AZ IMMUNOLÓGIAI LABORATÓRIUM DIAGNOSZTIKAI LEHETŐSÉGEI ÁOK III. évfolyam gyakorlat http://rimm.dote.hu www.3belklinika.deoec.hu
Az Immunológiai Laboratórium feladata: A.) Egy beteg immunrendszerének komplex vizsgálatával adatokat szolgáltatni egy immunológiai kórkép diagnózisának felállításához vagy kizárásához. B.) Az immunrendszer működésében kimutatott kóros laboratóriumi adat alapot szolgáltat a kórkép immunológiai eredetének felvetéséhez. C.) De a kóros laboratóriumi adat önmagában nem elegendő egy immunológiai kórkép diagnózisának kimondásához. A diagnózishoz mindig szükséges az összes klinikai adat együttes értelmezése.
1. Az Immunológiai Laboratórium diagnózist segítő adatai: a.) Immundeficiencia esetén: - szerológia: immunglobulinok (IgG, IgA, IgM, IgE) komplement fehérjék meghatározása - fagocita sejtek vizsgálata - limfocita alcsoportok vizsgálata (CD markerek) - aktív immunizálás hatásának lemérése (Pneumococcus) b.) Antimikróbális, reaktív gyulladások esetén (immunreaktivitás): -szerológia: We (fokozott), C reaktív protein, immunkomplex, IgG, IgA, IgM, IgE, C3, C4, szintek nőnek, -sejtes vizsgálatok: fehérvérsejtszám emelkedik, granulocitózis, limfocitózis, fagocita aktivitás megnő. -T sejtes aktiváció: HLA-DR, CD69 expresszió nő
c.) Allergia esetén: -szerológia: össz IgE, allergén specifikus IgE szintek emelkednek, -sejtek: az allergén T sejt proliferációt indukál. d.) Autoimmun kórképekben: -szerológia: a. szervspecifikus kórképekben szervspecifikus ellenanyagok, b. poliszisztémás kórképekben: „marker” ellenanyagok mutathatók ki. 2. Az Immunológiai Laboratórium adatai a terápia követésében a.) immunszuppresszió követése: kóros ellenanyag szint mérésekkel, b.) immunreaktivitás mérése: sejtproliferáció méréssel, citokin termelés méréssel, aktív immunizálás hatásának mérése, c.) deszenzibizálás hatásának mérése allergiában (IL-10 mérés), d.) immunszubsztitúció hatásának mérése: pl. IVIG terápia után.
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI I. A humorális immunitás vizsgálata: immunglobulinok akut fázis fehérjék komplement rendszer
a.) Immunglobulinok vizsgálata: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE meghatározás
- a normális szintek életkor függőek! - kórosan alacsonyabb szint: 1. Veleszületett deficienciák gyanúja: szelektív IgA hiány IgG alosztály deficiencia hiper-IgE szindróma 2. Szerzett deficienciák: immunszuppresszív és citosztatikus gyógyszerek malignus hematológiai megbetegedések tumorok, senyvesztő betegségek fokozott fehérjevesztés - kórosan magasabb szint: infekció, autoimmun betegség, lymphoma - természetes ellenanyagok: izohemagglutininek, pl. anti-A, anti-B
- patológiás szérum fehérjék:
monoklonális ellenanyagok,
krioglobulinok, hideg agglutininek
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI II. b.) Akut fázis fehérjék vizsgálata: Akut fázis fehérjék: a vérben normálisan is jelenlévő proteinek, amelyek mennyisége az akut fázis reakció során jelentősen megnő (pozitív akut fázis fehérjék) vagy lecsökken (negatív akut fázis fehérjék)
Akut fázis reakció történik:
-Pozitív akut fázis fehérjék:
-Negatív akut fázis fehérjék:
infekció, autoimmun gyulladás, tumoros megbetegedés, szövetkárosodás: műtét, trauma, égés, szívinfarktus esetén C-reaktív protein (CRP) alfa1-antitripszin haptoglobin fibrinogén komplement-komponensek szérum Amiloid A (SAA) prokalcitonin albumin, prealbumin transzferrin
Akut fázis proteinek (CRP) diagnosztikus jelentősége: -infekciók monitorizálása -autoimmun gyulladások aktivitásának megítélése (RA) -műtét után sebgyógyulás nyomon követése (sebfertőzés) -szervtranszplantációnál rejekció diagnosztizálása -coronaria betegeknél a fokozott rizikó előrejelzése -neonatológa
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI III.
