Keywords: apoptosis, ischaemia, pathomechanism, stroke

KLINIKAI TANULMÁNYOK APOPTÓZIS FOKÁLIS AGYI ISCHAEMIÁBAN Zádor Zsolt*, Lacza Zsombor†, Benyó Zoltán†, Harkány Tibor‡, Hortobágyi Tibor* Szegedi Tudományegyetem, *Patológiai Intézet, ‡Orvosi Vegytani Intézet, Szeged †Semmelweis Egyetem, Humán Élettani és Kísérletes Klinikai Kutató Intézet, Budapest

APOPTOSIS IN FOCAL BRAIN ISCHAEMIA Zádor Zs; Lacza Zs, MD, PhD; Benyó Z, MD, PhD; Harkány T, PhD; Hortobágyi T, MD, PhD Az ischaemiás stroke, amely hazánkban is vezetô halálok, gócos agyi vérellátási zavar következtében alakul ki. Az ischaemiás sejtpusztulás döntôen hevenyen lezajló nekrózis formájában jelentkezik. Terápiás szempontból is jelentôs sajátosság, hogy a nekrotikus agyterület határzónájában késleltetett sejtvesztés zajlik, amely az apoptózis jellegzetességeit mutatja. Az apoptózis korunk orvosbiológiai kutatásainak egyik legintenzívebben vizsgált folyamata, mechanizmusának jobb megismerése számos betegség, köztük az ischaemiás stroke eredményesebb terápiáját ígéri. A szerzôk összefoglalják a fokális agyi ischaemia neurológiai jellegzetességeit, az apoptotikus és a nekrotikus sejtpusztulás morfológiai jellemzôit. Az apoptózis mechanizmusát a gének szintjén zajló döntési és sejtszintû végrehajtási fázisra osztva tekintik át. Tárgyalják a fiziológiásan egyensúlyban lévô pro- és antiapoptotikus gének és fehérjetermékeik döntési fázisban bekövetkezô arányeltolódását, az apoptotikus kaszkád beindításában kulcsszerepet játszó kalciumhomeosztázis-felbomlás, energiadepletio és mitochondrialis diszfunkció sajátosságait. Bemutatják az apoptózisban fontos szerepet játszó kaszpázokat és a végrehajtási fázis három lehetséges eseménysorát: az intrinszik és az extrinszik kaszpáz utat, valamint a kaszpázfüggetlen intracelluláris jelátviteli rendszert. Ismertetik a végrehajtási fázisban jelentkezô idegsejtmembrán-károsodás molekuláris mechanizmusát, a fehérjeszintézis sajátos megváltozásának, az üzenetkiválasztásnak a jellemzôit. Hangsúlyozzák a késôi reperfúzió apoptózis-végrehajtásban játszott jelentôs szerepét. Bemutatják az apoptózis eseménysorának lehetséges terápiás célpontjait, ismertetik az állatkísérletekben eredményesnek bizonyult antiapoptotikus beavatkozásokat és azok humán alkalmazásának kilátásait.

Ischaemic stroke is one of the major causes of death and disability in the developed world. It is caused by focal impairment of cerebral blood flow. The subsequent ischaemic cell death is predominantly necrotic in nature. However, a therapeutically important characteristic is the delayed apoptotic cell demise in the border zone of the primary lesion core. Apoptosis is one of the most intensively studied field of current medical and biological research. The better understanding of its mechanism may provide novel and more effective ways of therapy in a wide range of diseases including ischemic stroke. The salient neurological features of focal brain ischaemia and the morphological signs of apoptotic and necrotic cell death are summarized. The mechanism of apoptosis is discussed. It is divided into an early genetic phase of decisionmaking followed by a cellular execution phase. The characteristics of the early shift in the finely tuned balance of proand antiapoptotic genes and their protein products, which is preceded by an inbalance in intracellular ionized calcium homeostasis, energy depletion and mitochondrial dysfunction is discussed. The crucial role of caspases in apoptosis is emphasized. The three possible pathways during the execution phase is described: the intrinsic- and extrinsic caspase activation cascade and the caspase-independent intracellular signal transduction route. The molecular mechanism of neural cell membrane damage in the execution phase is discussed and some examples of altered protein synthesis also known as message-selection are given. The important role of late reperfusion in the execution phase is emphasized. The possible targets of antiapoptotic therapeutic approaches and the results of experimental studies are presented as well as the perspectives of their use in human clinical care. Clin Neurosci/Ideggy Szle 2003;56(7–8):216–228.

Kulcsszavak: apoptózis, ischaemia, patomechanizmus, stroke

Keywords: apoptosis, ischaemia, pathomechanism, stroke

Levelezô szerzô/Correspondence: Dr. Hortobágyi Tibor Szegedi Tudományegyetem, Patológiai Intézet, H-6701 Szeged, Állomás utca 2., Pf. 427. Telefon: (62) 545-878, fax: (62) 545-868, e-mail: [email protected] Közlésre érkezett: 2003. január 28. Elfogadva: 2003. május 26.

216 Zádor: Apoptózis fokális agyi ischaemiában

z ischaemiás stroke a rendszerint valamelyik nagy agyi artéria elzáródása következtében kialakuló átmeneti vagy végleges fokális agyi vérellátási zavar, amely hirtelen kialakuló és több mint 24 óráig fennálló neurológiai deficitet okoz1. A fokális agyi ischaemia a harmadik leggyakoribb halálok (a cardiovascularis és a daganatos betegségek után)1. A betegek jelentõs hányada az akut stádiumban meghal, további egyharmaduknak pedig súlyos és maradandó neurológiai funkciókieséssel kell együtt élnie. A stroke egészségügyi, népgazdasági jelentõsége miatt klinikailag és kísérletesen egyaránt igen intenzíven vizsgált betegség. A múlt század kilencvenes éveiben – az „Agy évtizedében” – világszerte folyt a szélütéskampány (brain attack campaign). Ez magában foglalta a kísérletes és klinikai kutatás fokozott támogatását, a lakosság tájékoztatását és a prevencióban jelentõs egészséges életmód népszerûsítését. Ekkor mutattak elõször biztató eredményeket a klinikai gyógyszerkipróbálások is, az akut thrombolysis révén. Az idegsejt megmentését közvetlenül célzó terápiás stratégiák a klinikai kipróbálások során azonban eddig nem váltották be a hozzájuk fûzött reményeket. Továbbra is sokat ígérõ terápiás elképzelés azonban a nekrózis határzónájában zajló apoptotikus sejtpusztulás megakadályozása. Az alábbiakban az újabb kutatási eredmények fényében összefoglaljuk a fokális agyi ischaemia és az apoptózis fõ jellemzõit, ismertetjük az apoptotikus sejthalál mechanizmusát, valamint az antiapoptotikus kezelés lehetséges támadáspontjait.

