

ischaemia

ischaemia

ischaemia

IR

10

10

10

10

IP + IR

10

10

10

10

1. táblázat: Az I. kísérlet elrendezése a kísérletbe bevont állatok számával

3.7.2.2. II. Kísér let: Kémiai előkezelések – ischaemiareper fúzió Az első kísérletből levont következtetések alapján (ld. Eredmények), a kritikusnak tartott 60 perces ischaemiát követő 60 perces reperfúziót vettük alapmodellnek. A kísérletet kiegészítettük ischaemiás preconditionálással, PJ34 PARP inhibitor, illetve glutamin előkezeléssel. A posztoperatív 6. órában, az állatok leölése után, vizsgáltuk a késői oxidatív stressz jellemzőit, a necrosis, apoptózis jelenlétét. Csoportonként 1010 állatot használtunk fel, túlélő állat nem volt.

Áloperált

Állatok

10

Ischaemia reper fúzió

Ischaemiás

PJ 34

Glutamin

preconditionalás

előkezelés

előkezelés

+ IR

+ IR

+ IR

10

10

10

10

2. táblázat: A II. kísérlet elrendezése a kísérletbe bevont állatok számával

3.7.3. Az operáció 3.7.3.1. Az I és II. kísér letoperáció közös részei Tekintettel az I. és a II. kísérlet különbségeire (nem túlélő/túlélőállatok, ischaemia, reperfúzió ideje stb.), itt csupán a közös jellemzők kerülnek feltüntetésre. Állatok: Kísérleteinkhez (III) 250260 gramm súlyú, spf, hím Wistar patkányokat használtunk /Charles River Magyarország Kft/. Preoperatív időszak: Az állatok száraz tápot és vizet kaptak ad libitum, a műtét előtti 12 órában csak vizet biztosítottunk számukra. Tartásuk a napszaki változásokat követő mesterséges világítás mellett, 2224°Cos hőmérsékleten történt.

75. oldal

.


.

Műtét ideje: A műtéteket mindig azonos időben végeztük, hogy elkerüljük a cirkadián ritmus zavaró hatásait. Anaesthesia: Az állatokat intraperitonealisan adott 90mg/ttkg ketaminnal (Calypsol ® ) + 10 mg xylasinnal (Xylasin ® ) altattuk el, majd az altatás fenntartására 50 mg/ttkg/h ketamint adtunk infúziós pumpa segítségével a jobb oldali vena jugularis internán keresztül. Testhőmér séklet: Az állatok hőmérsékletét rectalisan és a májfelszíni mérőfejen át folyamatosan regisztráltuk. Fűthető műtőasztal segítségével az állatok hőmérséklete a kísérletek alatt mindvégig 37,538,5°C között volt tartható. Kirekesztések anatómiai alapja: A máj ischaemiás károsodásának vizsgálatára számos módszert dolgoztak ki, melyek közül az alapvető céloknak megfelelő patkány modellt

a

Semmelweis

Egyetem I. sz. Sebészeti Klinikáján 1974 és 1979 között során

végzett

kísérletek

fejlesztették

ki

(Kupcsulik és mtsai, 1977) [2;3;2729;41;176]. nemzetközi ismert

A

irodalomban

további

modellek

lényegében ezen alaptípus változatai (Clemens 1985, Sepherd

1987,

Wheatley

1993, stb.). A modellek

19. ábra: A patkánymáj szerkezete. IIIIVV lebeny: jobb és bal lebeny ; III: „ lobus quadratus” ; VIVII: „ lobus caudatus” Rajz: Mihály Zoltán

lényege az, hogy a patkánymáj lebenyezett szerkezete révén (19. ábra) a kiválasztott lebenyek keringése megszüntethető, a máj és splanchnicus keringés a reziduális lebenyeken át zavartalan. Így nem alakul ki splanchnicus pangás, illetve nincs anhepaticus fázis. Ezzel elkerülhetőek az előbbiek multiviscerális károsító hatásai. Az ischaemia és reperfúzió alatt mindvégig az explorált hasüreget nedves lappal fedtük le.

76. oldal


.

.

3.7.3.2. I. kísér let részletes leírása LDF

Kontroll szövettan

X IP + IR : 30456090 min VAGY: IR: 30456090 min

Ischaemia

Reper fúzió

X X

Reper fúziós szövettan

Ischaemiás szövettan

7. posztoperatív nap

1. posztoperatív nap

7. posztop.

X IR szövettan

20. ábra: Az első kísérlet vázlatos menete. Rajz: Mihály Zoltán & Szijártó Attila

12 órával a beavatkozás előtt 0,5 ml vérmintát vettünk farokvénából (kontroll minta: seBi, ALT, LDH, bazális TNFα szint meghatározás), melyet fiziológiás sóoldattal pótoltunk. A műtét napján az anaesthaesia bevezetését, majd median laparotomiat

77. oldal

.


.

követően a májat rögzítő peritoneális szalagokat átvágtuk, az I. és II. lebenyeket a retroperitoneumból felszabadítottuk. A VI. lebenyt kontroll hisztológiai mintavétel céljából eltávolítottuk. Az I, II, V. lebeny ischaemiáját az odavezető pediculumra – szegmentális biliovascularis nyélre – helyezett atraumatikus mikroklippel hoztuk létre. Az ischaemia ideje csoportonként 30, 45, 60, 90 perc volt. A leszorítás alatt a splanchnicus keringés zavartalan volt, minthogy a portális áramlás a máj ép lebenyein (III., IV. és VII. lebenyen, összvolumen mintegy 40%án [177]) át megtartott maradt. Az áramlást LDFrel vizsgáltuk folyamatosan az V. lebenyen. Az ischaemiás preconditionálást minden csoportban, 1 ciklusban [5 perc ischaemia – 10 perc reperfúzió] hoztuk létre a tervezett ischaemiát megelőzően. A prolongált ischaemiát követően a I. lebenyt hisztológiai vizsgálat céljából rezekáltuk. A csoportonként eltérő ischaemiás idők letelte után a microklippeket eltávolítottuk. A reperfúzió 30. percében a II. lebenyt rezekáltuk szövettani feldolgozásra. A 30 perces vizsgált reperfúzió végén vénás vérmintát vettünk TNFα szint meghatározásra. Az állatok így az ép IIIIVVII., valamint az IRkárosított V. lebennyel éltek tovább (jelen „maradék” májlebeny súlyarányok alapján /ld.: 3.7.8. fejezet/ 50 % ép, 50 % IR károsodott). Az állatok a preoperatív időszaknak megfelelő körülmények között éltek tovább. A v. jugularis kanült eltávolítottuk, az állatokat izolálva gondoztuk. További vérmintát vettünk: az első posztoperatív napon minta: seBi, ALT, LDH meghatározás céljából. Az állatokat a hetedik posztoperatív napon kivéreztettük, majd a vérmintákat (seBi, ALT, LDH), illetve az V. (IRkárosodott) lebenyből szövettani mintát vettünk. Az időközben elhullott állatokat felboncoltuk, a kóros patológiai jegyeket rögzítettük (20 ábra).

3.7.3.3. II. kísér let részletes leírása Az első kísérlettől eltérően, itt nem terveztünk túlélő állatokat, így a metodika különbözött a fentiektől, illetve a vizsgált reperfúziós idők és a mintavételi időpontok sem egyeztek. Légútbiztosítás, érkanülálás: Az ip. anaesthesiaindukció után lege artis tracheakanült helyeztünk be a légutak nyitva tartására. Ezután a jobb alsó végtag arteria és vena femoralis kipreparálása után az erekbe lege artis polietilén kanülöket vezettünk be. Ugyanilyen kanült helyeztünk a jobb vena jugularisba is. Az arteria femoralison át

78. oldal

.


.

bevezetett nyomásmérővel (Biopac MP100 system, SDR, Sydney) regisztráltuk az állatok artériás vérnyomását, ill. a vénás kanülök vérminta vételére és egyéb oldatok beadására (jugularis vénás kanül: PJ34, fiziológiás sóoldat) használtuk. A femoralis vénán keresztül 3 ml/ttkg/óra adagban fiziológiás sóinfusiót, infúziós pumpával anaesthetikumot és intravénás bólusban 60 IU/ttkg Naheparint adtunk. PJ 34 PARP inhibitor (21. ábra): A kisérletben a vízben oldható PJ34 szelektív PARP1 inhibitor t alkalmaztuk [Inotek Pharmaceuticals Corporation (Massachusetts, Beverly, USA)]. A PJ34 gátlószer szerkezete: (N(6oxo5,6dihydro phenanthridin2yl)N,Ndimethyacetamide HCl). A PARP inhibitort egy órával a beavatkozás előtt adtuk be az állatoknak 10mg/ttkg dózisban, intravénásan 1 mg/ml törzsoldatból, melyet frissen készítettünk a por alakú gyógyszer fiziológiás

21. ábra: PJ34 PARP inhibitor szerkezete

sóoldattal történt oldása után.

Glutamin (Gln, 22. ábra): Kísérleteinkhez Dipeptiven® (Fresenius Kabi) B05XB02 ATC számú törzskönyvezett (OGYI: 10.070/41/2003) glutamin tartalmú oldatot használtunk, melynek hatóanyaga: l ml oldatban 82 mg/ml Lalaninum (Ala) és 134, 6 mg/ml Lglutaminum (61,8 % Gln). Extrapolálva a humán dózist állatokra, a 22. ábra: Glutamin szerkezete

rágcsálók metabolizmusát is figyelembe véve 1,25szörös térfogathígításával 160 mg/mles Ala+Gln törzsoldatot

nyertünk, mellyel 0,5 ml/óra sebesség mellett – testtömegtől függően – kb. 3 óra alatt 245 mg/ttkg aminosav oldatot infundáltunk, így elérhettük a maximális napi dózis kétszeresét (240 mg aminosav), amely kevesebb a subletális dózisoknál.

Műtét: A megfelelő oldatok (fiziológiás sóoldat, PJ34, glutamin) beadása után 1 órával az artériás kanülből 0,5 ml vérmintát vettünk, melyet 0,5 ml fiziológiás sóoldattal pótoltunk vénás oldalon. Median laparotomia után mobilizáltuk a májat. Az V. májlebenyen 5 percig laser Doppler flowmeterrel alapáramlást mértünk. Az egyik csoportban (IP) 1 ciklusban [5 perc ischaemia – 10 perc reperfúzió] ischaemiás

79. oldal


.

x x x

x

.

x

x x IR szövettan és homogenizátum

Splanchnikus ker ingést fenntar tó shuntök 23. ábra: Az második kísérlet vázlatos menete. Rajz: Mihály Zoltán & Szijártó Attila

preconditionálást végeztünk. A többi csoportban ilyen beavatkozás nem volt. Ezután a III., IV., V. lebenyek biliovascularis nyelére atraumatikus mikroklippeket helyeztünk

60 percre. A májban így – a szerv közel 2/3t érintő [177] – szegmentális ischaemiát hoztunk létre. A I., II., VI., VII. lebenyeken át a splanchnikus keringés zavartalan volt splanchnikus pangás nem jött létre. A 60 perc ischaemia letelte után a I., II., VI., VII. lebenyeket rezekáltuk. Ezután a mikroklippeket eltávolítottuk, így a reziduális lebenyek vérellátása helyreállt. 60 percig kísértük LDFrel az V. lebeny mikrocirkulációját. Ezt követően zártuk a hasüreget, majd a postischaemiás 6. órában mindhárom IR károsodást szenvedett lebenyből (III., IV., V.) 11 db 34mmes szeletet eltávolítottunk szövettani, immunhisztokémiai feldolgozásra. A máj maradék, további részét apró darabokra vágtuk, majd többszöri mosással annak vértartalmát csökkentettük. Ezután a

80. oldal


.

.

májszövet homogenizálását PotterElvehjem készülékkel jeges hűtés mellett (0–4 o C) végeztük. Végül az állatokat az arteria femoralison át exsanguináltuk, a vérmintából szérum antioxidáns paramétereket, TNFα szintet, ASTt, ALTt szinteket mértünk (23. ábra). Az áloperált csoportban a kanülök behelyezését és a laparotómiat követően 60+60 percig nyitva tartottuk a hasüreget, majd a fenti metodika szerint 6. órában mintavétel, illetve az állatok leölése történt.

3.7.8. Májvolumenek Az áloperált állatok (II. kísérlet) máját a kísérlet végén, artériás kivéreztetés után lebenyenként lemértük, hogy pontos adatokat kapjuk az ischaemisált lebenyek/egész máj arányról.

3.8. Statisztikai feldolgozás Az adatok grafikus és statisztikai megjelenítését Microsoft Office 2003 Excel, illetve Statisoft Inc. STATISTICA 6.0 for Windows szoftver segítségével végeztük el. Az átlagértékek közötti különbségeket p<0,05 konfidencia intervallum esetén értékeltük szignifikáns különbségként. A táblázatban a mérések eredményét a mért értékek átlagával és a standard deviáció (± S. D.) megadásával fejeztük ki. A táblázatokban és az ábrákon * karakterrel jelöltük a szignifikánsan eltérő értékeket p<0,05, illetve ** karakterrel p<0,01 valószínűségi szinten. Studentféle egy és kétmintás tpróbát, variancia analízishez kétutas és egyutas ANOVAt használtunk.

81. oldal


.

.

4. EREDMÉNYEK 4.1. I. kísér let er edményei 4.1.1. Haemodinamikai paraméterek Nem volt mérhető szignifikáns különbség az állatok pulzusszáma (382 ± 22/perc), illetve az artériás középnyomás (MAP: 103±15 Hgmm) tekintetében. Ezen paraméterek a 30, 45 perces ischaemiás csoportban nem szignifikáns módon változtak meg a kísérlet alatt, sem az ischaemiásreperfúziós (IR) sem az ischaemiás preconditonálásban részesült állatok csoportjai (IP + IR) között. Általános jelenség volt az ischaemia alatti hypotónia, mely mintegy 10%kal tovább csökkent a reperfúzió kezdeti szakasza alatt, mely így a 60 és 90 perces ischaemiás csoportban a MAP szignifikáns csökkenését (p<0,05) okozta mind az ischaemia mind a reperfúzió alatt.

4.1.2. Mikrocir kuláció Az állatok individuális áramlási adatain végzett matematikai transzformáció után az egy csoporton belüli (n=10) átlagot tüntettük fel (24. ábra, 3. táblázat). A sematikus ábrán (3.1. fejezet: 1516. ábra) is feltüntetett PM és a RT elemzésekor látható, hogy valamennyi ischaemiás csoport között szignifikáns különbség mutatható ki (p<0,05); a Plató Maximum (PM: a reperfúziós görbe utolsó 5 percének átlaga) és Reperfúziós Terület (RT: görbe alatti terület integrálja) értéke fordítottan arányos az ischaemiás idővel.

ISCHAEMIA

Plató Maximum (% )

Reper fúziós Terület arány K RT = (RT x/RT 0) x 100

IR

IP + IR

IR

IP + IR

30 min

90 (± 5)

93 (± 4)

79 (± 6)

82 (± 8)

45 min

66 (± 12)

80 (± 15) *

51 (± 15)

75 (± 12) *

60 min

38 (± 21)

61 (± 18) *

31 (± 12)

60 (± 17) *

90 min

19 (± 13)

28 (± 21)

15 (± 8)

20 (± 14)

3. táblázat: PM és RT értékek

* = Szignif ikáns (p<0,05) különbség preconditionált és nem előkezelt csoportok á ra mlá si pa ra méterei (PM, RT) között.

82. oldal


.

.

Az IPsal előkezelt 45 és 60 perces ischaemiás csoportokban szignifikánsan magasabb (p<0,05) áramlásértékeket mutatott mind a RT, mind a PM a tisztán ischaemizáltreperfundált csoportokhoz képest. A két görbe alakja (IR, IP + IR) közt jelentős eltérés nem látható, az IP csoportok görbéinek meredeksége kifejezettebb. 90 perces ischaemiát megelőző IP áramlásban mutatott eredménye a tisztán ischaemiás csoportokhoz képest nem mutatott szignifikáns (p<0,05) különbséget (3. táblázat). A görbék karakterének vizsgálatakor látható, hogy a rövid (30 perces) idejű károsodást követő meredek emelkedés az ischaemiás idő megnyúlásával laposodik. Azt követően a reperfúzió végéig a platószakasz kissé emelkedik, majd egy szinten beáll. A görbe meredekségére és platófázisra illesztett egyenesek metszéspontjának, azaz a Reperfúziós Maximális Időnek (RMI; 3. táblázat) számítása során az ischaemiás (IR) csoportban az alábbi meglepő értékeket kapjuk: RMI30= 8’ 25”; RMI45= 9’ 23”; RMI60= 9’ 45”; RMI90= 6’ 12”. Az ischaemiás preconditionált csoportokban, az előző adatokhoz képest, csupán a 45 és 60 perces ischaemiás csoportban vannak érdemi eltérések: RMI45= 6’ 03”; RMI60= 7’ 15”. A reperfúzió kezdetén, a 4 ischaemiás, nem előkezelt (I R) csoportok RMI átlagát (RMIátlag = 8’ 23” ± 1’ 53”) nézve megállapítható, hogy egységesen kb. 79 perces időintervallum alatt a mikrocirkuláció kezdeti meredeken emelkedő fázisa befejeződik, innentől a platófázis lassan emelkedik csupán (4. táblázat).

