AZ IMMUNOLÓGIAI LABORATÓRIUM DIAGNOSZTIKAI LEHETİSÉGEI
http://rimm.dote.hu
Az Immunológiai Laboratórium feladata: A, Egy beteg immunrendszerének komplex vizsgálatával adatokat szolgáltatni egy immunológiai kórkép diagnózisának felállításához vagy kizárásához B, Az immunrendszer mőködésében kimutatott kóros laboratóriumi adat alapot szolgáltat a kórkép immunológiai eredetének felvetéséhez C, Ugyanakkor egy kóros laboratóriumi adat önmagában nem elegendı egy immunológiai kórkép diagnózisának kimondásához. A diagnózishoz mindig szükséges az összes klinikai adat együttes értelmezése
1. Az Immunológiai Laboratórium diagnózist segítı adatai: a.) Immundeficiencia esetén: - szerológia: IgG, IgA, IgM, IgE, C4 természetes ellenanyagok meghatározása, - fagocita vizsgálat: fagocitózis, kemotaxis, „killing”, kemilumineszcencia mérés, - limfocita alcsoportok vizsgálata sejtfelszíni antigének kimutatása alapján, - aktív immunizálás hatásának lemérése: pl.ellenanyag titer meghatározás Pneumococcus vakcináció után. b.) Antimikróbális, reaktív gyulladások esetén: -szerológia: We (fokozott), C reaktív protein, immunkomplex, IgG, IgA, IgM, IgE, C3, C4, szintek nınek, -sejtes vizsgálatok: fehérvérsejtszám emelkedik, granulocitózis, limfocitózis, fagocita aktivitás megnı. -T sejtes aktiváció: HLA-DR, CD25, CD30, CD38, CD54RO, CD69 expresszió megnı.
c.) Allergia esetén: -szerológai: össz IgE, allergén specifikus IgE szintek emelkednek. -sejtek: az allergén T sejt proliferációt indukál. d.) Autoimmun kórképekben: -szerológia: a. szervspecifikus kórképekben szervspecifikus ellenanyagok, b. poliszisztémás kórképekben: „marker” ellenanyagok mutathatók ki. 2. Az Immunológiai Laboratórium adatai a terápia követésében a.) immunszuppresszió követése: ellenanyag szint mérésekkel b.) immunreaktivitás mérése: sejtproliferáció mérés citokin termelés mérés in vitro aktív immunizálás hatásának mérése c.) deszenzibizálás hatásának mérése allergiában, d.) immunszubsztitúció hatásának mérése: pl. IVIG terápia után
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI I. A humorális immunitás vizsgálata: a, immunglobulinok
b, akut fázis fehérjék c, komplement rendszer
a, Immunglobulinok vizsgálata: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE meghatározás - a normális szintek életkor függıek! - kórosan alacsonyabb szint: 1. Veleszületett deficienciák gyanúja: szelektív IgA hiány IgG alosztály deficiencia hiper-IgE szindróma 2. Szerzett deficienciák: immunszuppresszív és citosztatikus gyógyszerek malignus hematológiai megbetegedések tumorok, senyvesztı betegségek fokozott fehérjevesztés - kórosan magasabb szint: infekció, autoimmun betegség, lymphoma - monoklonális immunglobulinok kimutatása - természetes ellenanyagok vizsgálata
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI II. b, Akut fázis fehérjék vizsgálata: Akut fázis fehérjék: a vérben normálisan is jelenlévı proteinek, amelyek mennyisége az akut fázis reakció során jelentısen megnı (pozitív akut fázis fehérjék) vagy lecsökken (negatív akut fázis fehérjék) Akut fázis reakció történik:
-Pozitív akut fázis fehérjék:
infekció, autoimmun gyulladás, tumoros megbetegedés, szövetkárosodás: mőtét, trauma, égés, szívinfarktus esetén
C-reaktív protein (CRP) alfa1-antitripszin haptoglobin fibrinogén komplement-komponensek szérum Amiloid A (SAA) prokalcitonin -Negatív akut fázis fehérjék: albumin, prealbumin transzferrin
