SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA
AZ ELŐREJELZÉS LEHETŐSÉGEI AZ IN VITRO METABOLIZMUS VIZSGÁLATOKBAN
Doktori (Ph.D.) értekezés
DALMADI BALÁZS
Témavezető: Dr. Tihanyi Károly, Ph.D.
Richter Gedeon Rt.
Budapest, 2005
Szigorlati Bizottság: Elnök: Prof. Dr. Tekes Kornélia, Ph.D. Tagok: Dr. Monostory Katalin, Ph.D. Dr. Tóthfalusi László, Ph.D.
Hivatalos bírálók: Dr. Veres Zsuzsa, D.Sc. Dr. Antal István, Ph.D.
2
TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK .......................................................................................................... 3 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE .................................................................................................... 5 1. BEVEZETÉS .................................................................................................................... 7 1.2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ........................................................................................... 9 1.2.1. A gyógyszermetabolizmus és a citokróm P450 enzimrendszer ..................... 9 1.2.2. A CYP katalitikus ciklusa............................................................................. 11 1.2.3. Biomimetikus rendszerek ............................................................................. 13 1.2.4. Nagy áteresztőképpeségű szűrés (HTS) ....................................................... 15 1.2.5. A nitrogén-monoxid szintézis és a citokróm P450 rendszer ........................ 15 1.2.6. Az enzimpolimorfizmus ............................................................................... 16 1.2.7. In vitro metabolizmus vizsgálatok................................................................ 17 1.2.7.1. Az in vitro metabolizmus vizsgálatok modelljei ................................... 19 1.2.7.2. Az enzimkinetika szerepe a metabolizmus-vizsgálatokban .................. 22 1.2.7.3. Kémiai gátlószerek ................................................................................ 25 1.2.7.4. Enzim specifikus gátló ellenanyagok .................................................... 25 1.2.7.5. Index reakció gátlás ............................................................................... 26 1.2.7.6. Korrelációs elemzés............................................................................... 29 1.2.8. A tolperizon .................................................................................................. 29 2. CÉLKITŰZÉSEK ............................................................................................................ 31 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ........................................................................................... 32 3.1. NO DONOR MOLEKULÁK AZONOSÍTÁSA BIOMIMETIKUS ÉS IN VITRO BIOLÓGIAI RENDSZERBEN ............................................................................................................. 32 3.1.1. Anyagok ....................................................................................................... 32 3.1.2. Kémiai-alapú szűrés és automatizálás .......................................................... 32 3.1.3. Az indukált patkány máj mikroszóma készítése és az inkubálási körülmények ........................................................................................................... 33 3.2. A TOLPERIZON IN VITRO METABOLIZMUS VIZSGÁLATA ......................................... 33 3.2.1. Anyagok ....................................................................................................... 33 3.2.2. Az inkubáló elegy összetétele és inkubálási körülmények........................... 34 3.2.3. A tolperizon Clint meghatározása.................................................................. 34 3.2.4. A tolperizon metabolizmus gátlása kémiai gátlószerekkel........................... 35 3.2.5. A tolperizon metabolizmus gátlása ellenanyagokkal. .................................. 36 3.2.6. Rekombináns enzimekkel végzett kísérletek................................................ 37 3.2.7. CYP index reakciók gátlása tolperizonnal ................................................... 37 3.2.8. Kromatográfiás módszerek........................................................................... 38 3.2.9. Az adatok elemzése ...................................................................................... 40 4. EREDMÉNYEK .............................................................................................................. 41 4.1. NO DONOR MOLEKULÁK AZONOSÍTÁSA BIOMIMETIKUS ÉS IN VITRO BIOLÓGIAI RENDSZERBEN ............................................................................................................. 41 4.2. A TOLPERIZON IN VITRO METABOLIZMUS VIZSGÁLATA ......................................... 45
3
4.2.1. A tolperizon intrinzik klirensze humán mikroszómán ................................. 45 4.2.2. A humán mikroszómán képződött metabolitok azonosítása ........................ 46 4.2.3. A tolperizon metabolizmus gátlása kémiai gátlószerekkel........................... 47 4.2.4. Gátló antitestek ............................................................................................. 49 4.2.5. Rekombináns enzimekkel végzett kísérletek................................................ 50 4.2.6. A tolperizon hidroxiláció enzimkinetikai jellemzése ................................... 51 4.2.7. A relatív részvétel becslése a Relatív Aktivitási Faktor (RAF) felhasználásával ...................................................................................................... 54 5. MEGBESZÉLÉS ............................................................................................................. 56 5.1. NO DONOR MOLEKULÁK AZONOSÍTÁSA BIOMIMETIKUS ÉS IN VITRO BIOLÓGIAI RENDSZERBEN ............................................................................................................. 56 5.2. A TOLPERIZON IN VITRO METABOLIZMUS VIZSGÁLATA ......................................... 57 6. KÖVETKEZTETÉSEK ..................................................................................................... 61 7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS.............................................................................................. 63 8. IRODALOMJEGYZÉK ..................................................................................................... 64 9. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE ................................................................................. 74
4
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AA
ammónium-acetát
ABT
1-aminobenztriazol
ADME
abszorpció, disztribúció, metabolizmus, exkréció
BI
1-benzilimidazol
BA
biológiai hasznosíthatóság (bioavailability)
Clint
intrinzik klirensz
CuOOH
kumol-hidroperoxid
CYP
citokróm P450
EM
extenzív metabolizáló
ER
endoplazmatikus retikulum
FeTPPF20
mezo-tetrakisz(pentafluoro-fenil)porfirin-vas(III) klorid
FMO
flavin-monooxigenáz
GC/MS
gázkromatográfia tömegspektrometriás detektálással (gas chromatography/mass spectrometry)
GLP
helyes laboratóriumi gyakorlat (good laboratory practice)
HLM
humán máj mikroszóma (human liver microsomes)
HPLC
nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (high performance liquid chromatography)
HTS
nagy áteresztőképességű szűrés (high throughput screening)
Ig
immunoglobulin
Ki
gátlási állandó
Km
Michaelis állandó
LC/MS
folyadékkromatográfia tömegspektrometriás detektálással (liquid chromatography/mass spectrometry)
MpTS
metil-p-tolil-szulfid
MpTSO
metil-p-tolil-szulfoxid
NADPH
redukált nikotinamid adenin dinukleotid foszfát
NO
nitrogén-monoxid
NHA
N-hidroxiarginin
5
NOS
nitrogén-monoxid szintáz
NSAO
nikotinsav amidoxim
PCR
polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction)
PK
farmakokinetika(i)
PM
lassú metabolizáló (poor metabolizer)
RAF
relatív aktivitási faktor
RLM
patkány máj mikroszóma (rat liver microsomes)
RT
szobahőmérséklet (room temperaturte)
SNP
single nucleotide polimorphism
UDPGT
UDP-glükuronozil transzferáz
Vmax
az enzimreakció maximális sebessége
6
1. BEVEZETÉS A gyógyszeripar napjainkban az egyik legköltségigényesebb iparág. Ez a költségigény abból ered, hogy a majdani gyógyszer bevezetését megelőzően óriási összegeket kell a kutatás-fejlesztésre fordítani úgy, hogy tudjuk: a vizsgált, majd fejlesztésre kiválasztott molekulák jelentős részéből soha nem lesz gyógyszer, tehát soha nem hozza vissza a befektetett pénzt. Ez a kockázat és az egyre élesedő piaci verseny teremti meg az igényt, hogy a kutatás-fejlesztés minél korábbi szakaszában rendelkezzünk olyan adatokkal, amelyek segítségével a molekula tulajdonságai, viselkedése a későbbi fejlesztési fázisokban és a klinikai kipróbálás során megjósolhatók. A gyógyszerfejlesztés során a legfontosabb feladat, hogy egy új molekuláról eldöntsük: hatékony-e és biztonságos-e. A hatékonyság elengedhetetlen feltétele a megfelelő mértékű gyógyszerhatásnak, míg a biztonsági vizsgálatok az esetleges mellékhatások jellemzését és minimalizálását célozzák. Természetesen a két tényező nem független egymástól, hiszen minél hatékonyabb egy molekula, annál kisebb dózis elegendő a kívánt hatás eléréséhez és ezáltal természetesen a nem-mechanizmus alapú mellékhatásprofil is változik, csökken a kockázat. A farmakokinetikai (PK) és metabolizmus vizsgálatok részét képezik mind a hatékonysági, mind a biztonsági vizsgálatoknak, hiszen egy gyógyszer csak akkor képes a hatását kifejteni, ha eljutott a célterületre, tehát nem ürült ki, nem bomlott el, nem metabolizálódott a kelleténél gyorsabban. Másrészt e vizsgálatok alkalmasak arra, hogy a gyógyszerjelölt kinetikai interakciós tulajdonságait megbecsüljük, ezáltal e kölcsönhatásokból eredő mellékhatásokat és kockázatokat előrejelezzük. Ezekben a vizsgálatokban in vivo állatmodellek segítségével és in vitro módszerekkel kívánjuk jellemezni az adott gyógyszer/jelölt/ tulajdonságait. Az in vivo kísérletek sajnos nagyon munka- és időigényesek, valamint nem hagyhatók figyelmen kívül az állatvédelmietikai okok sem, ezért a gyógyszeriparban egyre érezhetőbb a törekvés az in vitro módszerek használatára. E módszerek segítségével szöveteken, sejteken, sejtfrakciókon [1, 2] vizsgálják a molekula sajátságait. Előnyük, hogy munka- és költséghatékonyak, valamint az emberi szövetek, sejtek hozzáférhetősége miatt lehetőség van közvetlenül
7
modellezni az emberi szervezetben zajló folyamatokat. A kísérletek általában nem GLP (good laboratory practice) körülmények között folynak, de egyre inkább elterjednek a konszenzuson alapuló módszerek, ez által növelve e kísérletek megbízhatóságát [3,4]. A gyógyszeriparban napjainkra egyre inkább elterjedt az a megközelítés, hogy a nagyszámú molekula szintézisét követő nagy áteresztőképességű szűréssel (High Throughput Screening, HTS) próbálják kiválasztani azt a molekula szerkezetet, amely potenciálisan egy új gyógyszer szerkezeti alapja lehet. A molekulák szintézise ezért gyakran nem a klasszikus módon, hanem úgynevezett kombinatorikus kémiai módszerekkel történik. A módszert alkalmazva lehetőség van rá, hogy rövid idő alatt nagyszámú molekulaváltozat álljon rendelkezésre olyan módon, hogy a további szűrést is
a
HTS
rendszerben
lehessen
elvégezni,
amennyiben
a
megfelelő
automatizált/robotizált háttér és az alkalmas, validált teszt rendelkezésre áll. Természetesen a szűrés elvégezhető úgy is, hogy a külön-külön szintetizált molekulákat egyenként visszük fel a lemez lyukaira és már csak a kérdéses szűrőtesztet végezzük ezen a platformon. A HTS egyszerű és robusztus technikákat igényel, amelyek mind kémcsőben, mind a HTS rendszerben elterjedt különböző lyukszámú (96-384 stb.) lemezen (well plate) megbízhatóan alkalmazhatók. Ennek a törekvésnek tettünk eleget, amikor NO-donor sajátosságra szűrtük a Richter Gedeon RT. vegyülettárából származó molekulákat egy biomimetikus, tehát enzimfehérjét nem tartalmazó, tisztán kémiai rendszer segítségével. Rendszerünk a CYP enzimek által végzett NO-termelést modellezte, az eredményeket mikroszomális frakció felhasználásával igazoltuk. Mind az in vitro metabolizmus, mind a biomimetikus rendszerekben végzett kísérletek modellként szolgálnak egy nagyobb, bonyolultabb rendszer vizsgálatához. Éppen ezért szem előtt kell tartanunk azokat a lehetőségeket és korlátokat, amelyek e modellrendszereken nyert adataink kiterjesztését megszabják. A végső kérdés a gyógyszerkutatásban az in vitro megközelítések alkalmazásakor persze mindig az, hogy mennyire jelzi előre a módszerünk az élő szervezetben zajló történéseket. Dolgozatomban e modelleknek két szintjét vizsgáltam egy-egy példán keresztül. Az első a már említett kémiai-biomimetikus szint: e kísérleteinkkel a májban lévő CYP enzimek katalitikus ciklusát, pontosabban e ciklus ún. peroxid sönt alternatív reakcióútját próbáltuk modellezni. A modellalkotás következő, biokémiai-biológiai szintjén a máj metabolizáló kapacitásáért döntő részben felelős mikroszomális
8
enzimeket használtunk annak megállapítására, hogy a tolperizon – egy központi támadáspontú izomrelaxáns - milyen mértékben és mely enzimek hozzájárulásával metabolizálódik. Ez valójában egy retrospektív vizsgálat volt, hiszen a szakirodalomból ismert, hogy a tolperizon biológiai hasznosíthatósága viszonylag alacsony [5], valamint a
farmakokinetikai
paraméterek
nagy
egyedek
közötti
eltérést
mutatnak.
Kísérleteinkben ezen in vivo jelenségekre kerestünk magyarázatot in vitro technikákkal, továbbá alkalmaztunk egy meglehetősen új módszert, a relatív részvétel becslését a résztvevő CYP enzimek hozzájárulásának előrejelzésére.
1.2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.2.1. A gyógyszermetabolizmus és a citokróm P450 enzimrendszer
A szervezetbe kerülő testidegen anyagok (xenobiotikumok) zömmel apoláros jellegű, lipidoldékony molekulák [ 6 ]. A szervezet ezen anyagoktól igyekszik megszabadulni, ezért olyan enzimatikus átalakításoknak veti alá azokat, amelyek során az eredetileg apoláros molekulák polárosabbá válnak, ezáltal a testnedvekkel való kiürülésük
nagyságrendekkel
felgyorsul.