ISCHAEMIA

Ezeken az értékeken az IP sem RMI átlag (min, sec)

javít lényegesen, habár a megjelenő

IR

IP + IR

változás a 45 és 60 perces csoportban

30 min

8’ 25”

8’ 39”

megjelenő változás szembetűnő. Az

45 min

9’ 23”

6’ 03”

adatok

60 min

9’ 45”

7’ 15”

reperfúzió kezdeti szakaszában, egy

90 min

6’ 12”

6’ 19”

rövid intervallumban az átjárható

azt

sugallják,

hogy

a

kapillárisok szintje feltöltődik, innen

4. táblázat: RMI átlagidők

egy lassú „oldódási” szak indul meg. A 90 perces ischaemiás csoportban észlelhető rövid RMI pedig az átjárható, nyitva maradt kapillárisok, nagyerek csökkent számát igazolja. Az előző észrevételeket összevetve a szövettani mintákon (ld.: 4.1.3.) látható morfológiai eltérésekkel, illetve figyelembe véve ezek súlyossági fokát is (+/+++), a jelenség hátterében az alábbi patofiziólógia folyamatok állhatnak: (1) a reperfúzió kezdetén lévő meredek

83. oldal

.


.

emelkedést, a portális és arteriális vér beáramlása okozza. Az ischaemiás idő növekedésével létrejövő fokozott sinusoidalis pangás, leukostasis ezt lassítja. Így pl. 90 perc ischaemia után ezen jelenség nem jelenik meg, a görbe mindvégig lapos; (2) a reperfúzió végéig megjelenő kisfokú áramlásjavulás, javuló tendenciát mutató flux ingadozás a vizsgálat során makroszkóposan is látható, foltos reperfúzió (noreflow jelenség)

oldódásával,

az

érspazmus

megszűnésével

magyarázható.

Ilyen

makroszkópos, foltos reperfúziós jelenség 30 perc ischaemiánál szinte alig, 90 perc ischaemiánal pedig már nem figyelhető meg, tekintve a reperfúziós elégtelenséget. A legszembetűnőbb változások 45, illetve 60 perc ischaemiát követő reperfúzió során jönnek létre.

24. ábra: Különböző idejű ischaemiakat (3090 perc) követő 30 perces reperfúzió LDFrel rögzített áramlásgörbéi; 10 görbe átlagai

84. oldal


.

.

4.1.3. Szövettani feldolgozás Az eltávolított mintákon HE festés történt, az értékelés táblázatos, szemikvantitatív módon végeztük. (ld: 3.2. fejezet)

4.1.3.1. A nem preconditionalt IR csoport Az ischaemiás szövettani mintákban (I. lebeny) az elváltozások a kirekesztés után nem

jellemzően lineárisan változnak az idővel. 30 perces kirekesztést követően csupán sinusoidalis pangás látható (25. ábra), nomenklatúránk szerint (ld.: 3.2. fejezet) a károsodás foka enyhe (6 pont). 45 perc után a vacuolisatio elvétve látható; középsúlyos károsodás (10 pont). 60 perc ischaemia után vénatágulatok, jelentősebb vacuolisatio látható (16 pont), súlyos károsodás. 90 perc ischaemia után a fentiek mellett kifejezett sejtduzzadás, vacuolisatio, karyolysis, karyorrhexis és nagy kiterjedésű necrosis jelenik meg (19 25. ábra: Sinusoidalis pangás

pont). A reperfúzió után vett mintákban (II. lebeny) 30 perces csoportoknál a fenti

kép

ischaemia

változatlan. után

45

perc

vénatágulatok

alakulnak ki, kereksejtes periportális infiltráció jelenik meg, középsúlyos károsodás látható (13 pont). 60 perc után a fenti jelenségek nagyobb számban észlelhetőek (++ / +++; 20 pont), pericentralis foltos necrosisok jelennek meg. A 90 perces csoportban

26. ábra: Összefüggő pericentrális necrosis 90 perc ischaemia után

a legkifejezettebbek a vénatágulatok, és intenzív vacuolisatio, illetve helyenként bevérzett, összefüggő IIIII zónát érintő

85. oldal

.


.

necrosis (26. ábra) látható (21, maximális pont). Apoptózis jeleit – érthető módon a megfigyelés rövid volta miatt – elvétve, vagy nem láttunk. A túlélő állatokból a 7. napon vett mintákban (V. lebeny) 30 perces ischaemia

után

restitutio

ad

integrum, 45 perces csoportban periportalis kereksejtes beszűrődés látható (27. ábra). A 60 perces csoportokban vacuolisatio és egy– egy látótérben, igen kis terjedésű foltos necrosis jelen van (II. zóna) kifejezett periportális kereksejtes beszűrődéssel (15 pont); fibrózis, bridging vagy epeúti proliferáció

27. ábra: Portalis triad körüli kereksejtes beszűrődés egy héttel a műtét után

nem fordult elő. 90 perc ischaemiát túlélő állat nem volt a 7. napon.

4.1.3.2. Az IP csoportok hisztológiai elváltozásai. A 30, 45 és 90 perces mintákat vizsgálva azok sem az ischaemiát, sem a reperfúziót követően vett mintákban nem mutatnak jelentős különbséget a kontroll ischaemiás csoportokhoz képest, a necrosisra gyanús sejtek száma 1015%kal kisebb. Súlyossági besorolásuk nem tér el a kontroll csoportjukétól. A 60 perces csoportban mind az ischaemiás mintában, mind a reperfúziós mintákban a destrukció kisebb fokú: 14 és 17 pont, szemben a kontroll, IR csoportban fent leírtakkal (16 illetve 20 pont). Ezen csoportban összefüggő necrosis nem látható, pericentralisan fokozott sejtelhalási jelek mutatkoztak. A 7. napon vett mintákban azonban a 30, 45, 60 perces IP + IR csoportokban a kereksejtes beszűrődés és a szövetdestrukció foka kisebb a nem előkezelt csoportokhoz képest, enyhe–középsúlyosnak mondható. Apoptózis elvétve fordult elő. A 60 perces csoportban kiterjedt necrosis nincs. 90 perces IP + IR csoportból az egyetlen túlélő állat májában kifejezett necrosisok és lymphocyta infiltráció volt látható.

86. oldal


.

.

4.1.4. TNFα szintek A kontroll, beavatkozás előtt 12 órával vett bazális szintekhez képest ( 28.ábrán nem jelölt) a reperfúzió 30. percében vett TNFszintek, mind az IR, mind az IP+IR csoportban szignifikánsan

emelkedettek

voltak. Az IR és IP+IR csoportban mért TNFszintek (28.

ábra)

ischaemiás

arányosak idővel.

az Jelen

tanulmányunkban IP hatására a 30 és 45 perces ischaemiát követően

a

reperfúzió

30.

28. ábra: TNFα szintek a reperfúzió 30. percében; * p < 0,05; ** p < 0,01

percében vett TNFa szintek szignifikáns (p<0,05), 60 percnél erőteljes szignifikáns (p<0,01) csökkenést mutattak. A 90 perces ischaemiát követően a preconditionálás nem okoz szignifikáns TNFa csökkenést.

4.1.5. Laboratóriumi vizsgálatok: seBi, ALT, LDH A 30 perces ischaemiát követően sem a direkt bilirubin szint, sem a többi vizsgált laborérték (ALT, LDH) nem mutat szignifikáns (p<0,05) emelkedést a kontroll mintához képest, sem az első, sem a 7. posztoperatív napon. Ehhez hasonlóan az IP sem eredményezett szignifikáns csökkenést a csoporton belül. A 45 és 60 perces ischaemiát követően, az összes mért paraméter (direkt bilirubin, ALT, LDH) a kontroll mintához képest szignifikáns (p<0,05) emelkedést

29. ábra: Szérum bilirubin szintek * p < 0,05; ** p < 0,01

mutat az első napon. A preconditionált csoportokban mért laborértékek a tisztán

87. oldal

.


.

ischaemiás csoporthoz képest szignifikánsan (p<0,05) alacsonyabbak az első napon. A 7. posztoperatív napon ezek szintje egyik csoportban sem különbözik szignifikánsan a kiindulási kontroll csoportok értékeitől (2931. ábrák).

30. ábra: ALT szintek * p< 0,05, ** p < 0,01

31. ábra: LDH szintek * p< 0,05, ** p < 0,01

A 90 perces ischaemiát követően a kontroll értékekhez képest minden laborparaméter szignifikáns (p<0,05) emelkedést mutat az első napon, viszont nincs különbség a preconditionált és a nem előkezelt csoportok között. A 7. posztoperatív napon az enzimszintek továbbra is emelkedettek a preconditionáláson átesett egyetlen túlélő állatban.

4.1.6. Túlélés a 7. posztoperatív napon A kísérleti állatok túlélésének eredményei, illetve a két csoport összehasonlítása

IR

IP + IR

30 min

100 %

100 %

45 min

90 %

100 %

60 min

60 %

70 %

90 min

0 %

10 %

során talált különbségek az 5. táblázatban láthatók. 100%os túlélést

jelentett,

ha

a

csoportban lévő 10 állatból az összes túlélt. Megjegyzést érdemel, hogy az állatok 90 %a, a 34. posztoperatív

5. táblázat: Túlélő állatok 1 hét után

88. oldal

napon hullott el. Egyes állatok

.


.

láthatóan vérzéses szövődményt mutattak. Az elhullott állatok tetemeit felboncolva a 90 perces ischaemiás csoportban, szinte kivétel nélkül az érintett májlebeny nagyfokú felpuhulását, necrosisát észleltük. Az állatok felében észleltünk zavaros, vörhenyes ascitesszerű hasűri folyadékot. Az állatok halála vélhetően a dekompenzált májműködésből, illetve az ezt követő szeptikus állapotból származhatott.

4.2. II. kísér let er edményei A második kísérlet elvi háttere, problémafelvetése az I. kísérlet eredményein alapszik. Megfigyeléseink szerint a 60 perces ischaemiás idő jelentős mikrocirkulációs, szöveti, illetve transzamináz és TNFα szint változást okoz. Továbbá, az I. kísérletből levonható következtetés, hogy a 90 és 30 perces ischaemia kapcsán alkalmazott IP érdemileg nem befolyásolja az említett paramétereket. 45 perces ischaemiát követően a reperfúzió során látott változások inkább a 30 perces ischaemiához állnak közelebb. A 60 perces kirekesztést követő drámai változások, az IP hatására szignifikáns módon javulnak mind a mikrocirkuláció (PM, RT, RMI), mind a szöveti struktúra változásának tekintetében. Fentiekből arra a következtetésre jutottunk, hogy a patkánymáj számára ezen modellben a vulnerabilis periódust a 60 perces kirekesztés jelenti. További vizsgálatainkat ezért ezen hipotézis és modell alapján folytattuk.

4.2.1. Haemodinamikai paraméterek A laparotómia előtt nem volt mérhető szignifikáns különbség az állatok pulzusszáma (361 ± 32/perc), illetve az artériás középnyomás (109 ± 17 Hgmm) tekintetében. Ezen paraméterek szignifikáns módon változtak az ischaemia második felében és a reperfúzió első 20 percében, mind a 4 csoportban (IR, IP, PJ34, Gln) a MAP elérte a 59 ± 19 Hgmmt, míg a szívfrekvencia közel állandó (380 ± 62/min) volt.

89. oldal


.

.

4.2.2. Mikrocir kuláció Az egyéni áramlási adatokon végzett matematikai átalakítás után az egy csoporton belüli (n=10) átlagot tüntettük fel (32. ábra). A PM és a RT elemzésekor látható, hogy az áloperált, kezelésben nem részesült állatok mikrocirkulációja mindvégig stabil volt. Az áloperált és az IR csoport átlagait tekintve a különbség erősen szignifikáns (p<0,01). Plató Maximumot és Reperfúziós Területet alapul véve (6. táblázat) valamennyi előkezelt (IP, PJ34, Gln) csoport és „tisztán ischaemiás” (IR) csoport között szignifikáns különbség mutatható ki (p<0,05). Az előkezelt csoportok között számszerűen szignifikáns eltérés nem volt, ugyanakkor a görbék karaktere eltérő. A két

% 120 100 80 60 40 20

//

0 I

4

8

62

66

71

76

álope r ált

81

86

IR

91 Glu

95

99 103 107 110 114 118 122 m in PJ34

IP + IR

32. ábra: A II. kísérlet során (60 perc ischaemia + 60 perc reperfúzió), laser Doppler flowmeterrel regisztrált áramlási görbék átlagának eredménye.

görbe alakja az IP és PJ34 csoportok közt jelentős eltérés nem mutat, míg a Gln előkezelt csoportban a később szignifikáns javulást mutató görbe a reperfúzió második felében javul, meredekebben emelkedik. Ha csak 30 perces reperfúziót figyelembe véve számoljuk ki az áramlási jellemzőket, megállapítható hogy a Gln csoport PM és RT értéke nem különbözik szignifikáns módon az IR csoport értékeitől.

90. oldal


.

.

A görbék karakterét és az RMI értékeket figyelembe véve látható, hogy az IR és IP+IR csoportokban a kapott eredmények közel azonosak az I. kísérletben mértekhez:

E L Ő K E Z E L É S

egy relatív gyors emelkedés után egy hosszabb platófázis következik, lassan javuló

Plató

Reper fúziós Terület

Reper fúzió

Maximum

arány (% )

Maximális

(% )

K RT = ( RT x/RT 0) x 100

Idő (min, sec)

99,5 (± 2)

101,1 (± 4)

IR

35 (± 9) **

30,3 (± 11) **

10’ 45”

IP + IR

58 (± 14) *

56 (± 10) *

7’ 18”

PJ 34 + IR

58 (± 13) *

48 (± 12) *

12’ 54”

Gln + IR

50 (± 15) *

53 (± 14) *

14’ 07”

Nincs, Áloperált

6. táblázat: Mikrocirkulációs jellemzők a II. kísérletben

mikrocirkulációval. A PJ34gyel és glutaminnal előkezelt csoportokban viszont az áramlási görbék kezdetben az előzőekhez képest lassabb, de a végeredmény tekintetében eredményesebb reperfúziót írnak le. A korábbi, az I. kísérlet eredményeiben leírt okfejtést folytatva, illetve a szövettani minták áttekintése után, a jelenség hátterében a csökkent oxidatív stressz eredményezte kisebb fokú leukostasis, noreflow jelenség állhat.

4.2.3.Szövettani feldolgozás 4.2.3.1. Hematoxilyneosin festés A kísérlet során csak egy alkalommal, a kísérlet végén történt szövettani mintavétel. Szemikvantitatív táblázatos módszer alapján a következő mondható el: Az áloperált

állatok májában kórjelző eltérés nem volt látható. Az IR csoportban az I. kísérlethez hasonló jelenségek voltak megfigyelhetők (34. ábra), viszont a reperfúziós idők

91. oldal

.


.

különbsége miatt ezen modellben a szövettani kép színesebb volt. A mintákon jelentős (+++) sinusoidális pangás, IIIIIzóna határon vacuolisatio, centrolobularis foltos és összefüggő

necrosis,

periportalis

neutrophil infiltráció volt látható, nomenklatúránk szerint (ld.: 3.2. fejezet) a károsodás foka súlyos (19 pont). Az IP csoportban az I. kísérlethez hasonlóan, IR csoportban észlelt jelenségek intenzitása csökkent: egyértelmű, összefüggő necrotikus terület nem volt látható, pericentralis vacuolisatio volt látható a III. zónában, 33. ábra: Apoptózis jelei (kromatin kondenzáció és fragmentáció) a posztoperatív 6. órában az IP, a PJ34 és Gln előkezelt csoportokban.

de a II.ban nem. Egy metszeten láttunk focalis necrosist. Periportalis kereksejtes

infiltráció

volt

megfigyelhető kisebb fokú sinusoidalis pangás (++) mellett; apoptózisra gyanús sejtek (33. ábra) száma látóterenként 12 volt; összesen 14 pont: középsúlyossúlyos károsodás. A PJ 34 előkezelés után foltos necrosist nem észleltünk, ugyanakkor nagyobb számban volt látható apoptózisra gyanús sejtjelenség: sejtzsugorodás, a kromatin marginalizációja, kondenzációja, fragmentációja, „apoptotic body” megjelenése.

A

sejtek

egymástól

függetlenül,

„zónafüggetlenül”

voltak

megfigyelhetőek (35 ábra). Összességében a károsodás foka középsúlyossúlyos: 15 pont. A glutamin előkezelés hatására a PARP inhibitorhoz hasonló jelenségek voltak láthatók, azzal a különbséggel, hogy a sinusoidalis pangás foka jelentősen csökkent. Apoptózisra gyanús morfológiai jelek inkább a II.III. zóna határán voltak megfigyelhetőek. A károsodás középsúlyosnak tekinthető; 14 pont.

92. oldal

.