Akut fázis proteinek (CRP) diagnosztikus jelentısége: -infekciók monitorizálása -autoimmun gyulladások aktivitásának megítélése (RA) -mőtét után sebgyógyulás nyomonkövetése (sebfertızés) -szervtranszplantációnál rejekció diagnosztizálása -coronaria betegeknél a fokozott rizikó elırejelzése -neonatológa
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI III. c, A komplement rendszer vizsgálata Komplement rendszer: a szervezet kórokozókkal szembeni nem specifikus védekezésének elsı vonala Funkcói: -kórokozók direkt károsítása (lízise) -kórokozók fagocitózisának elısegítése (opszonizáció) -a szervezetben képzıdı immunkomplexek eltávolítása - gyulladásos reakciók kiváltása Csökkent komplement szint esetei: - veleszületett deficiencia - csökkent termelés (májkárodosás) -aktív szisztémás autoimmun betegségben fokozott felhasználódás (SLE) Emelkedett komplement szint esetei: - akut fázis reakciók A komplement rendszer Funkció:
- a kórokozók direkt lízise - opszonizáció - immunkomplexek eltávolítása - gyulladásos reakció kiváltása
A komplement rendszer aktiválódásának útjai: 1. Klasszikus út: antigén-antitest komplex útján 2. Alternatív út: baktériumok sejtfala vagy endotoxinja által gombák, vírusok, paraziták által 3. Lektin út: mannóz-kötı fehérje által A komplement rendszer vizsgálatának laboratóriumi módszerei: a, Egyes komplement fehérjék mennyiségének mérése: C3, C4, C1INH b, Komplement rendszer aktivitásának meghatározása: CH50 meghatározás c, A komplement aktiváció termékeinek: C3a, C5a CH50 = a beteg 1ml szérumának annyiad része, amely 1ml 2%-os szenzibilizált birka vörösvérsejt szuszpenzió 50%-os hemolízisét hozza létre. Magas CH50 érték: nagy komplement aktivitást jelent Alacsony CH50 érték: csökkent komplement aktivitást jelent
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI IV. Az autoantitestek vizsgálata Fiziológiás autoantitestek jellemzıi Pathológiás autoantitestek jellemzıi - alacsony titer - alacsony affinitás - IgM izotípus
- magas titer - magas affinitás - IgG izotípus
Vizsgálni kell: izotípust mennyiséget fennállás tartósságát Kimutatásuk: ELISA vagy indirekt immunfluoreszcens technikával
A poliszisztémás autoimmun kórképek legfontosabb autoantitestjei: 1.
Antinukleáris faktor (ANF) vagy „antinuclear antibody” (ANA): a sejtmag különbözı komponensei ellen irányuló autoantitestek összefoglaló neve. Indirekt immunfluoreszcenciás szőrıvizsgálat.
2.
Kettısszálú, duplaszálú DNS (dszDNS) elleni antitest: az SLE egyik diagnosztikus kritériuma (homogén ANF magfluoreszcencia)
3.
Hiszton elleni ellenanyag: gyógyszer indukálta SLE ellenanyaga (homogén ANF magfluoreszcencia)
4.
Kromatin (nukleoszóma) elleni antitest: anti dszDNS + hiszton komplex ellen képzıdött ellenanyagok, jellemzıek lupus nephritisre
5.
Extrahálható nukleáris antigének (ENA) elleni antitestek, szemcsézett (granuláris) ANF magfluoreszcenciát mutatnak. Antigén komponenseik: SS-A (Ro), SS-B (La), Sm, U1RNP, Scl-70, Jo-1 nevő RNS-bıl és nem hiszton természető fehérjébıl álló komplexek. Anti-neutrofil citoplazmatikus antitestek (ANCA) típusai: Citoplazma fluoreszcenciát mutató c-ANCA, perinukleáris fluoreszcenciát mutató p-ANCA és atípusos mag és citoplazmafluoreszcenciát mutató atípusos ANCA. Antifoszfolipid antitestek típusai: anti-kardiolipin antitest anti- béta2glikoprotein1 antitest lupus antikoaguláns
6.
