Az immunanalitikában felmerülő in vivo és in vitro interakciók az endokrin és a sürgősségi labordiagnosztikában
Toldy Erzsébet
Pécsi Tudomány Egyetem, ETK, Diagnosztikai Intézet Gyakorlati Diagnosztikai tanszéki Csoport és Vas megyei Markusovszky Kórház, Központi Laboratórium, Szombathely
Synalab Hungary Kft. Országos laboratóriumi medicina szakmaterületi továbbképzés. Főszervező: Prof. Dr. Fekete Mátyás 2011. május 12. Budapest
Az immunanalitikai módszerek használatának gyakorisága napjainkban Paraméterek Endokrin, tumormarker, autoimmun
Sürgősségi
Gyógyszerszint, haematologia
Egyéb
38% 95 %
62%
Immuno-assay
Immunanalitikai vizsgálatok a sürgősségi laboratóriumi vizsgálatok terén • Vesefunkció: cystatin C • Cardiologiai markerek: CK-MB-mass, Troponin I és T, pro-bNP • Akut fázisproteinek: CRP, Procalcitonin • Haemostasis: D-dimer • Gyógyszerszint monitorozások: Digoxin, MTX, • Extrauterin, v. ectopiás terhesség: hCG • Életet veszélyeztető endocrin diszfunkció: fT4, Cortisol • Intraoperativ monitorozás: PTHi, Insulin, ACTH
Sürgősségi diagnosztika: ACS ACS ST-eleváció
NINCS
VAN
cTn mérés Negatív Instabil angina
Pozitív NSTEMI
STEMI
A diagnosztikus folyamat: az összes idő legnagyobb hányadát a preanalitikai fázis teszi ki Preanalitikai fázis a laboratóriumon kívül: Postanalitikai fázis: Leletközlés, referencia tartománnyal Lelet interpretáció
14% 75%
Analitikai 25% fázis 61%
37%
beteg állapota, előkészítése mintavételi körülmények a biológiai minta adottsága minta szállítás
24 % Preanalitikai fázis a laboratóriumban: centrifugálás, tárolás minta-előkészítés
Guder W.G. és mtsai: Samples: From the Patient to the Laboratory 2003.
Anyagmennyiségek a vérben
Módszer szenzitivitás
Immunanalitikai módszerrel mért paraméterek koncentráció viszonyai a plazmában ECLIA MEIA IRMA RIA
Mikroanalitika
Gasztrin Szabad T3 Szabad progeszteron Szabad T4 TSH Szabad tesztoszteron Progeszteron T3 Tesztoszteron Vitamin D T4 Glükóz
sürgősségi markerek: ng
20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9
95%
8
7
6
5
4
3
2
1 0
1 ml vérben oldott molekulák számának a logaritmusa
Immuno-assay: több mint 50 éve Hormon
Hevesy Gy. 1938
R. Yalow S. & S.A. Berson 1960
H. Koehler & A. Mielstein 1975
Nobel-díjasok
„Ambient assay” - R. Ekins Az eredmény függ a szérum-mátrixtól = Hormon
• Fehérjefrakciók mennyisége és aránya • pH • Ionerősség - döntő fontosságú a komplexek kialakulásához
Globulin
Albumin
Beteg Kontroll
Gamma globulin frakció: 1, 6 %
Beteg
Kontroll
Mindhárom Ig osztály méréshatár alatt
SZÁZALÉKOS ELTÉRÉS
Immuno-assay-vel mért paraméterek szintjének változásai az IgG és az albumin adását követően 400 60 350 40
300 250 200
20
∗
∗
IgG IgG+Albumin
0 IgG
150-20
∗
IgG + Albumin
100-40 0 -60
-50
PTH
hCG
hGH
IGF1
PRL
Az interferencia független az analitikai módszertől ECLIA MEIA
TSH fT4 fT3 IgG adása után
-60%
-40%
-20%
0
20%
40%
60%
ECLIA MEIA
TSH fT3
fT4
IgG+Albumin adása után 40
fT3 -60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
60
40
50
60
in vitro protein manipuláció Equilibrium Dializis után mért X = Rutin szabad thyroxin assay
•A rutin fT4 módszereket úgy fejlesztették ki, hogy legyőzzék a gyakoribb fehérjefrakció rendellenességeket, cserében viszont az albumin-szint függők. • Ezzel a módszer szenzitivitásának is ártanak.