34. ábra IR csoport: sejtkárosodás jelei döntően a IIIII. zónában

35. ábra: PJ34 és Glu előkezelés utáni IR sejtkárosodás a III. zónában

93. oldal

.

.


.

4.2.3.2. TUNEL r eakció A DNS töredezettségének kimutatására elvégzett TUNEL reakció során kapott eredményeket

a

HE

metszeteken

látott,

50

apoptózisra

gyanús

45

‰

40

sejtekkel vetettük össze. Az

35

áloperált csoportban , az

30 25

apoptózisra gyanús, illetve TUNEL pozitivitást mutató

20 15 10

sejtek száma (1,6 ‰) megfelelt a nemzetközi

5 0 áloper ált

IR

IP + IR

PJ34

Glutam in

irodalomban [88] található adatoknak mely szerint ez

36. ábra: TUNEL pozitív sejtek száma 10 látótér átlagából, ezrelékben kifejezve.

nem több mint egykét ezrelék (3637. ábra). Az IR csoportban centrolobularis foltos, helyenként összefüggő necrosisok mellett, 10 látótér átlagát figyelembe véve, a TUNEL pozitív sejtek száma 26,5 ‰ volt, mely az áloperált csoporthoz képest szignifikáns emelkedést jelent. Jobban áttekintve a metszeteket, gyakorta a II. – III. zónának megfelelően volt látható pozitív festődés, mely inkább az IR alatt bekövetkezett DNS töredezettséget reprezentálja. Megerősíti ezt az is, hogy sok helyen elvétve is előfordultak TUNEL pozitív sejtek, sejtcsoportok is, de ugyanakkor jelentős számban volt látható összefüggő területeket érintő pozitivitás is, mely inkább az IR károsodásról, sem mint apoptózisról tanúskodik. Az IP csoportban összefüggő necroticus terület nem volt látható, pericentralis vacuolisatio mellett 23,8 ‰ volt TUNEL pozitív sejt. A PJ 34 és glutamin

előkezelés után foltos necrosist nem észleltünk, ugyanakkor TUNEL pozitív sejtjelenség: PJ34: 32,8 ‰ vs. Gln: 31,9 ‰, mely nem jelent szignifikáns emelkedést. Ezen csoportban jelentősebb számban voltak láthatóak rendezettséget nem mutató, önálló, pozitív festődésű sejtek, egy pár sejtből álló csoportok minden zónában. A további tisztázására aktív kaszpáz3 kimutatást végeztünk (ld. ott).

94. oldal

.


.

37. ábra: TUNEL festés, 20 x nagyítás (A E). Csoportok A: áloperált; B: IR ; C: IP+IR ; D: PJ34 ; E: Glu. F ábra 1000x nagyítás TUNEL pozitív sejtekről, a reakció eredményeként látható barnás festődés a DNS töredezettséget jelzi.

4.2.3.3. Aktív kaszpáz3 immunhisztokémia Az aktív kaszpáz3 festés során, a TUNEL reakcióhoz képest kisebb számban voltak találhatóak pozitív festődésű sejtek, melyek a TUNELtől eltérően nem csoportban,

B

A 38. ábra: Áloperált állatból vett minta vett minta, pozitivitás: 1,8 ‰. 400x nagyítás

39. ábra: Aktivált kaszpáz3 pozitivitás: barna festődés a citoplazmában (A) és a magban (B)

95. oldal


.

.

zónákra elosztva jelentek meg. Aktív kaszpáz3 aktivitás (barna festődés, 39. ábra) volt látható mind a magban, mind a citoplazmában, ezen utóbbi volt túlsúlyban. Az áloperált állatok között az kaszpáz3 pozitív sejtek aránya 1,8 ‰ volt, mely nem meglepő, közel azonos a TUNEL reakciókkal kapottakhoz (38. ábra). Az IR csoportban a pozitív festődés aránya 15,4 ‰, míg az IP csoportban ez eléri a 22,2 ‰et, ugyanakkor a PJ 34gyel előkezelt állatok csoportjában: 30,5 ‰. A Gln csoportban a pozitív festődést mutató sejtek aránya 28,9 ‰.

4.2.3.4 Poli(ADPribóz) (PAR) immunhisztokémia AntiPAR vizsgálatokat csupán az áloperált, IR és PJ34 előkezelt csoportokon végeztünk, igazolandó a PARPinhibitor működésének hatásosságát. A festési eljárás során látható volt, hogy az IR csoportban szignifikáns módon nőtt az antiPAR pozitív sejtek száma, mely hátterében a PARP túlaktivációja okozta fokozott PAR szintézis áll.

40. ábra: AntiPAR festés A: áloperált, B: IR ; C: PJ34 előkezelt csoportban

A PJ34 előkezelt csoportban a pozitív sejtek száma mintegy 4245%kal csökkent, jelezve a beadott inhibitor hatásosságát (40. ábra). 4.2.4. TNFα szintek

2 5

Az

2 0

ischaemiás

preconditionált

csoportban a TNFα szint változás tendenciája

hasonló

az

pg/ml 1 5

I.

*

1 0

kísérletben, WEHI sejtkultúrán mért értékekkel. Ezen csoportban

5

az IP hatására a kontroll, nem

0

előkezelt, ischaemiásreperfúziós (IR) csoporthoz képest a TNFα

á l o p e r á l t

I R

IP + I R

P J 3 4

G l u t a m i n

41. ábra: TNFα szintek ELISA módszerrel a postischaemias 6. órában. * p < 0,05

szint szignifikánsan csökkent. Ugyanakkor sem a PJ34, sem a glutamin előkezelés nem

96. oldal

.


.

okozott szignifikáns csökkenést az IR csoporttal szemben. Az áloperált csoporthoz képest, mind az IR, mind a három előkezelt csoport TNFα értékei szignifikáns módon emelkedtek (41. ábra).

4.2.5. Laboratóriumi vizsgálatok: AST, ALT A transzamináz szint változások tekintetében az IR csoportban az áloperált állatokhoz képest erősen szignifikáns (p<0,01) emelkedés volt tapasztalható. Az IP hatására a reperfúzió hatodik órájában az áloperált csoporthoz képest szintén szignifikáns emelkedés volt mérhető, mely IR csoporthoz képest AST tekintetében szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult. A májspecifikus ALT szint változatlanul magas volt. A PJ34 előkezelés mind az ALT mind AST szintekben szignifikáns javulást mutatott, mely a szövettani mintákon is látható, necrosis hiányával magyarázható. A glutamin előkezelés mérsékelte, de statisztikailag a nagy szórás miatt nem csökkentette szignifikáns módon az enzimszinteket (42. ábra).

5000

** **

ALT

AST

4500 4000 3500 3000

* *

2500 2000

*

1500 1000 500 0 áloperált

IR

IP + IR

PJ34

Glutamin

42. ábra: ALT, AST szintek postischaemias 6. órában. * p < 0,05; ** p < 0,01

4.2.6. Antioxidáns státusz Az antioxidáns tulajdonságokat májhomgenizátumon és a szérumban vizsgáltuk (43. ábra, 7. táblázat). Az egyes vizsgálati csoportok egymással való szigorú összevetése nem helyes, minden mérés más léptékben, más aspektusból vizsgálja a

97. oldal

.


.

redoxhomeostasist. Globális paraméterként a luminometriás vizsgálatot tekinthetjük, mely a minta összantioxidáns aktivitását hivatott jelezni. Tekintve, hogy a paraméterek grafikus ábrázolása sem könnyítené meg az átláthatóságot, így az alábbiakban a mérések jelentős részét felsorolás szinten mutatjuk be.

4.2.6.1 Luminometriás összscavanger kapacitás Az eredményeket Relative Light Unit (RLU) egységben adtuk meg. A fényintenzitás (RLU) arányos a mintában található szabadgyökök koncentrációjával. Mint korábban említettem, az alkalmazott eljárások közül ez a legérzékenyebb a redox státusz meghatározásában, az antioxidánsok kimutatása nmol nagyságrendben történik. Mindegyik előkezelés (IP, PJ34, Glutamin) szignifikáns módon javítja az össz antioxidáns státuszt. 16 14

RLU ( x 10 6 )

12

* * *

10 8 6 4 2 0 áloper ált

IR

IP + IR

PJ34

Glutam in

43.ábra: Luminometriás összscavager kapacitás. Mindhárom (IP, PJ34, Glu) előkezelés hatására az antioxidáns státusz szignifikánsan javult. * p < 0,05

4.2.6.2. Redukálóképesség A redukáló képesség, mely a szérum és a szövet teljes antioxidáns képességéről informál (antioxidánsok+fehérjék) és értéke fordítottan arányos a minta antioxidáns tartalmával melyet aszkorbinsav ekvivalensben (ASE) adunk meg. Mint a 7. táblázatból kitűnik, IP és glutamin előkezelés a szérumban szignifikáns csökkenést okoz. A májszövetben is látható ezen tendencia, de szignifikanciát nem igazolt. A PJ34 előkezelés során szintén csökkenés észlelhető, de nem éri el az előző két csoport értékeit. Szérum tekintetében, mind a műtét előtti, mind az áloperált állatokban mért antioxidáns képesség szignifikánsan jobb az IR csoporthoz képest.

98. oldal


.

.

4.2.6.3 Hidrogéndonor aktivitás A módszer a fehérjéhez nem kötött antioxidáns kapacitás mértékéről informál, ami a vizsgált csoportokban sem a májszöveti homogenizátumban, sem a szérumban nem mutatott szignifikáns javulást az IR csoporthoz képest egyik előkezelt csoportban sem.

4.2.6.4 Szabad szulfhidril (SH) csoportok meghatározása A fehérjékhez kötött antioxidáns tulajdonság vizsgálatnál mind az IP mind a glutamin előkezelés szignifikáns javulást eredményezett az IR csoporthoz képest, mind

Áloper ált

Se

Se

Máj

Máj

IR Se

Máj

0,588

±

IP + IR Se

11,65

±

Se

0,176

±

Se

8,547

7,856

Máj

Glutamin

±

Máj 8,147 ±

1,25

1,160

0,096

106,5 0,887

147,1

0,38

104,1

képesség

0,085

Máj

PJ 34

1,312

168,2

1,995

170,1

0,42

±

±

±

±

±

±

±

±

±

±

0,06

0,06

8,20

0,11

4,30

0,25

23,8

0,03

4,40

0,02

17,40

aktivitás

( X 10 6 )

Műtét előtt

1,330

29,15

32,50

51,31

29,79

42,21

37,82

49,5

45,82

47,94

50,58 41,94

±

±

±

±

±

±

±

±

2 ±

±

2,76

4,26

2,38

3,00

2,12

5,22

5,36

6,23

1,12

7,23

1,12

0,456

0,270

1,389

0,176

1,169

1,01

2,15

0,487

1,275

1,47

2,275

±

±

±

±

±

±

±

±

±

±

0,06

0,04

csopor t

Szabad SH –

HDonor

Redukáló

Luminometria

a májszöveti homogenizátumban, mind a szérumból vett mintákon.

±

±

± 0,06

0,074 0,071 0,067 0,091 0,026 0,084 0,086 0,084

7. táblázat: Antioxidáns paraméterek májhomogenizátumból és szérumból. Mértékegységek: Luminometria: RLU= relative light unit; Redukálóképesség: ASE = aszkorbinsav ekvivalencia; Hdonor aktivitás: gátlás % ; Szabad SH csoport: mmol/L

99. oldal

.


.

4.2.7. Májlebenyek tömegei Az I. és II. kísérlet során az áloperált állatok egy részénél (n=11), kivéreztetés után, a máját eltávolítva, analitikai mérlegen a lebenyeket lemértük, mely 250 ± 18,63 gramm súlyú állatoknál a következő: N o I.: 1,15 g, N o II: 1,84 g; N o III: 2,95 g; N o IV: 1,34 g; N o V: 4,16 g; N o VI: 0, 61 g; N o VII: 0,49 g. Összesen: 12,64 ± 2,28 gramm. Ezen adatok egyesével, a nemzetközi irodalomban nem fellelhetőek. Megállapítható volt viszont, hogy az irodalomban [177] leírtakhoz hasonlóan a IIIIVV lebeny („right” and "left lobes” [177]) az állatok összmájvolumenének 66,42 %át teszi ki, míg a többi I, II, VI, VII lebeny (III: „quadrate lobe”, VIVII: „caudate lobe” [177]) 33,58 %. Az I. kísérletben a lebenyek (I, II, VI) eltávolítása után az állatokban a megmaradt lebenyek 46,5%a (N o V.) károsodott, ezzel éltek tovább. A II. kísérletben a reperfúziós károsodások a lebenyek 6566%át érintették.

5. MEGBESZÉLÉS Az 1908ban leírt Pringlemanőver [17], (Báronféle műfogás) alkalmazása néha elengedhetetlen feltétele a májresectiok sikeres elvégzésének. A kiterjesztett májresectiók alatt így fellépő ischaemiás, illetve az azt követő reperfúziós károsodás mértéke azonban meghatározó jelentőségű a megmaradt májszövet életképessége szempontjából. A reperfúzió beállta után a májkárosodás különböző komplex mechanizmusok interakciójaként jön létre. Az ischaemia és reperfúzió toxikus szabadgyökök és egyéb, keringést befolyásoló mediátorok felszabadulását idézi elő. A TNFα és IL1 a két jelentős molekula az IR károsodásban. TNFα és az IL1 jelentős gyulladáskeltő hatású, mindkét citokin indukálja az IL8 szintézist, és upregulalja az adhéziós molekulák expresszióját, úm. selektinekét és a βintegrinekét, melyek megnövekedett leukocyta sinusendothelsejt interakciót okoznak és így azok további citokin termeléshez, Kupffersejt aktivációhoz vezetnek. E komplex mechanizmusok nem csupán a májszövetben, hanem a májon való gyors átáramlás következtében az egész szervezetben jelentős károsító hatással bírnak. Habár a máj egyes közlemények szerint akár egy órás meleg ischaemiát is képes tolerálni [10], a gyakorlatban mégis intermittáló keringésleállítást használunk széles körben, tekintve, hogy a késői eredmények egyértelműen ezen utóbbi módszer célszerűségét támasztják alá.ű

100. oldal

.


.

Ennek szokásos eljárása a 1530 perces kirekesztés majd 510 perces reperfúzió [11;12]. Az ideális protektív stratégia a májműtétek kapcsán a vértelenségben, illetve vérvesztés nélkül végezhető parenchymális transzszekciók lennének, olyan körülmények közt, ahol az ischaemiatolerancia maximális. Feltételesen az endogén defenzív mechanizmuson alapuló ischaemiás preconditionálás vagy ezen protektív védelmi rendszert felépítő kémiai anyagok biztosíthatják a megnyúlt ischaemiás tolerancia felépülését, ezzel az egyszeri kirekesztések ideje elnyújtható. Hasonló az igény a transzplantációk tekintetében is. Kísérleteink célja a máj kiterjesztett, műtéti resectiója során fellépő ischaemia, és az ischaemia tolerencia vizsgálata volt, illetve a tanulmányban egy endogén defenzív mechanizmust (IP) és kémiai előkezeléseket (PJ34, Gln) használtunk a máj ischaemiás–reperfúziós károsodásának csökkentésére. Az IP először Murry és mtsai írták le myocardiumon [9]. Azóta számos tanulmány jelent meg más szervek preconditionálásáról, annak patomechanizmusát tárgyalva, úm.: hypoxiajelpálya, adenozin, NOET egyensúly stb. Az először myocardiumon tanulmányozott ischaemiás preconditionálás paradox módon a reperfúzió során beinduló károsító hatásokat használja triggerként a szövetek endogén védelmi rendszerének aktiválásához. Jelentős különbség van ugyanakkor a myocardium védettsége és hepatoprotekció elméleti háttere között. Ennek alapja a májban lévő szöveti macrophagok – Kupffer sejtek – megléte, melyekhez hasonló a szívizomban nem fordul elő. A citokinek, illetve az általuk aktivált Kupffer sejtek vezetik be és tartják fenn a reperfúziós károsodás kezdeti szakaszát. Ennek mértéke viszont – szemben a szívvel – sok esetben túlfokozott is lehet, így az IP szívben leírt „tiszta formájától” jelentős eltérésekre kell számítanunk. Az ischaemiás preconditionálás protectív hatása, legalábbis részben, adenozin felszabadulást okoz az ischaemiás szövetekben. Eme hipotézis bizonyítéka, hogy adenozindezamináz vagy adenozinA2 receptor antagonista használata patkány modellben eltüntette az ischaemiás preconditionálás protektív hatását. Megállapították, hogy az adenozin védő hatása részben NOn keresztül valósul meg, mivel a NO szintézis inhibitor ezt a hatást eltünteti [56]. Ezt a teóriát az a megfigyelés is megerősíti, hogy Pringlemanőver során az iNOS megjelenése figyelhető meg a májban [121]. Ugyanakkor ismert, hogy az IP effektor mechanizmusában a KATP csatornák szerepe egyértelmű [133;134].

101. oldal


.

.