A

A fokális agyi ischaemiás laesio általános jellemzõi A fokális agyi ischaemia hátterében érelzáródás áll, amely lehet teljes vagy részleges. Patológiailag vértelen vagy vérzéses jellegû nekrózisnak felel meg, amely kezdetben (napok) koagulációs, késõbb (egy-két hét) a makrofágok nagyszámú jelenléte miatt abszorptív jellegû, míg mintegy három hét múlva üregcse (cavitatio) marad helyén vissza. A jóval ritkább vénás elzáródás (mely leggyakrabban a nagy vénás agyi sinusok valamelyike, elsõsorban a sinus sagittalis superior érintettsége következtében alakul ki) szinte mindig vérzéses jellegû elhalást okoz. További speciális forma az inkomplett infarktus, amely esetén egyes szöveti alkotók – elsõsorban a vérerek, kisebb mértékben az astrocyták – túlélnek, míg a sérülékenység függvényében a többi szövetalkotó nagyrészt elpusztul. Ennek egyik típusa a szelektív neuronalis nekrózis. Az elhalás érintheti izoláltan az agykérget, a subcorticalis terü-

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK AIF: apoptózisindukáló faktor AMPA: α-amino-3-hidroxi-5-metil4-izoxalon-propionsav Apaf-1: apoptózisprotein-akiváló faktor 1 BDNF: agyi eredetû idegnövekedési faktor CAD: kaszpáz 3-aktiválta dezoxiribonukleáz CARD: kaszpázrekrutáló domén COX: ciklooxigenáz ec.: extracelluláris eIF4G, eIFα(P): elongációiniciáló faktor FADD: Fas-asszociált haláldomén Fas-L: Fas-ligand FFA: szabad zsírsav (free fatty acid) FGF: fibroblastnövekedési faktor GABA: gamma-aminovajsav IAP: apoptózisprotein-inhibitor ic.: intracelluláris ICAD: kaszpáz 3-aktiválta dezoxiribonukleázgátló MAP: mitogénaktivált protein NGF: idegnövekedési faktor NIAP: neuronalis apopózisprotein-inhibitor NMDA: N-metil-D-aszpartát NOS: nitrogén-oxid-szintetáz PARP: poli(ADP-ribóz)-polimeráz PCD: programozott sejthalál (programmed cell death) PGG: prosztaglandin G PGH: prosztaglandin H PKA: proteinkináz A PLA2: foszfolipáz A2 PLC: foszfolipáz C PP1: proteinfoszfatáz 1 SM: szfingomielináz SOD: szuperoxid-dizmutáz TNFα: tumornekrózisfaktor-α TRADD: TNF-asszociált haláldomén TRAP: TNF-receptor-asszociált protein-2 VEGF: vascularis endothelialis növekedési faktor

letet, a fehérállományt, de leggyakrabban mindhárom részét képezi a szövetpusztulásnak. Agyi ischaemiában az idegsejt tehát letálisan vagy szubletálisan károsodhat. Fokális laesio esetén a sérült területek jellegzetesen rendezõdnek és elkülönülnek: a károsodás centrumában nekrotizált sejtek alkotta központi mag (core) jön létre, míg körülötte szubletálisan sérült, szelektív neuronalis károsodást mutató szövet alkotja a penumbrát (ez eredetileg csillagászati fogalom: félárnyékot jelent,

Clin Neurosci/Ideggy Szle 2003;56(7–8):216–228

217

amely jellegzetesen teljes nap- vagy holdfogyatkozás esetén látható az égitest körül). A penumbra olyan csökkent vérátáramlású terület, ahol a morfológiai integritás ugyan részlegesen megmarad, de a sejtes funkciók kiesése mutatkozik. A köpenyszerû penumbra térfogata gyakran többszöröse a menthetetlenül elpusztult központi mag térfogatának. Sajnos, a penumbra specifikus morfológiai jellegzetességei pontosan nem ismertek. Annyi bizonyosnak látszik, hogy a penumbra sejtjei döntõen apoptózissal pusztulnak el, de megmenthetõk, ha a sejthalált reverzíbilis fázisában le tudjuk állítani. A penumbra megmentésének klinikai jelentõségét az adja, hogy bizonyos lokalizációban az agyi infarktus méretének akár csekély mérséklõdése a neurológiai funkció jelentõs javulását eredményezheti. Az elhalás helye az elzáródott értõl függ. Az agy vérellátása mintegy 90%-ban az arteria carotis interna felõl biztosított; ennek ága az a. cerebri media, az a. chorioidea anterior és az a. cerebri anterior. Ezen, úgynevezett anterior circulatio területén a leggyakoribb a fokális agyi ischaemia kialakulása, s az a. cerebri media a leggyakrabban érintett ér, mind thromboticus, mind emboliás eredetû elzáródás esetén. Az agyi vérellátás 10%-ban a posterior (vertebrobasilaris) rendszer felõl biztosított; ide tartozik az a. cerebri posterior ágrendszere is. A vérellátás természetesen csak ép érrendszer esetén ilyen megoszlású. Itt jegyezzük meg, hogy az ischaemiás stroke korai diagnózisának felállítását megnehezíti, hogy hagyományos CT- és MR-vizsgálattal az érelzáródást követõ 12–18 órában definitív elváltozások nem észlelhetõk. AZ ISCHAEMIÁS KÁROSODÁST MODULÁLÓ FÔBB TÉNYEZÔK

Az agy sajátos metabolizmusa és vérellátása miatt a többi szövetnél fokozottabban érzékeny ischaemiára. Az ischaemia káros következményeit azonban számos tényezõ befolyásolja. Lényeges az érokklúzió helye (általában minél proximálisabb, annál nagyobb az infarktus) és a kollaterális keringés mértéke. Utóbbi mind az ember esetében, mind a kísérleti állatfajták között igen nagy variabilitást mutat. Az ischaemia idõtartama sorsdöntõ lehet, ugyanis csak a korai reperfúzió teszi lehetõvé a szöveti restitúciót, egyébként a reperfúziós károsodás tovább súlyosbítja az érelzáródás következményeit (az oxigén-szabadgyökök képzõdése, a fokozott Ca++-beáramlás, az oedema súlyosbítása és a gyakoribb vérzéses jelenségek miatt). A hõmérséklet igen jelentõs hatású: a hipotermia neuroprotektív, míg a hipertermia súlyosbítja az ischaemia hatását. A vércukorszint a fiziológiás tartomány fölött káros ischaemia esetén is. A vérgázparaméterek közül a


hypoxia és a hypercapnia súlyosbítja az ischaemiás károsodást, mivel az oxigénhiány és a lokális acidózis a penumbra sejtjeinek pusztulását serkenti. Az artériás vérnyomás csökkenése hipoperfúziót és ezáltal az oxigenizáció további romlását okozza a penumbra területén.

A programozott sejthalál, az apoptózis és a nekrózis Az apoptózis jelenségét Kerr, Wyllie és Currie írták le több mint három évtizede2, 3. Napjainkra a klinikai kutatómunka egyik gyújtópontjába került az apoptózis vizsgálata, és az elmúlt öt év tudományos eredményei alapján számos lehetõség mutatkozik a folyamat visszafordítására. Az apoptózis jelentõségét az is aláhúzza, hogy a 2002. évi orvosi Nobeldíjjal is a kitüntetetteknek (Sydney Brenner, Robert Horvitz, John Sulston) az apoptózis vizsgálatában elért eredményeit ismerték el. Magyar nyelvû közlemény az irodalmi adatbázisok szerint eddig négy jelent meg a témában4–7, s csupán Hortobágyi és Nagy 1997-es cikke foglalkozik az apoptózis neurológiai vonatkozásaival, kiemelten tárgyalva agyi ischaemiában játszott szerepét5. A programozott sejthalál és az apoptózis gyakran szinonimaként használatos fogalmak, de a közös vonások mellett számos eltérés figyelhetõ meg a két folyamat között. A programozott sejthalál a sejtek idõzített, jól körülhatárolt, genetikailag meghatározott pusztulása, amely része a szervek fejlõdésének és fiziológiájának. Ez zajlik például a laktáló emlõ regressziójakor, a bélhámsejtek lelökõdésekor, az embrió morfogenezisében, és ez a folyamat felelõs a proliferáló sejtek számának állandóságáért is. Az apoptózis morfológiája messzemenõkig megegyezik a programozott sejthaláléval. Döntõ különbség, hogy a genetikailag szabályozott sejtpusztulást apoptózisban patológiás tényezõk indítják el, a szükségesnél korábban. Idõrendben a következõ változásokat látjuk mind a programozott sejthalálban, mind az apoptózis esetében: 1. A sejt közötti kapcsolatok visszafejlõdnek, a maganyag jellemzõ méretû darabokra hasad (úgynevezett létra és rozetta jelenik meg gélfuttatáskor) és az endoplazmatikus retikulum megduzzad. 2. A sejtmembrán álnyúlványokat bocsát ki (bimbózás), a megmaradt sejttest pedig fokozatosan apoptotikus testté válik. 3. Az intracelluláris enzimkészlet biztonságos lebomlása után a sejthártya permeabilitása megnõ, egyúttal jelzõmolekulák jelennek meg a sejt felszínén, elõsegítve, hogy a megmaradt apoptotikus testet a falósejtek bekebelezhessék. A két folyamat további közös jellemzõje –