WWW.THYROIDMANAGER.ORG Chapter 6a – THYROID FUNCTION TESTS: Assay of Thyroid Hormones -Carole Spencer,University of Southern California Technical Director, Updated 1 January 2010
Abnormális hormoneredmények, klinikai konzekvenciával járnak ! Emelkedett hormonszint: hCG Calcitonin Prolactin Kortisol Testosteron fT4
⇒ szükségtelen műtét, kemoterápia ⇒ finomtű biopszia ⇒ MR, felesleges bromocriptin kezelés ⇒ CT, (topical szteroid) ⇒ felesleges további vizsgálatok ⇒ felesleges thyreostaticus kezelés
Alacsony szintek: hCG Insulin
⇒ choriocarcinoma félrekezelése ⇒ insulinoma félrediagnosztizálása
Alison MJ et al: Unusual results and the role of the the clinical endocrinologist. Clin Endocrinol 2006: 64 234-44.
Preanalitikai körülmények • In vivo: - általános élettani állapot - vérvételi körülmények - mintában lévő nem kívánatos szubsztanciák
• In vitro: - vérvételi cső, szállítás - centrifugálás - minta azonosítás - tárolás
Preanalitika: a beteg előkészítése és állapota • Mintavétel időpontja • Testhelyzet, mozgás • Alimentaris állapot • Stress • Terhesség • Súlyos betegség
A hormonok fluktuációja Krono-biológiai változások Változás az életkorral : GH, IGF1, E2, Testosteron, DHEAS↓ FSH ↑
Ciklikus: • Biológiai pl. menstruációs ciklus • Napi, éjszakai: ACTH, Cortisol, PRL, Aldosteron, Testosteron • Szezonális pl. D-vitamin • Egyéb történés: testhelyzet, evés
ACTH napi ritmus: reggel magas (idős emberben ~3 órával korábban), este alacsony. Vak egyénekben nincs napi ritmus.
Élettani állapotok: pszichés vagy fizikális stress Stress hatás időtartama, súlyossága
ACTH, Cortisol, katecholaminok, TSH, PRL, hGH, AVP, Oxytocin.,
Kisebb
Aldosteron, PRA, ANP ⇑
Nagyobb
pl. betegség műtét
TNF-α α IL-1,6
Csökken: májban : 5’MD aktivitás ⇓, T3 ⇓,
Infekció
Akut fázisreakciók Vermes és mtsai, 2001
A T4, TSH hormonkötő-proteinek
Neuroendokrin válasz súlyos betegségben • Hypophysis -adrenális tengely aktiváció • Hypophysis -genitális és pajzsmirigy tengely inhibició • Eltolja a szokásos referencia tartományokat • További komplikációk: -változás a táplálkozásban -gyógyszerhatások
Gyógyszerhatások In vivo
In vitro
• Béta blokkolók: PRA ↓ • ACE-, AR- blokkolók: PRA↑ • Ca-csatorna blokkolók: ALD↓ PRL ↑ • Spironolacton: ALD ↑ • Antikoncipiensek: BP, PRL↑ • Amiodaron fT4↑ fT3 ↓ • Adrenerg szerek: ↓TSH • Neuroleptikumok, antidepresszánsok: PRL↑
• Steroid assayk-ben számtalan metabolit és gyógyszer zavarhat • Heparin, phenytoin, carbamazepin, salicylat,-fT4,fT3 ↑ • Biotin • Fluoroforok • Exogén T4 mérése szubsztituált betegekben • Insulinnal, v. GH-val kezelt beteg
A biológiai minta rendkívüli adottsága, amely rejtett hibaként jelentkezhet az analitika során 1.) Rendkívül magas, vagy alacsony transzport proteinek, vagy rendhagyó (paraproteinek) proteinek. 2.) A mérni kívánt biomolekula rendkívül magas koncentrációja 3.) A módszert zavaró endogén immunglobulinok jelenléte. 4.) Az antitest-antigén komplex kialakulását zavaró pharmakonok jelenléte.