Korábbi tanulmányok igazolták [70;103;122;127;128], hogy patkánymájon végzett ischaemiás preconditionálás emelte a túlélést és csökkentette szérum transzamináz és szérum TNFα szinteket, javította az oxigenizáció, összességében csökkentette az IR károsodás mértékét. Ezen kísérletekben a mikrocirkuláció vizsgálata során számos ellentmondás született a mérési metodika hiányosságaiból. Az általunk kidolgozott módszer, a mikrocirkuláció mérésére alkalmas laser Doppler flowmeter használatának feltételeit kívánta bemutatni, rögzíteni. Továbbiakban a LDFrel kapott eredmények összevetése, tárgyalása a szövettani és citokinszintek ismeretében szintén újszerű, eddig nem vizsgált kérdés. Olyan tanulmány sem született eddig, mely az IPt követő különböző idejű ischaemiás idők hosszát, illetve a mikrocirkulációs változásokat veti össze. A máj mikrocirkulációjának vizsgálatára számos jól kidolgozott módszer létezik. A szöveti áramlás változása, egész pontosan a májperfúzió relatív változása jól követhető laser Doppler flowmetriával (Seifalian 1991 [178], Wang 1992 [179], Barbiro 1998 [180] stb.). Megállapítást nyert az is, hogy a műtéti körülmények in vivo modellezése során a szöveti perfúzió vizsgálatára optimális a noninvazív laser Doppler flowmérés (Seifalian 1997 [181], Wheatley 1993 [164]). Bizonyítást nyert – összevetve a LDFt egyéb direkt és indirekt áramlásmérési technikával , hogy a patkánymáj vérellátása homogén és ez jól követhető laser Doppler flowmetriával. Ugyanakkor sokan, technikai nehézségekre hivatkozva mégis elvetik az eljárást, mivel a módszer széles körű alkalmazása során derült fény a reprodukálhatóság hibáira, illetve a kapott értékek értelmezésének nehézségeire. Valóban, a LDF eredményei, csupán egy adott, zárt rendszerben értelmezhetőek, ahol egy meghatározott időszak alatt, azonos szöveti struktúra felett a mikrocirkuláció dinamikus változásait vizsgáljuk, pl. ischaemiát követő reperfúzió. Megfelelő matematikai korrekciók után kettő vagy több, azonos körülmények között vett minta összehasonlítható egymással, ugyanakkor különböző időpillanatokban, másmás helyről vett minták egymással való összevetése ezen módszerrel nem helyes. Az általunk használt kísérleti modellben a fent részletezett eljárásokkal méréseink reprodukálhatóvá váltak. Ennek feltétele, hogy állandó hőmérsékleten, a légzőmozgást és a mérőfej által kifejtett nyomóerőt minimalizáljuk, illetve állandó mérési helyet kell választanunk, kiküszöbölve a külső fény zavaró hatásait.

Így

eredményként

hőmérsékletre,

102. oldal

vörösvértest

koncentrációra

és

.


.

szövetvastagságra korrigált fluxot kapunk, mely a máj mikrocirkuláció változásait pontosan jellemzi. További gondot jelentett a kapott áramlási görbék helyes interpretációja. A korábbi kísérletek során [164] a LDF alkalmasságát vagy csupán az arteria hepatica okklúziója vagy csupán az vena portae szelektív elzárása mellett vizsgálták. Ugyanilyen hemodinamikai vizsgálatok történtek patkányon végzett hemihepatectomiak vagy haemorrhágiás shockvizsgálatok kapcsán. Teljes kirekesztést követő áramlásváltozás matematikai vizsgálata az irodalomban nem található. Éppen ezért a „nulla” áramláskor mért jellel és az áramlás abszolút értékének mérésével és értékelésével problémák voltak. Kísérleteink során a körülmények standardizálása után kapott görbéken az ischaemia alatti áramlást zajnak vettük (biological zero), mely egy új relatív skála nulla értékeként szerepelt. A kontroll, alap mikrocirkulációs értéket (baseline) vettük a relatív skála 100as értékének. Ezek függvényében fejeztük ki százalékban a reperfúziót. Korábbi LDFrel kapcsolatos tanulmányok [164;182] ettől eltérőek, mivel a kiindulási fluxot veszik alapul. A reperfúzó leírására újabb fogalmak kerültek bevezetésre, úm.: Plató Maximum (PM),

Reperfúziós Terület (RT), illetve ebből a könnyebb kifejezhetőségért képzett egy „ K” arányszám, és a görbe karakterét leírni hivatott Reperfúziós Maximális Idő (RMI). Ezáltal az individuális áramlási görbék összehasonlíthatóvá, statisztikai elemzésre alkalmassá váltak. A máj ischaemiás károsodásának vizsgálatára számos módszer ismeretes, melyek közül a Semmelweis Egyetem I. sz. Sebészeti Klinikáján kifejlesztett patkány modellt használtuk (Kupcsulik és mtsai, 1977) [2;3;176]. A nemzetközi irodalomban ismert további modellek lényegében ezen alaptípus (Clemens 1985, Sepherd 1987, Wheatley 1993, stb.) változatai. A modell lényege az, hogy a patkánymáj lebenyezett szerkezete révén segmentalis ischaemia hozható létre és nem alakul ki splanchnicus pangás, anhepaticus fázis. Jelen kísérletünkben az így létrehozott 30456090 perces ischaemiát 30 perces reperfúzióval követtük (I. kísérlet). Megállapítható, hogy a máj mikrocirkulációját leíró PM és RT értéke fordítottan arányos az ischaemiás idővel. Az RMI és a görbék karakterének összevetésekor látható, hogy a reperfúzió maximumának eléréséhez „felhasznált idő” szinte azonos, a lassú áramlásjavulás a mikorvaszkulatúra regenerációjával magyarázható. Ugyanebben a modellben ischaemiás preconditionálást (5 perc ischaemia + 10 perc reperfúzió) végeztünk. Az IP ciklusszámát, illetve az

103. oldal

.


.

ischaemiareperfúzió hosszát tekintve LlorisCarsi és mtsai [117] által máj esetén elsőnek leírt IPhoz szükséges időket vettük alapul, tekintve, hogy ez és ezt követő közlemények szerint [119;120] a patkánymáj afferens ereinek 5 perces okklúzióját követő 10 perces reperfúzióval az állatok túlélése növelhető, a transzamináz szintek csökkenthetőek. Kísérletünkben az IP szignifikáns módon javította az áramlási paramétereket (PM, RT) a 45 és 60 perces ischaemiás csoportban. A két görbe alakja (IR, IP+IR) közt jelentős eltérés nem látható, az IP csoportok görbéinek meredeksége kifejezettebb. 30 és 90 perces ischaemiát megelőző IP áramlásban mutatott eredménye a tisztán ischaemiás csoportokhoz képest nem mutatott szignifikáns különbséget. Az áramlási paraméterek eredményeit összevetve a szövettani, laboratóriumi, és tumor necrosis faktor (TNFα) szintekkel megállapítható, hogy: 30 perces ischaemia után a szöveti károsodás foka enyhe, a laboratóriumi és TNFα szintek változása nem szignifikáns. 45 és 60 percnél középsúlyossúlyos szöveti károsodással kell számolnunk mind az ischaemia, mind a reperfúzió végén, a citokinszint változás az IP csoportban szignifikáns módon kisebb, mint a nem előkezelt csoportban, csakúgy, mint az ALT, LDH szint tekintetében. 90 perces, prolongált ischaemia után a szöveti destrukció foka igen súlyos, kritikusnak mondható. A mikrocirkulációs zavarok mellett megjelenő transzamináz enzim és citokinszint változások is erről tanúskodnak. Egy nappal az operációt követően a laboratóriumi minták minden IR csoportban, ischaemiás idővel arányos módon, jelentős májérintettséget mutattak. A 90 perces csoportban extrém értékek voltak mérhetőek. Egy héttel a beavatkozás után a 30 perces ischaemiás csoportban teljes gyógyulás, a laboratóriumi paraméterek rendeződése látható, 100%os túléléssel mind az IR, mind IP + IR csoportban. A 45 és 60 perces csoportban a posztoperatív 3.4. napon történt elhullás (10 vs. 40 %) májelégtelenség mellett szól, melyet az IP, az adatok alapján (0% vs. 30% letalitás), nem volt képes jelentős mértékben csökkenteni. A túlélő állatokban a laborparaméterek normalizálódása, illetve a szövettani jelenségek a gyógyulás mellett szólnak. Összességében elmondható, hogy az I. kísérlet során a LDFrel kapott mikrocirkulációs változásoknak megfeleltek és azt megerősítették a szövettani, labor paraméterek, és a TNFalfa vizsgálatok. Az IP protektív, keringésjavító hatása LDFrel különösen jól demostrálhatónak tűnik, melyet korábban ilyen modellben nem vizsgáltak. 60 perces kirekesztést követő drámai változások, az IP hatására szignifikáns

104. oldal

.


.

módon javulnak mind a mikrocirkuláció (PM, RT, RMI), mind a szöveti struktúra tekintetében. Fentiekből arra a következtetésre jutottunk, hogy a máj számára ezen modellben a vulnerabilis periódust a 60 perces kirekesztés jelenti. További vizsgálatainkat ezért ezen hipotézis alapján folytattuk, így a II. kísérletben az ischaemiás időt 60 percesnek választottuk, melyet 60 perc reperfúzióval folytattunk. A kísérlet alapgondolata, problémafelvetése a következő: az IR alatt képződött szabad gyökök, illetve az ezek hatására meginduló citotoxikus reakciók a DNSlánc károsodását idézik elő. Ennek folyományaként aktiválódó poly(ADPribóz) polimeráz, egy energiaigényes folyamat révén a NAD + ból, mint szubsztrátjából ADPribózt és nikotinamidot hasít le, mely előbbieket különböző proteinekhez csatolja, ezáltal poly(ADPribóz) egységeket épít fel. Ezen folyamat vezet a magas energiatartalmú foszfátok sejten belüli depléciójához, majd a további mitochondrialis funkciózavarhoz. Logikusnak tűnik a folyamat korai gátlása, és így a késői károsodások kivédése. Bizonyított tény, hogy a PARP gyógyszeres gátlása csökkenti a szervekben kialakuló necrosis nagyságát, és ezáltal megőrzi azok funkcióit [8;106]. A jelenség hátterében a PARPinhibitorok okozta ATP prezerváció áll, mely eredményeként a sejt necrosis helyett a gyulladásos válasszal nem kísért apoptózis felé indul. Ennek alapján feltételeztük, hogy a PARP1 enzim szelektív gátlása (PJ34), az enzim túlaktiválódásának megelőzésével alkalmas lehet máj ischaemiásreperfúziós modellben is a késői károsodások csökkentésére. Jelen vizsgálatban az említett kritikus ischaemia (60 perc) előtt 1 órával alkalmaztuk a PJ34 PARP inhibitort. Hasonló protektív hatással rendelkezhet a reperfúziós károsodásokban felszabaduló ODFR elleni védelemben, a nem esszenciális aminosav, a glutamin. Ismeretes, hogy katabolitikus állapotokban a glutamin esszenciális aminosavként viselkedik. Ugyanakkor jelen tanulmány bizonyította, hogy (máj)sebészeti beavatkozásokat megelőzően enterális vagy parenteralis formában történő adagolása jelentős előnnyel jár a gyógyulás tekintetében. Egyes közlemények szerint a glutamin protektív hatása a csökkent szabadgyökprodukción keresztül valósul meg [65;157]; ismerve a tényt, hogy a glutamin a májban, az antioxidans glutation (GSH) bioszintézisében vesz részt, illetve prekurzor molekulája. Ugyanakkor a glutamin, a fentiek mellett az apoptózisban is fontos szerepet tölt be. Feltételezések szerint a glutamin a Fas ligandmedialt apoptózist gátolja, a TNFα mediált apoptózist serkenti [65].

105. oldal

.


.

A II. kísérlet során az előkezelések (IP, PJ34 és Gln) hatásait vizsgáltuk mikrocirkulációs, szöveti (apoptózis/necrosis) és redoxhomeosztázis szintjén. Megállapítható, hogy mindhárom előkezelés szignifikáns módon javította a mikrocirkulációs paramétereket (PM, RT) a kontroll IR csoporthoz képest. A görbék jellemzésekor viszont kisebb különbségek láthatóak. A farmakológia előkezelés csupán a számtani paramétereket figyelembe véve, összességében jobban javította a mikrocikulációt mint az IP, de végleges, stabil áramlás kialakulásához több időre volt szükség. A szövettani mintákkal történt összehasonlítás során látható, hogy ezen farmakonokkal történt kezelés csökkentette a gyulladásos jeleket a májszövetben. Necrosist ezekben a csoportokban nem láttunk. TUNEL assayt végeztünk a sejtelhalás, apoptózis igazolására. Eredményül részben összefüggő pozitív festődésű területeket (II III zóna határa, pericentralis területek) kaptunk, melyeket az IR károsodásból eredő DNS töredezettségnek tartottunk. Ebből két tanulság volt levonható: (1) a nemzetközi tanulmányokkal egybehangzóan [88] a TUNEL assay nem ideális vizsgálati módszer I R közegben az apoptózis detektálására; illetve (2) a necrosis manifeszt jelenléte ellenére igen nagy számban ment végbe sejtszintű elhalás, esetleg necrapoptózis a vizsgált 6. posztoperatív órában. Ezen utóbbi késői következményeit (összefüggő necrosis megjelenése, kiterjedése) nem vizsgáltuk. Az apoptózis detektálására a nemzetközi irodalomban [88;95;96] is ajánlott aktív kaszpáz3 kimutatást használtuk, mely ilyen körülmények közt is specifikus. Az itt látott pozitív festődés megerősítette feltételezésünket, hogy a TUNEL pozitvitáshoz (IR károsodás + apoptózis) képest kisebb számban, de jelen van apoptózis. Jogosan merül fel a kérdés, mely szerint: milyen relációban van a máj foltos reperfúziója miatt kialakult „noreflow” jelenségek kapcsán észlelt prolongált ischaemia, majd következményes (apoptózis helyett kialakult) necrosis és a kaszpáz3 immunhisztokémia? Az immunhisztokémiai vizsgálatokat minden egyes esetben 3 különböző helyről végeztünk, illetve ezen belül is 10 át nem fedő látótérben 1000 sejtet vizsgáltunk meg. Az anatómiai hely különbségei, illetve a nagyszámú vizsgált terület statisztikailag kellően nagy esetszám, ahhoz hogy a minta reprezentatív legyen, vagyis tartalmazzon „noreflow” területeket is. Az áloperált csoportban mind a TUNEL, mind az aktív kaszpáz3 immunhisztokémiával azonos mértékű pozitivitást kaptunk. Az apoptózis a PJ34 és a Gln csoportokban szignifikánsan nagyobb számban fordult elő, mint az IR csoportban, ahol a necrosis

106. oldal

.


.

jelei is láthatóvá váltak. Az IP csoportban necrosis nem volt, az apoptózis száma nem érte el a kémiai előkezelt csoportokban kapott sejtek számát. Az apoptózis arányának növekedésék tudható be részben a javuló mikrocirkuláció, hiszen a postischaemias gyulladás csökkenésével a keringésregeneráció üteme gyorsabb. Továbbá ismerni kell azon irodalmi adatot is, amely szerint a PARP inhibitoroknak létezik direkt kaszpáz3 aktiváló hatásuk is [88;183]. Kézenfekvőnek tűnik a PARPinhibitorok esetén az a következtetés, miszerint a csökkent mértékű oxidatív stressz is a PARPinhibitorok közvetlen hatása lenne, de ez a hatás csupán másodlagos. A jelenség az apoptózis eredményeként létrejött csökkent gyulladásos válaszjelenséggel áll összefüggésben [106]. A kísérletben kapott antioxidáns vizsgálatok is erre egyértelműen rámutatnak: a globális antioxidáns státusz jellemzésére használt összscavanger kapacitás luminometriás mérése csökkent oxidatív stresszt igazolt, de a többi paraméter (szabad SHcsoport, Hdonor aktivitás, redukálóképesség) sem a szérumban, sem a májszöveti homogenizátumban nem mutatott szignifikáns javulást. Ugyanakkor a glutamin előkezelés hatására mind a luminometriás összscavanger, mind a fehérjékhez kötött antioxidáns tulajdonság (szabad SH csoport) szignifikáns módon javult. Az előzőekkel összevág, hogy az előkezelések hatására csökkent TNFα szint volt mérhető, mely a necrosis hiányára és a kisebb fokú gyulladásos reakcióra is utal. Hasonlóképpen a PJ34 előkezelt és ischaemiásan preconditionált csoportokban az ALT, illetve az ALT és AST szint csökkenést detektálhattunk. Az antioxidáns státusz pontos megítéléséhez egy további, eddig még nem részletezett tényt kell figyelembe vennünk. Váli és mtsai [184] az általunk használt kísérleti modellben kimutatták, hogy a glutathione peroxidáz és szuperoxid dizmutáz aktivitás szignifikáns módon csökkent azon lebenyekben is, melyek a II. kísérlet alatt nem vettek részt az ischaemiában (I., II., VI., VII.), hanem mint egy fiziológiás shöntöt képzve biztosították a splanchnikus keringést. Ezen hyperaemiás lebenyek totál antioxidáns státusza szintén csökkenést mutatott; a Hdonor aktivitás, redukáló képesség, illetve a szabad SHcsoport azonos tendenciájú változása volt megfigyelhető a kísérlet alatt. A teljesség kedvéért megemlítem, hogy korábban Bowes és Thiemermann (1998) által végzett PARPinhibitor előkezelés (3AB, ISO és 4amino1,8naphtalimide) nem csökkentette az ischaemiásreperfúziós károsodásokat, mivel, mint az mára már kiderült a “klasszikus” PARP inhibitorok, úm.: 3AB, csak kis mértékben képesek PARP

107. oldal

.