ellentétben a nekrózissal –, hogy a sejthártya és a többi fõ sejtorganellum a folyamat végsõ fázisáig csupán mérsékelt fokú, reverzíbilis károsodást szenved, lizoszomális enzimek nem szivárognak ki a sejtbõl és a bekövetkezõ sejtpusztulás környezetében nincs neutrofilgranulocyta- vagy lymphocytainfiltráció. Ez a folyamat energia- (azaz ATP-) igényes. Mivel napokkal, sõt, hetekkel a kiváltó inzultus után is megfigyelhetõ, az eredményes terápiás beavatkozásra több idõ áll rendelkezésre. A nekrózis a sejtek irreverzíbilis károsodása, gyors és kiterjedt pusztulása, amelyet reaktív leukocytainfiltráció vesz körül és – szemben a fenti két folyamattal – hegesedés követ. A nekrotizáló sejtekben aspecifikus génaktiváció van és új fehérje képzõdésétõl függetlenül is végbemegy.

Az agyi ischaemiában jelentkezõ apoptózis Az agyi ischaemiában jelentkezõ apoptózis molekuláris mechanizmusának ismerete terápiás lehetõségeket kínál. Az apoptózis morfológiai változásait ugyanis molekuláris folyamatok elõzik meg, amelyek megismerése lehetõvé teszi, hogy farmakonokkal az apoptózis eseménysorába beavatkozzunk, idõben megállíthassuk azt, és így megakadályozzuk a nem kívánt sejtpusztulást. Apoptózist számos fiziológiás és patológiás hatás idézhet elõ: DNS-károsodás, az úgynevezett haláldomén aktiválódása, az apoptotikus jelút beindítása és serkentése, valamint közvetlenül károsító fizikai hatás. Az agyi ischaemiában jelentkezõ apoptózist elsõdlegesen az oxigénhiány és a következményes ATP-csökkenés indítja el. Feltételezik, hogy agyi ischaemiában egyfajta apoptózis-nekrózis kontínuum áll fenn: az ischaemia súlyosságától és idõtartamától függõen vagy ionok (elsõsorban Ca++) és ioncsatornák közvetítette gyors és nekrotikus sejthalál, vagy molekuláris kaszkádaktiváció révén lassú és apoptotikus sejtpusztulás következik be8. Következésképpen, a nekrotikus sejthalált mérséklõ (például antiexcitotoxikus vagy reperfúziót elõsegítõ thrombolyticus) kezelés az apoptózis elõtérbe kerülését eredményezheti – azaz a sejthalál ugyanúgy bekövetkezik, csak idõbeni eltolódással. Ez is indokolja, hogy a korai, az ischaemiás károsodást megelõzõ (antinekrotikus) kezelést egy késõbbi és hosszabb hatású antiapoptotikus kezelés kövesse. További érv emellett, hogy az apoptózissal kapcsolatos fehérjék (mint például a Fas/Apo-1 vagy a Bcl-2) szintje a stroke-betegek liquorában jelentõsen lecsökken az elsõ három nap során9 – mindez arra utal, hogy az agy endogén

antiapoptotikus arzenálja gyengül agyi ischaemia hatására.

Az apoptózis mechanizmusa Az idegsejten belül zajló apoptotikus eseményeket in vivo és in vitro kísérletek eredményei alapján foglaljuk össze. Etiológiától függetlenül az apoptózis folyamata döntési fázisra és azt követõ végrehajtási fázisra oszlik10. AZ APOPTÓZIS DÖNTÉSI FÁZISA A GÉNEK SZINTJÉN ZAJLIK

Az idegsejtben, mint minden más sejtben, az apoptózist okozó proapoptotikus gének (például a bax, a bad, a bak) és az apoptózist gátló antiapoptotikus gének (például a bcl-2, a bcl-XL) termékei különféle heterodimerek képzésével módosítják egymás hatását, és döntõ tényezõi annak, hogy a sejt tovább él vagy pedig elpusztul11. A pro- és az antiapoptotikus tényezõk egyensúlyának megbomlása indítja el az apoptózist. Ischaemiában a károsodott idegsejtet elsõsorban az ATP-csökkenés, valamint az azt – nem minden esetben – követõ reperfúzió billenti ki a pro- és antiapoptotikus egyensúlyi állapotból. Ha a hypoxia következtében jelentkezõ ATPdepletio szubletális mértékû, a döntési fázissal megkezdõdik az apoptózis eseménysora – ez látható a penumbra területén is. Ha az ATP-hiány átlépi a kritikus mértéket, nem apoptózist, hanem nekrózist indukál12. Ezt igazolja, hogy a sejttõl mitochondrialis mérgekkel kísérletesen megvonva az ATP-t, az apoptózis az energiaigényes lépéseknél megáll12, és a folyamat a nekrózis irányába terelõdik. A kiterjedt DNS-károsodás a nagy ATP-igényû javító enzim, a poli(ADP-ribóz)polimeráz (PARP) nagyfokú aktivációját is eredményezi, amely nagyban hozzájárul a sejt energiaraktárainak kimerüléséhez s a következményes sejthalálhoz13. Az ATP-hiány mellett további fontos patomechanikai tényezõ a komplett érelzáródást követõ reperfúzió, amely a reoxigenizáció és a sérült területre a véráram révén történõ Ca++-beáramlás útján további reaktívszabadgyök-képzést, következményes membránkárosodást okoz az idegsejtben. Az apoptózis kezdeti eseménysorában ugyanis döntõ a Ca++ intracelluláris koncentrációjának emelkedése (1. ábra). A Ca++-nak az extracelluláris térbõl az idegsejtbe jutásában három mechanizmus játszik szerepet: 1. az ATP-depletio miatt jelentkezõ, aktív Ca++pumpához kötött transzportelégtelenség; 2. mivel az energiaigényes Na+/K+-ATP-áz csökkent mûködése sejtmembrán-depolarizációt okoz, feszültségfüggõ Ca++-csatornák nyílnak meg; 3. N-metil-D-aszpartát


219

1. ábra Az apoptózis végrehajtási fázisa. Az ischaemia az idegsejt homeosztázisát az oxidatív foszforiláció gátlásával borítja fel, elindítva az apoptózist a membrántranszporterek következményes elégtelenségével. A Na+/K+-ATP-áz kiesése sejtduzzadást, membrándepolarizációt és következményes Ca++-beáramlást okoz a megnyíló feszültségfüggõ ioncsatornákon keresztül. A Ca++-ATP-áz csökkent mûködése ugyancsak az intracelluláris Ca++-koncentrációt emeli. A membrándepolarizáció miatt számos Ca++-független enzim is aktiválódik. Ez mitochondriumkárosodáshoz, DNSfragmentációhoz, lipolízishez és lipid-peroxidációhoz vezet. ec.: extracelluláris, ic.: intracelluláris