c, A komplement rendszer vizsgálata Komplement rendszer: kaszkád szerű enzim rendszer és szabályzó fehérjéi (17 elem) Funkcói:
-kórokozók direkt károsítása (lízise) -kórokozók fagocitózisának elősegítése (opszonizáció) -a szervezetben képződő immunkomplexek eltávolítása - gyulladásos reakciók kiváltása és fenntartása
Csökkent komplement szint esetei: - veleszületett deficiencia - csökkent termelés (májkárodosás) - aktív szisztémás autoimmun betegségben fokozott felhasználódása, konszumpciója (pl. SLE) Emelkedett komplement szint esetei: - akut fázis reakciók
A komplement rendszer aktivátorai: 1. Klasszikus út: antigén-antitest komplex, 2. Alternatív út: baktérium sejtfal vagy endotoxin, gombák, vírusok, paraziták, 3. Lektin út: mannóz-kötő fehérje (baktériumok)
A komplement rendszer vizsgálatának laboratóriumi módszerei: a.) Egyes komplement fehérjék mennyiségének mérése: C3, C4, C1INH, b.) Komplement rendszer aktivitásának meghatározása: CH50 meghatározás, c.) A komplement aktiváció termékeinek mérése: C3a, C5a. CH50: a beteg 1ml szérumának az a része, amely 1ml 2%-os szenzibilizált birka vörösvérsejt szuszpenzió 50%-os hemolízisét hozza létre. Magas CH50 érték: nagy komplement aktivitást jelent. Alacsony CH50 érték: csökkent komplement aktivitást jelent.
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI IV. Az autoantitestek vizsgálata Fiziológiás autoantitestek jellemzői: Pathológiás autoantitestek jellemzői:
- alacsony titer - alacsony affinitás - IgM izotípus
- magas titer - magas affinitás - IgG izotípus
Vizsgálni kell: izotípust mennyiséget fennállás tartósságát Kimutatásuk: ELISA vagy indirekt immunfluoreszcens technikával
A poliszisztémás autoimmun kórképek legfontosabb autoantitestjei: 1.
Antinukleáris faktor (ANF) vagy „antinuclear antibody” (ANA): a sejtmag különböző komponensei ellen irányuló autoantitestek összefoglaló neve. Indirekt immunfluoreszcenciás szűrővizsgálat.
2.
Kettősszálú, duplaszálú DNS (dszDNS) elleni antitest: az SLE egyik diagnosztikus kritériuma (homogén ANF magfluoreszcencia)
3.
Hiszton elleni ellenanyag: gyógyszer indukálta SLE ellenanyaga (homogén ANF magfluoreszcencia)
4.
Kromatin (nukleoszóma) elleni antitest: anti dszDNS + hiszton komplex ellen képződött ellenanyagok, jellemzőek lupus nephritisre
5.
Extrahálható nukleáris antigének (ENA) elleni antitestek, szemcsézett (granuláris) ANF magfluoreszcenciát mutatnak. Antigén komponenseik: SS-A (Ro), SS-B (La), Sm, U1RNP, Scl-70, Jo-1 nevű RNS-ből és nem hiszton természetű fehérjéből álló komplexek. Anti-neutrofil citoplazmatikus antitestek (ANCA) típusai: Citoplazma fluoreszcenciát mutató c-ANCA, perinukleáris fluoreszcenciát mutató p-ANCA és atípusos mag és citoplazmafluoreszcenciát mutató atípusos ANCA. Antifoszfolipid antitestek típusai: anti-kardiolipin antitest, anti- béta2glikoprotein1 antitest, lupus antikoaguláns Reumatoid faktor (RF): IgM típusú anti-humán IgG RA-ban, Anti-citrullinált peptid (anti-CCP) RA-ban.