.

gátlásra (szemben az isoquinolineszármazékokkal, mint pl.: ISO), illetve nem jutnak át teljességgel a sejtmembránon [185]. MotaFilipe és mtsai. (2002) első ízben mutattak be egy olyan vízoldékony PARPinhibitort (5AIQ), mely csökkentette az IR károsodásokat patkánymájban [186]. Ezen korábbi tanulmányok egyike sem foglal állást a mikrocirkulációs változásokról. Szintén meg kell említeni, hogy a korábbi tanulmányok szerint a glutaminhiányban vizsgált monocyták esetén jelentős funkcionális változások voltak megfigyelhetők, úm. csökkent phagocytosis [187], citokin termelés [188]. Emellett szól az is, hogy a glutamin szint emelése megnöveli a TNFα termelést sebészeti beavatkozáson átesett betegekben [189]. Ugyanakkor ismert tény az is, hogy glutamin deplécióban nem tartható fent a normális glutation szint, így a sejtek antioxidáns kapacitása is jelentősen csökken, vagyis glutaminhiányban szenvedő sejtek sokkal érzékenyebbek az oxidatív ártalmakra [190193]. Jelen vizsgálatban a glutamin ezen utóbbi, jótékony antioxidáns tulajdonságát igazolni tudtuk. Hasonló ellentmondások vannak a glutaminapoptózis összefüggésben is. Egy vizsgálat szerint a glutamin hiánya deszenzitizálja a sejteket a TNFα indított apoptózis szignáltól [194], illetve egy másik vizsgálat azt állítja, hogy a glutaminban gazdag étrend növeli az apoptózist egerekben [195]. Ezen kijelentések első hallásra ellentmondásban vannak az általunk kapott eredményekkel (alacsony TNFα szint, jelentős apoptózis, csökkent ODFR szint). Viszont azt a tényt is figyelembe véve, hogy az általunk vizsgált modellben jelentős oxidatív stresszel járó ischaemia reperfúzió ment végbe, az eredmény még inkább elgondolkodtató, különös tekintettel arra, hogy ilyen összefüggést az irodalomban nem találtam. A megoldás kulcsa a kapott mikrocirkulációs adatokat, a redoxhomeosztázis és szövettani eredményeket is figyelembe véve – a necrosis/apoptózis, illetve redukció/oxidáció arányának kedvező eltolódásában lehet. A glutamin, mint antioxidáns vegyület csökkenti a gyulladásos választ, javítja a mikrocirkulációt. A redoxhomeosztázis ezen irányú eltolódása „redox szenzitív kinázok” aktivációjával járhat [196;197], mely eredményeként csökken a citokin termelés és növekszik az apoptózis mértéke. Ennek további vizsgálata és igazolása későbbi, részben már folyamatban lévő, részben tervezett kísérleteimtől remélhető. Rövid összefoglalásként elmondható, hogy a laser Doppler flowmeterrel nyert áramlási görbék matematikai transzformációk után jól jellemzik a máj

108. oldal

.


.

mikrocirkulációjának változásait; az ischaemiás preconditionálás, PARPinhibitor és glutamin előkezelés kedvező hatással befolyásolja a mikrocirkulációs és szövettani eltéréseket és a redoxhomeosztázist. További kísérletes vizsgálatok szükségesek a széleskörű klinikai alkalmazások előtt.

6. KÖVETKEZTETÉSEK 1. Az ischaemiásreperfúziós károsodások kulcsszerepet játszanak a vena portae és az arteria hepatica időszakos okklúziójával járó májsebészeti beavatkozásoknál, illetve májtranszplantáció során.

2. Az irodalmi adatok és a saját vizsgálataink alapján a folyamatban központi szerepet kap a TNFα jelenléte és a poly(ADPribóz) polymeráz enzim aktivációja. Hasonló fontossággal bír az antioxidáns raktárak feltöltöttsége.

3. A laser Doppler flowmeter alkalmas a máj mikrocirkulációjának mérésére, meghatározott körülmények, standardizált feltételek mellett. Az állandó hőmérséklet, a légzőmozgások minimalizálása, a mérőfej állandó nyomóereje, a pontosan megválasztott mérési hely és külső környezet standardizálása elengedhetetlen feltétele a mérés reprodukálhatóságának, illetve a vizsgálat sikerének.

4. A LDF használata során kapott áramlási görbék helyes interpretációja mellett (úm.: az ischaemia alatti áramlás zajnak nyilvánítása és egy új relatív skálán nullaként való feltüntetése, illetve így a kontroll, alap mikrocirkulációs érték 100, mint maximumként való értékelése) az egyedi áramlási görbék összehasonlíthatóvá válnak.

5. A görbék további statisztikai feldolgozásához a Plató Maximum (PM: stabil, maximális áramlási érték, mértékegysége: %), Reperfúziós Terület (RT: a reperfúziós görbe alatti integrál, mértékegysége: nincs) és Reperfúziós Maximális Idő (RMI: a reperfúziós görbe inflexiós pontja, mértékegysége: min és sec), mint új

109. oldal

.


.

fogalmak bevezetése szükséges. A RT könnyebb kezelhetőségét egy „KRT” arányszám (KRT = RTx/RT0 x 100; mértékegysége: %) teszi lehetővé. 6. A patkánymáj a 30 perces ischaemiát jól tolerálja, a 45 és 60 perces kirekesztés jelentős áramlásbeli (PM, RT) változásokat okoz. A 90 perces ischaemia után a máj mikrocirkulációja pedig olyan súlyosan károsodik, hogy spontán javulása, rendeződése nem következik be a megfigyelt reperfúziós idő (30 perc) alatt.

7. Az egy ciklusban alkalmazott ischaemiás preconditionálás (5 perc ischaemia 10 perc reperfúzió) szignifikáns reperfúziós áramlásjavulást (PM, RT) okoz a 45 és 60 perces ischaemiában részesített májszöveten. A 30 perces ischaemia alatt még nem, a 90 perces ischaemiát követően már nem jelentkezik az IP protektív hatása.

8. A szövettani elváltozások, illetve egy hetes túlélés tekintetében kisfokú javulás látható IP hatására, mely nem szignifikáns mértékű egyik csoportban sem.

9. A korai gyulladásos választ, Kupffersejt érintettséget reprezentáló szérum TNFα szintek szignifikáns módon javulnak IP hatására 45 és 60 perc ischaemia után. Hasonló változások észlehetők a rutin laboratóriumi paraméterekben.

10. Fentiek alapján (79 pont) elmondható, hogy az IP protektív hatását 45 és 60 perces ischaemiás periódusok előtt alkalmazva képes létrehozni. A máj számára ezen időszak, különösen a 60 perces kirekesztés kritikusnak mondható.

11. 60 perces ischaemiát megelőző IP, PJ34 PARPinhibitor, illetve glutamin előkezelés, 60 perc reperfúziót vizsgálva, összességében kedvező irányba változtatja meg a mikrocirkulációt, mely a PM, RT értékek szignifikáns javulásában mutatkozik meg.

12. Az apoptózis detektálására széles körben használt TUNEL assay a jelen kísérleti rendszerben nem alkalmas az apoptózis detektálására, tekintettel az ischaemia

110. oldal

.


.

hatására kialakult DNS töredezettség megjelenésére, mely az ischaemiás károsodásra jellemző zonális eloszlást mutatja.

13. A DNS fragmentáció apoptotikus és ischaemiás eredetének elkülönítésében, az aktivált kaszpáz3 immunhisztokémiával végzett vizsgálatok során, a PJ34 PARP inhibitor és glutamin előkezelések hatására szignifikánsan magasabb apoptózis szám volt detektálható a kontroll, IR csoporthoz képest. Az áloperált, nem ischaemizált állatokból vett májszöveten vizsgált két módszer (TUNEL, aktivált kaszpáz3) azonos értékeket adott.

14. A májszöveti és szérum antioxidáns paramétereket mind az IP, mind a glutamin előkezelés javította, míg a PJ34 PARPinhibitor, mintegy másodlagosan, csökkent mértékben hozott létre antioxidáns védelmet. Ezért javasolt a preoperatív glutamin előkezelés kiterjesztett májresectiok előtt.

15. A fenti módszerek és kísérletesen alkalmazott vegyületek (különös tekintettel a PJ 34 PARP inhibitorra) klinikai alkalmazása előtt további problémák (távoli szervhatások, túlélés, tumorgenezis) kísérletes vizsgálata szükséges.

111. oldal

.


.

7. ÖSSZEFOGLALÁS Bevezetés: A disszertáció az ischaemiareperfúzió kapcsán fellépő kórállapotokat elemzi kísérletes májműtétek kapcsán. Összegzi a kísérletek kapcsán szerzett tapasztalataokatt, összeveti azt a nemzetközi irodalommal. Az ischaemiásreperfúziós (IR) károsodás központi szerepet játszik a májtranszplantációban és a májresectiókban. Célkitűzés: Kísérleteink célja a máj kiterjesztett, műtéti resectiója során fellépő ischaemia, és az ischaemia tolerancia vizsgálata volt. Célunk volt egy endogén defenzív mechanizmus: ischaemiás preconditionálás (IP), illetve az oxidatív stressz hatására aktiválódó: poly(ADPribóz) polymeráz enzimet gátló vegyület (PJ34), és az antioxidáns potenciállal bíró glutamin (Gln) kísérletes vizsgálat IR modellben. Anyagok és módszer: Kísérleteinkben első kíséletben 80 db hím Wistar patkány máján változó időtartamú (30456090 perc) segmentalis ischaemiát hoztunk létre, kiegészítve IPsal, a biliovascularis nyélre helyezett mikroklippel. Második kísérletben 50 állaton PJ34, Gln előkezelés történt 60 perces ischemiaval. Laser Doppler flowmeterrel mértünk a mikrocirkulációs változásokat. A módszer alkalmazásához kritériumokat állítottunk fel, illetve a kapott értékeket, matematikai analízist követően, statisztikai feldolgozásra alkalmassá tettük. Vizsgáltuk a szövettani változásokat (apoptózis necrosis), antioxidáns szinteket, konvencionális laboratóriumi és TNFα szinteket mértük. Eredmények, megbeszélés: A máj a 30 perces ischaemiát jól tolerálja, a 45 és 60 perces kirekesztés jelentős áramlásbeli változásokat okoz. A 90 perces ischaemia nem tolerálható. Az IP szignifikáns reperfúziós áramlási javulást és szérum TNFα csökkenést okoz a 45 és 60 perces ischaemiát előtt alkalmazva, továbbá javulás látható a szövettani elváltozások, illetve az egy hetes túlélés tekintetében. Hasonló változások észlelhetők a rutin laboratóriumi paraméterekben. PJ34 PARPinhibitor, illetve Gln előkezelés, 60 perc reperfúziót vizsgálva, javítja a mikrocirkulációt. Az apoptózis detektálására széles körben használt TUNEL assay a jelen kísérleti rendszerben nem alkalmas. Aktivált kaszpáz3 immunhisztokémiával végzett vizsgálatok során, a PJ34 PARPinhibitor és Gln előkezelések hatására szignifikánsan magasabb apoptózis volt detektálható a kontroll csoporthoz képest. A májszöveti és szérum antioxidáns paramétereket mind az IP, mind a Gln előkezelés javították, míg a PJ34 PARP inhibitor, mintegy másodlagosan, csökkent mértékben hozott létre antioxidáns védelmet.

112. oldal

.


.

8. SUMMARY Introduction: The author reviews the international literature regarding ischemia reperfusion pathophysiology, and evaluates an experimental model of hepatic resection. Ischemiareperfusion (IR) injury plays an important role during liver resection or liver transplantation. Oxygenderived free radicals activate poly(ADPribose)polymerase (PARP) and decrease the available antioxidant pools. The aim of the study was to investigate ischemic tolerance during liver resection. In this model, we also investigated the protective effects of ischemic preconditioning (IP), PARP enzyme inhibitor (PJ34), and glutamine (Gln), an antioxidant. Inbred male Wistar rats were used for the experiment (n=130). Complete segmental ischemia of the liver was achieved by clamping of the portal triad with, or without, IP, PJ34 or Gln pretreatment before the ischemia. The microcirculation was monitored using laser Doppler flowmeter (LDF) throughout the ischemiareperfusion period. Required standardizations and mathematical analyses were performed in order to validate the statistical data. Histological alterations, immunohistochemistry (TUNEL, caspase), liver enzymes, bilirubin, and TNFα levels were all measured simultaneously. Results, conclusion: 30 minutes ischemia is well tolerated by the liver and IP does not cause further improvement. 45 to 60 minutes ischemia results in serious microcirculatory changes during reperfusion. 90 minutes ischemia is unequivocally intolerable. The liver injury and microcirculatory changes caused by 45 or 60 minutes of ischemia could be reduced with IP. Improvement was observed both, in the histological samples and in the survival rates. 45 and 60 minutes, IP + IR caused a significant decline in the TNFα level as well as in the laboratory blood samples. IP, PJ34 PARPinhibitor and glutamine pretreatment prior to 60 minutes of ischemia, all resulted in significant improvement of the microcirculation. We conclude that the widelyused TUNEL assay is inadequate in the present IR model to detect apoptosis. Immunohistochemistry against activated caspase3 showed significantly higher apoptosis rates in the PJ34 PARPinhibitor and glutaminepretreated groups, in contrast to the sham and IR groups. Antioxidant levels in the serum and in the liver homogenates showed significant improvement in the IP and glutaminepretreated groups, in contrast to the PJ34 PARPinhibitor pretreatment, where only slight improvement was seen.

113. oldal

.


.

IRODALOMJ EGYZÉK

1. Vauthey, J. N., Baer, H. U., Guastella, T., and Blumgart, L. H. Comparison of outcome between extended and nonextended liver resections for neoplasms. Surgery 114:968975, 1993. 2. Kupcsulik, P. and Kokas, P. Ischemic damage of the liver. Part I: In vitro investigation of the prevention of the ischemic lesion of the liver. Acta Hepato Gastroenterologica. 26(4):27983, 1979. 3. Kupcsulik, P. and Kokas, P. Ischemic damage of the liver. Part II: In vivo investigation of the prevention of the ischemic lesion of the liver. Acta Hepato Gastroenterologica. 26(4):2849, 1979. 4. Faller, J., Karacsonyi, S., Nemeth, M., and Kupcsulik, P. Role of hypothermia and perfusion in liver preservation. Acta Chirurgica Academiae Scientiarum Hungaricae. 15(1):6977, 1974. 5. Marubayashi, S., Dohi, K., Sugino, K., and Kawasaki, T. The protective effect of administered alphatocopherol against hepatic damage caused by ischemia reperfusion or endotoxemia. Ann N. Y. Acad. Sci. 570:208218, 1989. 6. Pietta, P. G. Flavonoids as antioxidants. [Review] [91 refs]. Journal of Natural Products. 63(7):103542, 2000. 7. Kobayashi, S. and Clemens, M. G. Kupffer cell exacerbation of hepatocyte hypoxia/reoxygenation injury. Circulatory Shock. 37(3):24552, 1992. 8. Virag, L. and Szabo, C. The therapeutic potential of poly(ADPribose) polymerase inhibitors. [Review] [630 refs]. Pharmacological Reviews. 54(3):375429, 2002. 9. Murry, C. E., Jennings, R. B., and Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation 74:11241136, 1986. 10. Huguet, C., Gavelli, A., and Bona, S. Hepatic resection with ischemia of the liver exceeding one hour. Journal of the American College of Surgeons. 178(5):4548, 1994. 11. Ezaki, T., Seo, Y., Tomoda, H., Furusawa, M., Kanematsu, T., and Sugimachi, K. Partial hepatic resection under intermittent hepatic inflow occlusion in patients with chronic liver disease. Br. J. Surg. 79:224226, 1992. 12. Isozaki, H., Adam, R., Gigou, M., Szekely, A. M., Shen, M., and Bismuth, H. Experimental study of the protective effect of intermittent hepatic pedicle clamping in the rat. Br. J. Surg. 79:310313, 1992.

114. oldal

.


.