7.
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI V. Autoantitestek kimutatásának jelentısége: I.Diagnózis felállítása – marker autoantitestek -anti-dsz DNS -szisztémás lupus erythematosus (SLE) -anti-Sm -szisztémás lupus erythematosus (SLE) -anti-hiszton - gyógyszer indukálta SLE -anti-SS-A -Sjögren szindróma, SLE -anti-Scl-70 -progresszív szisztémás sclerosis (PSS) -anti-Jo-1 -polymyositis/dermatomyositis (PM/DM) -anti-U1RNP -kevert kötıszöveti betegség (MCTD) -anti-Scl-70 -szisztémás sclerosis -anti-centromer -szisztémás sclerosis -reumatoid faktor -rheumatoid arthritis -anti-ciklikus citrullinált peptid -reumatoid arthritis -anti-citrullinált vimentin -reumatoid arthritis -ANCA -vasculitis 2.Differenciáldiagnosztika 3.Alcsoportba, altípusba sorolás, prognózis elırejelzés -anti-Scl-70: PSS súlyosabb, rosszabb prognózisú formája -anti-centromer: PSS enyhébb, jobb prognózisú formája(CREST szindróma) -antifoszfolipid antitestek: antifoszfolipid szindróma 4.A betegség aktivitásának nyomon követése, terápia hatékonyságának megítélése: anti-dsz DNS, anti-Jo-1, antifoszfolipid autoantitestek, ANCA anti-TG(tireoglobulin), anti-TPO(tireoidea peroxidáz), anti-GBM (glomeruláris bazálmembrán)
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI VI. Szervspecifikus autoantitestek -
pajzsmirigy elleni autoantitestek: anti-TG, anti-TPO: Hashimoto thyreoiditis, anti-TSH receptor: Graves-Basedov
-
gyomor parietális sejt elleni autoantitestek: anaemia perniciosa
-
pankreas szigetsejt elleni autoantitestek: I. típusú diabetes
-
mellékvesekéreg steroidtermelı sejtjei elleni autoantitestek: Addison-kór
-
veseglomerulusok bazálmembránjai elleni autoantitestek: Goodpasture szindróma
-
simaizom elleni autoantitestek: autoimmun hepatitis
-
LKM (máj-vese mikroszóma) elleni autoantitest: autoimmun hepatitis
A poliszisztémás autoimmun betegségek marker autoantitestjei és elıfordulásuk gyakorisága (%) Autoantitest
SLE
MCTD
RA
pSs
PM/DM
Anti-dszDNS*
60-70%
20/25%
Anti-hiszton*
40-60%
20-25%
Anti-nukleoszóma (kromatin)*
85-90%
Anti-Sm*
30-35%
5-10%
10-15%
Anti-(U1) RNP*
20-25%
>95%
10-15%
-
10-15%
Anti-SS-A*
40-50%
10-15%
85-90%
Anti-SS-B*
20-25%
10-15%
70-75% 10-15%
PSS
10-15%
Anti-centromer*
40-50%
Anti-fibrillarin* (U3 RNP)
25-30%
Anti-RNS polimeráz I*
25-30%
Anti-Scl-70*
40-50%
Anti-Jo-1*x
20-25%
Anti-alfa-fodrin Rf
ANCA vasculitis
35-40% +-
+-
Anti-ciklikus citrullinált peptid (CCP) + vimentin
40-60%
+-
+-
+-
+-
85-90%
ANCA
15-20%
Anti-foszfolipid
40-50%
>95% 20-30%
*ANF (ANA) pozitivitás autoantitestje
x
citoplazma pozitivitást is mutat
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI VII. Allergiás megbetegedések diagnosztikája
-össz IgE szint – nem feltétlenül emelkedett -allergénspecifikus IgE meghatározása (IgG ellenanyag = nem allergia) -allergénspecifikus IgE mennyiségi meghatározása, követése deszenzibilizáló kezelés során
A laboratóriumi lelet önmagában nem diagnosztikus értékő!