6.
7. 8. 9.
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI V.
Autoantitestek kimutatásának jelentősége: I.Diagnózis felállítása – marker autoantitestek -anti-dsz DNS -szisztémás lupus erythematosus (SLE) -anti-Sm -szisztémás lupus erythematosus (SLE) -anti-hiszton - gyógyszer indukálta SLE -anti-SS-A -Sjögren szindróma, SLE -anti-Scl-70 -progresszív szisztémás sclerosis (PSS) -anti-Jo-1 -polymyositis/dermatomyositis (PM/DM) -anti-U1RNP -kevert kötőszöveti betegség (MCTD) -anti-Scl-70 -szisztémás sclerosis -anti-centromer -szisztémás sclerosis -reumatoid faktor -rheumatoid arthritis -anti-ciklikus citrullinált peptid -rheumatoid arthritis -anti-mutált citrullinált vimentin -rheumatoid arthritis -ANCA -vasculitis -RF, anti-CCP - rheumatoid arthritis Rövidítések: dsz-dupla szálú; Sm- Smith nevű beteg; SS-Sjögren szindróma; Scl-scleroderma; RNP-ribonukleoprodeid; ANCA-anti neutropfil citoplazma antitest RF-reumatoid faktor, CCP-citrullinált ciklikus peptid
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI VI. Szervspecifikus autoantitestek - pajzsmirigy elleni autoantitestek: anti-TG, anti-TPO: Hashimoto thyreoiditis, anti-TSH receptor: Graves-Basedov - gyomor parietális sejt elleni autoantitestek: anaemia perniciosa - pankreas szigetsejt elleni autoantitestek: I. típusú diabetes - mellékvesekéreg steroidtermelő sejtjei elleni autoantitestek: Addison-kór - veseglomerulusok bazálmembránjai elleni autoantitestek: Goodpasture szindróma - simaizom elleni autoantitestek: autoimmun hepatitis - LKM (máj-vese mikroszóma) elleni autoantitest: autoimmun hepatitis Rövidítések: TG-tireoglobulin; TPO-tireoidea peroxidáz; TSH-tireoidea stimuláló hormon, LKM- „liver kidney microsome”
A poliszisztémás autoimmun betegségek marker autoantitestjei és előfordulásuk gyakorisága (%) Autoantitest
SLE
Anti-dszDNS*
60-70%
20/25%
Anti-hiszton*
40-60%
20-25%
Anti-nukleoszóma (kromatin)*
85-90%
Anti-Sm*
30-35%
5-10%
10-15%
Anti-(U1) RNP*
20-25%
>95%
Anti-SS-A* Anti-SS-B*
MCTD
RA
pSs
PM/DM
10-15%
-
10-15%
40-50%
10-15%
85-90%
20-25%
10-15%
70-75%
10-15%
PSS
10-15%
Anti-centromer*
40-50%
Anti-fibrillarin* (U3 RNP)
25-30%
Anti-RNS polimeráz I*
25-30%
Anti-Scl-70*
40-50%
Anti-Jo-1*x
20-25%
Anti-alfa-fodrin Rf
ANCA vasculitis
35-40% +-
+-
Anti-ciklikus citrullinált peptid (CCP) + anti-mutált citrullinált vimentin (MCV)
40-60%
+-
+-
+-
+-
85-90%
ANCA
15-20%
Anti-foszfolipid
40-50%
>95% 20-30%
*ANF (ANA) pozitivitás autoantitestje
x
citoplazma pozitivitást is mutat
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI VII. Allergiás megbetegedések diagnosztikája -össz IgE szint – nem feltétlenül emelkedett -allergénspecifikus IgE meghatározása (IgG ellenanyag = nem allergia) -allergénspecifikus IgE mennyiségi meghatározása, követése deszenzibilizáló kezelés során (IL-10) A laboratóriumi lelet önmagában nem diagnosztikus értékű!