13. Belghiti, J., Noun, R., Zante, E., Ballet, T., and Sauvanet, A. Portal triad clamping or hepatic vascular exclusion for major liver resection. A controlled study. Annals of Surgery. 224(2):15561, 1996. 14. Man, K., Fan, S. T., Ng, I. O., Lo, C. M., Liu, C. L., and Wong, J. Prospective evaluation of Pringle maneuver in hepatectomy for liver tumors by a randomized study. Annals of Surgery. 226(6):70411; discussion 7113, 1997. 15. Belghiti, J., Noun, R., Malafosse, R., Jagot, P., Sauvanet, A., Pierangeli, F., Marty, J., and Farges, O. Continuous versus intermittent portal triad clamping for liver resection: a controlled study. Annals of Surgery. 229(3):36975, 1999. 16. Blumgart LH and Fong Y Surgery of the Liver and the Biliary Tract.W.B. Saunders Company LTD , 2000. 17. Pringle J.H Notes of the arrest of hepatic hemorrhage due to trauma. Ann Surg 48:541, 1908. 18. Pichlmayr, R., Bretschneider, H. J., Kirchner, E., Ringe, B., Lamesch, P., Gubernatis, G., Hauss, J., Niehaus, K. J., and Kaukemuller, J. [Ex situ operation on the liver. A new possibility in liver surgery]. [German]. Langenbecks Archiv fur Chirurgie. 373(2):1226, 1988. 19. Jakab, F., Rath, Z., Schmal, F., Nagy, P., and Faller, J. A new method to measure portal venous and hepatic arterial blood flow in patients intraoperatively. HPB Surgery. 9(4):23943, 1996. 20. Jakab, F., Sugar, I., Rath, Z., Nagy, P., and Faller, J. The relationship between portal venous and hepatic arterial blood flow. I. Experimental liver transplantation. HPB Surgery. 10(1):216, 1996. 21. Lautt, W. W. Evaluation of surgical denervation of the liver in cats. Canadian Journal of Physiology & Pharmacology. 59(9):10136, 1981. 22. Lautt, W. W., Brown, L. C., and Durham, J. S. Active and passive control of hepatic blood volume responses to hemorrhage at normal and raised hepatic venous pressure in cats. Canadian Journal of Physiology & Pharmacology. 58(9):104957, 1980. 23. Goldsmith N.A and Woodburn, R. T. The surgical anatomy pertaining to liver resection. Surg Gynecol. Obstet. 105:310318, 1957. 24. Couiaud, C. [Anatomic principles of left and right regulated hepatectomy: technics.]. J Chir (Paris) 70:933966, 1954. 25. Carden, D. L. and Granger, D. N. Pathophysiology of ischaemiareperfusion injury. [Review] [97 refs]. Journal of Pathology.255266, 190. 26. Faller, J., Kupcsulik, P., and Karacsonyi, S. Histochemical study of nonspecific acid and alkaline phosphatase, adenosine triphosphatase and lactate

115. oldal

.


.

dehydrogenase in the dog liver perfused in vitro. Acta Chirurgica Academiae Scientiarum Hungaricae. 15(3):31326, 1974. 27. Kupcsulik, P., Faller, J., and Karacsonyi, S. [Histochemical studies of the unspecific acid and alkaline phosphatase, adenosine triphosphatase and lactate dehydrogenase of in vitro perfused dog liver]. [German]. Gegenbaurs Morphologisches Jahrbuch. 120(5):63857, 1974. 28. Kupcsulik, P., Faller, J., and Kokas, P. Enzyme histochemical studies of the preserved rat liver. Acta Chirurgica Academiae Scientiarum Hungaricae. 17(4):27588, 1976. 29. Kupcsulik, P., Stekker, K., and Nemeth, M. Effect of ischaemia on the enzyme activity of the hepatic tissue. Research in Experimental Medicine. 170(3):259 70, 1977. 30. Wang, G. L., Jiang, B. H., and Semenza, G. L. Effect of altered redox states on expression and DNAbinding activity of hypoxiainducible factor 1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 212:550556, 1995. 31. Wang, G. L. and Semenza, G. L. Molecular basis of hypoxiainduced erythropoietin expression. Curr. Opin. Hematol. 3:156162, 1996. 32. Tacchini, L., Radice, L., and BernelliZazzera, A. Differential activation of some transcription factors during rat liver ischemia, reperfusion, and heat shock. J. Cell Physiol 180:255262, 1999. 33. Bandyopadhyay, R. S., Phelan, M., and Faller, D. V. Hypoxia induces AP1 regulated genes and AP1 transcription factor binding in human endothelial and other cell types. Biochim. Biophys. Acta 1264:7278, 1995. 34. DarleyUsmar, V. M., Stone, D., and Smith, D. R. Oxygen and reperfusion damage: an overview. [Review] [30 refs]. Free Radical Research Communications. 7(36):24754, 1989. 35. Stone, D., DarleyUsmar, V., Smith, D. R., and O'Leary, V. Hypoxia reoxygenation induced increase in cellular Ca2+ in myocytes and perfused hearts: the role of mitochondria. Journal of Molecular & Cellular Cardiology. 21(10):96373, 1989. 36. Hoek, J. B., WalajtysRode, E., and Wang, X. Hormonal stimulation, mitochondrial Ca2+ accumulation, and the control of the mitochondrial permeability transition in intact hepatocytes. Mol. Cell Biochem. 174:173179, 1997. 37. Granger, D. N. Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia reperfusion injury. Am. J. Physiol 255:H1269H1275, 1988.

116. oldal

.


.

38. Granger, D. N. Ischemiareperfusion: mechanisms of microvascular dysfunction and the influence of risk factors for cardiovascular disease. Microcirculation. 6:167178, 1999. 39. Suzuki, S., ToledoPereyra, L. H., Rodriguez, F. J., and Cejalvo, D. Neutrophil infiltration as an important factor in liver ischemia and reperfusion injury. Modulating effects of FK506 and cyclosporine. Transplantation 55:12651272, 1993. 40. Harrison, D. G. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. J. Clin. Invest 100:21532157, 1997. 41. Kupcsulik, P., Kokas, P., and Karacsonyi, S. [The effect of ischemia on ascites secretion in the perfused rat liver]. [German]. Acta Chirurgica Academiae Scientiarum Hungaricae.111, 1920. 42. Dustin, M. L. and Springer, T. A. Lymphocyte functionassociated antigen1 (LFA1) interaction with intercellular adhesion molecule1 (ICAM1) is one of at least three mechanisms for lymphocyte adhesion to cultured endothelial cells. J. Cell Biol. 107:321331, 1988. 43. Kurose, I., Anderson, D. C., Miyasaka, M., Tamatani, T., Paulson, J. C., Todd, R. F., Rusche, J. R., and Granger, D. N. Molecular determinants of reperfusion induced leukocyte adhesion and vascular protein leakage. Circ. Res. 74:336343, 1994. 44. Kurose, I., Wolf, R., Grisham, M. B., and Granger, D. N. Modulation of ischemia/reperfusioninduced microvascular dysfunction by nitric oxide. Circ. Res. 74:376382, 1994. 45. Ambrosio, G., Zweier, J. L., Duilio, C., Kuppusamy, P., Santoro, G., Elia, P. P., Tritto, I., Cirillo, P., Condorelli, M., Chiariello, M., and . Evidence that mitochondrial respiration is a source of potentially toxic oxygen free radicals in intact rabbit hearts subjected to ischemia and reflow. J. Biol. Chem. 268:18532 18541, 1993. 46. Powell, S. R. and Tortolani, A. J. Recent advances in the role of reactive oxygen intermediates in ischemic injury. I. Evidence demonstrating presence of reactive oxygen intermediates; II. Role of metals in sitespecific formation of radicals. J. Surg Res. 53:417429, 1992. 47. IYER, G. Y., NAIR, M. S., and SUKUMARAN, M. Metabolic effects of alpha oxobutyric acid: effect on respiration of ratliver homogenates. Biochem. J. 78:766769, 1961. 48. Babior, B. M., Curnutte, J. T., and McMurrich, B. J. The particulate superoxide forming system from human neutrophils. Properties of the system and further evidence supporting its participation in the respiratory burst. J. Clin. Invest 58:989996, 1976.

117. oldal

.


.

49. Curnutte, J. T., Karnovsky, M. L., and Babior, B. M. Manganesedependent NADPH oxidation by granulocyte particles. The role of superoxide and the nonphysiological nature of the manganese requirement. J. Clin. Invest 57:1059 1067, 1976. 50. Blázovics A Az oxidatív stressz és a máj. In Fehér J and Lengyel G (Eds.), Hepatológia . Budapest: Medicina, 2001. Pp. 5090. 51. Marubayashi, S., Dohi, K., Yamada, K., and Kawasaki, T. Role of conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat liver cell injury. Surgery 110:537543, 1991. 52. Grisham, M. B., Granger, D. N., and Lefer, D. J. Modulation of leukocyte endothelial interactions by reactive metabolites of oxygen and nitrogen: relevance to ischemic heart disease. Free Radic. Biol. Med. 25:404433, 1998. 53. Jones, S. P., Girod, W. G., Palazzo, A. J., Granger, D. N., Grisham, M. B., Jourd'Heuil, D., Huang, P. L., and Lefer, D. J. Myocardial ischemiareperfusion injury is exacerbated in absence of endothelial cell nitric oxide synthase. Am. J. Physiol 276:H1567H1573, 1999. 54. Cutrn, J. C., Perrelli, M. G., Cavalieri, B., Peralta, C., Rosell, C. J., and Poli, G. Microvascular dysfunction induced by reperfusion injury and protective effect of ischemic preconditioning. [Review] [95 refs]. Free Radical Biology & Medicine. 33(9):12008, 2002. 55. FarzanehFar, R. and Moore, K. Nitric oxide and the liver. [Review] [158 refs]. Liver. 21(3):16174, 2001. 56. Zhang, B., Borderie, D., Sogni, P., Soubrane, O., Houssin, D., and Calmus, Y. NOmediated vasodilation in the rat liver. Role of hepatocytes and liver endothelial cells. Journal of Hepatology. 26(6):134855, 1997. 57. Kawamura, E., Yamanaka, N., Okamoto, E., Tomoda, F., and Furukawa, K. Response of plasma and tissue endothelin1 to liver ischemia and its implication in ischemiareperfusion injury. Hepatology. 21(4):113843, 1995. 58. McCord, J. M. and Fridovich, I. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). Journal of Biological Chemistry. 244(22):6049 55, 1969. 59. Marubayashi, S., Dohi, K., and Kawasaki, T. Role of free radicals in hepatic reperfusion injury. Ann N. Y. Acad. Sci. 723:368370, 1994. 60. Marubayashi, S., Dohi, K., Ezaki, H., Hayashi, K., and Kawasaki, T. Preservation of ischemic rat liver mitochondrial functions and liver viability with CoQ10. Surgery 91:631637, 1982. 61. Marubayashi, S., Dohi, K., Yamada, K., and Kawasaki, T. Changes in the levels of endogenous coenzyme Q homologs, alphatocopherol, and glutathione in rat

118. oldal

.


.

liver after hepatic ischemia and reperfusion, and the effect of pretreatment with coenzyme Q10. Biochim. Biophys. Acta 797:19, 1984. 62. Marubayashi, S., Oku, J., Dohi, K., Ochi, K., Yamada, K., and Kawasaki, T. [Changes in the levels of lipid peroxides in regenerating rat liver and the effect of pretreatment with CoQ10]. Nippon Geka Gakkai Zasshi 89:381387, 1988. 63. Bors, W., Heller, W., Michel, C., and Saran, M. Flavonoids as antioxidants: determination of radicalscavenging efficiencies. Methods in Enzymology. 186:34355, 1990. 64. Mates, J. M., PerezGomez, C., Nunez, d. C., I, Asenjo, M., and Marquez, J. Glutamine and its relationship with intracellular redox status, oxidative stress and cell proliferation/death. [Review] [163 refs]. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34(5):43958, 2002. 65. Oehler, R. and Roth, E. Regulative capacity of glutamine. [Review] [52 refs]. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 6(3):27782, 2003. 66. Rothlein, R., Dustin, M. L., Marlin, S. D., and Springer, T. A. A human intercellular adhesion molecule (ICAM1) distinct from LFA1. J. Immunol. 137:12701274, 1986. 67. Pober, J. S. WarnerLambert/ParkeDavis award lecture. Cytokinemediated activation of vascular endothelium. Physiology and pathology. Am. J. Pathol. 133:426433, 1988. 68. Marubayashi, S., Oshiro, Y., Maeda, T., Fukuma, K., Okada, K., Hinoi, T., Ikeda, M., Yamada, K., Itoh, H., and Dohi, K. Protective effect of monoclonal antibodies to adhesion molecules on rat liver ischemiareperfusion injury. Surgery. 122(1):4552, 1997. 69. Kupffer K Ueben Sternzellen der Leber. Briefliche Mittellung an Professor Waldayer. ArchMikr Anat 12:353358, 1876. 70. Shiratori, Y., Kiriyama, H., Fukushi, Y., Nagura, T., Takada, H., Hai, K., and Kamii, K. Modulation of ischemiareperfusioninduced hepatic injury by Kupffer cells. Digestive Diseases & Sciences. 39(6):126572, 1994. 71. Shiraishi, M., Hiroyasu, S., Nagahama, M., Miyaguni, T., Higa, T., Tomori, H., Okuhama, Y., Kusano, T., and Muto, Y. Role of exogenous Larginine in hepatic ischemiareperfusion injury. Journal of Surgical Research. 69(2):429 34, 1997. 72. Hur, G. M., Ryu, Y. S., Yun, H. Y., Jeon, B. H., Kim, Y. M., Seok, J. H., and Lee, J. H. Hepatic ischemia/reperfusion in rats induces iNOS gene transcription by activation of NFkappaB. Biochemical & Biophysical Research Communications. 261(3):91722, 1999.

119. oldal

.


.

73. Koeppel, T. A., Thies, J. C., Schemmer, P., Trauner, M., Gebhard, M. M., Otto, G., and Post, S. Inhibition of nitric oxide synthesis in ischemia/reperfusion of the rat liver is followed by impairment of hepatic microvascular blood flow. Journal of Hepatology. 27(1):1639, 1997. 74. Isobe, M., Katsuramaki, T., Hirata, K., Kimura, H., Nagayama, M., and Matsuno, T. Beneficial effects of inducible nitric oxide synthase inhibitor on reperfusion injury in the pig liver. Transplantation. 68(6):80313, 1999. 75. Bauer, M., Zhang, J. X., Bauer, I., and Clemens, M. G. ET1 induced alterations of hepatic microcirculation: sinusoidal and extrasinusoidal sites of action. American Journal of Physiology. 267(1 Pt 1):G1439, 1994. 76. Pannen, B. H., Bauer, M., NoldgeSchomburg, G. F., Zhang, J. X., Robotham, J. L., Clemens, M. G., and Geiger, K. K. Regulation of hepatic blood flow during resuscitation from hemorrhagic shock: role of NO and endothelins. American Journal of Physiology. 272(6 Pt 2):H273645, 1997. 77. Scommotau, S., Uhlmann, D., Loffler, B. M., Breu, V., and Spiegel, H. U. Involvement of endothelin/nitric oxide balance in hepatic ischemia/reperfusion injury. Langenbecks Archives of Surgery. 384(1):6570, 1999. 78. Trump, B. F., Goldblatt, P. J., and Stowell, R. E. Studies of necrosis in vitro of mouse hepatic parenchymal cells. Ultrastructural and cytochemical alterations of cytosomes, cytosegresomes, multivesicular bodies, and microbodies and their relation to the lysosome concept. Laboratory Investigation. 14(11):194668, 1965. 79. Lemasters, J. J., DiGuiseppi, J., Nieminen, A. L., and Herman, B. Blebbing, free Ca2+ and mitochondrial membrane potential preceding cell death in hepatocytes. Nature. 325(6099):7881,7, 1987. 80. Nieminen, A. L., Gores, G. J., Wray, B. E., Tanaka, Y., Herman, B., and Lemasters, J. J. Calcium dependence of bleb formation and cell death in hepatocytes. Cell Calcium. 9(56):23746, 1988. 81. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., and Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. [Review] [68 refs]. British Journal of Cancer. 26(4):23957, 1972. 82. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., and Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. [Review] [68 refs]. British Journal of Cancer. 26(4):23957, 1972. 83. CamilleriBroet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., and Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Experimental Cell Research. 239(2):27792, 1998.

120. oldal

.


.