A
biotranszformációs
folyamatokat
hagyományosan két nagy fázisra osztjuk: az I. Fázis reakciói zömmel oxidatív átalakulások, amelyek növelik a molekula vízoldhatóságát a polaritást növelő funkciós csoport - leggyakrabban hidroxilcsoport - kialakításával, vagy dealkilálással. A II. Fázis reakciói során az így beépült, vagy a már eleve jelen lévő funkciós csoportok révén a xenobiotikumok
konjugálódnak
valamilyen
endogén,
poláros
kismolekulával
(glükuronid, szulfát, glutation). Az így kialakult konjugátum kiválasztása jelentősen felgyorsul. Meg kell jegyezni, hogy az I. Fázis reakciói nem feltétlenül szüntetik meg a gyógyszerhatást: gyakran előfordul, hogy farmakológiailag aktív, esetleg toxikus metabolit képződik. Ezzel szemben a II. Fázis enzimatikus átalakításai az esetek döntő többségében a hatás erős csökkenését vagy megszűnését eredményezik [7]. Az I. és II. Fázis enzimei és reakciói viszonylag régóta ismertek, szerepük a gyógyszermetabolizmusban
többé-kevésbé
tisztázott.
Számos
vegyület
farmakokinetikai viselkedését azonban nem lehetett az ismert résztvevőkkel és mechanizmusokkal megmagyarázni. A sejt- és molekuláris biológiai kutatások
9
derítettek fényt a transzporter fehérjék fontosságára: ezek a karrier molekulák mind az endogén anyagok, mind a xenobiotikumok transzportjában szerepet játszanak és működésükkel jelentősen képesek befolyásolni egy adott gyógyszermolekula ADME (felszívódás, megoszlás, metabolizmus, kiválasztás) tulajdonságait. A rendszert a szakirodalomban III. Fázisnak is nevezik, utalva az első két Fáziséval megegyező jelentőségére. A
gyógyszermetabolizmus
legfontosabb
és
legjobban
tanulmányozott
enzimrendszere a citokróm P450 (CYP) rendszer. A CYP-ek a hem-tiolát enzimek családjába tartoznak, az élővilág mind az öt birodalmában (archebaktériumok, prokarióták, gombák, növények, állatok) megtalálhatók [8]. Emlősökben szinte minden szövetben jelen vannak, de legnagyobb mennyiségben a májban, a májsejtek endoplazmatikus retikulumában (ER) mutathatók ki [9]. A máj, mint fő metabolizáló szerv mellett másodlagos, de farmakokinetikailag mégis jelentős lehet a bél, a vese, a tüdő és a placenta metabolizáló kapacitása is. A kísérletekhez szükséges enzimek legnagyobb mennyiségben májsejtekből, differenciálcentrifugálással preparálhatók: az ily módon előállított mikroszóma frakció a májsejt ER-át és az abban lévő enzimeket tartalmazza. A CYP enzimekről szóló első közlemények 1958-ban jelentek meg [10,11], az elnevezés azonban csak később született meg, utalva a redukált pigment CO-dal alkotott komplexének 450 nm-nél mérhető elnyelési maximumára a differencia spektrumban [12,13]. A kutatások kezdetén úgy gondolták, hogy egyetlen citokrómról van szó, de hamarosan bebizonyosodott, hogy az enzim több változatban létezik: ma az osztályozás az egyes izoformák közötti homológia mértéke alapján történik [ 14 , 15 ]. 40%-nál nagyobb aminosavszekvencia-homológia esetén azonos családba, 60%-nál nagyobb homológia esetén azonos alcsaládba soroljuk őket. A családok jelölése arab számmal (pl. CYP1, CYP2 stb), az alcsaládoké betűvel történik (pl. CYP1A, CYP2B stb.). Az egyedi enzimeket a betű utáni számmmal különböztetjük meg (pl. CYP1A1, CYP1A2, stb). A gyógyszermetabolizmusban a CYP1, CYP2 és CYP3 család enzimei vesznek részt, a többi család tagjai endogén folyamatokat katalizálnak (szteroid bioszintézis, zsírsav- és arachidonsav-anyagcsere) [14, 16]. Az 1. táblázat a gyógyszermetabolizmusban fontos szerepet játszó CYP-ek relatív mennyiségét és részvételük arányát mutatja:
10
Relatív mennyiség a
Relatív részvétel a
májban
gyógyszermetabolizmusban
(%)
(%)
<1 13 4 <1 18 1 2,5 7 28
2,5 8,2 2,5 3,4 15,8 8,3 18,8 4,1 34,1
CYP1A1 CYP1A2 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8, CYP2C9 CYP2C18, CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP3A4, CYP3A5
1. táblázat. A gyógyszermetabolizmusban szerepet játszó CYP enzimek relatív mennyisége és a gyógyszermetabolizmusban betöltött szerepe. Az adatok hozzávetőleges értékek [17].
A farmakokinetikai és gyógyszerinterakciós szempontból szerepet játszó enzimcsaládok jelenleg 18 azonosított tagja közül is csupán 5-6 játszik igazán fontos szerepet a gyógyszermetabolizmusban (CYP3A4, CYP2D6, CYP2C8/9, CYP2C19, CYP1A2). A fenti táblázatből kitűnik továbbá, hogy míg bizonyos enzimek relatív mennyisége jól tükrözi jelentőségüket az ismert gyógyszerek metabolizmusában (pl. CYP1A2, CYP2C8 és 2C9, CYP3A4) addig pl. a CYP2D6 mennyisége elenyésző a fontosságához viszonyítva. Hozzá kell tenni azonban, hogy míg az egyes izoenzimek relatív mennyiségét illetően konszenzus van az irodalomban, addig a relatív részvétel mértéke még élénk vita tárgya [14].
1.2.2. A CYP katalitikus ciklusa
A dolgozatban tárgyalt biomimetikus rendszerek jobb megértéséhez szükséges röviden szólni a CYP enzimek katalitikus ciklusáról (1. ábra).
11
RH Fe3+ RH
Fe3+
ROH
peroxid − sönt
e− XO
( Fe − O) 3+ RH
X
Fe 2+ RH O2
H 2O
2H +
Fe3+ − O22− RH
Fe3+ − O2− RH e−
1. ábra. A CYP enzimek katalitikus ciklusa.
A ciklus elején a központi vas III-as oxidációs állapotban megköti a szubsztrátot, majd egy elektron felvételével II-es oxidációs állapotba kerül. Ebben az állapotban kötődik a hemhez az O2 molekula, majd még egy e- és egy H+, amelyek a NADPH-ról származnak a NADPH-P450 reduktáz enzim közreműködésével. Ebben az aktivált állapotban zajlik le a szubsztrát oxidációja. A korábban belépő O2 másik atomja egy vízmolekulaként távozik a rendszerből. Ezt követően az oxidált termék leválik az enzimről és az enzim visszakerül alapállapotba, a ciklus elejére. A szubsztrát oxidációja végbemehet az ún. peroxid sönt útvonalon is, amelynek során a reakció nem fut végig a teljes cikluson: ebben az esetben a szubsztrát oxidálásához peroxidokat használ az enzim oxigén és edonorként.
A
laboratóriumi
gyakorlatban
e
katalitikus
reakció
oxigén
és
elektrondonoraként kumol-hidroperoxidot alkalmaznak [ 18 , 19 , 20 ]. A szubsztrát oxidáció e mechanizmusa ugyan kevéssé hatékony reakció, mégis jó modellje a CYP
12
katalízisnek, mivel nem befolyásolja a reduktázról történő elektrontranszfer sebességmeghatározó lépése. 1.2.3. Biomimetikus rendszerek Szintetikus metalloporfirinek napjainkban igen elterjedtek a különböző biológiai oxidációs reakciók modellezésében [21,22], mind a kutatásban, mind az ipari célú felhasználásban. Ez utóbbi területen olyan vegyületeket fejlesztenek, amelyek képesek bizonyos sztereo-, vagy regioszelektív oxidációs reakciókra, illetve alkalmasak bizonyos szennyező anyagok elbontására [23,24,25,26,27]. E biomimetikus modell rendszerek számos előnnyel bírnak, akár a biológiai alapú in vitro technikákhoz képest is [28]:
a reakciók általában jól kézbentarthatók, robusztusak
a metabolitok nagy mennyiségben állíthatók elő, így lehetőség nyílik azok tisztítására és további vizsgálatára
kevésbé érintik a biológiai modellek inherens bizonytalanságai (pl változó enzimaktivitás, sejt életképesség)
A CYP enzimek modellezésének szempontjából a biomimetikus rendszerek két nagy családját különböztetjük meg: az első rendszerben a metalloporfirin rész vasat, mangánt vagy krómot tartalmaz, oxigén donoroként pedig leggyakrabban H2O2-t, mklórperbenzoesavat, jodozilbenzolt, NaOCl-ot, perjodátokat alkalmaznak. Az így létrehozott rendszer a citokróm P450 peroxid sönt mechanizmusához hasonló katalitikus viselkedést mutat [29, 30, 31, 32]. A másik típusú rendszer metalloporfirint, molekuláris oxigént és redukálószert (pl. NaBH4, aszkorbinsav, Zn(Hg), kolloidális Pt/H2) tartalmaz: működése a citokróm P450 enzim teljes ciklusát modellezi. A szintetikus metalloporfirinek működési sémája a 2. ábrán látható.
13
Oxidálószer O N
N FeIV .+
N N Fe III N
N X vagy
N
O
N
N
N Fe IV
N
N
Oxidatív termék(ek)
Szubsztrát
2. ábra.
A szintetikus vas-porfirinek működési mechanizmusa [27].
Az alapállapotú, +3 oxidációs állapotú központi fématommal rendelkező metalloporfirin, a fentiekben leírt oxidálószer, illetve oxidatív rendszer hatására reaktív, magas oxidációs állapotú oxo-metalloporfirinné alakul [27, 33 , 34 ]. Ez a reaktív termék oxidálja a rendszerben található szubsztrátot, miközben maga alapállapotba kerül. A
szintetikus
metalloporfirineket
széles
körben
alkalmazzák
a
gyógyszermolekulák és növényvédőszerek (pl. fenciklidin [ 35 ], nikotin [ 36 ], acetaminophen [37], tiagabin [38], lidokain [39], karbofurán [40]) metabolizmusának tanulmányozására és modellezésére, nagy mennyiségű metabolit termelésére. Igen érdekes példája a CYP-en keresztül, a peroxid sönt útvonalon zajló, H2O2-mediált oxidációs reakció tanulmányozásának az a kísérlet, amelyben laboratóriumi evolúciós rendszert állítanak össze a CYP-mediált naftalin hidroxiláció modellezésére. A P450cam enzimet mutációs PCR-nek (polimeráz láncreakció) vetik alá és az egyes változatokat expresszálják, majd a szubsztrát hozzáadásával tesztelik, hogy okozott-e javulást a mutáció a hidroxilációs lépés hatékonyságában [41].
14
1.2.4. Nagy áteresztőképpeségű szűrés (HTS) Az eredeti gyógyszerkutatásban az egyik legfontosabb tényező az idő: a molekuláris célpont (target) azonosítását követően a lehető leghamarabb rendelkezésre kell, hogy álljon az a vezérmolekula, amelyből a későbbi hatóanyag kifejleszthető, ellenkező esetben versenyhátrányba kerülünk és az adott témával ekkor már nem érdemes foglalkozni [42]. Természetesen a vezérmolekula még számos optimalizálási lépésen kell, hogy átessen a fejlesztési kandidátussá történő kiválasztásig. A kiválasztás hatékonysága
jelentősen
növelhető,
ha
megfelelő
méretű
és
diverzitású
molekulakönyvtár nagyteljesítményű szűrését valósítjuk meg, vagyis HTS módszert alkalmazunk. Ehez megfelelő automatizált és robotizált technológia és HTS-re kifejlesztett miniatürizált tesztrendszerek szükségesek. A tesztrendszerek fejlesztésének egyik lehetősége a már meglévő farmakológiai eljárás miniatürizálása és adaptálása az automatizált platformra. A másik lehetőség, hogy alapjaiban új, a HTS szempontjait figyelembe vevő módszert dolgozunk ki. E tesztek megfelelően robusztusak és megbízhatóan működnek 96/384 stb. lyukú tesztlemezeken is. A HTS eredménye a találat: ez olyan molekula, amely a vizsgált teszben a kívánt koncentrációban aktivitást mutat és ismert a szerkezete. A találatok kémiai szerkezetének optimalizálásával jutunk el a vezérmolekulához, amely alapja lehet egy új gyógyszerkutatási programnak [42].
1.2.5. A nitrogén-monoxid szintézis és a citokróm P450 rendszer
A nitrogén-monoxid (NO) szerepe az élő szervezetben szerteágazó: fontos szignálmolekula a sejtek közötti kommunikációban, az ideg-, kardiovaszkuláris-, izom-, és immunrendszerben egyaránt [43 ]. Termelődéséért a nitrogén monoxid szintázok (NOS) felelősek, amelyek a CYP-ekhez hasonlóan szintén hemoproteinek. Ezen enzimeknek 4 izoformája ismert, amelyből 3 konstitutív (neuronális nNOS, endoteliális eNOS és mitokondriális mtNOS) és egy citokinek által indukálható (iNOS). A NOS enzimek egy 5-elektronos oxidációs folyamatban oxidálják az arginint citrullinná és NO-dá, N-hidroxiarginin (NHA) köztiterméken keresztül (3. ábra). A reakció, a CYPekhez hasonlóan itt is NADPH-t és O2-t igényel. E kétlépéses folyamat első lépése a CYP enzimek teljes ciklusának megfelelő mechanizmus szerint zajlik, míg a második
15
lépés nem teljesen tisztázott, de feltételezik, hogy a NHA-ból történő NO képződés a CYP-ek peroxid sönt mechanizmusa szerint megy végbe [44, 45]. OH H2N
+
HN
NH2 NH
NADP+ NADPH
+
NH2 NH
0,5 NADP+ 0,5 NADPH
H2N
O NH
+ 0,5 H + O2
O2 +
H3N
COO-
L-Arginin
NO
+
H2O
+
H3N
COO-
H2O
N-Hidroxi-Arginin (NHA)
+
H3N
COO-
Citrullin (CIT)
3. ábra.