SEJTES VIZSGÁLATOK TÍPUSAI I. Fagocita aktivitás mérés módszerei 1. mikroba kivonattal aktivált fagociták szabadgyök képzésének (kemilumineszcenciájának mérése luminométerrel) 2. monocita-, granulocita-fagocitózis mérés (fénymikroszkópos értékelés) Fc receptorok komplement –receptorok szénhidrát receptorok aktivitásának mérése lehetséges 3. Kemotaxis mérés
Limfocita proliferáció (blasztos transzformáció) mérés: Aktiválás: a.) specifikus antigénnel b.) aspecifikus mitogénel Értékelés: 3H-timidin inkorporáció alapján
NK (természetes ölő) sejt aktivitás mérés:
Cr jelzett tumorsejtekből történő izotóp felszabadítás alapján
51
SEJTES VIZSGÁLATOK TÍPUSAI II. Limfocita CD antigének vizsgálata áramlási sejtfluoriméterrel: Ezek sejtfelszíni differenciálódási fehérjék (antigének). Limfocita-szubpopulációk: CD3 + CD4 + CD8 + CD19+ CD56+
T sejtek helper T sejtek citotoxikus T sejtek B sejtek NK sejtek
A vizsgálatok célja: 1. Veleszületett defektusok kimutatása. 2. Szerzett defektusok kimutatása: -immunszuppresszív és citosztatikus gyógyszerek -malignus hematológiai megbetegedések -tumorok, senyvesztő betegségek -AIDS következményeként.
Az áramlási sejtfluorimetria további felhasználása leukémia/limfoma diagnosztika (pl.: CD5/CD20 – B- CLL) sejtaktiváció mérés pl.: CD3/CD69, CD3/HLA-DR DNS tartalom meghatározás: tumorsejtek (46-nál több vagy kevesebb kromoszóma ill. DNS) Fagocitózis NK aktivitás Szabadgyök képzés Intracelluláris citokinek meghatározása Celluláris- Ca2+-szint, membránpotenciál, pH, stb… mérés
AZ IMMUNOLÓGIAI LABORATÓRIUMBAN ALKALMAZOTT VIZSGÁLÓMÓDSZEREK TÍPUSAI
SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK: 1. FEHÉRJÉK MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA SZÉRUMBAN, PLAZMÁBAN, VIZELETBEN, LIQUORBAN - radiális immundiffúzió (Mancini-technika) - turbidimetria - nefelometria - elektroforézis 2. ÖSSZKOMPLEMENT AKTIVITÁS - hemolitikus módszer 3. PASSZÍV HEMAGGLUTINÁCIÓ - baktérium elleni antitest titer - rheumatoid faktor meghatározása 4. INDIREKT IMMUNFLUORESZCENCIA - antinukleáris antitest kimutatása - szervspecifikus autoantitestek - ANCA (anti neutrophil cytoplasmaticus antitest) 5. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) - autoantitestek pontos, kvantitatív meghatározása allergén specifikus IgE
Mancini teszt
Immunglobulinok mérési technikái A. Turbidimetria
B. Nefelometria
Turbidimetria
Nefelometria
A koncentrációval arányos fényintenzitás csökkenését méri
A koncentrációval arányos szórt fény intenzitását méri
Az immunglobulinok mennyiségének változása
Immunglobulinok mennyisége
az életkor függvényében
IgG IgA IgM
életkor
Albumin
α1 globulins
α2 globulins
β1β2 globulins γ globulins
1
2 3
4
5
6
7
8 9
10
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
N
Albumin
PROTEINOGRAM
OCT 18 93
2/1 ECH: 1 AGE: 0 SEX: TOTAL PROTEINS: 61.0 G/L A/G: 1.33 NAME
0/0
G/L
NORM:%
G/L
Albumin
57.1
34.9
52-65
34-42
Alpha 1
3.6
2.2
2-4.5
1-3
Alpha 2
14.6
8.9
10-15
6-9
Beta
12.5
7.6
6-13
4-9
Gamma
12.2
7.4
10-19
6-13
Albumin α1 zone: α1 antitrypsin, orosomucoid, α1 antichymotrypsin α2 zone: haptoglobin, ceruleoplasmin, Gc globulin, α2 macroglobulin, α lipoprotein β1 zone: transferrin – hemopexin β2 zone: βlipoprotein, C3 complement γ zone: IgG, IgA, IgM, (IgD, IgE)
G
A
M
K
Poliklonális IgG szaporulat
L
ELP
G
Monoklonális IgG szaporulat
A
M
K
L
with β mercaptoethanol reduction: correct typing of IgM K cryoglobulin. (To be confirmed after isolation of the cryoprecipitate).