(NMDA), majd α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-izoxalon-propionsav (AMPA) típusú glutamátreceptorokkal rendelkezõ ioncsatornák nyílnak meg14. Két endogén Ca++-raktár is kitárul apoptózisban: az endoplazmatikus retikulum és a mitochondrium14. Az ionizált Ca++ szintjének emelkedése pedig további glutamátfelszabadulást okoz az axonterminálisokban, megváltoztatva a kapcsolt sejtek mûködését, ezáltal szöveti szintre emelve az apoptózis következményeit. A megemelkedett ionkoncentráció az idegsejt több Ca++-függõ enzimét aktiválja. A foszfolipáz-A2 (PLA2) a lipidmembrán közvetlen lízisét eredményezi15, míg a nitrogén-oxid-szintetáz (NOS) aktivációja nitrogén-oxid és peroxi-nitrit képzése útján okoz lipid-peroxidációt16. A Bad proapoptotikus fehérje defoszforilációja az apoptózis végrehajtás fázisába tolja a sejtet. Ugyanis a Bad defoszforilált formája a Bcl-2 antiapoptotikus fehérjét kirekeszti a


Bcl-2/Bax komplexbõl17, míg a Bax fehérje felszabadulva a kötésbõl képes arra, hogy az idegsejt mitochondriumainak membránján pórusokat formáljon18. A lipolízis, a lipid-peroxidáció és a pórusképzés mind strukturális elváltozás a sejtszervecskékben, tehát itt jelölhetnénk ki az apoptózis végrehajtási fázisának kezdetét. AZ APOPTÓZIS VÉGREHAJTÁSI FÁZISA CELLULÁRIS SZINTÛ

A rendellenes mitochondrialis mûködés az apoptotikus sejthalál egyik meghatározó tényezõje: a végrehajtási fázis intrinszik kaszpáz útját és a kaszpázfüggetlen utat indítja be (2. ábra). Ischaemiában az ATP-szint csökkenése az ionpumpák következményes diszfunkciója miatt az intracelluláris Ca++-szint emelkedését okozza. Ekkor a Ca++-függõ enzimek megváltozott aktivitása

2. ábra Az apoptózis végrehajtási fázisának intrinszik kaszpáz útja, a mitochondrium szerepe. Az antiapoptotikus Bcl-2 a Bax proapoptotikus fehérjét köti a mitochondrium külsõ membránján. Az intracelluláris Ca++-szint az ischaemia miatt megemelkedik, és a Ca++-függõ kalcineurint aktiválja, amely a Bad proapoptotikus fehérjét hozza mûködésbe. A Bad és a Bcl-2 kölcsönhatása elvonja a Bcl-2-Bax komplex antiapoptotikus Bcl-2 komponensét. Az így felszabadult Bax pórust formál a mitochondrium membránján. Ezen keresztül jut a citokróm-c a citoplazmába, és a megemelkedett Apaf-1-gyel és dATP-vel prokaszpáz 9-et bontó komplexet képez. A kaszpáz 9 a prokaszpáz 3-at hasítja kaszpáz 3má, amely az ICAD hasításával felszabadítja a CAD-ot a gátlás alól. A CAD eredményezi a DNS feltöredezõdését. A mitochondrialis változások a citokróm-c kiszabadulása mellett AIF-felszabadulást is eredményeznek, amely foszfatidil-szerin membránexpozícióval a sejt fagocitózisát segíti elõ, illetve a maganyag fragmentációját okozza. AIF: apoptózisindukáló faktor, Apaf-1: apoptózisprotein-akiváló faktor 1, CAD: kaszpáz 3-aktiválta dezoxiribonukleáz, ec.: extracelluláris, ic.: intracelluláris, ICAD: kaszpáz 3-aktiválta dezoxiribonukleáz-gátló

kibillenti az idegsejtet a pro- és antiapoptotikus egyensúlyából. Emiatt az idegsejt mitochondriumainak mûködése is megváltozik, így fontos résztvevõi az apoptózis végrehajtási fázisának. Az idegsejt mitochondriumain számos anti- és proapoptotikus fehérje hatása összegzõdik19. A külsõ membrán felszínén rögzülõ Bcl-2 antiapoptotikus fehérje kötésben tartja a Bax proapoptotikus fehérjét. Az emelkedett Ca++-koncentráció következtében aktiválódott kalcineurin defoszforilálja a Bad proapoptotikus fehérjét, amely ezután kirekeszti a Bcl-2-t és lehetõvé teszi, hogy a Bax pórusokat for-

máljon a mitochondrium membránján20, 21. Ekkor a mitochondrium megduzzad, csökken membránpotenciálja és megnõ a Ca++-tartalma21. A mitochondriumokból, a reaktív szabad gyökök mellett, apoptózisindukáló faktor (AIF)22 és citokróm-c23 kerül a citoszolba. Egyesek feltételezik, hogy citokróm-c a Bax formálta pórusokon szabadul ki a citoplazmába24. Mások eredményei ezt kizárni látszanak, ugyanis a pórusokon legfeljebb 1500 Da méretû molekulák juthatnak át21, de ez sem zárja ki a citokróm-c áthelyezõdése és a mitochondrium szerkezeti változása közötti kapcsolatot.


221

A VÉGREHAJTÁSI FÁZIS HÁROM LEHETSÉGES ÚTVONALA

A döntési fázis után beinduló apoptotikus végrehajtási fázisban a kaszpázokként is számon tartott cisztein-aszpartát fehérjék döntõ szerepet játszanak. A kaszpázok az apoptotikus jelutak közvetítésében és az apoptózis kivitelezésében fontosak. Proenzim formában folyamatosan képzõdnek a sejtben, majd proteolitikusan aktiválódva tetramerekké állnak öszsze. Ma 14 kaszpázt ismerünk az emlõsökben, amelyek három csoportba sorolhatók12. Az elsõ csoportba tartozó kaszpázok (1, 4, 5, 13) a gyulladás folyamatában vesznek részt, míg a második csoport tagjait (2, 3, 7) az apoptózis kivitelezõinek tekintik25. A harmadik csoportbeli kaszpázok (6, 8, 9, 10) szubsztrátjait a kettes csoport kaszpázai képezik (tehát a kaszpázkaszkád kezdeti lépéseiben a hármas csoport kaszpázai szerepelnek, majd aktiválják a kettes csoport kaszpázait). Agyi ischaemiában az apoptózis három kaszpázaktivációs végrehajtási útvonala ismert. A mitochondrium eredetû citokróm-c-hez kötött az intrinszik kaszpáz út26. Fas és tumornekrózisfaktor-α (TNF-α) halálreceptorokon keresztül aktiválódik az extrinszik kaszpáz út a kaszpáz 8 közremûködésével27 és fontos szerepe van a szöveti szintrõl érkezõ proapoptotikus jelek intracelluláris továbbításában. A harmadik a kaszpázoktól független végrehajtási útvonal, amelynek a mitochondriumból a második fázisban felszabaduló AIF a fõ induktora. A végrehajtási fázis intrinszik kaszpáz útja a kaszpáz 9-hez és 3-hoz köthetõ. A mitochondriumokból a Bax molekulák formálta pórusokon keresztül felszabaduló citokróm-c a dATP-vel és az apoptózisproteáz-aktiváló faktor 2-vel (Apaf-2) komplexet képez, amelynek szubsztrátja a prokaszpáz 9, amit aktív kaszpáz 9-cé hasít. A kaszpáz 9 mûködésekor csökken a prokaszpáz 3 szintje és megnõ az aktív kaszpáz 3 mennyisége a sejtben. A kaszpáz 3 képes aktiválni a prokaszpáz 9-et28 továbbgerjesztve az apoptózist. A DNS darabolódása és a kaszpáz 3-aktiváció viszonyát a kaszpáz 3aktivált dezoxiribonukleáz (CAD) megismerése tárta fel. A CAD végzi az apoptózisra jellemzõ internukleoszomális darabolást29, de az intakt neuronban mûködését a CAD-inhibitor (ICAD) (vagy DNS-fragmentáló faktor, DFF) fehérje gátolja. A kaszpáz 3 hasítással inaktiválja az ICAD-ot, ezzel lehetõvé válik a CAD intranukleáris transzpozíciója, és általa darabolódik a DNS. A végrehajtási fázis kaszpázfüggetlen útvonala az AIF-hez köthetõ. Az AIF fehérje az intakt sejtben kizárólag a mitochondriumban fordul elõ30, apoptózis során azonban a citoszolba jut és proapoptotikus hatást fejt ki22. AIF-et ép sejtekbe mikroin-