A NO bioszintézise [27].
1.2.6. Az enzimpolimorfizmus
Az enzimek és ezáltal a reakcióutak diverzitását tovább növeli a polimorfizmus, amelynek eredményeképpen az adott populációban egy adott gén és ebből kifolyólag az adott fehérje különböző változatokban van jelen. A polimorfizmus lehet ún. SNP (single nucleotide polimorphism), amikor egy nukleotidcsere vagy úgynevezett frameshift történik. A megváltozott triplet gyakran más aminosavat kódol, tehát az eredeti aminosav
kicserélődik,
ezáltal
kevésbé
aktív
vagy
teljesen
inaktív
fehérje
expresszálódik [46]. A polimorfizmus megvalósulhat úgy is, hogy az adott enzimet kódoló gén hiányzik (deléció) vagy több kópiaszámban van jelen a genomban. A fenotípusban az SNP és a deléció általában az adott izoenzim csökkent működését vagy a működés teljes hiányát okozza, míg a génsokszorozódás eredménye az átírt enzim mennyiségének növekedése és ezáltal a megfelelő szubsztrátok gyorsabb eliminációja. A klinikai kép alapján nevezzük el az adott genotípusú populációkat gyors (extenzív) metabolizálóknak (EM), gyenge (poor) metabolizálóknak (PM) és ultragyors metabolizálónak (UM). Az extenzív metabolizálók jelentik az ún „vad típust”, mivel a DNS szekvenciában bekövetkező változás rendszerint az aktivitás csökkenésével jár; a PM fenotípusú egyedekben a csökkent működés oka leggyakrabban a mutáció, a rossz
16
„splicing” vagy a teljes génhiány. Az ultragyors metabolizálókban az adott enzimet kódoló szekvencia több kópiában fordul elő: ez fokozott expressziót eredményez, tehát ezekben az egyénekben megnövekedett enzimmennyiséggel kell számolnunk. Természetesen ezek a genomot érintő változások heterozigóta formában is jelen vannak a populációban: a szakirodalom „intermediate metabolizer”-nek (IM) nevezi ezt a csoportot: a mért enzimaktivitás-értékek a PM és az EM csoport értékei közé esnek. A gyógyszermetabolizmusban szerepet játszó enzimek legtöbbje polimorf formában van jelen a populációban (pl. CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, flavin-monooxigenáz (FMO), N-acetiltranszferáz, glutation S-transzferáz, UDPglukuronozil-transzferáz, P-glikoprotein, stb.) [46]. Az EM és PM fenotípus aránya enzimenként és rasszonként változik: pl. az egyik legfontosabb, polimorf enzim, a CYP2D6 esetében a kaukázusi populáció 5-10%-a PM fenotípusú, míg az ázsiai populációnak csupán 1-2 %-a érintett. A CYP2C19 esetében a kaukázusi populáció 35% -a míg az ázsiai 20 %-a tekinthető PM fenotípusúnak [47]. Az enzimpolimorfizmus vizsgálata a gyógyszerfejlesztés során azért fontos, mert a nagymértékben polimorf metabolizmust szenvedő molekulák PK paraméterei nagyon nagy variabilitást mutatnak. Egyrészt a PM fenotípusú egyedekben mérhető emelkedett gyógyszerkoncentráció
toxikológiai
problémákhoz
vezethet,
másrészt
az
EM
egyedekben a gyógyszerszint esetleg el sem éri a terápiás koncentrációt. Ez a tény már a klinikai kipróbálás során megnehezíti a gyógyszeradagolást, éppen ezért a sikeres klinikai vizsgálatokhoz előzetesen genotipizált populációt kell beválogatni, valamint a terápiás gyógyszermonitorozás (therapeutic drug monitoring, TDM) is szükséges lehet.
1.2.7. In vitro metabolizmus vizsgálatok A gyógyszerjelöltek ADME/PK tulajdonságait célszerű a kutatás-fejlesztés minél korábbi szakaszában földeríteni, mivel ezen az alapon (pl. metabolikus stabilitás, enzimgátlás) hatékony szűrés valósítható meg. Ezt támasztja alá az a tény, hogy a klinikai kipróbálás során sikertelennek bizonyuló molekulák kb. 30 %-a a rossz ADME/PK, illetve biofarmáciai tulajdonságok miatt esik ki a fejlesztésből [48,49]. Az
17
in vitro metabolizmus vizsgálatoknak számos előnyük van az in vivo kisérletekkel szemben: •
Munka- és költséghatékonyabbak
•
Kevesebb élő állatra van szükség
•
Humán sejteken és sejtfrakciókon is végezhetők kísérletek
Ez utóbbi különösen fontos tényező, hiszen a kísérleti állat és az ember metabolikus útvonalai nagymértékben eltérhetnek egymástól mind mennyiségi, mind minőségi szempontból. Ezért az emberi eredetű sejteken illetve sejtfrakciókon (pl mikroszóma) végzett
kísérletek
adataiból
–
megfelelő
kiterjesztési
(„scaling”)
módszerek
alkalmazásával - közvetlenül jósolhatók a klinikai történések. E módszereknek igen kiterjedt és exponenciálisan bővülő irodalma van, bár bizonyos területeken (pl. gyógyszerinterakciók) a tudományos közvélemény megosztott az előrejelzések használhatóságát illetően [50]. Az ADME szempontból ideális gyógyszerjelölt az alábbi tulajdonságokkal kell, hogy rendelkezzen: •
Jó oldhatóság
•
Lineáris farmakokinetika
•
Több eliminációs út ¾ az anyavegyület kiválasztása a vesén keresztül ¾ az anyavegyület kiválasztása az epével ¾ kevés, farmakológiailag inaktív metabolit
•
az oxidatív metabolizmusban több CYP enzim vesz részt
•
a metabolizmus nem kizárólag polimorf CYP enzimek részvételével zajlik
•
nincs kémiailag reaktív metabolit
•
a metabolizáló enzimeket és a transzportereket nem vagy csak gyengén gátolja vagy indukálja
•
Kis mértékű „first pass” metabolizmus
•
Széles terápiás index
Az in vitro metabolizmus vizsgálatoknak három fő területe van: 1. az enzimgátlás és ezen keresztül a gyógyszerinterakciók becslése,
18
2. a metabolikus stabilitás mérése, metabolikus útvonalak, metabolitok és a metabolizmusban részt vevő enzimek - enzimprofil - meghatározása 3. enzimindukció vizsgálata Természetesen a három terület elválása nem ilyen éles, hiszen pl. az index reakciók gátlásával kapott eredmények nem csak a gyógyszerinterakciós potenciált jósolják, hanem a metabolizmusban szerepet játszó CYP enzimek relatív részvételét is előrejelzik. Ez a három fő irány jellemző a kísérleti oldalon, a modellek szintjén is: az enzimgátlás meghatározására
elsősorban
mikroszómát
használnak
[57],
a
metabolizmus
vizsgálatokban a mikroszóma mellett a májsejtek is jelentős szerepet kapnak, az indukciós vizsgálatok pedig értelemszerűen élő sejteket, elsősorban primer májsejteket igényelnek [51, 52]. Az egyes területek jelentősége a későbbi klinikai történések, az esetleges gyógyszerinterakciók szempontjából nem egyforma: sokkal nagyobb súllyal esik latba az enzimgátlás okozta interakció, mint az indukció eredményeként létrejött kölcsönhatások. Ennek oka, hogy míg az indukció létrejöttéhez órák-napok kellenek, addig
az
enzimgátlás
sokkal
rövidebb
idő
alatt
kialakul,
és
súlyosabb
következményekkel jár. Az enzimprofil meghatározása szintén fontos része a preklinikai metabolizmusvizsgálatoknak. Egyrészt kimutatja a polimorf enzimek részvételét a metabolizmusban és ezáltal lehetőséget ad mind a farmakokinetikai paraméterek, mind az ebből következő gyógyszerkölcsönhatások becslésére. Másrészt – ismerve a biotranszfomációban résztvevő enzimeket – lehetőség van az esetleges enzimgátlás meghatározására. A szakirodalomban „reaction phenotyping” vagy „enzyme mapping” néven említik azt az összetett folyamatot, amelynek során meghatározzák, hogy mely metabolizáló enzimek vesznek részt egy adott gyógyszer(jelölt) átalakításában [14].
1.2.7.1. Az in vitro metabolizmus vizsgálatok modelljei Az in vitro metabolizmus vizsgálatokat leggyakrabban a máj oxidatív metabolizáló kapacitásáért döntő részben felelős ER frakción végezzük, amelyet a májsejtből történt preparálás – centrifugálás – után mikroszómának nevezünk [57]. Ez valójában az ER membránt tartalmazó vezikulumokból áll, amelyek a CYP enzimeket, az FMO-t és a II fázis enzimei közül az UDPGT-t tartalmazzák. A mikroszóma előnye a
19
könnyű preparálhatóság és az, hogy az enzimek - -80 ºC-on tárolva – hosszú ideig megőrzik aktivitásukat. Egyszerre nagyobb mennyiséget készíthetünk belőle, így lehetőség van egy hosszabb vizsgálatsorozatot is elvégezni ugyanazzal az sarzzsal. Mivel az egyes enzimek aktivitása egyénenként változik, gyakran használunk több donorból származó ún. mikroszóma pool-t. Ezáltal az egyedi különbségek kiegyenlítődnek, megfelelően sok egyedből összegyűjtött mikroszóma preparátum jól reprezentálja a populáció átlagára jellemző metabolikus történéseket. További előnye, hogy a NADPH-P450 reduktáz/CYP arány, a citokróm b5 mennyisége, továbbá a lipidösszetétel megegyezik az intakt májban lévő értékekkel. A mikroszómán alapuló in
vitro módszerek széles körben elterjedtek, sőt napjainkban egyre több közlemény jelenik meg, amelyben konszenzuson alapuló technikákat javasolnak az adatok megbízhatósága és laboratóriumok közötti összehasonlíthatósága érdekében [3]. Szintén ER membránból állnak, tehát mikroszómának tekintendők a rekombináns enzimeket tartalmazó preparátumok. Ezeket úgy állítják elő, hogy az adott enzimet kódoló szekvenciát klónozzák és cDNS-ként beépítik egy vektorba (pl. baculovírus), amely vektor a gazdasejtbe – baktérium-, élesztő-, emlős-, esetünkben rovarsejt – jutva a hordozott szekvenciát a gazdagenomba építi, ahonnan az kifejeződik . Nagy előnyük e modelleknek, hogy elkülönítve expresszálják az egyes CYP izoenzimeket, éppen ezért nem szükséges specifikus index szubszrát a mérésekhez. Hátrányuk, hogy a már említett NADPH-P450 reduktáz/CYP és citokróm b5/CYP arány változó és jelentősen eltérhet a máj mikroszóma megfelelő értékeitől, ami megváltozott átviteli számot (Vmax-ot) eredményezhet, NHA a Km érték a mikroszóma adott izoenzimje és a rekombináns CYP között általában hasonló. Ez utóbbi kitétel csak abban az esetben igaz, ha a mikroszómán is csak egy izoenzim vesz részt az adott metabolikus átalakításban [14]. Éppen ezért egy egyszerű, rekombináns enzimekkel végzett kísérlet nem ad választ arra a kérdésre, hogy milyen mértékben bontja az adott enzim a tesztvegyületet, valamint, hogy az enzimek egymáshoz viszonyított kapacitása ténylegesen milyen; csupán azt mondja meg, hogy egyáltalán részt vesz-e a kérdéses enzim a metabolizmusban.
Ahhoz, hogy fiziológiásan is releváns mennyiségi
adatokhoz jussunk úgynevezett „kiterjesztési” (scaling) módszereket kell alkalmaznunk. Ezek a módszerek az adott izoenzim mennyiségi vagy aktivitási arányát veszik alapul a rekombináns preparátumban, illetve a mikroszómában és ezzel az arányszámmal (RAF)
20
korrigálják a rekombináns rendszerben nyert adatokat [53, 54]. Az irodalom azonban inkább az utóbbi, tehát az aktivitás alapú RAF számolást fogadja el, mivel ez tükrözi a tényleges kapacitás arányt a metabolizmusban az expresszált enzim és a mikroszóma között [55]. Kevésbé elterjedtek, de említést érdemelnek a tisztított, rekonstituált enzimek, amelyek legfőbb előnye az egyszerű használat, a könnyű kezelhetőség [14]. E preparátumokat úgy készítik, hogy a tisztított CYP enzimeket megfelelő arányban keverik a NADPHP450 reduktázzal és a citokróm b5-tel. Hátrányuk, hogy nem minden enzim hozzáférhető
tisztított
formában,
valamint
a
rekonstituálás
sem
mindig
reprodukálhatóan történik. Az említett enzim alapú modellek mellett a vizsgálatok másik nagy csoportját a sejt alapú modellek jelentik. Ezek a frissen preparált vagy mélyfagyasztott májsejtek és a májszeletek. Számos előnyük mellett – pl. teljes metabolikus enzimkészlet rendelkezésre áll – hátrányuk, hogy az enzimaktivitások jelentősen változhatnak a sejtkultúra körülményeitől függően, valamint, hogy egyéb tényezők, pl. a tesztanyag sejtekbe való bekerülésének módja jelentősen befolyásolhatják egy adott molekula enzimkinetikai tulajdonságait. Éppen ezért az enzimgátlás mértékének megállípítására kevésbé használatosak, inkább a metabolikus profil térképezésére és a metabolikus stabilitás számítására alkalmasak. Természetesen az enzimindukciós vizsgálatok – mivel az indukció során a sejt teljes transzkripciós-transzlációs apparátusára szükség van - csak élő májsejteken végezhetők, erre a mikroszóma nem alkalmas.