SEJTES VIZSGÁLATOK TÍPUSAI I. Fagocita aktivitás mérés módszerei 1. mikroba kivonattal aktivált fagociták szabadgyök képzésének (kemilumineszcenciájának mérése luminométerrel) 2. monocita-, granulocita-fagocitózis mérés (fénymikroszkópos értékelés) Fc receptorok komplement –receptorok szénhidrát receptorok aktivitásának mérése lehetséges 3. Kemotaxis mérés Limfocita proliferáció (blasztos transzformáció) mérés: Aktiválás: a.) specifikus antigénnel b.) aspecifikus mitogénel Értékelés: 3H-timidin inkorporáció alapján NK (természetes ölı) sejt aktivitás mérés: 51Cr
jelzett tumorsejtekbıl történı izotóp felszabadítás alapján
SEJTES VIZSGÁLATOK TÍPUSAI II. Limfocita CD antigének vizsgálata áramlási sejtfluoriméterrel: ezek sejtfelszíni differenciálódási antigének: limfocita-szubpopulációk: CD3+: T sejtek CD4+: helper T sejtek CD8+: citotoxikus T sejtek CD19+: B sejtek CD56+: NK sejtek A vizsgálatok célja: 1. Veleszületett defektusok kimutatása 2. Szerzett defektusok kimutatása: -immunszupresszív és citosztatikus gyógyszerek -malignus hematológiai megbetegedések -tumorok, senyvesztı betegségek -AIDS következménye
Az áramlási sejtfluorimetria további felhasználása leukémia/limfoma diagnosztika (pl.: CD5/CD20 – B- CLL) sejtaktiváció mérés pl.: CD3/CD69, CD3/HLA-DR DNS tartalom meghatározás: tumorsejtek (46-nál több vagy kevesebb kromoszóma ill. DNS) Fagocitózis NK aktivitás Szabadgyök képzés Intracelluláris citokinek meghatározása Celluláris- Ca2+-szint, membránpotenciál, pH, stb… mérés
AZ IMMUNOLÓGIAI LABORATÓRIUMBAN ALKALMAZOTT VIZSGÁLÓMÓDSZEREK TÍPUSAI
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK: 1. FEHÉRJÉK MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA PLAZMÁBAN, VIZELETBEN, LIQUORBAN -
SZÉRUMBAN,
radiális immundiffúzió (Mancini-technika) turbidimetria nefelometria elektroforézis
2. ÖSSZKOMPLEMENT AKTIVITÁS
- hemolitikus módszer
3. PASSZÍV HEMAGGLUTINÁCIÓ
- baktérium elleni antitest titer - rheumatoid faktor meghatározása
4. INDIREKT IMMUNFLUORESZCENCIA -
antinukleáris antitest kimutatása szervspecifikus autoantitestek ANCA (anti neutrophil cytoplasmaticus antitest)
5. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) -
autoantitestek pontos, kvantitatív meghatározása allergén specifikus IgE
Mancini teszt
Immunglobulinok mérési technikái A. Turbidimetria
B. Nefelometria
Turbidimetria
Nefelometria
A koncentrációval arányos fényintenzitás csökkenését méri
A koncentrációval arányos szórt fény intenzitását méri
Az immunglobulinok mennyiségének változása
Immunglobulinok mennyisége
az életkor függvényében
IgG IgA IgM
életkor
Albumin
α1 globulins
α2 globulins
β1β2 globulins γ globulins
1
2 3
4
5
6
7
8 9
10
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
N
Albumin
PROTEINOGRAM
OCT 18 93
2/1 ECH: 1 AGE: 0 SEX: TOTAL PROTEINS: 61.0 G/L A/G: 1.33 NAME
0/0
G/L
NORM:%
G/L
Albumin
57.1
34.9
52-65
34-42
Alpha 1
3.6
2.2
2-4.5
1-3
Alpha 2
14.6
8.9
10-15
6-9
Beta
12.5
7.6
6-13
4-9
Gamma
12.2
7.4
10-19
6-13
Albumin α1 zone: α1 antitrypsin, orosomucoid, α1 antichymotrypsin α2 zone: haptoglobin, ceruleoplasmin, Gc globulin, α2 macroglobulin, α lipoprotein β1 zone: transferrin – hemopexin β2 zone: βlipoprotein, C3 complement γ zone: IgG, IgA, IgM, (IgD, IgE)
with β mercaptoethanol reduction: correct typing of IgM K cryoglobulin. (To be confirmed after isolation of the cryoprecipitate).