jektálva négy fõ apoptotikus jegy jelentkezik: 1. foszfatidil-szerin-expozíció a sejtmembrán felszínén; 2. a maganyag kondenzálódása; 3. nagyfokú DNS-fragmentáció; 4. a mitochondrium transzmembrán-potenciáljának megváltozása és a citokróm-c kiszabadulása31. Megállapították továbbá, hogy az AIF hatását nem befolyásolják a kaszpázok és független a Bcl-2 antiapoptotikus fehérje mûködésétõl22. A végrehajtási fázis extrinszik kaszpáz útvonala (3. ábra) a kaszpáz 8-hoz és a kaszpáz 3-hoz köthetõ. Az apoptózis ezen kaszpázútja proapoptotikus receptorok és ligandjaik interakcióiból indul ki, mint például a Fas-Fas L, illetve a TNF-receptor (TNFR) -TNF-α kölcsönhatások32. A Fas-receptor intracellulárisan elhelyezkedõ Fas-asszociált haláldomént hordoz (FADD), és a hozzá kötõdõ prokaszpáz 8-at alakítja aktív kaszpáz 8-cá27. A kaszpáz 8, akárcsak a kaszpáz 9, a prokaszpáz 3-at aktiválja33. Megjegyezzük, hogy a kaszpáz 8 a Bcl2 antiapoptotikus fehérjecsaládba tartozó Bid bontásával aktiválhatja az intrinszik utat is34. A TNFRTNF-α kötésre intracelluláris haláldomének jelennek meg, úgymint a TNF-receptor-asszociált haláldomén (TRADD), a TNF-receptor-asszociált protein-2 (TRAF) és az apoptózisprotein-inhibitor (IAP). A kötött receptor aktivitása eredményeként mitogénaktivált fehérje (MAP) és egyéb kinázok lépnek mûködésbe, valamint a szfingomielináz (SM) enzim aktiválódik. Mindkét enzim az IκB-t (amely gátló alegysége a neuroprotektív NFκBnek) foszforilálja15. Receptorkötéskor egyéb kinázok is aktiválódnak a neuronban15, amelyek JUNkinázokat foszforilálnak. Ezen enzimek a halálfehérjék szintézisét okozzák, és ezáltal az apoptózist segítik. Megjegyezzük, hogy a TNFR aktivitása nem egyértelmû az apoptózis vonatkozásában. Fokális agyi ischaemiának kitett TNF-α-receptorgén-kiütött homozigóta egerekben reperfúziót követõen a TNF neuroprotektív szerepe bizonyított35, bár mások proapoptotikus hatását emeli ki32. A kaszpáz 3-aktiválás, amely a találkozási pontja az apoptózis extrinszik és intrinszik útjainak, valós célponja lehet az antiapoptotikus terápiának. Jelentõségét alátámasztja a kaszpáz 3 mûködését gátló apoptózisinhibitor-protein (IAP) gén- és fehérjecsalád felfedezése is25, 36. Ezen gének szekvenciái konzerválódtak az evolúció során37. Az elsõként felfedezett IAP a neuronalis apoptózisinhibitorfehérje (NIAP) volt, amelynek deletiója látható a spinalis muscularis atrófiák (SMA) kétharmadában38. Másodikként az XAIP került felderítésre, amely az Xq24–25-ös pozícóban van, a kaszpáz 3-at és 7-et inaktiválja39. A humán 11-es kromoszómán található a humán apoptózisinhibitor-fehérje-1

3. ábra Az apoptózis extrinszik kaszpáz útja. Az ischaemia miatt nekrotizáló és apoptózisban elpusztuló sejtekbõl Fas-L, glutamát és TNF szabadul fel. A Fas-L-Fas-R kölcsönhatás intracellulárisan prokaszpáz 8 → kaszpáz 8 proteolitikus átalakulást okoz. A kaszpáz 8 ezzel a pro-Bid → Bid átalakulást eredményezi a mitochondriumban és a Bax-felszabaduláson keresztül az intrinszik kaszpáz utat indítja el. Emellett a kaszpáz 8, akárcsak a 9, prokaszpáz 3 → kaszpáz 3 átalakulást okoz és DNS-fragmentációt eredményez. Az intracelluláris Ca++-szint emelkedése proapoptotikus enzimprofilt ad a sejtnek. A TNF egyaránt mutat neuroprotektív és proapoptotikus tulajdonságokat. Az IκB transzkripciós faktor aktiválása neuroprotektív fehérjék szintézisét eredményezi. AIP: apopotózisinhibitor protein, FADD: Fas-asszociált haláldomén, Fas-L: Fas-ligand, Fas-R: Fas-receptor, Glu: glutamát, TRADD: TNF-receptor-asszociált haláldomén, TRAF: TNF-receptor-asszociált protein-2

és -2 (HIAP-1, HIAP-2)36, amelyek szintén a kaszpáz 3-at és 7-et inaktiválják. Egyedülálló szerkezeti elemük a kaszpázrekrutáló domén (CARD), amelynek szerepe az apoptózisban nem ismert. Az egyes gátló fehérjecsaládok molekuláris szerkezeti és evolúciós rokonságát többen vizsgálták25. Agyi ischaemiát követõ reperfúzióban – az apoptózis végrehajtási fázisában – az idegsejt fehérjeszintézise is megváltozik (4. ábra). Ismeretes, hogy az eukaryota sejtben, így a neuronban is, a fehérjeszintézis elõfeltétele az iniciációs komplex képzõdése, amely közel 140 fehérjébõl, kilenc iniciációs faktorból és az információhordozó mRNSbõl áll40. Noha reperfúzió alatt az idegsejt fehérjeszintézise összességében visszaszorul41, egyes

mRNS-molekulák transzlációja fokozódik42. Ez a jelenség az üzenetkiválasztás (message selection). Apoptózisban döntõen két iniciációs faktor, az elongációt iniciáló faktor-2 (eIF2) és az eIF4G alakítja ki az üzenetkiválasztást. Az eIF2 foszforilálódik eIF2α(P)-vé, amelynek mértéke határozza meg a sejtben a transzlációs iniciáció fokát (a reperfúzió során ennek mintegy hússzoros emelkedése igazolódott)40. Az eIF2α(P)-t a proteinfoszfatáz 1 (PP1) defoszforilálja, azonban ezt az enzimet a reperfúzió miatt megemelkedõ cAMP-szint és következményes proteinkináz-A-aktivitás gátolja40. Egy további célpont az eIF4G proteolitikus hasítása az intracelluláris Ca++-szint-emelkedés és autoproteolitikus úton aktivált µ-kalpain révén43. Az in-