21
1.2.7.2. Az enzimkinetika szerepe a metabolizmus-vizsgálatokban A gyógyszermetabolizmus in vitro tanulmányozása során a biotranszformáció jellemzésére gyakran használjuk az enzimkinetikai paramétereket [56]. E paramétereket a klasszikus enzimkinetikai analízisnek megfelelően növekvő szubsztrátkoncentráció mellett mért reakciósebességek ábrázolása után kapjuk, egy adott biotranszformációs útvonalon. Fontos tényező, hogy a reakció lineáris legyen mind az idő, mind a fehérjekoncentráció függvényében, valamint, hogy a szubsztrátfogyás ne haladja meg a 10 %-ot [14]. Meg kell azonban jegyezni, hogy mivel a mikroszomális közeg nem csak egy enzimet tartalmaz, tehát a tesztanyagunk több enzim által is metabolizálódhat többféle kinetikával, továbbá maguk a metabolitok is egy konszekutív lépés szubsztrátjai lehetnek, az ideális feltételeket gyakran nehéz teljesíteni. További korlátot jelent az analitika, vagyis, hogy az enzimreakció lineáris tartományában esetleg detektálhatatlanul kevés metabolit képződik. Az in vitro enzimkinetikai mérés tehát leggyakrabban kompromisszum eredménye, de természetesen a vezérelv mindezek mellett is a linearitásra való törekvés. A legegyszerűbb esetet feltételezve a szubsztrát metabolizmusáért egy enzim felel: ebben az esetben a reakció leírható a MichaelisMenten egyenlettel :
v =
Vmax ⋅ [S ] Km + [S ]
(1)
amelyben v az aktuális reakciósebesség, [S] a szubsztrátkoncentráció, Vmax az enzimreakció maximális sebessége és Km a Michaelis-állandó, vagyis az a szubsztrátkoncentráció, ahol a reakció sebessége Vmax/2 [57]. Az „egy enzim”-modellt igazolhatjuk az ún. Eadie-Hofstee ábrázolással, ahol az x tengelyen a v/[S] (reakciósebesség/szubsztrátkoncentráció) arányt, az y tengelyen a v-t ábrázoljuk. Amennyiben egy egyenest kapunk, valószínűsíthetjük, hogy az adott metabolit termelésért egy enzim a felelős (4. ábra, A és B). Ez az ún. egyfázisú kinetika nem jelenti feltétlenül azt, hogy csupán egy CYP enzim vesz részt a folyamatban. Ha a résztvevő enzimek hasonló kinetikai paraméterekkel bírnak, az egyes komponensek nem válnak szét az ábrázolás szintjén, vagyis úgy tűnik, mintha egyfázisú kinetikával működne az enzimreakció, mint a citaloprám [58] és a zolpidem [59] esetében.
22
v
v
[S]
v
v/[S]
C
v
D
[S]
v
v/[S]
E
v
F
[S] v
v/[S]
G
v
[S]
H
v/[S]
4. ábra. Az enzimkinetikai adatok Michaelis - Menten (A, C, E, G) és Eadie-Hofstee (B, D, F, H) ábrázolása. Az A és B ábra az egy enzim részvételét leíró kinetikát, a C és D ábra a két-enzim kinetikát, a E és F ábra a szubsztrátgátlás kinetikáját, a G és H ábra az allosztérikus aktiváció kinetikáját mutatja [57]. v: reakciósebesség, [S]: szubsztrátkoncentráció.
23
Leggyakrabban azonban az Eadie-Hofstee grafikon pontjai nem esnek egy egyenesbe: ilyenkor a görbe alakjának vizsgálata a különböző enzimkinetikai jellegzetességekre világíthat rá (4. ábra) [57]. Az egyszerű Michaelis-Menten összefüggéstől való eltérés oka lehet, hogy az enzim aktív helyén több szubsztrátkötő régió is található. Ezek a kötőhelyek befolyásolhatják egymás működését: az ún. szubsztrátgátlás esetén a nagy szubsztrátkoncentráció az enzimaktivitás csökkenéséhez vezet (4. ábra. E-F). Az allosztérikus aktivációnál a növekvő szubsztrátkoncentráció egy bizonyos küszöbérték fölött az enzim fokozott működését eredményezi. Így jön létre a jellegzetes S alakú görbe a Michaelis-Menten ábrázoláson. (4. ábra. G-H) [60]. A CYP3A4-ről közismert, hogy több szubsztrátkötő hellyel is rendelkezik ezért nem véletlen, hogy ezen enzim vizsgálatakor adódnak leggyakrabban az imént említett atipusos kinetikai profilok [61, 62 ]. Az atipusos kinetikai viselkedés megítélése még intenzív vita tárgya az irodalomban: sem a szubsztrát gátlás, sem az aktiváció in vivo jelentőségét nem támasztották alá meggyőző adatokkal; annyi mindenesetre bizonyos, hogy a tévesen értelmezett adatokból téves enzimkinetikai paraméterek számolhatók [63, 64]. Ha az adott metabolikus folyamathoz két enzim járul hozzá, akkor kétfázisú összefüggést kapunk, vagyis a két komponens jellemezhető egy-egy paraméterpárral (Km-Vmax) [65].
v =
Vmax,1 ⋅ [ S ] K m ,1 + [ S ]
+
Vmax, 2 ⋅ [ S ] K m, 2 + [ S ]
(2)
Ilyenkor a kisebb Km-mel rendelkező összetevőt nagy affinitású komponensnek, a nagyobb Km-mel bíró összetevőt kis affinitású komponensnek nevezzük, bár a szintén használatos „kis-Km enzim (low-Km enzyme)” és a „nagy-Km enzim (high-Km enzyme)” elnevezést bizonyos szerzők pontosabbnak tartják. Az egyfázisú kinetikánál kifejtett okok miatt a kétfázisú kinetika is csak azt jelenti, hogy legalább két enzim vesz részt a metabolizmusban, de a mért értékek valójában lehetnek ún. hibrid paraméterek [66]. A Km nagyon hasznos paraméter a predikció szempontjából: az enzimek nettó hozzájárulását durván becsülni lehet a terápiás koncentráció és a Km-ek ismeretében: mivel a terápiás tartomány a legtöbb gyógyszer esetén jóval a kis affinitású enzim Km – je alatt marad ezért azon enzimek szerepe kiemeltebb, amelyek már alacsony
24
szubsztrátkoncentráció esetén is képesek működni, tehát a nagy affinitású enzimek jelentősége általában nagyobb. A gyakorlatban az említett paraméterek kiszámítására számos linearizált ábrázolás alkalmas (pl. Lineweaver-Burke (1/S-1/v); Eadie-Hofstee (v/S-v), Hanes (SS/v)), a modern szoftverek azonban a Michaelis-Menten ábrázolásból egy lépésben, nemlineáris illesztéssel is megadják azokat.
1.2.7.3. Kémiai gátlószerek Egy adott molekula metabolizmusában részt vevő enzimek azonosításának egyik fontos lépése az izoenzim-specifikus kémiai gátlószerek alkalmazása. A kísérleteknél figyelembe
kell
azonban
vennünk,
hogy
az
egyes
gátlószerek
adott
koncentrációtartományban specifikusak, valamint maguk is szubsztrátjai lehetnek vagy a gátolt, vagy egy másik izoenzimnek, továbbá, hogy a gátlószer metabolitja is gátol, esetenként erősebben, mint az anyavegyület. Általában minél magasabb az alkalmazott koncentráció, annál kevésbé szelektív a gátlószer az adott izoformára [ 67 , 68 ]. Mindezen korlátok mellett a kémiai gátlószerek igen hasznos eszközei az in vitro metabolizmus vizsgálatoknak, mivel alkalmazásuk jelenti a legegyszerűbb és legolcsóbb megoldást a résztvevő enzimek azonosítására.
1.2.7.4. Enzim specifikus gátló ellenanyagok A kémiai gátlás sok esetben nem specifikus, valamint nagyon érzékeny a gátolt anyag és a gátlószer koncentráció arányára. Ezért célszerű olyan enzimgátlási módszert keresnünk, amely specificitása jóval nagyobb az említett vegyületekénél. Az utóbbi 1-2 évtizedben, az immunológia fejlódésével, az immunfolyamatok megértése révén számos igen hasznos eszköz került a kutatók kezébe. Ezek közül az in vitro metabolizmus vizsgálatok során elsősorban a gátló ellenanyagokat használjuk. A poliklonális ellenanyagokat úgy készítik, hogy a gátolni kívánt humán fehérjét, vagy annak valamilyen ortológ formáját megtisztítják és kísérleti állatot, általában nyulat, vagy kecskét immunizálnak vele, tehát antigénként alkalmazzák. Az antigén nem csak teljes,
25
tisztított fehérje lehet: gyakran használnak egy rövidebb polipeptid antigént, vagy a fehérje rekombináns DNS technikával előállított változatát [ 69 ]. Az immunválasz kialakulása után az immunizált állat szérumából megfelelő kromatográfiás eljárással – pl. affinitáskromatográfia – tisztítható az antigén specifikus immunoglobulin (Ig) frakció, vagy egyszerűen az immunszérumot használjuk. Ekkor természetesen egy nem immunizált állat vérsavóját is használnunk kell kontrolként. Az így nyert ellenanyagkeverék, mint azt a neve is mutatja, több epitopot is felismerő Ig molekulák elegye. Ezzel szemben a hibridóma technikával előállított monoklonális ellenanyag csak egyféle specifitású Ig-okat tartalmaz, mivel azokat egy meghatározott epitopra szelektált sejt klónjai termelik; ebben az esetben az ellenanyag alkalmas eljárással a sejtek felülúszójából tisztítható.
1.2.7.5. Index reakció gátlás Az egyes CYP izoenzimeknek léteznek ún. index reakcióik. Ezek olyan metabolikus átalakítások, amelyekről bizonyították, hogy döntően egy adott izoenzim katalizálja őket. A leggyakrabban használt index reakciókat a 2. táblázatban foglaltam össze. Tehát nem arról van szó, hogy adott szubsztrát csak egy adott enzim hatására bomlik, hanem, hogy egy adott metabolitképződési lépést egy adott enzim katalizál. Ez jelenti egyben a módszer hátrányát is: mivel több enzim vehet részt a metabolizmusban, a tényleges szubsztrátkoncentráció az inkubálási idő előrehaladtával lényegesen eltérhet a kiindulási koncentrációtól, azaz a nem vizsgált átalakulás is jelentős mértékű szubsztrátdepléciót okozhat. Ezért van szükség arra, hogy a szubsztrátfogyást kb. 10%ban maximáljuk. A kísérletek során kromatográfiás vagy spektrometriás módszerrel detektáljuk
az
index
szubsztrátkoncentráció
szubsztrátból függvényében
képződött és
metabolitot
meghatározzuk
az
a
növekvő
enzimkinetikai
paramétereket a különböző koncentrációjú tesztvegyület, mint gátlószer jelenlétében. Ezt követően kiszámítjuk az ún. gátlási állandót (Ki). A Ki egy koncentrációfüggetlen paraméter, ami az enzim-gátlószer komplex disszociációs állandója. Az indexreakciógátlás eredményeinek kinetikai elemzése alkalmas a gátlás típusának megállapítására is.
26
Enzim
Index reakció
CYP1A1
Etoxirezorufin O-deetiláció
CYP1A2
Fenacetin O-deetiláció Etoxirezorufin O-deetiláció
CYP2A6
Cumarin 7-hidroxiláció
(S)-mefenitoin N-demetiláció Paclitaxel 6-hidroxiláció Tolbutamide 4’-hydroxiláció Diclofenac hidroxiláció CYP2C19 (S)-mefenitoin 4’-hidroxiláció CYP2D6 Dextrometorfán O-demetiláció Bufuralol 1’-hidroxiláció Debrisoquine 4- hidroxiláció CYP2E1 p-Nitrofenol- hidroxiláció Klórzoxazon 6-hidroxiláció CYP3A Midazolám 1-hidroxiláció Tesztoszteron 6ß- hidroxiláció Dextrometorfán N-demetiláció FMO Benzidamin N-oxidáció CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9
2. táblázat. A legfontosabb CYP enzimek és index reakcióik.
Leggyakrabban a direkt, vagy reverzibilis gátlási típusok, azon belül is az ún. kompetitív gátlás fordul elő, amikor a tesztanyagunk, mint gátlószer verseng az index szubsztráttal az enzim kötőhelyéért. Ebben a kitüntetett esetben a Ki-t úgy is értelmezhetjük, mint az a szabad gátlószerkoncentráció, amely a Clint –et a felére csökkenti [14].