Transzport proteinek 1.) Peptideket szállítók: CRH-BP (placenta, 38 KD, CRH-t inaktiválja), IGFBP1-6, Albumin (Calcitonin, PTH, ACTH)
2.) Szteroid hormonokat szállítók: CBG, SHBG, D-vitamin -BG
3.) Pajzsmirigy hormonokat szállítók: TBG, Albumin, Transthyretin (prealbumin)
A módszerek mérési tartománya véges Kontroll Acromegalia aktív Acromegal remis. GH-hiány
Az assay mérési tartománya
PAOLO MARZULLO P et al.: Usefulness of Different Biochemical Markers of the Insulin-Like Growth Factor (IGF) Family in Diagnosing Growth Hormone Excess and Deficiency in Adults, J. Clin Endocrin & Metab, 2001; 86: 3001-5.
Rendkívül magas hormonszint: "High Dose Hook" jelenség
Captures antitest
Jelölt antitest
2.
1.
3.
Jel nagysága
Antigén
Szilárd fázis
Tévesen leolvasott alacsony koncentráció
Valós magas koncentráció
Interferenciáért felelős endogén antitestek
I. Specifikus antitestek az analit ellen II. Heterophyl antitestek III. Reuma faktor IV. Human anti-animal-antitestek V. Human-antihuman-antitestek (HAHA) ?
Immunglobulinok okozta keresztreakciók feltételei 1.) Az analitre nézve antigénkötőmolekularésszel rendelkező – specifikusantitestek jelenléte a szérumban. 2.) A zavaró specifikus antitest koncentráció viszonya a módszer méréstartományát elérő, vagy azt meghaladó legyen. 3.) Aspecifikus immunglobulinok kóros mennyiségi arányai.
I. Specifikus autoantitestek • Izotípusuk: főként IgG , de leírtak már IgM, IgA-izoformát is
• Gyakoriságuk- eltérő:
Prolactin:
H2 OS SS S
S S SS S S S I I I g g g G G G
H2 O
S
I g G
normál populáció: 2%, hyperprolactinaemia: 21-46%
Tg: DTC-ben 26%, T4, T3: normál 0,3-1,8%, betegekben: 5-25%, TSH: 0.02% Leírtak már: cTn-I és T , Procalcitonin, CRP esetében is, főként álnegatív eseteket antitest interferencia miatt.
II. Heterophyl antitestek prevalencia: 0,5-12%
III. Reuma faktor Előfordulásuk: a normál populációban (idősebb kor): 5-10%, autoimmun betegekben gyakrabban. RA kezdeti stádium első év: 40-60%, később: 80% - Úgy viselkednek, mint a heterophyl antitestek: minden faj immunglobulinjához hozzákötődnek.
IV. Human anti-animal-antitestek (HAMA)
Szérum koncentrációi: µg/L-g/L is lehet, évekig perzisztálhatnak a keringésben Előfordulásuk: 1-80% is lehet.
A human anti-animal antitestek ellen keletkező további antitestek
Állati antitest
Human anti-idiotípiás antitest
Human anti-anti idiotípiás antitest Human anti-izotípiás antibody Kricka: Clin. Chem. 1999.
Az állati antitestek ellen keletkező IgG interakciók
Y Y Y
)
Y
Tévesen magas
*
Tévesen alacsony
)
YY Y
*
Szilárd fázishoz kötött specifikus Ab
Anti idiotípiás Ab *Jelet adó Ab
Anti-anti idiotípiás Ab vagy
Anti izotípiás Ab
MIT TEHET A LABORATÓRIUM? • Plauzibilítási kontroll • Visszatekintő biokémiai kontroll (delta check) • Blokkoló ágenseket használó assay-k beszerzése • Analitikai megközelítések
Kell-e szűrni antitest interferenciákra a laboratóriumban? IGEN, ha a populáció jelentős %-át érinti és az eredmény a döntéshozatalban meghatározó. pl. bbPRL, Tg
Az anamnesis megköveteli
Laboratóriumé a felelősség!
Az antitest interakciók kiküszöbölése: LEHETETLEN, DE…. …..együtt kell élni vele a következőképpen: • Több módszert kell elérhetővé tenni • Team munkában: - tudatosítani kell a klinikusokban az immunanalitikai módszerek korlátait, - klinikai összefüggéseket ismertté kell tenni a labor felé.