223

REPERFÚZIÓ ÉS APOPTÓZIS

4. ábra A fehérjeszintézis megváltozása és az üzenetkiválasztás mechanizmusa az apoptózis végrehajtási fázisában. A sejtmagban zajló transzkripcióátrendezõdés és üzenetkiválasztás az eIF4G hasításának és az eIF foszforilációjának következménye. Az elõbbit az intracelluláris Ca++-felszaporodás, az utóbbit a reperfúzió miatti cAMP-szint-emelkedés okozza. A Ca++-függõ µ-kalpain hasítja az eIF4G-t. A cAMP-függõ PKA gátolja a PP1-et, ezzel a foszforilált eIF2 felé tolja az egyensúlyt. Következésképpen az idegsejt összfehérje-szintézise csökken, de kedvezményezett lesz az Apaf-1, a VEGF és az FGF képzõdése. Apaf-1: apoptózisprotein-aktiváló faktor-1; eIF4G, eIFα(P): elongációiniciációs faktor 4G, α(P); FGF: fibroblastnövekedési faktor; ic.: intracelluláris; PKA: proteinkináz A; PP1: proteinfoszfatáz 1; VEGF: vascularis endothelialis növekedési faktor

takt idegsejtben a lokális Ca++-koncentráció szorosan szabályozza a kalpasztatingátló enzim mûködését, de agyi ischaemiában a µ-kalpain kóros aktivitása látható14. Mindezen változások nem egységesen gátolják a sejtben zajló transzlációt, hanem egyes mRNS-molekulák szekvenciájuk miatt fokozottan transzlálódnak, ami által új fehérje- és enzimprofilt kap az idegsejt. Ilyen kedvezményezettek az apoptózisaktiváló faktor 1 (Apaf-1), a vascularis endothelialis növekedési faktor (VEGF) és a fibroblastnövekedési faktor (FGF) mRNS-molekulái14.


Az agyi ischaemiát követõ reperfúzióindukálta folyamatok (az úgynevezett reperfúziós károsodás) része az apoptotikus sejtpusztulás. A reperfúzió során (amely endogén vagy exogén thrombolysis következménye lehet) további kalcium- és szabadgyökbeáramlás történik az ischaemiás területre, és a következményes fokozott lipid-peroxidáció további szabadgyök-képzõdést okoz. Fehérvérsejtek (elsõsorban leukocyták) is nagy számban kerülnek a sérült vér-agy gáton keresztül az agyszövetbe, ami szintén szabadgyök-képzõdést eredményez, közvetve (például a NOS és a PARP enzimek aktiválása révén) és közvetlenül. A reperfúziós károsodás sajátossága a permanens érelzáródásban észleltekkel szemben a NOS-PARP-aktivációs kaszkád és a leukocytamediálta folyamatok megléte. A képzõdõ szabad gyökök felgyorsult sejtmembrán-károsodást okoznak (5. ábra) és a lipolízis, a lipid-peroxidáció, valamint a reaktív szabad gyökök egyéb hatásai révén a sajátos morfológiai kép létrejöttében döntõ szerepet játszanak. Az idegsejtmembránt a foszfolipáz-C (PLC) és a foszfolipáz-A2 (PLA2) bontja. A PLC-t közvetlenül az idegsejtmembrán depolarizációja, a PLA2-t a következményes intracelluláris Ca++-koncentráció-emelkedés aktiválja44. Ennek következtében az intracelluláris szabad zsírsav koncentrációja megemelkedik, s a reperfúzió során a lipolízishez reaktív szabad gyökök beáramlása miatt lipid-peroxidáció is társul. Egy telítetlen szabad zsírsav (például arachidonsav) -molekulához a reperfúzió hatására a ciklooxigenáz enzim két molekula oxigént köt, így prosztaglandin G (PGG) képzõdik. A PGG szinte azonnal prosztaglandin H-vá (PGH) peroxidálódik O–-szabadgyök képzõdése mellett45. A reperfúzióban felgyorsult szerkezeti károsodásért tehát jelentõs részben a lipid-peroxidációban képzõdött többlet reaktív szabad gyökök felelnek46. A károsodott lipidmembrán fokozott fluiditása és permeabilitása mellett további fontos tényezõ a membránfehérjék megváltozása.

Antiapoptotikus terápiás stratégiák agyi ischaemiában Érthetõen vonzó az a gondolat, hogy a fokális agyi ischaemiában kibillent anti- és proapoptotikus egyensúlyt antiapoptotikus faktorok adásával helyreállítva megmenthetõk a penumbra sejtjei. Számos állatkísérletben igazolódott a várt neuroprotekció, és több szer klinikai kipróbálásra került47 (6. ábra). Terápiásan kedvezõ, hogy az antiapoptotikus terápiás ablak hosszú idõtartamú48, 49. Az apoptotikus

kaszkád mind pontosabb megismerése a lehetséges antiapoptotikus támadáspontok azonosítását is eredményezi. Így elvileg antiapoptotikus hatásúak lehetnek a növekedési faktorok és egyéb neurotrofinok, egyes fehérjék szintézisgátlói, az RNSszintézis-gátlók, a specifikus ICEgátlók, az endonukleáz-inhibitorok, az antioxidánsok, a kalciumkötõ ágensek, valamint az antiszensz nukleotidok. A génterápiás lehetõségek közül ígéretes az antiapoptotikus gének, mint például a bcl-2 virális vektorokkal történõ bevitele50. A kaszpázkaszkád gátlását nem specifikus és kaszpáz 3-specifikus blokkolókat alkalmazva vizsgálták, s e szerek eredményesnek bizonyultak fokális agyi ischaemia állatmo- 5. ábra Az idegsejtmembrán károsodásának molekuláris folyamata az delljében51, noha lehetséges, hogy a apoptózis végrehajtási fázisában. Az intracelluláris Ca++-szint-emelkedés kaszpáz 3 az ischaemiát követõ sejt- a PLA2 enzimet, a sejtmembrán-depolarizáció pedig a PLC-t aktiválja. pusztulásban csak fiatal életkorban Mindkettõ a sejtmembrán lipolízisét eredményezi, amely által arachidonA reperfúzió fokozza a játszik fontos szerepet52. Itt jegyez- sav szabadul fel, amit a COX enzim alakít PGG-vé. – PGG-képzõdést, amely PGH-vá alakul O -szabadgyök keletkezésével, zük meg, hogy az irreverzíbilisen amely utóbbi lipid-peroxidációt okoz. károsodott, de még el nem pusztult ciklooxigenáz, FFA: szabad zsírsav, ic.: intracelluláris, PGG: prosztaglandin G, PGH: idegsejtek (Nicotera ezeket nevezi COX: prosztaglandin H, PLA2: foszfolipáz A2, PLC: foszfolipáz C „undead” neuronoknak12) apoptózissal történõ eliminálása igenis kedvezõ lehet, hiszen ez a környezõ túlélõ neuronok újra- modelljében igazoltuk a neuronalis NOS (nNOS) szervezõdését, az agyi plaszticitás megvalósulását szerepét a PARP-aktivációban s a PARP-inhibitor segítik elõ. 3-aminobenzamid neuroprotektív hatását54, állatkíA neurotrofinok – idegnövekedési faktor (NGF), sérletes stroke-modellekben pedig a PARP-gátlás agyi eredetû növekedési faktor (BDNF), neu- neuroprotektív hatása igazolódott55. rotrofin-3 és 4/5, bázikus fibroblastnövekedési fakTovábbi sejten belüli antiapoptotikus mechator (bFGF), inzulinszerû növekedési faktor (IGF) nizmus a sejtváz aktinfilamentumainak antiexcitostb. – hatására számos intracelluláris proteinkináz toxikus depolimerizációja, amely az NMDAaktiválódik, amelyek transzkripciós faktorokra hat- receptorok és a feszültségfüggõ Ca++-csatornák va neuroprotektív antioxidáns enzimek (például aktivációjával kapcsolatos kalciumbeáramlást készuperoxid-dizmutáz, SOD) és Ca++-kötõ fehérjék pes mérsékelni56. A hõsokkfehérjék (HSP-70, (kalbindin) képzõdését eredményezi. Neurotrofin- GRP-78) gyorsan aktiválódó, a sejttúlélést szintén ban gazdag, transzplantált embrionális agyszövet potenciálisan elõsegítõ molekulák, amelyek a promérsékli az ischaemiás laesio kiterjedését patkány- teinképzõdésnek és a kóros fehérjék eltávolításában, amely hátterében – legalábbis részben – anti- nak chaperon szerepû tényezõi15. A hõsokkfehérapoptotikus mechanizmus állhat53 jék mellett a késõbb kimutatható hypoxiaindukálA citokinek, így például a TNF, receptorokon ta faktor (HIF) hasonló szerepû. E fehérjéket a terhatva a transzkripciós faktor NFκB aktiválása révén jedõ depressziónak (spreading depression) neveközvetlen antiapoptotikus hatásúak; noha ezen ked- zett depolárizációs hullám aktiválja, ami ezáltal is vezõ hatást ellensúlyozza a potenciálisan neuro- fontos szerepet játszik a stroke utáni reparatív folyamatokban57. Új lehetõség az apoptózisprotoxikus microglia egyidejû aktiválása15. Mint azt a reperfúzió és az apoptózis kapcsolatá- tein-inhibitor (IAP) kedvezõ hatásának terápiás alnak ismertetésekor említettük, a NOS-PARP aktivá- kalmazása. Számos adat szól a mellett, hogy a ciós kaszkád az apoptotikus sejtpusztulásban fontos neuronalis apoptózisprotein-inhibitor (NIAP) -inszerepet játszik. Fokális agyi sérülés hideg laesiós dukció neuroprotektív hatású, amely adenovírus-