CLint, gátolt =
CLint I 1+ Ki
(3)
amelyben I a gátlószer koncentrációja. A fenti összefüggésből kitűnik tehát, hogy nem elsősorban a Ki az a paraméter, amely a gátlás erősségéről tájékoztatást ad, hanem a I/Ki hányados. A kompetíció miatt, ha a szubsztrátot többszörös moláris feleslegben adjuk,
27
képes teljesen leszorítani a kompetitív gátlószert az enzim aktív helyéről. Ezáltal a Vmax érték nem változik, viszont, a Km érték nő. A kompetitív gátlás mellett gyakran tapasztalunk nonkompetitív gátlást: ekkor a gátlószer nem a szubsztrátkötő helyen, hanem máshol kötődik az enzimhez. Mivel az enzim-szubsztrát kötődés erőssége nem változik, csak a katalizált reakció sebessége, ezért a Km érték változatlan marad, míg a Vmax csökkenése tapasztalható. Az unkompetitív gátlás esetében a gátlószer csak az enzim-szubsztrát komplexhez képes kötődni; a kötőhely lehet az aktív helyen, vagy azon kívül is. Ekkor mind a Km, mind a Vmax csökken. Az említett „tiszta” eseteken kívül gyakran találkozunk ún. kevert gátlással (mixed inhibition), ami a kompetitív és a nonkompetitív hatások eredőjeként jön létre és a Km növekedése mellett a Vmax csökkenésével jár [15]. A gátlószerek másik nagy csoportját alkotják a metabolizmus-függő gátlószerek: ekkor a gátlószer az enzim által történő átalakítást követően válik aktivvá és csak így fejti ki a gátlást, ami kvázi-irreverzibilis vagy irreverzibilis lehet. Az első esetben – pl. makrolid antibiotikumok, alkilaminok, heterociklusos aminok esetében – a kialakuló metabolit erősen kötődik az enzim hem részéhez. A kvázi-irreverzibilis gátlás igazolható az ún. metabolikus inhibitor komplex (MI) kimutatásával. Ez egy spektrofotometriásan detektálható komplexet eredményez, amely csak NADPH hozzáadására alakul ki, jelezve a szükséges metabolikus lépést. A spektrumon a komplex jellegzetes, általában 452-460 nm körüli csúcsként jelentkezik, amely az inkubálási idővel egyre nő [70, 71]. Terminális kettős-, vagy hármas kötést tartalmazó molekulákból az oxidáció során reaktív gyökök képződnek, amelyek alkilálhatják mind a hemet, mind az apoproteint. Ebben az esetben irreverzibilis gátlásról beszélünk, mivel az enzimaktivitás visszaállításához de novo enzimszintézis szükséges. A kváziirreverzibilis és a reverzibilis gátlószereket mechanizmus-alapú gátlószereknek is nevezzük. A preklinikai metabolizmus-vizsgálatok során igen fontos, hogy a klinikai kandidátust megvizsgáljuk, hogy rendelkezik-e ilyen irreverzibilis gátló hatással, mivel gyakran előfordul, hogy ezek az anyagok viszonylag magas Ki értékkel rendelkeznek, tehát gyenge gátlószernek tűnnek, in vivo gátló hatásuk azonban sokkal drasztikusabb lehet az említett okok miatt. A metabolizmus-kutató számára nem mellékes, hogy ezek a gátlószerek eredménnyel használhatók a laboratóriumi gyakorlatban izoforma specifikus vagy általános kémiai gátlószerként (pl. furafillin és ABT).
28
1.2.7.6. Korrelációs elemzés A résztvevő CYP enzimek azonosítására alkalmazható a korrelációs analízis is. A módszer lényege, hogy meghatározzuk az egyedi mikroszómák specifikus aktivitását egy kitüntetett index reakcióban, valamint az általunk vizsgált, szubsztrátként a tesztvegyületünket tartalmazó átalakulásban, és a kapott értékeket ábrázoljuk rendre a grafikon X és Y tengelyén. A módszer hátránya, hogy ha az aktivitási szélsőértékek között kevesebb, mint 5-szörös különbség adódik, akkor a korreláció felállítása nem megbízható [69]. Természetesen a módszer nem csak mikroszomális, hanem egyéb, pl. citoplazmatikus enzimek azonosítására is alkalmas [72].
1.2.8. A tolperizon A tolperizon - 1-(4-metil-fenil)-2-metill-3-(1-piperidino)-1-propanon-hidroklorid (5. ábra)- egy központi támadáspontú izomrelaxáns [ 73 ], amelyet évtizedek óta használnak izomgörcsök és egyéb ortopédiai és reumatológiai megbetegedések kezelésére.
CH3 CH3
C
CH CH2
N
HCl
O 5. ábra. A tolperizon szerkezeti képlete.
Membránstabilizáló, helyi érzéstelenítő hatása révén gátolja a gerincvelői mono- és poliszinaptikus reflexeket. A szinaptikus Ca++ beáramlás gátlásával feltehetően gátolja a transzmitter kiáramlást. Az agytörzsben a reticulospinalis reflexek facilitációját gátolja. Csökkenti a decerebrációs izomtónus-fokozódást, rigiditást az állatmodellek szerint. A perifériás véráramlást fokozza, ezáltal oldja az érgörcsöket, feltehetően perifériás
29
hatással. Szedációt nem okoz, az alkohol központi idegrendszeri hatását nem befolyásolja. Ono és munkatársai kimutatták, hogy a tolperizon lokális anesztetikumként viselkedik motoneuronokon és a primer afferenseken in vivo illetve a patkány perifériás idegein in vitro [ 74 ]. A tolperizon hatásában azonos a lidokainnal: mindketten feszültségfüggő nátrium-csatornákat gátolnak [75]. Pratzel és munkatársai hatékonynak találták a tolperizont fájdalmas izomgörcsök kezelésében [76]. Tolperizon tartalmú készítmény Mydeton néven (filmtabletta és injekció) van forgalomban Magyarországon. Adása amiotróf laterális szklerózisban (ALS), paralysis spinalis spasticában és szklerózis multiplexben szenvedő betegek részére, valamint stroke utáni centrális izomtónus fokozódással járó állapotokban javallott [77]. A tolperizon farmakokinetikai jellemzőiről található utalás az irodalomban, ám a molekula in vitro metabolizmusa és izoenzim profilja ezidáig még nem volt ismert. A hetvenes években végzett in vivo patkány vizsgálatok során GC/MS technikát alkalmaztak [78, 79]. 1987-ben publikálta Miskolczi és munkatársai annak a humán vizsgálatnak az eredményeit, amelyben két tolperizon tartalmú készítmény, a Mydeton és a Mydocalm farmakokinetikai paramétereit határozták meg plazmából egy újonnan kifejlesztett és érzékeny kromatográfiás technikával [5]. E tanulmány alapján a tolperizon biológiai felezési ideje 1,55 ± 0,7 h, a teljestest klirensz 140,8 ± 33,8 l/h értéknek adódott. A biológiai hasznosíthatóság rendre 22,3 ± 6% és 16,7 ± 8,9% volt.
30
2. CÉLKITŰZÉSEK 1. Biomimetikus rendszer kifejlesztése és validálása potenciális nitrogénmonoxid (NO) donorok azonosítására. Célul tűztük ki, egy szintetikus metalloporfirint tartalmazó biomimetikus oxidációs rendszer kidolgozását, amely alkalmas potenciális NO donorok azonosítására, HTS módszerrel. Célom volt a biomimetikus rendszer összehasonlítása patkány mikroszomális CYP enzimekkel, vagyis annak igazolása, hogy a kémiai rendszer képes modellezni a biológiai, in vitro reakciókat és előrejelezni egy adott molekula NO donor sajátságát. Mivel a NO-ról köztudott, hogy erős értágító, simaizomlazító hatása van, a kísérletek megalapozhatják egy esetleges máj-szelektív NO donor sajátságú gyógyszer kifejlesztését a portális hipertenzió okozta elváltozások kezelésére. 2. A tolperizon in vitro metabolizmusában szerepet játszó mikroszomális enzimek azonosítása. Célunk volt, hogy humán máj mikroszóma frakció, és rekombináns humán mikroszomális enzimek felhasználásával azonosítsuk a tolperizon metabolizmusában szerepet játszó enzimeket és megállapítsuk, melyek azok, amelyek kulcsszerepet játszanak a biotranszformációban. E vizsgálatainkkal választ kívántunk adni arra a kérdésre, hogy miért alacsony a tolperizon biológiai hasznosíthatósága annak ellenére, hogy jól felszívódik. A kísérletekben a klasszikus CYP reakció-fenotípus meghatározás (CYP reaction phenotyping) módszereit kívántuk használni. 3. A tolperizon hidroxiláció enzimkinetikai jellemzése. Célunk volt, hogy humán mikroszóma és rekombináns enzimek felhasználásával jellemezzük a tolperizon legfontosabb metabolikus átalakulását, továbbá meghatározzuk az egyes izoenzimek relatív részvételét a relatív aktivitási faktor (RAF) alkalmazásával. Ez az eljárás lehetővé teszi, hogy a rekombináns enzimek felhasználásával nyert adatokat mikroszomális rendszerre is kiterjesszük, és így becsülni tudjuk a résztvevő metabolikus enzimek hozzájárulásának mértékét.
31
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. NO DONOR MOLEKULÁK AZONOSÍTÁSA BIOMIMETIKUS ÉS IN VITRO BIOLÓGIAI RENDSZERBEN
3.1.1. Anyagok Kumol-hidroperoxid (Koch-Light Laboratories; Colnbrook Bucks, Egyesült Királyság). Glükóz-6-foszfát, glükóz-6-foszfát dehidrogenáz, N-(1-naftil)etiléndiamin, szulfanilamid, FeTPPF20, cupferron, streptozotocin, NSAO, 3-nitropropionsav (Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO, USA). V-PYRRO/NO (Alexis Biochemicals; Lausen, CH). Na-pirofoszfát, MgCl2, NADPH-nátrium só, MgCl2, CaCl2, trisz-hidroximetilaminometán (Reanal; Budapest, Magyarország). Metanol, diklórmetán, hidrogénperoxid (Merck, Darmstadt, Németország).
3.1.2. Kémiai-alapú szűrés és automatizálás A HTS méréseket Tecan CombiTec automatán végeztük. 96 lyukú lemez (deep well plate) egyes lyukaiba 0,05-0,05 mmol tesztanyagot tettünk, ehhez 1 ml, diklórmetán:metanol=1:1 elegyben oldott 1 μmol FeTPPF20 –t és 0,4 μmol H2O2-t adtunk. A tálcát 30 percig szobahőmérsékleten ráztuk, majd 100-100 μl-t átpipettáztunk egy új 96 lyukú tálcára LC/MS analízishez. A reakcióelegy adott térfogatait 0,5-0,5 ml Griess-Ilosvay reagenssel (1. 0,2% N-(1-naftil)etiléndiamin 0,4 M HCl-ben, 2,2% szulfanilamid 4 M HCl−ben) összekevertük, az elegyet 1 percig ráztuk, majd 100-100 μl-t egy külön 96 lyukú lemezre pipettáztunk. Az abszorbanciát 550 nm-en határoztuk meg Tecan Sunrise Microplate Reader segítségével.
32
3.1.3. Az indukált patkány máj mikroszóma készítése és az inkubálási körülmények
Hím Wistar patkányokat (200 g; Toxicoop, Magyarország) itattunk ad libitum 0,5 g/l koncentrációjú fenobarbitál oldattal, 3 napig. A negyedik napon az állatok májából az alábbiak szerint izoláltuk a mikroszóma frakciót: a májat 0,1 mM ditiotreitolt, 0,2 mM EDTA-K-t, 1,15 m/v% KCl-t és 10 v/v% glicerint tartalmazó, 0,1 M Tris-KCl (pH 7,4) oldatban homogenizáltuk, majd 9000 g-vel 0 ºC-on 15 percig centrifugáltuk. A felülúszó 2,25 ml-ét 15 ml 68 mM CaCl2 oldattal kicsaptuk, majd 20000g-vel 0 ºC-on 15 percig centrifugáltuk. A pelletet a fenti összetételű Tris-KCl oldatban felszuszpendáltuk és ebben az állapotában tároltuk -70 ºC-on a felhasználásig. Az inkubáló elegy összetétele: 6,25 mM Na-pirofoszfát, 5 mM MgCl2, 5 mM glükóz-6foszfát, 1 U/ml glükóz-6-foszfát dehidrogenáz, 0,5 mM NADPH, 0,5 ml-re kiegészítve 0,12 M Tris-HCl pufferrel (pH 7,4 ). Az elegy 1mg/ml mikroszomális fehérjét és 12,5 mM kumol-hidroperoxidot tartalmazott. A reakciót a DMSO-ban oldott tesztvegyületek 5-5 μl-ének hozzáadásával indítottuk. Az inkubálásokat 37 ºC-os rázó vízfürdőben végeztük. A megadott inkubálási idők után az elegyet azonos térfogatú -20 ºC-os metanollal kicsaptuk, centrifugáltuk (10000 g , 10 min) és a felülúszókból 100-100 μl-t 96 lyukú tálcára mértünk. Ehhez összesen 100 μl Griess-Ilosvay reagenst adtunk, összekevertük, majd Labsystems iEMS microplate olvasó segítségével megmértük az abszorbanciát 550 nm-en.
3.2. A TOLPERIZON IN VITRO METABOLIZMUS VIZSGÁLATA 3.2.1. Anyagok Tolperizon hidroklorid és metabolitok (Richter Gedeon RT.) Kinidin, gradiens minőségű metanol (Merck; Darmstadt, Germany); ketokonazol, szulfafenazol, 6ßhidroxitesztoszteron, SKF-525A (proadifen hidroklorid), glükóz-6-foszfát, glükóz-6foszfát dehidrogenáz, fenacetin, 4-acetamidofenol, 1-aminobenzotriazol (Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO). Furafillin,
S-mefenitoin
(Ultrafine Chemicals Ltd.
Manchester, UK); tesztoszteron (Fluka; Buchs, Switzerland); tolbutamid (RBI; Natick,
33
MA). Metil p-tolil szulfid, metil p-tolil szulfoxid (Aldrich Chemical Co.; Milwaukee, WI, USA). 1-benzilimidazol (Sigma-Aldrich Chemie GmbH.; Steinheim, Németország). Na-pirofoszfát, MgCl2, NADPH-nátrium só (Reanal; Budapest, Magyarország). (+/-)-Bufuralol hidroklorid, (+/-)-1’-hidroxibufuralol maleát, CYP2D6 és CYP3A4 specifikus monoklonális antitestek, CYP2C8/9/19 és NADPH-P450-reduktáz specifikus poliklonális antitestek, baculovirussal fertőzött rovarsejtben expresszált humán enzimek (SUPERSOMES) (BD/Gentest; Woburn, MA). Az egyedi és a több, különböző nemű egyedből származó humán máj mikroszóma (In Vitro Technologies; Baltimore, MD és Farmakobiokémiai
Osztály,
MTA
Kémiai
Kutatóközpont,
Budapest)
14
C-
Dextrometorfán (MTA Kémiai Kutatóközpont, Budapest). Normál kecske szérum (Invitrogen New Zeland Ltd; Auckland, NZ).