ELP
G
A
M
K
L
ELP
G
A
M
K
L
Image of biclonal gammapathy
ELP GAM
K
L
K free
L free
Presence of two Lambda monoclonal bands confirmed: one with anti heavy chains (γ, α or µ) the other, more anodic, with anti Lambda free light chain. Conclusion: presence of a Lambda Ig monoclonal component with more anodic Lambda free light chains.
Ur Ser
Albumin
Ur Ser
IgG
Transferrin
Albumin
Ur Ser
Albumin
CH50 meghatározás (hemolízis)
passzív hemagglutináció (Waaler-Rose)
C-ANCA
P-ANCA
Atípusos-ANCA
1. Antigén 2. Antigén – antitest komplex 3. Antigén – antitest komplex + konjugátum 4. Antigén – antitest komplex + konjugátum + szubsztrát = termék
ELISA (anti-kardiolipin IgG)
Kombinált ELISA (anti-Sm, anti-RNP)
Allergen specifikus IgE
SEJTES VIZSGÁLATOK 1 Fagocitasejtek szabadgyöktermelésének kemilumineszcencia
vizsgálata:
teljes
vér
2. Monociták és granulociták fagocitálóképességének vizsgálata 3. limfocita blasztos transzformáció vizsgálata 4. NK sejt aktivitás mérés 5. Sejtfelszíni differenciálódási antigének (CD antigének) expressziójának vizsgálata áramlási citométerrel
Fluoreszkáló részecskéket fagocitáló neutrofil granulociták
Limfocita blasztos transzformáció 1.
Limfocita aktiválás (blasztos átalakítás) -
specifikus antigénnel
-
aspecifikus mitogénnel
-
T sejt mitogén: concavalin A (ConA), phytohemagglutinin (PHA)
-
B sejt mitogén: lipopolysaccharid (LPS)
-
T-B sejt mitogén: pokeweed mitogén (PWM)
2.
Aktiváció (blasztképzıdés) mérés: 3H-timidin felvétel alapján
3.
Értékelés: Proliferációs Index ( PI ) =
cpm (mitogénnel kezelt minta beütésszáma) cpm (kezeletlen minta beütésszáma)
NK sejt aktivitás mérés Célsejt: 51Cr –al jelzett K562 tumorsejtvonal
Effektor sejt:a beteg limfocita szuszpenziója
Értékelés: a.) 51Cr felszabadulás a beteg sejtei által b.) 51Cr felszabadulás az egészséges kontroll sejtei által c.) a két eredmény összevetése
Fehérvérsejt szubpopulációk eloszlása a sejtek nagysága és granuláltsága alapján
limfocita
granulocita Referens egyén monocita
Limfocita túlsúly
Törmelékes minta
CD3/CD19 pozitív sejtek meghatározása különbözı festékkel konjugáltatott monoklonális ellenanyagok segítségével
CD19+ sejtek
CD3+ sejtek
CD4 és CD8 sejtek meghatározása különbözı színő festékkel konjugáltatott ellenanyagok segítségével CD8+ sejtek
CD4+ sejtek
Aktivált T-sejtek (kettıs pozitív sejtek) meghatározása
CD3+/HLADR+ sejtek
CD20/CD5 kettıs pozitív sejtek meghatározása
Referens egyén
B-CLL-ben szenvedı beteg esetén CD20/CD5 kettıs pozitív sejtek megjelenése