225

6. ábra Lehetséges antiapoptotikus terápiás stratégiák. A szaggatott nyilak közvetett kapcsolatokat, a satírozott négyzetek a kórfolyamat lehetséges támadáspontjait jelölik. A vonalkázott négyzet az állatkísérletes stádiumban lévõ vagy feltételezett antiapoptotikus terápiás stratégiát, míg a pöttyös négyzet klinikai kipróbálásig eljutott lehetõséget jelöl. 1. A szöveti ischaemia megelõzése és kontrollált hipotermia, 2. korai reperfúzió thrombolysissel, 3. Ca++-csatornaantagonisták, 4. excitatorikus aminosav-antagonisták, 5. a gangliozidok membránstabilizáló hatása, 6. különféle növekedési faktorok adása, 7. a TNF-α hatását gátló szerek, 8. K+-csatorna-blokkolók, 9. intracelluláris Ca++-kötõ ágensek, 10. antioxidánsok, 11. nitrogén-oxid-szintetáz (NOS) -gátlók, 12. a mitochondrium károsodását gátló szerek, 13. a kaszpáz 3 gátlása, 14. PARP-inhibitorok. AMPA: α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-izoxalon-propionsav, ec.: extracelluláris, Glu: glutamát, ic.: intracelluláris, NF: neurotrofin, NMDA: Nmetil-D-aszpartát, NOS: nitrogén-monoxid-szintetáz, PARP: poli(ADP-ribóz)-polimeráz, TNF: tumornekrózis-faktor

vektorral sejtbe juttatva is eredményes antiapoptotikus stratégiának bizonyult25. Az antiapoptotikus célzatú beavatkozás kedvezõ mellékhatása lehet a neurodegeneratív folyamatok lassulása. Óvatosságra int azonban, hogy noha az agyi apoptózis gátlása az ischaemia sújtotta területen kedvezõ lehet, nem zárható ki ennek daganatindukáló hatása más lokalizációban.

Összegzés Az utóbbi néhány év kutatásai jelentõsen bõvítették ismereteinket az apoptózis molekuláris mechanizmusáról. A döntési és végrehajtási fázis megkü-


lönböztetése, az ezekben zajló gén-, fehérje- és sejtszintû folyamatok azonosítása, valamint ezek viszonyrendszerének, idõrendjének megismerése a szabályozott sejthalál mind eredményesebb befolyásolásának lehetõségét jelenti. Az agyi ischaemiában zajló apoptózis fontos sajátossága, hogy az ATP-hiány, a mitochondrialis sejtlégzés károsodása és a késõi reperfúzió miatt bekövetkezõ fokozott szabadgyök-képzõdés és Ca++-beáramlás a más kórfolyamatokban észleltnél hangsúlyosabb patomechanikai szerepet játszik. Az ischaemiában zajló apoptotikus kaszkád hosszú terápiás ablaka és döntõen a penumbrára lokalizált volta adja az antiapoptotikus terápiás stratégia elvi alapját. Noha az eddigi állatkísérletes eredmények biztatóak,

óvatosságra intenek az apoptózisgátlás lehetséges nem kívánatos következményei, úgymint a sejtpusztulás nekrotikus formájának elõtérbe kerülése és a neoplasztikus transzformáció fokozott kockázata.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A kézirat az Állami Eötvös Ösztöndíj (Hortobágyi Tibor) és az Országos Tudományos Kutatási Alap (Hortobágyi Tibor, Harkány Tibor) támogatásával készült.

IRODALOM 1. Nagy Z. Az agyérbetegségek epidemiológiája. In: Nagy Z (ed). Stroke ellátás. Budapest: Springer-Verlag; 1994. p. 19-28. 2. Kerr JFR. Shrinkage necrosis: a distinct mode of cellular death. J Pathol 1971;105:13-20. 3. Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972;26: 239-57. 4. Szende B. A programozott sejthalál (apoptózis) biológiai és patológiai jelentõsége. Lege Artis Med 1992;2:4-11. 5. Hortobágyi T, Nagy Z. Az apoptózis jellemzõi és szerepe az ischaemiás agykárosodásban. Lege Artis Med 1997; 7:462-71. 6. Lakos G, Szegedi G. Az apoptózis fiziológiás és patológiás körülmények között. Lege Artis Med 1998;8:352-6. 7. Szende B. Az apoptózis jelentõsége az emberi megbetegedésekben. Lege Artis Med 2000;10:386-92. 8. Dirnagl U, Iadecola C, Moskowitz MA. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci 1999;22:391-7. 9. Tarkowski E, Rosengren L, Blomstrand C et al. Intrathecal expression of proteins regulating apoptosis in acute stroke. Stroke 1999;30:321-7. 10. Wyllie AH. Apoptosis: an overview. Br Med Bull 1997;53:451-65. 11. Martin LJ, Al-Abdulla NA, Brambrink AM et al. Neurodegeneration in excitotoxicity, global cerebral ischemia, and target deprivation: A perspective on the contributions of apoptosis and necrosis. Brain Res Bull 1998;46:281-309. 12. Nicotera P, Leist M, Fava E et al. Energy requirement for caspase activation and neuronal cell death. Brain Pathol 2000;10:276-82. 13. Ha HC, Snyder SH. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 in the nervous system. Neurobiol Dis 2000;7:225-39. 14. White BC, Sullivan JM, DeGracia DJ, et al. Brain ischemia and reperfusion: molecular mechanisms of neuronal injury. J Neurol Sci 2000;179:1-33. 15. Mattson MP Culmsee C, Yu ZF. Apoptotic and antiapoptotic mechanisms in stroke. Cell Tissue Res 2000;301: 1731-87. 16. Kruman I, Bruce-Keller AJ, Bredesen D, et al. Evidence that 4-hydroxynonenal mediates oxidative stress-induced neuronal apoptosis. J Neurosci 1997;17:5089-100. 17. Zha J, Harada H, Yang E, et al. Serine phosphorylation of death agonist BAD in response to survival factor results in binding to 14-3-3 not BCL-X(L) Cell 1996;87:619-28. 18. Antonsson B, Montessuit S, Lauper S, et al. Bax oligomerization is required for channel-forming activity in liposomes and to trigger cytochrome c release from mitochondria. Biochem J 2000;345:271-8. 19. Chan PH. Reactive oxygen radicals in signaling and dam-