3.2.2. Az inkubáló elegy összetétele és inkubálási körülmények 6,25 mM Na-pirofoszfát, 5 mM MgCl2, 5 mM glükóz-6-foszfát, 1 U/ml glükóz6-foszfát dehidrogenáz, 0,5 mM NADPH kiegészítve 0,5 ml-re 0,12 M Tris-HCl pufferrel (pH 7,4). Az inkubálásokat 37 ºC-os rázó vízfürdőben végeztük enyhe rázatással (humán mikroszóma) vagy rázatás nélkül (rekombináns enzimek). A megadott inkubálási idők után kivett mennyiségeket azonos térfogatú -20 ºC-os metanollal kicsaptuk, -20 ºC-on tartottuk 20-30 percig, centrifugáltuk (7500 g , 10 min) és közvetlenül injektáltunk a HPLC-be.
3.2.3. A tolperizon Clint meghatározása 5 μM tolperizont inkubáltunk 1 mg/ml koncentrációjú egyedi humán mikroszóma frakciókkal (9 donor: 3 nő, 6 férfi) a 3.2.2. pontban megadott összetételű inkubáló elegyben 20 percig. A 0. és 20. percben mintát vettünk, a Clint értékét az alábbi képlettel számoltuk:
dc CLint = dt ⋅ 45 [ml/min/g máj)], c0
34
(4)
ahol dc/dt a rekciósebesség az egységnyi térfogatú reakcióelegyben, szubsztrátfogyás alapján mérve, c0 a szubsztrát kiindulási koncentrációja. Ún. „scaling” faktorként a 45 mg fehérje/g máj értéket használtuk [80].
3.2.4. A tolperizon metabolizmus gátlása kémiai gátlószerekkel CYP izoenzim-specifikus gátlószereket vagy index szubsztrátot (kompetitív inhibitort) alkalmaztunk a tolperizon metabolizmusának gátlására humán máj mikroszómán a megadott összetételű inkubáló elegyben. A felhasznált izoenzimspecifikus gátlószereket a 3. táblázatban foglaltam össze.
A gátlószer neve
Gátolt izoenzim
Alkalmazott koncentráció
Hivatkozás
(tartomány) [81, 82, 83,
Furafillin
CYP1A2
2-200 μM
Szulfafenazol
CYP2C9
2-200 μM
[84, 85]
CYP2C19
2-200 μM
[86]
CYP2B6
2-200 μM
[87]
Kinidin
CYP2D6
1-100 μM
[84]
Ketokonazol
CYP3A4
1-100 μM
[84, 85,88]
Tiokarbamid
FMO3
10 mM
[89]
SKF-525A
Általános CYP
100-1000 μM
[90]
1-Aminobenzotriazol (ABT)
Általános CYP
1000 μM
[22, 91]
1-Benzilimidazol (BI)
Általános CYP
1000 μM
[92, 93]
S-mefenitoin
(szubsztrát)
3. táblázat. Specifikus gátlószerek, a gátolt enzimek és az alkalmazott gátlószerkoncentrációk.
35
84]
A gátlószereket metanolban oldottuk és a furafillin és az ABT kivételével együtt inkubáltuk a tolperizonnal. Mivel a furafillin és az ABT ún. mechanizmus-alapú gátlószerek, vagyis a gátlás egy metabolikus lépést követően alakul ki, e gátlószerekkel előinkubáltuk a mikroszómát rendre 10 és 20 percig. A szerves oldószer koncentrációja nem haladta meg az 1 v/v %-ot.
3.2.5. A tolperizon metabolizmus gátlása ellenanyagokkal. A monoklonális ellenanyag tisztított specifikus immunoglobulin oldat, míg a poliklonális ellenanyag kecske immunszérum volt. Ez utóbbi kontrolljaként nem immunizált állat szérumát használtuk. A CYP2C8/9/19 specifikus poliklonális ellenanyag csomag tartalmazta a kontroll szérumot, a NADPH-P450-reduktáz specifikus ellenanyag kontrolljaként normál kecske savót használtunk (Invitrogen). A mikroszómát az adott ellenanyaggal előinkubáltuk és ezután mértük az inkubáló elegybe. A tolperizont 5 és 50 μM koncentrációban alkalmaztuk. A felhasznált gátló ellenanyagokat és inkubálási körülményeket a 4. táblázatban foglaltam össze.
Gátolt izoenzim
Az ellenanyag típusa
Alkalmazott mennyiség (100 μg mikroszomális fehérjére)
Inkubálási körülmények
CYP2C8/9/19
Poliklonális
20 μl
30 min, RT
CYP2D6
Monoklonális
6 μl
15 min, jégen
CYP3A4
Monoklonális
10 μl
15 min, jégen
NADPH-P450-
Poliklonális
7,5 μl
30 min, RT
reduktáz 4. táblázat.
Az ellenanyagokkal végzett kísérletek összefoglaló módszertani táblázata.
36
3.2.6. Rekombináns enzimekkel végzett kísérletek A heterológ expressziós rendszerben lévő humán CYP izoenzimekkel (SUPERSOMESTM) végzett kísérletekben az enzimkoncentráció 20 pmol/ml (CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 és CYP3A4), illetve 100 és 1000 pmol/ml (FMO3) volt. A reakciót az enzim hozzáadásával indítottuk és 37 ºCon, rázatás nélkül inkubáltuk. Kontrollként a vad típusú baculovírussal fertőzött rovarsejtből preparált mikroszómát használtunk. Az egyes izoenzimek relatív hozzájárulását a tolperizon hidroxilációs lépéshez az ún. „Relative Activity Factor” (RAF) számolásával határoztuk meg [55], az alábbi képletek segítségével:
RAFizoenzim =
Vmax ,mikroszóma Vmax ,rekombináns
(5)
ahol az egyes Vmax értékek a mikroszómán, illetve a rekombináns enzimen mért index reakciók megfelelő értékei. Az enzimaktivitásokat mikroszómán és rekombináns rendszerben telítési szubsztrátkoncentrációnál (500-1000 μM) határoztuk meg a bufuralol 1’-hidroxiláció (CYP2D6),
S-mephenytoin-hidroxiláció
fenacetin O-deetiláció (CYP1A2) segítéségével.
(CYP2C19) és
A RAF meghatározása után a
szációalékos részvétel becslésére a következő képletet használtuk:
fi =
Ai vi ( s ) ∑ Ai vi ( s)
(6)
i
ahol Ai az ún. scaling faktor (itt a RAF), vi(s) az i izoenzimhez rendelhető sebességfüggvény a tolperizon-hidroxilációs reakcióban (itt a Vmax/Km hányados, azaz az intrinzik klirensz).
3.2.7. CYP index reakciók gátlása tolperizonnal Ezekben a kísérletekben a tolperizont gátlószerként alkalmaztuk, hogy megállapítsuk, milyen mértékben képes gátolni az egyes CYP izoenzimekre jellemző index reakciókat és ezáltal a metabolizmusában résztvevő enzimek hozzájárulásáról
37
valamint a tolperizon enzimgátló sajátságairól képet kapjunk. A reakció a 3.2.2. pontban leírt inkubálási körülmények között zajlott. A tolperizont mint gátlószert együtt inkubáltuk az index szubsztrátokkal. A kísérletekben HLM-t használtunk az MpTS oxidáz teszt kivételével. Mivel ez a reakció nem kizárólag FMO3-katalizált folyamat (azaz más, mikroszomális CYP enzimek is részt vesznek benne) [99], rekombináns humán FMO3-t használtunk (100 pmol/ml). A reakciósebességi adatokat 5-7 szubsztrátkoncentrációnál mértük 4 különböző gátlószerkoncentráció mellett. Az adott CYP izoenzimek és az FMO3 index reakcióinak összefoglaló adatait az 5. táblázat tartalmazza. Index reakció 14
C-dextrometorfán O-
CYP
Index szubsztrát
Tolperizon
izoenzim
koncentráció
koncentráció
CYP2D6
5-45 μM
0-5-15-45 μM
Bufuralol hidroxiláció [95]
CYP2D6
5-200 μM
0-10-30-90 μM
Tesztoszteron 6ß-
CYP3A4
20-500 μM
0-10-30-90 μM
hidroxiláció CYP2C9
20-500 μM
0-10-30-90 μM
demetiláció [94]
hidroxiláció [96] Tolbutamid [97] Fenacetin O-deetiláció [98]
CYP1A2
20-500 μM
0-10-30-90 μM
MpTS oxidáció [99]
FMO3
10-1500 μM
0-50-300-1500 μM
5. táblázat. Az alkalmazott CYP index reakciók és szubsztrát/ gátlószer koncentrációk.
3.2.8. Kromatográfiás módszerek. 1. HPLC-UV Az analitikai méréseket a Merck-Hitachi LaChrom HPLC rendszerén végeztem, UV detektálást alkalmazva. Discovery C18 150 x 4.6 mm (5 μm) kolonnát használtam
38
Supelguard 20 x 4 mm (5 μm) előtétoszloppal (Supelco, Bellefonte, PA). Az eluens áramlási sebessége minden esetben 0,8 ml/min volt, az oszloptermosztátot 40 ºC-ra állítottam. A tolperizon és hidroximetil tolperizon, valamint az egyes index szubsztrátok és
metabolitjaik
mérésére
kidolgozott
módszereket
az
irodalmi
előzmények
feltüntetésével a 6. táblázatban foglaltam össze λ (nm)
Eluens
Tolperizon
256
47 v/v % metanol 0,1 M
Hidroximetil-tolperizon
251
AA
Bufuralol és 1’hidroxibufuralol [100]
Dextrometorfán és dextrorfán
Testosterone és 6ßhidroxitesztoszteron [96] Tolbutamid/hidroxitolbutamid [97]
Fenacetin/4-acetamidofenol
MpTS/MpTSO
252
220
254
230
249
233
Gradiens A Izokratikus
A: metanol:0,1M
0-8 min= 100%
AA=27:73
16-17 min= 40%
B: metanol
20-25 min=100%
A: metanol:0,1M
0-4 min= 100%
AA=42:58
16-20 min= 40%
B: metanol
20-30 min=100%
A: metanol:0,1M
0-4 min= 100%
AA=45:55
14-17 min= 40%
B: metanol
20-26 min=100%
A: metanol:0,1M
0-4 min= 100%
AA=25:75
10-11 min= 70%
B: metanol
13-20 min=100%
A: metanol:0,1M
0 min= 100%
AA=25:75
12 min= 50%
B: metanol
14-19 min=100%
A: metanol:0,1M
0-5 min= 100%
AA=34:66
12 min= 35%
B: metanol
16-22 min=100%
6. táblázat.
A tolperizon, M1 és az index szubsztrátok/metabolitok HPLC analízisének körülményei.
39
2. LC/MS mérések A
Merck-Hitachi
LaChrom
HPLC
rendszert
Merck-Hitachi
M-8000
tömegsekrométerrel kapcsoltuk, electrospray ionizációt (ESI) alkalmaztunk. A Sciex API 3000 készüléket „turboionspray” ionizációval üzemeltettük. 50 µM tolperizont inkubáltunk 30 percig humán máj mikroszómával a 3.2.2. pontban megadott inkubáló elegyben. Az enzimreakció leállítása és a centrifugálás után nyert felülúszókhoz (1 ml) 5-5 ml klórbutánt, vízmentes nátrium-szulfátot és 50 μl 10% -os ammónium-hidroxidot adtunk, 2 x 20 sec-ig extraháltunk majd 5 percig 800 g-vel centrifugáltuk. A felső fázisból 4-4 ml-t vákuummal bepároltunk. A bepárlási maradékot 100 μl etanolban vettük fel és 10 μl-t injektáltunk a HPLC-be. Az (A) eluens összetétele a következő volt: 140 ml metanol, 100 ml víz, 100 μl 10% hangyasav és 200 μl 10% ammóniumhidroxid. A (B) eluens: metanol. Gradiens: 0. min: 100% (A), 8. min: 60% (A), 12. min: 100% (A). Az áramlási sebesség 0.25 ml/min volt. A mintákat 255 nm–en mértük. Prontosil C-18 ACE EPS 5 μm, 100-2 mm kolonnát (Bischoff, Germany) használtunk 35°C-on termosztálva.
3.2.9. Az adatok elemzése A tolperizon-hidroxiláció, valamint az index reakciók enzimkinetikai adataira Michaelis-Menten kinetika szerinti (reakciósebesség ’V’ a Szubsztrátkoncentráció ’S’ függvényében) és Eadie-Hofstee összefüggés szerinti (‘V/S’ a ‘V’ függvényében) görbéket illesztettünk. A kinetikai paramétereket (Michaelis állandó: ’Km’ és maximális reakciósebesség: ’Vmax’) nemlineáris illesztéssel határoztuk meg a GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, Inc.) szoftverrel. A szórást (S.D.) és a Student t teszt p értékét a Microsoft Excel programmal számoltuk. A Ki meghatározását a nemszimultán nemlineáris regresszió (Km,app) módszerrel végeztük [ 101 ]. A regressziós egyenest legalább 3 pontra fektettük, az így – a tengelymetszetnél − leolvasott értéket tüntettem fel a Ki értékeként.
40
4. EREDMÉNYEK
4.1. NO DONOR MOLEKULÁK AZONOSÍTÁSA BIOMIMETIKUS ÉS IN VITRO BIOLÓGIAI RENDSZERBEN Első lépésként a biomimetikus rendszer validálását végeztük el 6 ismert NO donor felhasználásával (cupferron, streptozotocin (NHA analóg) [ 102 ], nikotinsav amidoxim (NSAO), molsidomin, 3-nitro-propionsav, V-PYRRO/NO). Ez utóbbi egy, a közelmúltban kifejlesztett, máj-szelektív NO donor, amelyről kimutatták, hogy hatékonyan kivédi az acetaminofén-indukálta májkárosodást [ 103 ]. A molekulákat Keserű és mtsi. által részletesen leírt H2O2/FeTPPF20 rendszerben teszteltük [44] . Az eredmények az alábbi ábrán láthatóak.