IN VITRO- PREANALITIKA Biológiai minta és cső •
Teljes vér: - intracelluláris enzimek szabaddáválása, haemolízis (catalase,
protease, hydrolase). Antiproteolitikus ágens: Trasylol (aprotinin)
• Szérum: a legtöbb hormonhoz, illetve antitesthez alkalmas pár kivétellel. • Plazma: PRA, Renin, ACTH,Catecholaminok csak EDTA-val (kofaktort köt meg)! Li-heparin nem jó, mert Ab-Ag komplex kialakulását gátolja.
•Vérvételi cső: - Géles szeparáló csövek használata kerülendő. Interakció a legtöbb assay-vel: az SST-gél abszorbeálja úgy a makro-, mind a kis- (pl. szteroidok) molekulákat. - Üveg, illetve műanyagcsövek (pl. ACTH-t adszorbeáló üvegcső)
cTnT szintek torzítása
0,035 ng/ml 0,172 ng/ml
0,054 ng/ml 0,178 ng/ml
20% 0% -20% -40%
p<0,01
-60% -80% 0
2
4
6
8
10
12
14
Hgb g/l
cTnI szintek torzítása
0,42ng/ml 0,94 ng/ml
0,54 ng/ml 1,59 ng/ml
5% 0% -5% -10% -15% 0
2
4
6
8 Hgb g/l
10
12
14
25(OH)-D3-vitamin-preanalitika: fényfüggés Tárolás: alufóliában v. anélkül, szobahőmérsékleten, lesavózva ill. szétválasztás nélkül Az alapértékhez képest négy óra elteltével nem tapasztaltak szignifikáns eltérést, 24 óra múlva azonban mind a lesavózott, mind a szétválasztás nélküli minták esetén szignifikánsan (p<0,001) alacsonyabb értéket mértek de csak a fénynek kitett mintákban.
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
Fénytől védve
p < 0,001 p < 0,001 NS
0 perc
25-OH-D3 (ng/ml)
25-OH-D
3
(ng/ml)
Fénynek kitéve
4 óra
24 óra
24 óra, lesavózva
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
NS
0 perc
4 óra
24 óra
Bekő Gabriella és mtsai, SE , Központi Labor, Poszter: MLDT Pécs, 2010
24 óra, lesavózva
A minták tárolása PTHi rövid távú eltartása plazmában és szérumban
Szérum (N=11)
Plazma (N=11)
Óra
48. 32.
0
4-9 C
24. 0
20-25 C
4. -13
-10
-8
-5
-3
0
3
5
PTHi szint változások %-ban
8
10
ACTH szint (pg/ml)
Módszerfüggő változás az ACTH szintekben a fagyasztásos tárolás során 30
Friss minta 2. hét
25 20 15 p<0,05
N.S.
10 5 0
ECLMA
CLMA CLMA p < 0,001
ECLMA -20
-15
-10
-5
0
5
10
immunreaktivitás változás %
15
20
A tárolási idő hatása (-20 fokon): szignifikáns különbség a PRA esetében N=36 PRA
RENIN
-32*
7.hét -15,2* 5.hét -9,4* 2.hét
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
koncentráció változás %
0
5
10
Aldoszteron/PRA vagy Aldoszteron/Renin hányados: pontosan definiált preanalitika mellett is módszerfüggő Guideline-2008-1
Guideline-2008-2
Saját kontroll (N=36)
140
hányadosok
120 100 80 60 40 20 0
ALD/PRA
ALD/Renin
Clinical practice guidelines, Endocrine Society Funder et al: JCEM 2008. 93
Az abszolút referencia tartományt torzító komponensek Egyeden Egyedenbelüli belüli== Egyedek között Analitikai
=
=
+ preanalitikai , CVpre Az egészségesnek feltételezett populáció 95%-ára érvényes
-2,5%
-2,5%
„A modern orvosi együttműködésben két veszedelmes résztvevő van, az egyik az a klinikai kémikus, aki keveset tud az orvoslásról, a másik az a gyógyító orvos, aki a laboratóriumi eredmények értékeléséről tud keveset. ” (The American Journal of Digestive Diseases.) „Az értéket teremtő szinergia” kulcsa a klinikai és laboratóriumi és a vért vevő szakemberek kiváló együttműködésében rejlik.
Köszönöm a megtisztelő figyelmet!