ELP
G
A
Monoklonális IgM szaporulat
M
K
L
Image of biclonal gammapathy
ELP GAM K
L
K free
L free
Presence of two Lambda monoclonal bands confirmed: one with anti heavy chains (γ, α or µ) the other, more anodic, with anti Lambda free light chain. Conclusion: presence of a Lambda Ig monoclonal component with more anodic Lambda free light chains.
Ur Ser
Albumin
Ur Ser
IgG
Transferrin
Albumin
Ur Ser
Albumin
CH50 meghatározás (hemolízis)
passzív hemagglutináció (Waaler-Rose)
Anti-glomeruláris bazál membrán ellenanyag
C-ANCA
P-ANCA
Atípusos-ANCA
1. Antigén 2. Antigén – antitest komplex 3. Antigén – antitest komplex + konjugátum 4. Antigén – antitest komplex + konjugátum + szubsztrát = termék
ELISA (anti-kardiolipin IgG)
Kombinált ELISA (anti-Sm, anti-RNP)
Allergen specifikus IgE
SEJTES VIZSGÁLATOK 1 Fagocitasejtek szabadgyöktermelésének vizsgálata: teljes vér kemilumineszcencia 2. Monociták és granulociták fagocitálóképességének vizsgálata 3. limfocita blasztos transzformáció vizsgálata 4. NK sejt aktivitás mérés 5. Sejtfelszíni differenciálódási antigének (CD antigének) expressziójának vizsgálata áramlási citométerrel
Fluoreszkáló részecskéket fagocitáló neutrofil granulociták
Limfocita blasztos transzformáció 1.
Limfocita aktiválás (blasztos átalakítás) -
specifikus antigénnel
-
aspecifikus mitogénnel
-
T sejt mitogén: concavalin A (ConA), phytohemagglutinin (PHA)
-
B sejt mitogén: lipopolysaccharid (LPS)
-
T-B sejt mitogén: pokeweed mitogén (PWM)
1.
Aktiváció (blasztképződés) mérés: 3H-timidin felvétel alapján
2.
Értékelés: Proliferációs Index ( PI ) =
cpm (mitogénnel kezelt minta beütésszáma) cpm (kezeletlen minta beütésszáma)
NK sejt aktivitás mérés Célsejt: 51Cr –al jelzett K562 tumorsejtvonal
Effektor sejt:a beteg limfocita szuszpenziója
Értékelés: a.) 51Cr felszabadulás a beteg sejtei által b.) 51Cr felszabadulás az egészséges kontroll sejtei által c.) a két eredmény összevetése
Fehérvérsejt szubpopulációk eloszlása a sejtek nagysága és granuláltsága alapján
limfocita
granulocita Referens egyén monocita
Limfocita túlsúly
Törmelékes minta
CD3/CD19 pozitív sejtek meghatározása különböző festékkel konjugáltatott monoklonális ellenanyagok segítségével
CD19+ sejtek
CD3+ sejtek
CD4 és CD8 sejtek meghatározása különböző színű festékkel konjugáltatott ellenanyagok segítségével CD8+ sejtek
CD4+ sejtek
Aktivált T-sejtek (kettős pozitív sejtek) meghatározása
CD3+/HLADR+ sejtek
CD20/CD5 kettős pozitív sejtek meghatározása
Referens egyén
B-CLL-ben szenvedő beteg esetén CD20/CD5 kettős pozitív sejtek megjelenése