1,4
Abszorbancia (550 nm)
1,2
+H2O2 porfirin + H2O2
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Cupferron
Streptozotocin
NSAO
Molsidomin
3-nitropropionsav
V-PYRRO/NO
6. ábra. A referenciavegyületek NO donor aktivitásának vizsgálata biomimetikus rendszerben. A kontrol minták csak H2O2-t tartalmaztak (átlag ± S.D., N=3).
A cupferron és a NSAO biomimetikus oxidációja során a H2O2 kontrolhoz képest nagymértékű NO termelést tapasztaltunk a vas-porfirint tartlamazó reakcióelegyekben. A streptozotocin a csak H2O2-t tartalmazó mintákban is bomlik: mind a kontroll, mind a
41
porfirint is tartalmazó biomimetikus elegyben nagymennyiségű NO mérhető. A molsidomin és a 3-nitropropionsav kismértékű, de a H2O2 kontrolhoz képest szignifikáns NO termelést mutatott a vas-porfirint is tartalmazó reakcióelegyekben. Érdekes módon a máj-szelektív NO donorként azonosított V-PYRRO/NO esetében csak kismértékű NO termelés volt mérhető. Az eredmények alapján a biomimetikus rendszer alkalmas NO donorok kimutatására és a V-PYRRO/NO-val kapott eredmények alapján, korlátozott módon, a CYP mediált NO termelődést is modellezi. A HTS kísérletek során az ilymódon validált biomimetikus rendszer segítségével szűrtük a Richter Gedeon RT. molekulakönyvtárából számítógépes szerkezethasonlósági elemzés alapján kiválasztott molekulákat. A méréseket a Módszerek fejezetben leírt 96-lyukú lemezeken végeztük. Az NO-donor sajátság mértékének találati eloszlását a 7. ábra mutatja.
Abszorbancia (550 nm)
2
1,5
1
0,5
70 0 20 019 2 2 00 008 2 2 21 04 080 6 6 00 115 9 2 6 00 009 4 2 6 00 003 6 2 0 04 000 7 51 55 00 13 1 1 00 081 9 1 7 00 074 2 1 22 00 074 1 2 00 074 0 1 1 00 068 8 2 8 00 057 3 1 9 00 033 9 10 26 00 23 1 0 00 006 1 1 5 00 006 0 2 3 00 034 1 2 1 00 038 9 2 43 00 049 2 8 04 055 5 5 1 04 128 7 5 9 04 130 5 5 0 04 136 9 5 32 04 137 6 6 04 115 9 6 7 04 118 9 6 0 11 118 8 0 0 14 011 9 5 21 20 011 2 6 20 007 6 2 9 20 007 7 2 98 23 008 0 5 70 009 3 0 0 00 011 3 2 5 00 010 1 2 7 00 018 0 2 68 00 051 5 5 00 019 0 50 70 22 46
0
7. ábra. A számítógépes elemzés alapján a molekulakönyvtárból kiválasztott molekulák NO-donor aktivitása.
Az eredmények alapján a 0,1 OD (optikai denzitás) értéket meghaladó értékeket tekintettük elsődleges találatoknak, és ezek közül azokat választottuk ki további vizsgálatra, amelyek NO termelő képessége megközelítette a NSAO NO termelő képességét. Egy másik szempont volt, hogy szerkezetileg lehetőleg eltérjenek egymástól,
42
vagyis minél nagyobb legyen az a kémiai tér, amelyben dolgozhatunk. Ez utóbbi megfontolás részletes kifejtése azonban túlmutat e dolgozat keretein. A kiválasztott molekulák szerkezetét a 8. ábrán tüntettem fel.
00205799
00501970
04513632
N OH
N
OH
N
N
S N O
N N
+
O
N
OH
20200797
N OH
N
N
20200798 N
N
N
OH
HO
N
N
N OH
OH
8. ábra. A biomimetikus HTS rendszerben NO donorként azonosított és további vizsgálatokra kiválasztott molekulák szerkezete.
Az 8. ábrán feltüntetett molekulákat tovább vizsgáltuk hagyományos, azaz nem HTS körülmények között szintetikus vas-porfirint és hidrogén-peroxidot tartalmazó elegyben. Az eredményeket az alábbi ábrán mutatom be (9. ábra).
43
Abszorbancia (550 nm)
3
+H2O2
2,5
porfirin + H2O2 2 1,5 1 0,5 0 00205799
04513632
20200797
20200798
00501970
Vegyületek
9. ábra. NO képződés mértéke a legaktívabb molekulákból vas-porfirinnel és H2O2 –dal történő 30 perces inkubálást követően (átlag ± S.D., N=3).
Az eredmények alapján a kiválasztott molekulák hatékony NO donorként működtek a kémcsőkísérletben is. A kontrolhoz viszonyított legintenzívebb hatás a 04513632 esetében volt mérhető. Általánosan elfogadott tény, hogy a vas-porfirin alapú biomimetikus oxidációs rendszerek reakciómechanizmusa a CYP enzimek működésének ún. peroxid sönt (ld. 1. ábra) útvonalát modellezik [104]. Kísérleteinkben indukált patkány mikroszóma-kumolhidroperoxid rendszerben vizsgáltuk a kiválasztott molekulák viselkedését, vagyis arra a kérdésre kerestünk választ, hogy megtartják-e a biomimetikus rendszerben azonosított molekulák NO-donor sajátságukat a biológiai közegben. Az eredmények a 10. ábrán láthatóak.
44
Abszorbancia (550 nm)
0,25
CuOOH CuOOH+RLM
0,2
0,15
0,1
0,05
0 00205799
04513632
20200797
20200798
00501970
V-PYRRO/NO
Vegyületek
10. ábra. NO képződés a HTS legaktívabb “hit” molekuláiból kumol-hidroperoxid (CuOOH) és CuOOH+ patkány máj mikroszóma (RLM) jelenlétében (átlag ± S.D., N=3).
In vitro, patkány máj mikroszóma frakciót használva sikerült - a HTS és a biomimetikus rendszer eredményeit igazolva - NO termelést kimutatni a 00205799, 04513632, 20200797, 20200798, 00501970, és V-PYRRO/NO molekulák esetében (10. ábra). Az NO termelés mértéke azonban egy nagyságrenddel elmarad a biomimetikus rendszerben mért értékektől.
4.2. A TOLPERIZON IN VITRO METABOLIZMUS VIZSGÁLATA
4.2.1. A tolperizon intrinzik klirensze humán mikroszómán A 9 egyedi mikroszómán mért Clint érték 1,27 ± 0,16 ml/perc/g máj értéknek adódott. A nő donorokból származó mintákkal (N=3) 1,39 ± 0,22 ml/perc/g máj, míg a férfi donorokból származókkal (N=6) 1,15 ± 0,2 ml/perc/g máj értékeket mértünk. A két érték eltérése statisztikailag nem szignifikáns. A metabolizmus NADPH-függő folyamat, mivel e kofaktor elhagyásakor a tolperizon metabolizmusa – az anyavegyület fogyása nem volt megfigyelhető.
45
4.2.2. A humán mikroszómán képződött metabolitok azonosítása A HPLC-UV mérések alapján megállapítható, hogy a tolperizon humán máj mikroszómán elsősorban hidroximetil-tolperizonná alakul. Ez a hidroxiláció a molekula 4-metil-fenil részén történik (lásd 11. ábra). Az LC/MS mérések három jelentős metabolitot mutattak ki, amelyek M=261, M=263 és M=247 molekulaionokként jelentkeztek (11. ábra).
TOLPERIZON
M= 261(M1) M= 247
M= 263 (M2)
11. ábra. A tolperizon és humán máj mikroszómán keletkezett metabolitjainak LC/MS kromatogramja. Az M=261 metabolitot hidroximetil-tolperizonként (M1), az M=263 metabolitot az M1 metabolit karbonil-redukált formájaként azonosítottunk (M2). Az M=247 tömeg/töltés aránynál mérhető metabolit feltételezéseink szerint az anyavegyület karbonil-redukált formája. E redukált metabolit jelenlétét későbbi HPLC/UV módszerrel, kvalitatív módon igazoltuk egy olyan metabolitstandard segítségével, amely a redukált metabolit treo és eritro izomerjét egyaránt taratlmazza. E mérések alapján azt is igazoltuk, hogy a
46
mikroszomális metabolizmus során kizárólag a treo izomer képződik, vagyis a metabolizmus sztereoszelektív. A metabolitok szerkezeti képleteit az 12. ábrán tüntettem fel. Korábban mindkét metabolitot kimutatták 24 órás patkány vizeletből is [77].
CH3 OH CH2
C
CH CH2
Hidroximetil tolperizon (M1) M=261
N
O CH3 OH CH2
CH CH CH2
M2 M=263
N
OH
CH3 CH3
CH CH CH2
M=247
N
OH 12. ábra. A tolperizon in vitro képződött metabolitjainak szerkezete.
4.2.3. A tolperizon metabolizmus gátlása kémiai gátlószerekkel Kísérleteinkben
izoenzim-specifikus
kémiai
gátlószereket,
illetve
index
szubsztrátot használtunk, hogy a tolperizon metabolizmusára és a fő, M1 metabolit képződésre kifejtett hatásukat vizsgáljuk. Nem specifikus CYP gátlószereket is alkalmaztunk, hogy a CYP független metabolizmus mértékéről képet kapjunk. Az eredményeket a 7. táblázatban foglaltam össze.
47
Gátlószer
Koncentráció
A tolperizon Clint
Az M1 metabolit
(szubsztrát)
(μM)
gátlása (%)
képződésének gátlása (%)
Izoforma-specifikus gátlószerek Kinidin
10
27 ± 6.6
77 ± 0.3
Ketokonazol
10
15 ± 13.1
24 ± 1.6
Furafillin
20
14 ± 4.0
25 ± 3.2
Szulfafenazol
200
19 ± 9.3
28 ± 0.9
S-mefenitoin
200
22 ± 5.6
16 ± 1.6
Nemspecifikus gátlószerek 100
39 ± 7.6
79 ± 0.4
1000
61 ± 9.4
100
1-aminobenzotriazol
1000
43 ± 7.4
100
1-benzilimidazol
1000
49 ± 2.5
100
SKF-525A
7. táblázat. A tolperizon-metabolizmus gátlása kémiai gátlószerekkel (átlag ± S.D., N=3)
Az egyes gátlószerek koncentrációját úgy választottuk meg, hogy közel legyenek az ún. diagnosztikus tartományhoz, de megfelelő mértékű gátlást lehessen elérni velük. A 100 % gátlás a 1000 μM SKF-525A, ABT és BI esetében azt jelenti, hogy az M1 metabolit egyáltalán nem volt kimutatható. Az izoforma-specifikus gátlószerek közül a legjelentősebb gátlást kinidin jelenlétében tudtuk mérni bár az anyavegyület fogyására gyakorolt hatás mértéke jóval elmarad az M1 képződésre gyakorolt hatás mértékétől. A mikroszomális FMO3 gátlására 10 mM tioureát használtunk, de gátlást sem a klirenszben, sem az M1 képződésében nem sikerült kimutatnunk. A nemspecifikus kémiai gátlószerekkel (SKF-525A, 1-aminobenzotriazol (ABT), 1-benzilimidazol (BI)) végzett kísérletek azt mutatták, hogy míg a CYP mediált
48
folyamatok, például a metil-hidroxiláció teljes mértékben gátolható volt, addig ezek az anyagok az anyavegyület fogyását csak kisebb mértékben tudták csökkenteni. 4.2.4. Gátló antitestek Humán CYP2D6 és CYP3A4 specifikus monoklonális és CYP2C8/9/19 és NADPH-P450 reduktáz specifikus poliklonális antitesteket használtunk az egyes CYP izoformák, illetve általában CYP-ek részvételének becslésére. Az eredményeket az alábbi táblázatban foglaltam össze. Mivel a CYP3A4 specifikus antitesttel nem sikerült gátlást kimutatnunk, az erre vonatkozó adatok nem szerepelnek a táblázatban. A tolperizon Clint
Az M1 metabolit képződésének
gátlása (%)
gátlása (%)
5 μM
50 μM
5 μM
50 μM
Anti CYP2C8/9/19
7 ± 1,0
14 ± 2,6
32 ± 5,7
39 ± 0,7
Anti CYP2D6
18 ± 1,3
11 ± 4,0
70 ± 1,1
49 ± 1,2
43 ± 3,4
-
76 ± 1,9
-
Anti NADPH-P450 reduktáz
8. táblázat. 5 μM és 50 μM tolperizon metabolizmus gátlása ellenanyagok segítségével (átlag ± S.D., N=3). Érdekes módon az ellenanyagokkal elérhető gátlás mértéke függött az alkalmazott szubsztrátkoncentrációtól: nagyobb koncentrációnál (50 μM) a CYP2C specifikus ellenanyag, ha kis mértékben is, de jobban gátolt, mint alacsony (5μM) koncentrációnál. A CYP2D6 esetében pont fordított a helyzet: alacsony szubsztrátkoncentrációt alkalmazva értünk el erősebb gátló hatást mind a klirensz gátlás, mind az M1 képződés terén. Meg kell azonban jegyezni, hogy a poliklonális ellenanyaggal kapott eredmények körültekintően értékelendők, mivel a kecske szérum önmagában serkentette a tolperizon bomlását. A NADPH-P450 reduktáz specifikus ellenanyag azt az enzimet gátolja, amely az összes CYP enzimnek szállít elektronokat, tehát a gátlás hatására az összes CYP mediált folyamat gátlódik. Az ellenanyag a tolperizon fogyást mintegy 43 %-kal gátolta, míg az
49
M1 képződésére kifejtett hatás sokkal markánsabb volt (76 %). Ezek az eredmények összhangban vannak a nemspecifikus kémiai CYP gátlószerekkel kapott eredményekkel. Kvalitatív LC/MS méréseink szerint a NADPH-P450 reduktáz elleni ellenanyag jelentősen gátolta az M1 és M2 metaboltok képződését (megfelelő kromatográfiás csúcsok magassága csökkent), míg a korábban azonosított M=247–nél jelentkező metabolit képződésére nem volt hatással. 4.2.5. Rekombináns enzimekkel végzett kísérletek Az egyes CYP izoformák hozzájárulását a tolperizon metabolizmusához rekombináns humán CYP enzimekkel is vizsgáltuk (CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 és CYP3A4). A 13. ábrán feltüntettem mind az anyavegyület fogyásának, mind az M1, mint főmetabolit képződésének mértékét az egyes rekombináns enzimeken.