84. Yin, X. M. Bid, a critical mediator for apoptosis induced by the activation of Fas/TNFR1 death receptors in hepatocytes. [Review] [80 refs]. Journal of Molecular Medicine. 78(4):20311, 2000. 85. Nieminen, A. L., Gores, G. J., Wray, B. E., Tanaka, Y., Herman, B., and Lemasters, J. J. Calcium dependence of bleb formation and cell death in hepatocytes. Cell Calcium. 9(56):23746, 1988. 86. Qian, T., Nieminen, A. L., Herman, B., and Lemasters, J. J. Mitochondrial permeability transition in pHdependent reperfusion injury to rat hepatocytes. American Journal of Physiology. 273(6 Pt 1):C178392, 1997. 87. Schwabe, R. F., Bennett, B. L., Manning, A. M., and Brenner, D. A. Differential role of I kappa B kinase 1 and 2 in primary rat hepatocytes. Hepatology. 33(1):8190, 2001. 88. Jaeschke, H. and Lemasters, J. J. Apoptosis versus oncotic necrosis in hepatic ischemia/reperfusion injury. [Review] [109 refs]. Gastroenterology. 125(4):124657, 2003. 89. Bedner, E., Li, X., Gorczyca, W., Melamed, M. R., and Darzynkiewicz, Z. Analysis of apoptosis by laser scanning cytometry. [Review] [120 refs]. Cytometry. 35(3):18195, 1999. 90. GraslKraupp, B., RuttkayNedecky, B., Koudelka, H., Bukowska, K., Bursch, W., and SchulteHermann, R. In situ detection of fragmented DNA (TUNEL assay) fails to discriminate among apoptosis, necrosis, and autolytic cell death: a cautionary note. Hepatology. 21(5):14658, 1995. 91. Gujral, J. S., Knight, T. R., Farhood, A., Bajt, M. L., and Jaeschke, H. Mode of cell death after acetaminophen overdose in mice: apoptosis or oncotic necrosis? Toxicological Sciences. 67(2):3228, 2002. 92. Sasaki, H., Matsuno, T., Tanaka, N., and Orita, K. Activation of apoptosis during the reperfusion phase after rat liver ischemia. Transplantation Proceedings. 28(3):19089, 1996. 93. BorghiScoazec, G., Scoazec, J. Y., Durand, F., Bernuau, J., Belghiti, J., Feldmann, G., Henin, D., and Degott, C. Apoptosis after ischemiareperfusion in human liver allografts. Liver Transplantation & Surgery. 3(4):40715, 1997. 94. Kohli, V., Selzner, M., Madden, J. F., Bentley, R. C., and Clavien, P. A. Endothelial cell and hepatocyte deaths occur by apoptosis after ischemia reperfusion injury in the rat liver. Transplantation. 67(8):1099105, 1999. 95. Bajt, M. L., Lawson, J. A., Vonderfecht, S. L., Gujral, J. S., and Jaeschke, H. Protection against Fas receptormediated apoptosis in hepatocytes and nonparenchymal cells by a caspase8 inhibitor in vivo: evidence for a postmitochondrial processing of caspase8. Toxicological Sciences. 58(1):109 17, 2000.

121. oldal

.


.

96. Bajt, M. L., Vonderfecht, S. L., and Jaeschke, H. Differential protection with inhibitors of caspase8 and caspase3 in murine models of tumor necrosis factor and Fas receptormediated hepatocellular apoptosis. Toxicology & Applied Pharmacology. 175(3):24352, 2001. 97. Cursio, R., Gugenheim, J., Ricci, J. E., Crenesse, D., Rostagno, P., Maulon, L., SaintPaul, M. C., Ferrua, B., and Auberger, A. P. A caspase inhibitor fully protects rats against lethal normothermic liver ischemia by inhibition of liver apoptosis. FASEB Journal. 13(2):25361, 1999. 98. Natori, S., Selzner, M., Valentino, K. L., Fritz, L. C., Srinivasan, A., Clavien, P. A., and Gores, G. J. Apoptosis of sinusoidal endothelial cells occurs during liver preservation injury by a caspasedependent mechanism. Transplantation. 68(1):8996, 1999. 99. Currin, R. T., Gores, G. J., Thurman, R. G., and Lemasters, J. J. Protection by acidotic pH against anoxic cell killing in perfused rat liver: evidence for a pH paradox. FASEB Journal. 5(2):20710, 1991. 100. Paxian, M., Bauer, I., Rensing, H., Jaeschke, H., Mautes, A. E., Kolb, S. A., Wolf, B., Stockhausen, A., Jeblick, S., and Bauer, M. Recovery of hepatocellular ATP and "pericentral apoptosis" after hemorrhage and resuscitation. FASEB Journal. 17(9):9931002, 2003. 101. Ogasawara, J., WatanabeFukunaga, R., Adachi, M., Matsuzawa, A., Kasugai, T., Kitamura, Y., Itoh, N., Suda, T., and Nagata, S. Lethal effect of the antiFas antibody in mice.[erratum appears in Nature 1993 Oct 7;365(6446):568]. Nature. 364(6440):8069, 1993. 102. Yang, J., Liu, X., Bhalla, K., Kim, C. N., Ibrado, A. M., Cai, J., Peng, T. I., Jones, D. P., and Wang, X. Prevention of apoptosis by Bcl2: release of cytochrome c from mitochondria blocked.[see comment]. Science. 275(5303):112932, 1997. 103. Yadav, S. S., Sindram, D., Perry, D. K., and Clavien, P. A. Ischemic preconditioning protects the mouse liver by inhibition of apoptosis through a caspasedependent pathway. Hepatology. 30(5):122331, 1999. 104. Kim, Y. M., Talanian, R. V., and Billiar, T. R. Nitric oxide inhibits apoptosis by preventing increases in caspase3like activity via two distinct mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 272(49):3113848, 1997. 105. Kim, Y. M., de Vera, M. E., Watkins, S. C., and Billiar, T. R. Nitric oxide protects cultured rat hepatocytes from tumor necrosis factoralphainduced apoptosis by inducing heat shock protein 70 expression. Journal of Biological Chemistry. 272(2):140211, 1997. 106. Jagtap, P. and Szabo, C. Poly(ADPribose) polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors. Nat. Rev. Drug Discov. 4:421440, 2005.

122. oldal

.


.

107. de Murcia, J. M., Niedergang, C., Trucco, C., Ricoul, M., Dutrillaux, B., Mark, M., Oliver, F. J., Masson, M., Dierich, A., LeMeur, M., Walztinger, C., Chambon, P., and de Murcia, G. Requirement of poly(ADPribose) polymerase in recovery from DNA damage in mice and in cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94(14):73037, 1997. 108. Oei, S. L. and Ziegler, M. ATP for the DNA ligation step in base excision repair is generated from poly(ADPribose). Journal of Biological Chemistry. 275(30):232349, 2000. 109. Hassa, P. O. and Hottiger, M. O. The functional role of poly(ADP ribose)polymerase 1 as novel coactivator of NFkappaB in inflammatory disorders. [Review] [208 refs]. Cellular & Molecular Life Sciences. 59(9):1534 53, 2002. 110. Nakajima, H., Nagaso, H., Kakui, N., Ishikawa, M., Hiranuma, T., and Hoshiko, S. Critical role of the automodification of poly(ADPribose) polymerase1 in nuclear factorkappaBdependent gene expression in primary cultured mouse glial cells. Journal of Biological Chemistry. 279(41):4277486, 2004. 111. Anup, R., Aparna, V., Pulimood, A., and Balasubramanian, K. A. Surgical stress and the small intestine: role of oxygen free radicals. Surgery. 125(5):5609, 1999. 112. Yellon, D. M., Alkhulaifi, A. M., and Pugsley, W. B. Preconditioning the human myocardium. Lancet 342:276277, 1993. 113. Pang, C. Y., Yang, R. Z., Zhong, A., Xu, N., Boyd, B., and Forrest, C. R. Acute ischaemic preconditioning protects against skeletal muscle infarction in the pig. Cardiovasc. Res. 29:782788, 1995. 114. Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C., and Lazdunski, M. Essential role of adenosine, adenosine A1 receptors, and ATPsensitive K+ channels in cerebral ischemic preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92:46664670, 1995. 115. Turman, M. A. and Bates, C. M. Susceptibility of human proximal tubular cells to hypoxia: effect of hypoxic preconditioning and comparison to glomerular cells. Ren Fail. 19:4760, 1997. 116. Hotter, G., Closa, D., Prados, M., FernandezCruz, L., Prats, N., Gelpi, E., and RoselloCatafau, J. Intestinal preconditioning is mediated by a transient increase in nitric oxide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 222:2732, 1996. 117. LlorisCarsi, J. M., Cejalvo, D., ToledoPereyra, L. H., Calvo, M. A., and Suzuki, S. Preconditioning: effect upon lesion modulation in warm liver ischemia. Transplant. Proc. 25:33033304, 1993. 118. Adam, R., Arnault, I., Bao, Y. M., Salvucci, M., Sebagh, M., and Bismuth, H. Effect of ischemic preconditioning on hepatic tolerance to cold ischemia in the rat. Transplant International. 11 Suppl 1:S16870, 1998.

123. oldal

.


.

119. Hardy, K. J., McClure, D. N., and Subwongcharoen, S. Ischaemic preconditioning of the liver: a preliminary study. Aust. N. Z. J Surg 66:707710, 1996. 120. Yoshizumi, T., Yanaga, K., Soejima, Y., Maeda, T., Uchiyama, H., and Sugimachi, K. Amelioration of liver injury by ischaemic preconditioning. Br. J Surg 85:16361640, 1998. 121. Peralta, C., Hotter, G., Closa, D., Gelpi, E., Bulbena, O., and RoselloCatafau, J. Protective effect of preconditioning on the injury associated to hepatic ischemia reperfusion in the rat: role of nitric oxide and adenosine. Hepatology 25:934 937, 1997. 122. Tsuyama, H., Shimizu, K., Yoshimoto, K., Nezuka, H., Ito, H., Yamamoto, S., Hasebe, K., Onishi, I., Muraoka, K., Ninomiya, I., Tani, T., Hashimoto, T., Yagi, M., and Miwa, K. Protective effect of ischemic preconditioning on hepatic ischemiareperfusion injury in mice. Transplant. Proc. 32:23102313, 2000. 123. Yin, D. P., Sankary, H. N., Chong, A. S., Ma, L. L., Shen, J., Foster, P., and Williams, J. W. Protective effect of ischemic preconditioning on liver preservationreperfusion injury in rats. Transplantation. 66(2):1527, 1998. 124. Howell, J. G., Zibari, G. B., Brown, M. F., Burney, D. L., Sawaya, D. E., Olinde, J. G., Granger, D. N., and McDonald, J. C. Both ischemic and pharmacological preconditioning decrease hepatic leukocyte/endothelial cell interactions. Transplantation 69:300303, 2000. 125. Koti, R. S., Seifalian, A. M., McBride, A. G., Yang, W., and Davidson, B. R. The relationship of hepatic tissue oxygenation with nitric oxide metabolism in ischemic preconditioning of the liver. FASEB J 16:16541656, 2002. 126. Koti, R. S., Yang, W., Dashwood, M. R., Davidson, B. R., and Seifalian, A. M. Effect of ischemic preconditioning on hepatic microcirculation and function in a rat model of ischemia reperfusion injury. Liver Transpl. 8:11821191, 2002. 127. Zapletal, C., Maksan, S. M., Lehmann, T., Guenther, L., Fallsehr, C., Mehrabi, A., Weiss, G., Golling, M., Gebhard, M. M., Herfarth, C., and Klar, E. Ischemic preconditioning improves liver microcirculation after ischemia/reperfusion. Transplant. Proc. 31:32603262, 1999. 128. Serafin, A., RoselloCatafau, J., Prats, N., Xaus, C., Gelpi, E., and Peralta, C. Ischemic preconditioning increases the tolerance of Fatty liver to hepatic ischemiareperfusion injury in the rat. Am. J Pathol. 161:587601, 2002. 129. Arai, M., Thurman, R. G., and Lemasters, J. J. Involvement of Kupffer cells and sinusoidal endothelial cells in ischemic preconditioning to rat livers stored for transplantation. Transplantation Proceedings. 31(12):4257,Mar, 1999. 130. Arai, M., Thurman, R. G., and Lemasters, J. J. Ischemic preconditioning of rat livers against cold storagereperfusion injury: role of nonparenchymal cells and

124. oldal

.


.

the phenomenon of heterologous preconditioning.[see comment]. Liver Transplantation. 7(4):2929, 2001. 131. Arai, M., Thurman, R. G., and Lemasters, J. J. Ischemic preconditioning of rat livers against cold storagereperfusion injury: role of nonparenchymal cells and the phenomenon of heterologous preconditioning.[see comment]. Liver Transplantation. 7(4):2929, 2001. 132. Noack, K., Bronk, S. F., Kato, A., and Gores, G. J. The greater vulnerability of bile duct cells to reoxygenation injury than to anoxia. Implications for the pathogenesis of biliary strictures after liver transplantation. Transplantation. 56(3):495500, 1993. 133. Compagnon, P., Wang, H. B., Southard, J. H., and Mangino, M. J. Ischemic preconditioning in a rodent hepatocyte model of liver hypothermic preservation injury. Cryobiology. 44(3):26978, 2002. 134. Bouma, M. G., van den Wildenberg, F. A., and Buurman, W. A. The anti inflammatory potential of adenosine in ischemiareperfusion injury: established and putative beneficial actions of a retaliatory metabolite. [Review] [108 refs]. Shock. 8(5):31320, 1997. 135. Arai, M., Thurman, R. G., and Lemasters, J. J. Contribution of adenosine A(2) receptors and cyclic adenosine monophosphate to protective ischemic preconditioning of sinusoidal endothelial cells against Storage/Reperfusion injury in rat livers. Hepatology. 32(2):297302, 2000. 136. Arai, M., Thurman, R. G., and Lemasters, J. J. Contribution of adenosine A(2) receptors and cyclic adenosine monophosphate to protective ischemic preconditioning of sinusoidal endothelial cells against Storage/Reperfusion injury in rat livers. Hepatology. 32(2):297302, 2000. 137. Liu, Y., Ytrehus, K., and Downey, J. M. Evidence that translocation of protein kinase C is a key event during ischemic preconditioning of rabbit myocardium. Journal of Molecular & Cellular Cardiology. 26(5):6618, 1994. 138. Ytrehus, K., Liu, Y., and Downey, J. M. Preconditioning protects ischemic rabbit heart by protein kinase C activation. American Journal of Physiology. 266(3 Pt 2):H114552, 1994. 139. Ricciardi, R., Meyers, W. C., Schaffer, B. K., Kim, R. D., Shah, S. A., Wheeler, S. M., Donohue, S. E., Sheth, K. R., Callery, M. P., and Chari, R. S. Protein kinase C inhibition abrogates hepatic ischemic preconditioning responses. Journal of Surgical Research. 97(2):1449, 2001. 140. Nichols, C. G., Ripoll, C., and Lederer, W. J. ATPsensitive potassium channel modulation of the guinea pig ventricular action potential and contraction. Circulation Research. 68(1):2807, 1991.

125. oldal

.


.

141. Sanada, S., Kitakaze, M., Asanuma, H., Harada, K., Ogita, H., Node, K., Takashima, S., Sakata, Y., Asakura, M., Shinozaki, Y., Mori, H., Kuzuya, T., and Hori, M. Role of mitochondrial and sarcolemmal K(ATP) channels in ischemic preconditioning of the canine heart. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 280(1):H25663, 2001. 142. Steenbergen, C., Perlman, M. E., London, R. E., and Murphy, E. Mechanism of preconditioning. Ionic alterations. Circulation Research. 72(1):11225, 1993. 143. Ishikawa, Y., Yamamoto, Y., Kume, M., Yamagami, K., Yamamoto, H., Kimoto, S., Sakai, Y., Yamamoto, M., and Yamaoka, Y. Heat shock preconditioning on mitochondria during warm ischemia in rat livers. Journal of Surgical Research. 87(2):17884, 1999. 144. Kume, M., Yamamoto, Y., Saad, S., Gomi, T., Kimoto, S., Shimabukuro, T., Yagi, T., Nakagami, M., Takada, Y., Morimoto, T., and Yamaoka, Y. Ischemic preconditioning of the liver in rats: implications of heat shock protein induction to increase tolerance of ischemiareperfusion injury. Journal of Laboratory & Clinical Medicine. 128(3):2518, 1996. 145. Peralta, C., Closa, D., Hotter, G., Gelpi, E., Prats, N., and RoselloCatafau, J. Liver ischemic preconditioning is mediated by the inhibitory action of nitric oxide on endothelin. Biochemical & Biophysical Research Communications. 229(1):26470, 1996. 146. Fernandez, L., Heredia, N., Grande, L., Gomez, G., Rimola, A., Marco, A., Gelpi, E., RoselloCatafau, J., and Peralta, C. Preconditioning protects liver and lung damage in rat liver transplantation: role of xanthine/xanthine oxidase.[see comment]. Hepatology. 36(3):56272, 2002. 147. Van Winkle, D. M., Chien, G. L., and Davis, R. F. Myocardial ischemic preconditioning. Advances in Pharmacology. 31:99108, 1994. 148. Terajima, H., Enders, G., Thiaener, A., Hammer, C., Kondo, T., Thiery, J., Yamamoto, Y., Yamaoka, Y., and Messmer, K. Impact of hyperthermic preconditioning on postischemic hepatic microcirculatory disturbances in an isolated perfusion model of the rat liver. Hepatology. 31(2):40715, 2000. 149. Terajima, H., Enders, G., Thiaener, A., Hammer, C., Kondo, T., Thiery, J., Yamamoto, Y., Yamaoka, Y., and Messmer, K. Impact of hyperthermic preconditioning on postischemic hepatic microcirculatory disturbances in an isolated perfusion model of the rat liver. Hepatology. 31(2):40715, 2000. 150. Katori, M., Busuttil, R. W., and KupiecWeglinski, J. W. Heme oxygenase1 system in organ transplantation. [Review] [72 refs]. Transplantation. 74(7):905 12, 2002.

126. oldal

.


.