20. 21. 22. 23.

24. 25. 26.

27. 28.

29. 30.

31.

32. 33. 34.

age in the ischemic brain. J Cereb Blood Flow Metab 2001;21:2-14. Dubinsky JM, Brustovetsky N, Pinelis V, et al. The mitochondrial permeability transition: the brain’s point of view. Biochem Soc Symp 1999;66:75-84. Sims NR, Anderson MF. Mitochondrial contributions to tissue damage in stroke. Neurochem Int 2002;40:511-26. Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, et al. Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature 1999;397:441-6. Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell 1997;91:47989. Liu X, Kim CN, Yang J, et al. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c. Cell 1996;86:147-57. Robertson GS, Crocker SJ, Nicholson DW, et al. Neuroprotection by the inhibition of apoptosis. Brain Pathol 2000;10:283-92. Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell 1997;91:47989. Scaffidi C, Fulda S, Srinivasan A, et al. Two CD95 (APO1/Fas) signaling pathways. EMBO J 1998;17:1675-87. Slee EA, Harte MT, Kluck RM, et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9dependent manner. J Cell Biol 1999;144:281-92. Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature 1998;391:43-50. Lorenzo HK, Susin SA, Penninger J, et al. Apoptosis inducing factor (AIF): a phylogenetically old, caspase-independent effector of cell death. Cell Death Differ 1999;6:51624. Ferri KF, Jacotot E, Blanco J, et al. Apoptosis control in syncytia induced by the HIV type 1-envelope glycoprotein complex: role of mitochondria and caspases. J Exp Med 2000;192:1081-92. Rudin CM, Thompson CB. Apoptosis and disease: regulation and clinical relevance of programmed cell death. Annu Rev Med 1997;48:267-81. Stennicke HR, Salvesen GS. Caspases-controlling intracellular signals by protease zymogen activation. Biochim Biophys Acta 2000;1477:299-306. Gross A, Yin XM, Wang K, et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. J Biol Chem 1999;274:1156-63.


227

35. Bruce AJ, Boling W, Kindy MS, et al. Altered neuronal and microglial responses to excitotoxic and ischemic brain injury in mice lacking TNF receptors. Nat Med 1996;2:788-94. 36. Liston P, Roy N, Tamai K, et al. Suppression of apoptosis in mammalian cells by NAIP and a related family of IAP genes. Nature 1996;379:349-53. 37. Hay BA, Wassarman DA, Rubin GM. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell 1995;83:1253-62. 38. Roy N, Mahadevan MS, McLean M, et al. The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is partially deleted in individuals with spinal muscular atrophy. Cell 1995;80:167-78. 39. Deveraux QL, Takahashi R, Salvesen GS, et al. X-linked IAP is a direct inhibitor of cell-death proteases. Nature 1997;388:300-4. 40. Merrick WC. Mechanism and regulation of eukaryotic protein synthesis. Microbiol Rev 1992;56:291-315. 41. Dienel GA, Pulsinelli WA, Duffy TE. Regional protein synthesis in rat brain following acute hemispheric ischemia. J Neurochem 1980;35:1216-26. 42. Gan W, Rhoads RE. Internal initiation of translation directed by the 5’-untranslated region of the mRNA for eIF4G, a factor involved in the picornavirus-induced switch from cap-dependent to internal initiation. J Biol Chem 1996;271:623-6. 43. Neumar RW, DeGracia DJ, Konkoly LL, et al. Calpain mediates eukaryotic initiation factor 4G degradation during global brain ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 1998;18:876-81. 44. Moskowitz N, Schook W, Puszkin S. Regulation of endogenous calcium-dependent synaptic membrane phospholipase A2. Brain Res 1984;290:273-9. 45. Krause GS, White BC, Aust SD, et al. Brain cell death following ischemia and reperfusion: a proposed biochemical sequence. Crit Care Med 1988;16:714-26. 46. Demopoulos HB, Flamm ES, Pietronigro DD, et al. The free radical pathology and the microcirculation in the major central nervous system disorders. Acta Physiol Scand Suppl 1980;492:91-119.

47. Zádor Z, Benyó Z, Lacza Z, et al. Neuroprotekció agyi ischaemiában – kételyek és remények. Clin Neurosci/Ideggy Szle (In press). 48. Fink K, Zhu J, Namura S, et al. Prolonged therapeutic window for ischemic brain damage caused by delayed caspase activation. J Cereb Blood Flow Metab 1998;18:1071-6. 49. Shultz JB, Weller M, Matthews RT, et al. Extended therapeutic window for caspase inhibition and synergy with MK-801 in the treatment of cerebral histiotoxic hypoxia. Cell Death Differ 1998;5:847-57. 50. Linnik MD, Zahos P, Geschwind MD, et al. Expression of bcl-2 from a defective herpes simplex virus-1 vector limits neuronal death in focal cerebral ischemia. Stroke 1995;26:1670-4. 51. Endres M, Namura S, Shimizu-Sasamata M, et al. Attenuation of delayed neuronal death after mild focal ischemia in mice by inhibition of the caspase family. J Cereb Blood Flow Metab 1998;18:238-47. 52. Hu Br, Liu CL, Ouyang Y, et al. Involvement of caspase-3 in cell death after hypoxia-ischemia declines during brain maturation. J Cereb Blood Flow Metab 2000;20:1294-300. 53. Hortobágyi T, Harkány T, Reisch R, et al. Neurotrophinmediated neuroprotection by solid fetal telencephalic graft in middle cerebral artery occlusion: a preventive approach. Brain Res Bull 1998;47:185-91. 54. Hortobágyi T, Görlach C, Benyó Z, et al. Inhibition of neuronal nitric oxide synthase-mediated activation of poly(ADP-ribose) polymerase in traumatic brain injury: neuroprotection by 3-aminobenzamide. Neuroscience 2003 (In press) 55. Virág L, Szabó C. The therapeutic potencial of poly(ADPribose) polymerase inhibitors. Pharmacol Rev 2002; 54:375-429. 56. Furukawa K, Smith-Swintosky VL, Mattson MP. Evidence that actin depolymerization protects hippocampal neurons against excitotoxicity by stabilizing [Ca2+]i. Exp Neurol 1995;133:153-63. 57. Sharp FR, Lu A, Tang Y, Millhorn DE. Multiple molecular penumbras after focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 2000;20:1011-32.

Keywords: apoptosis, ischaemia, pathomechanism, stroke

Recommend Documents