151. Clavien, P. A., Yadav, S., Sindram, D., and Bentley, R. C. Protective effects of ischemic preconditioning for liver resection performed under inflow occlusion in humans. Ann Surg 232:155162, 2000. 152. Jassem, W., Fuggle, S. V., Cerundolo, L., Heaton, N. D., and Rela, M. Ischemic preconditioning of cadaver donor livers protects allografts following transplantation. Transplantation. 81(2):16974, 2006. 153. Jassem, W., Fuggle, S. V., Cerundolo, L., Heaton, N. D., and Rela, M. Ischemic preconditioning of cadaver donor livers protects allografts following transplantation. Transplantation. 81(2):16974, 2006. 154. Serafin, A., RoselloCatafau, J., Prats, N., Xaus, C., Gelpi, E., and Peralta, C. Ischemic preconditioning increases the tolerance of Fatty liver to hepatic ischemiareperfusion injury in the rat. American Journal of Pathology. 161(2):587601, 2002. 155. Trevisani, F., Colantoni, A., Caraceni, P., and Van Thiel, D. H. The use of donor fatty liver for liver transplantation: a challenge or a quagmire? Journal of Hepatology. 24(1):11421, 1996. 156. Curthoys, N. P. and Watford, M. Regulation of glutaminase activity and glutamine metabolism. [Review] [140 refs]. Annual Review of Nutrition. 15:13359, 1995. 157. Roth, E., Oehler, R., Manhart, N., Exner, R., Wessner, B., Strasser, E., and Spittler, A. Regulative potential of glutaminerelation to glutathione metabolism. [Review] [44 refs]. Nutrition. 18(3):21721, 2002. 158. Johnson, D. J., Muhlbacher, F., and Wilmore, D. W. Measurement of hepatic blood flow. Journal of Surgical Research. 39(5):47081, 1985. 159. Bradley, E. L., III Measurement of hepatic blood flow in man. Surgery. 75(5):7839, 1974. 160. Dhumeaux, D. and Berthelot, P. Measurement of hepatic blood flow in the rat. Transhepatic catheterization of the hepatic veins. Biologie et Gastro Enterologie. 6(1):4953,Feb, 1973. 161. Loisance, D. Y. and Lenriot, J. P. [Critical review of methods of measurement of hepatic blood flow in animal experimentation and human clinical practice]. [Review] [96 refs] [French]. Coeur et Medecine Interne. 11(3):54757,Sep, 1972. 162. Christie, J. H. and Chaudhuri, T. K. Measurement of hepatic blood flow. [Review] [57 refs]. Seminars in Nuclear Medicine. 2(2):97107, 1972. 163. Johnson, D. J., Muhlbacher, F., and Wilmore, D. W. Measurement of hepatic blood flow. Journal of Surgical Research. 39(5):47081, 1985.

127. oldal

.


.

164. Wheatley, A. M., Almond, N. E., Stuart, E. T., and Zhao, D. Interpretation of the laser Doppler flow signal from the liver of the rat. Microvascular Research. 45(3):290301, 1993. 165. Paku, S., Bodoky, G., Kupcsulik, P., and Timar, J. Blood supply of metastatic hepatic tumors: suggestions for improved delivery of chemotherapeutic agents. Journal of the National Cancer Institute. 90(12):9367, 1998. 166. Jakab, F., Rath, Z., Schmal, F., Nagy, P., and Faller, J. Intraoperative estimation of liver blood flow in man. Acta Chirurgica Hungarica. 33(34):36774,93, 1992. 167. Jakab, F., Rath, Z., Schmal, F., Nagy, P., and Faller, J. The interaction between hepatic arterial and portal venous blood flows; simultaneous measurement by transit time ultrasonic volume flowmetry. HepatoGastroenterology. 42(1):18 21, 1995. 168. Szijarto, A., Hahn, O., Lotz, G., Schaff, Z., Madarasz, E., and Kupcsulik, P. K. Effect of ischemic preconditioning on rat liver microcirculation monitored with laser Doppler flowmetry. J Surg Res. 131:150157, 2006. 169. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65(12):5563, 1983. 170. Hansen, M. B., Nielsen, S. E., and Berg, K. Reexamination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. Journal of Immunological Methods. 119(2):20310, 1989. 171. Blazovics, A., Kovacs, A., Lugasi, A., Hagymasi, K., Biro, L., and Feher, J. Antioxidant defense in erythrocytes and plasma of patients with active and quiescent Crohn disease and ulcerative colitis: a chemiluminescent study. Clin. Chem. 45:895896, 1999. 172. Oyaizu M Studies on products of browning reaction prepared from glucosamine. Japanase Journal of Nutrition 44:307315, 1986. 173. Blois MS Antioxidant determination by the use of stable free radicals. Nature 4617:19992000, 1958. 174. Sedlak, J. and Lindsay, R. H. Estimation of total, proteinbound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman's reagent. Anal. Biochem. 25:192205, 1968. 175. LOWRY, O. H. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265275, 1951. 176. Kupcsulik P Az ischaemia hatása a májra : A májkárosodás megelőzésének lehetőségei.Kandidátusi értekezés ; MTA TMB, 1977.

128. oldal

.


.

177. Palmes, D. and Spiegel, H. U. Animal models of liver regeneration. [Review] [86 refs]. Biomaterials. 25(9):160111, 2004. 178. Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., and Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. [Review] [116 refs]. HPB Surgery. 4(3):17186, 1991. 179. Wang, P., Ba, Z. F., Burkhardt, J., and Chaudry, I. H. Measurement of hepatic blood flow after severe hemorrhage: lack of restoration despite adequate resuscitation. American Journal of Physiology. 262(1 Pt 1):G928, 1992. 180. Barbiro, E., Zurovsky, Y., and Mayevsky, A. Real time monitoring of rat liver energy state during ischemia. Microvascular Research. 56(3):25360, 1998. 181. Seifalian, A. M., Mallet, S. V., Rolles, K., and Davidson, B. R. Hepatic microcirculation during human orthotopic liver transplantation. British Journal of Surgery. 84(10):13915, 1997. 182. Almond, N. E. and Wheatley, A. M. Measurement of hepatic perfusion in rats by laser Doppler flowmetry. American Journal of Physiology. 262(2 Pt 1):G2039, 1992. 183. Virag, L., Salzman, A. L., and Szabo, C. Poly(ADPribose) synthetase activation mediates mitochondrial injury during oxidantinduced cell death. J Immunol. 161:37533759, 1998. 184. Vali, L., Taba, G., Szentmihalyi, K., Febel, H., Kurucz, T., Pallai, Z., Kupcsulik, P., and Blazovics, A. Reduced antioxidant level and increased oxidative damage in intact liver lobes during ischaemiareperfusion. World Journal of Gastroenterology. 12(7):108691, 2006. 185. Bowes, J. and Thiemermann, C. Effects of inhibitors of the activity of poly (ADPribose) synthetase on the liver injury caused by ischaemiareperfusion: a comparison with radical scavengers. British Journal of Pharmacology. 124(6):125460, 1998. 186. MotaFilipe, H., Sepodes, B., McDonald, M. C., Cuzzocrea, S., Pinto, R., and Thiemermann, C. The novel PARP inhibitor 5aminoisoquinolinone reduces the liver injury caused by ischemia and reperfusion in the rat. Medical Science Monitor. 8(11):BR44453, 2002. 187. Curthoys, N. P. and Watford, M. Regulation of glutaminase activity and glutamine metabolism. [Review] [140 refs]. Annual Review of Nutrition. 15:13359, 1995. 188. Murphy, C. and Newsholme, P. Macrophagemediated lysis of a betacell line, tumour necrosis factoralpha release from bacillus CalmetteGuerin (BCG) activated murine macrophages and interleukin8 release from human monocytes are dependent on extracellular glutamine concentration and glutamine metabolism. Clinical Science. 96(1):8997, 1999.

129. oldal

.


.

189. Exner, R., Tamandl, D., Goetzinger, P., Mittlboeck, M., Fuegger, R., Sautner, T., Spittler, A., and Roth, E. Perioperative GLYGLN infusion diminishes the surgeryinduced period of immunosuppression: accelerated restoration of the lipopolysaccharidestimulated tumor necrosis factoralpha response. Ann Surg 237:110115, 2003. 190. Roth, E., Oehler, R., Manhart, N., Exner, R., Wessner, B., Strasser, E., and Spittler, A. Regulative potential of glutaminerelation to glutathione metabolism. [Review] [44 refs]. Nutrition. 18(3):21721, 2002. 191. Chang, W. K., Yang, K. D., Chuang, H., Jan, J. T., and Shaio, M. F. Glutamine protects activated human T cells from apoptosis by upregulating glutathione and Bcl2 levels. Clinical Immunology. 104(2):15160, 2002. 192. Manhart, N., Vierlinger, K., Spittler, A., Bergmeister, H., Sautner, T., and Roth, E. Oral feeding with glutamine prevents lymphocyte and glutathione depletion of Peyer's patches in endotoxemic mice. Annals of Surgery. 234(1):927, 2001. 193. Wernerman, J., Luo, J. L., and Hammarqvist, F. Glutathione status in critically ill patients: possibility of modulation by antioxidants. [Review] [29 refs]. Proceedings of the Nutrition Society. 58(3):67780, 1999. 194. Goossens, V., Grooten, J., and Fiers, W. The oxidative metabolism of glutamine. A modulator of reactive oxygen intermediatemediated cytotoxicity of tumor necrosis factor in L929 fibrosarcoma cells. Journal of Biological Chemistry. 271(1):1926, 1996. 195. Obrador, E., Carretero, J., Esteve, J. M., Pellicer, J. A., Pascual, A., Petschen, I., and Estrela, J. M. Glutamine potentiates TNFalphainduced tumor cytotoxicity. Free Radical Biology & Medicine. 31(5):64250, 2001. 196. Filomeni, G., Rotilio, G., and Ciriolo, M. R. Glutathione disulfide induces apoptosis in U937 cells by a redoxmediated p38 MAP kinase pathway. FASEB Journal. 17(1):646, 2003. 197. Filomeni, G., Rotilio, G., and Ciriolo, M. R. Cell signalling and the glutathione redox system. [Review] [62 refs]. Biochemical Pharmacology. 64(56):105764, 2002.

130. oldal

.


.

SAJ ÁT PUBLIKÁCIÓK J EGYZÉKE Az értekezés alapjául szolgáló elsőszer zős közlemények jegyzéke: A. Szijártó, O. Hahn, G. Lotz, Z. Schaff, E. Madarász, P. Kupcsulik: Effect of ischemic preconditioning on rat liver microcirculation monitored with laser doppler flowmetry. Journal of Surgical Research 131(1):150157, 2006

IF: 1,956

A Szijártó, E Batmunkh, O Hahn, Z Mihály, Á Kreiss, A Kiss, G Lotz, Zs Schaff, L Váli, A Blázovics, D Gerő, Cs Szabó, P Kupcsulik: Effect of PJ34 PARPinhibitor on rat liver mikrocirkuláción and antioxidant status Journal of Surgical Research [nyomtatásban]

IF: 1,956

Nem az értekezés alapjául szolgáló közlemények: Váli L., Szijártó A., Hahn O., Fehér J., Kupcsulik P.: A benignus májdaganatok és szabadgyökök kapcsolata Orvosi Hetilap (40) 204351, 2004 okt

Lódi C, Szabó E, Holczbauer Á, Batmunkh E, Szijártó A, Kupcsulik P, Kovalszky I, Paku S, Illyés G, Kiss A , Schaff Z: Claudin4 differentiates biliary tract cancers from hepatocellular carcinomas Modern Pathology (19):460469, 2006

IF: 3,426

E. Gyurkovics, B. Tihanyi, A. Szijarto, P. Kaliszky, H. Sas, V. Temesi, P. Kupcsulik: Fatal outcome from extereme acute gastric dilatation after an eating binge Case report International Journal of Eating Disorders 39(7): 602605, 2006

IF: 1,915

Wacha J., Szijártó A., Kupcsulik P.:Prebiotikumok, Probiotikumok, Szinbiotikumok – Irodalmi Áttekintés Kontrollált Klinikai Vizsgálatok Elemzései Alapján Metabolizmus IV. Évfolyam 1:6267, 2006

Hahn O, Szijártó A, Lotz G, Schaff Zs, Vígváry Z, Váli L, Kupcsulik P: The effect of ischemic preconditioning (IP) prior to intraoperative radiotherapy (IORT) on ischemic and on reperfusioned rat liver Journal of Surgical Research [nyomtatásban] IF: 1,956

131. oldal

.


.

Megjelent és elfogadott in extensio közlemények impakt faktora összesen: 11,209 IF Az értekezéssel összefüggő, lektorált folyóiratban megjelent idézhető abstractok: Szijártó A., Hahn O., Kupcsulik P.: Ischaemia és reperfusio okozta károsodás vizsgálata patkánymájon. Magyar Sebészet 2001 54 (Suppl) 40 p.

Szijártó A., Hahn O., Kupcsulik P.: Ischaemia és reperfúzió kisérletes vizsgálata patkánymájon. Magyar Sebészet 2002 55 (3) 135 p

Szijártó A., Hahn O., Mihály Z., Kreiss Á., Kiss A., Batmunkh E., Váli L., Blázovics A., Szabó Cs., Kupcsulik P: PJ34 PARP inhibitor előkezelés hatása a máj microcirculatiojára és az ischaemias károsodásra állatkisérletes modellen. Magyar Sebészet 2005 58 (4) 272 p.

Szijártó A, Hahn O, Mihály Z, Kreiss Á, Kiss A, Batmunkh E, Váli L, Blázovics A, Kupcsulik P, Harsányi L: PJ34 PARP inhibitor versus glutamin előzelések kisérletes vizsgálata ischaemias patkánymájon. Magyar Sebészet 2006 59 (4) 306 p

Hahn O., Szijártó A., Mihály Z., Kreiss Á., Kiss A., Batmunkh E., Váli L., Blázovics A., Szabó Cs., Kupcsulik P, Harsányi L.: Kémiai preconditionalas kisérletes vizsgálata ischaemias patkánymájon. PJ34 PARP inhibitor versus glutamin. Magyar Sebészet 2005 58 (4) 261 p.

Mihály Z., Szijártó A., Hahn O., Kupcsulik P: Az ischaemias preconditionalas hatása a máj microcirculatiojára és az ischaemias károsodásra. Magyar Sebészet 2005 58 (4) 268 p.

Kreiss Á., Szijártó A., Hahn O., Kupcsulik P.: Ischaemia és reperfusio kísérletes vizsgálata patkánymájon laser Doppler flowmeterrel. Magyar Sebészet 2005 58 (4) 284 p.

132. oldal

.


.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretném köszönetemet kifejezni a sebészpályámon elindító Kupcsulik Péter

Professzor Úrnak, aki a kezdetektől lehetővé tette kutatásaimat, megértő türelemmel és segítőkészséggel buzdított a tökéletes munka felé. Köszönöm hasznos tanácsait, építő kritikáit munkám során és az értekezés elkészítésénél. Köszönet illeti Schaff Zsuzsa Professzor Asszonyt, témavezetőmet, aki kellő bátorítással és hasznos tanácsaival segítette munkámat. Külön köszönettel tartozom barátomnak, kollégámnak Dr. Hahn Oszkárnak, akinek éveken át tartó segítőkészsége, ötletei és közös lelkesedésünk minden oldalon jelen van. Köszönöm Dr. Harsányi László Docens Úrnak ötleteit, támogatását és segítségét, melyet a glutaminnal végzett kísérleteimben tanúsított, továbbá köszönöm az értekezés elkészítésénél nyújtott hasznos tanácsait, kritikai megjegyzéseit. Köszönöm a tudományos diákköri munka keretében a kísérleti műtőben dolgozó hallagtók és ma már egyikmásik doktor segítségét, úm.: Dr. Váli László, Dr. Mihály

Zoltán, Kreiss Ádám, Stangl Rita, Szentiványi Zoltán, Halasi Tamás, Tamás Judit. A teljesség igénye nélkül, köszönet illeti a II. sz. Patológiai Intézet munkatársait: Dr.

Kiss Andrást, Dr. Lotz Gábort, Dr. Batmunkh Enkhjargalt. Továbbá Szabó Csaba Dr. és Gerő Domokos Dr. segítségét köszönöm, akik nélkül a PARP inhibitorokkal végzett kísérletek nem jöhettek volna létre. Köszönöm a II. sz. Belgyógyászati Klinikán dolgozó Dr. Blázovics Anna és Dr. Váli László kollégák aktív részvételét az antioxidáns vizsgálatokban. Köszönettel tartozom mindazoknak, akik a jelen értekezés létrejöttében tevőlegesen, szakmai, kritikai és morális segítségükkel részt vettek, ötleteikkel, türelmükkel, vagy bátorításukkal elősegítették a munkámat. Hálás köszönet illeti Szüleimet, akik segítségével lettem orvos és így elérthettem céljaimat. Köszönöm Ágnesnek és egész Családomnak kitartó buzdításukat és megértő türelmüket.

133. oldal

Az ischaemia tolerancia növelésének lehetőségei a májsebészetben

Recommend Documents