Enzimaktivitás
pmol/min/pmol P450
3
2
1
0
1.00 μM M1 /20 perc
A
ND Control 1A2
2A6
ND 2B6
2C9
2C19
2D6
2E1
3A4
ND
ND
2E1
3A4
B
0.75 0.50 0.25 0.00
ND Control 1A2
ND
ND
ND
2A6
2B6
2C9
2C19
2D6
13. ábra. A tolperizon metabolizmusa rekombináns humán CYP enzimeket tartalmazó mikroszómákkal. A. Tolperizon fogyás. B. M1 képződés. ND: változás nem volt mérhető (átlag ± S.D., N=3).
50
A legaktívabb izoformának a CYP2D6 bizonyult mind az anyavegyület fogyása, mind a főmetabolit képződése alapján. (12. ábra). Emellett jelentős CYP2C19 aktivitás is kimutatható volt, valamint a CYP1A2 szerepét is igazoltuk mindkét említett metabolikus folyamatban. A CYP2B6 esetében az anyavegyület fogyása megfigyelhető volt, de a metabolizmus nem az M1, hanem más, általunk nem azonosított metabolit irányaban történt.
4.2.6. A tolperizon hidroxiláció enzimkinetikai jellemzése A hidroximetil-tolperizon (M1) képződésének útvonalát részletesebben is tanulmányoztuk, mivel ez egy bizonyítottan meghatározó in vitro biotranszformációs lépés. Elsőként a humán máj mikroszóma tolperizon-hidroxiláz aktivitását jellemeztük enzimkinetikai szempontból. Az eredményeket a 14. ábrán tüntettem fel.
30
A
B
20
v/[S]
Reakciósebesség (pmol/min/mg protein)
500
250
10
0
0 0
250
500
750
0
1000
Tolperizon (μM)
100
200
300
400
500
v
14. ábra. A tolperizon hidroxiláció kinetikája humán máj mikroszómán. A. Michelis-Menten ábrázolás. B. Eadie-Hofstee ábrázolás Az ’A’ ábrán a pontozott vonal az egy enzim részvételét leíró modell szerint, míg az egyenes vonal a két résztvevő alapján számolt illesztés eredménye. A vonatkozó korrelációs koefficiens (r2) értékei rendre 0,954 és 0,998. Látható tehát, hogy a két enzim részvételén alapuló modell (kétfázisú kinetika) sokkal pontosabb illesztést eredményez, vagyis, amint azt a rekombináns enzimekkel kapott eredmények alapján
51
már láttuk, a tolperizon metil-hidroxilációjáért legalább két enzim(populáció) felelős. Ezt igazolja az Eadie-Hofstee ábrázolás is, amelyen szemmel láthatóan három, különböző meredekségű egyenes illeszthető az ábrázolt pontokra. A nemlineáris illesztéssel kapott kinetikai paramétereket a 9. táblázat tartalmazza.
Km
(μM)
Vmax
(pmol/min/mg protein)
„Egy enzim”
„Két enzim”
modell
modell
Alacsony Km enzim
Magas Km enzim
67 ± 2,8
7,9 ± 0,95
448 ± 58,9
458 ± 8,2
172 ± 9,9
436 ± 12,7
9. táblázat. A tolperizon hidroxiláció enzimkinetikai paraméterei humán máj mikroszómán. (N=3, átlag ± S.D.) Az adatok alapján az egyik résztvevő enzim Km értéke 2 nagyságrenddel kisebb, mint a másik résztvevőé (7,9 vs. 448 μM). Mivel a Vmax értékekben nincs ilyen mértékű eltérés (172 vs. 436 pmol/min/mg protein) ezért arra következtettünk, hogy a kis Km-mel jellemezhető enzim szerepe a döntő a hidroxilációs lépés katalizálásában. A rekombináns enzimekkel végzett kísérleteink szerint a hidroximetil-tolperizon képződéséért a CYP1A2, a CYP2C19 és a CYP2D6 enzimek felelősek (ld. 13.B. ábra). Ezért a tolperizon hidroxiláció részletes kinetikai jellemzését a máj mikroszóma frakció mellett ezen rekombináns enzimek felhasználásával is elvégeztük (15. ábra).
52
Reakciósebesség (pmol/min/pmol P450)
CYP1A2 30
20
10
0 0
250
500
750
1000
Tolperizon (μM)
Reakciósebesség (pmol/min/pmol P450)
CYP2C19 40 30 20 10 0 0
250
500
750
1000
Tolperizon (μM)
Reakciósebesség (pmol/min/pmol P450)
CYP2D6 12
8
4
0 0
25
50
75
100
Tolperizon (μM)
15. ábra. A tolperizon hidroxiláció kinetikája rekombináns humán enzimekkel. Eredményeink alapján a CYP2D6, mint kis Km értékkel jellemezhető enzim vesz részt a hidroxilácóban, míg a CYP2C19 közepes, a CYP1A2 nagy Km-mel jellemezhető (10. táblázat). A Vmax értékeket elemezve kítűnik, hogy noha a CYP2D6 Vmax értéke jóval kisebb a másik két izoenzimre jellemző Vmax értékeknél, a Vmax/Km hányadost képezve mégis ez a legnagyobb intrizik klirenszszel működő komponens, vagyis a Km alacsony értéke a meghatározó az izoenzimek hozzájárulását illetően.
53
Km
Vmax
Vmax/Km
(μM)
(pmol/min/pmol P450)
(μl/min/pmol P450)
CYP1A2
160,6 ± 7,1
23,6 ± 5,78
0,15 ± 0,04
CYP2C19
24,4 ± 8,6
33,7 ± 9,16
1,47 ± 0,54
CYP2D6
1,8 ± 0,29
9,3 ± 2,46
5,16 ± 1,03
10. táblázat. A tolperizon-hidroxiláció rekombináns humán enzimeken mért enzimkinetikai paraméterei, valamint a számított intrinzik klirensz (átlag ± S.D., N=3).
4.2.7. A relatív részvétel becslése a Relatív Aktivitási Faktor (RAF) felhasználásával A tolperizon hidroxilációban szerepet játszó izoenzimek relatív részvételét a Venkatakrishnan és mtsi. által kidolgozott módszerrel határoztuk meg (részletesen lásd az Anyagok és Módszerek 3.2.6. pontjában). Az adatokat a 11. táblázatban foglaltam össze.
RAF (Ai)
Clint {vi(s)} [μl/min/pmol P450]
fi Ai vi(s)
(relatív részvétel) (%)
CYP1A2
31,0
0,15
4,65
3,0
CYP2C19
1,4
1,47
2,06
1,3
CYP2D6
28,6
5,16
147,6
95,7
11. táblázat. A tolperizon hidroxilácóban résztvevő CYP izoenzimek relatív részvételének becslése.
54
Eredményeink szerint a humán máj mikroszómában történő hidroxilációért majdnem teljes mértékben a CYP2D6 a felelős. A Vmax/Km alapján számolt Clint adatok a CYP2C19 nagyobb fontosságára engednek következtetni, ám ha ezeket az adatokat korrigáljuk a RAF értékével, az arány megfordul: a CYP1A2 a jelentősebb, bár szerepe így is elhanyagolható a domináló CYP2D6-tal szemben.
55
5. MEGBESZÉLÉS 5.1. NO DONOR MOLEKULÁK AZONOSÍTÁSA BIOMIMETIKUS ÉS IN VITRO BIOLÓGIAI RENDSZERBEN
Az in silico és in vitro technikák egyre szélesebb körben való elterjedése megköveteli, hogy olyan módszereket dolgozzunk ki, amelyek használatával adataink kiterjeszthetők egy következő, magasabb szintre. Ez azt jelenti, hogy pl. az in silico eredményeket jól lehessen használni in vitro vagy akár in vivo technikák eredményeinek becslésére (pl. receptor kötődés, enzimgátlók azonosítása) illetve, hogy az in vitro adatok az in vivo történéseket jelezzék előre. Vagyis megfogalmazódik az elvárás, hogy megfelelő jelző értékkel bírjanak a módszerek. Dolgozatomban a gyógyszerfejlesztés preklinikai fázisának két szintjét elemeztem abból a szempontból, hogy az alkalmazott módszerek mennyire alkalmasak az előbb említett előrejelzésre. A biomimetikus modell alkalmazásával igazoltuk a CYP enzimek azon képességét, hogy potenciális NO donorokból képesek NO-t lehasítani. E reakcióút a peroxid sönt útvonallal magyarázható. Ez az eredmény összhangban azokkal a megfigyelésekkel,
amelyek szerint a NO CYP-katalizált keletkezése NHA-ből és
analóg N-hidroxi vegyületekből a teljes ciklus mechanizmusával nem, míg a peroxid sönt útvonalat föltételezve jól magyarázható [45, 105 ]. A biomimetikus rendszer validálása során kapott eredményeink szerint a streptozotocin csupán H2O2 hatására is bomlik ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a NO képződés ebből a donorból nem specifikusan monooxigenáz közreműködésével zajlik: a reakcióhoz csupán oxidatív körülmények szükségesek. A V-PYRRO/NO esetében tapasztalt kismértékű NO termelés magyarázata lehet, hogy a korábbi hepatocita-vizsgálatok alapján a NO termelődése a molekulából egy többlépéses folyamat [106]. Ennek első lépéseként a molekula oxidálódik a CYP enzimek által a megfelelő epoxiddá, majd ezt az epoxidot az epoxid-hidrolázok alakítják át egy diazónium vegyületté, amelyből spontán képződik a NO. Mivel a kémiai rendszerben a hidrolízis limitált, ezért arra következtettünk, hogy az epoxid kevéssé hatékony továbbalakulása miatt képződik viszonylag kevés NO a molekulából. Ez a megfigyelés egyben arra is felhívja a figyelmet, hogy a biomimetikus
56
modell nem alkalmas olyan molekulák szűrésére, amelyek a biológiai közegben többlépéses, több enzimet igénylő folyamat során adnak le NO-t. Ezt az érvelést támasztják alá a patkány máj mikroszómával végzett kísérleteink: itt a V-PYRRO/NO esetében nagymértékű NO termelés volt megfigyelhető, ami azzal magyarázható, hogy a mikroszomális hidrolázok elvégzik az oxidált termék diazónium-vegyületté való átalakítását és így a NO spontán lehasadása kedvezményezetté válik. Mivel oxidatív környezetben a NO pillanatszerűen átalakul nitritté, e stabil, nemillékony terméknek a meghatározása Griess-Ilosvay reagenssel messzemenően alkalmas a NO termelés kimutatására. Az ismert NO donorokkal validált kísérleti rendszer alkalmas volt arra, hogy HTS platformon egy többezres molekulakönyvárból szűrjünk NO donor vegyületeket. Ezen szűrés eredménye az úgynevezett elsődleges találatok (primary hit) azonosítása. Az ily módon azonosított molekulák kémcsőkísérletben is pozitívnak bizonyultak. Ezt követően a patkány mikroszóma frakció felhasználásával is sikerült NO termelést kiváltanunk kumol-hidroperoxid jelenlétében, a peroxid sönt útvonalon. 5.2. A TOLPERIZON IN VITRO METABOLIZMUS VIZSGÁLATA A tolperizon in vitro metabolizmus vizsgálata során kimutattuk, hogy a tapasztalt alacsony, kb. 20%-os biológiai hasznosíthatóság a magas Clint következménye. E vizsgálataink során derült fény arra is, hogy a fő in vitro metabolit az LC/MS mérések alapján a hidroximetil-tolperizon (M1; M=261), valamint kimutatható kis mennyiségű karbonil redukált M1 (M2; M=263) és jelentős mennyiségben egy metabolit az anyavegyületénél 2-vel nagyobb tömegnál, M=247-nél. Mivel korábban Miyazaki és mtsi. több karbonil-redukált metabolitot azonosítottak patkányban [78], amelyek közül az egyiket (M2) mi is kimutattuk a tolperizon humán máj mikroszómával való inkubálását követően, ésszerű volt azt feltételezni, hogy a kérdéses metabolit az anyavegyület karbonil-redukált metabolitja. A NADPH-P450 reduktáz elleni ellenanyag nem csökkentette e metabolit képződését, míg az M1 és M2 metabolitok mennyisége csökkent, valamint nemspecifikus CYP gátlószerek (SKF-525A, ABT, BI) hatására a CYP mediált folyamatok teljes gátlása mellett a Clint csak kb. 50%-ban volt gátolható. Feltételeztük, hogy a tolperizon metabolizmusában egy CYP független szereplő is részt
57
vesz, amely enzim egy általunk eddig nem azonosított, NADPH függő karbonilreduktáz. A CYP-mediált folyamatok részletes vizsgálata kimutatta, hogy a kinidin volt a legerősebb gátló hatással mind az M1 képződésre, mind az anyavegyület fogyására. Ebből arra következtettünk, hogy a CYP2D6 játszik fontos szerepet a metabolizmusban, a metil-hidroxiláció katalízisével. Ezt a megfigyelést támasztották alá a rekombináns enzimekkel végzett kísérletek, amelyekben a legaktívabb izoforma szintén a CYP2D6 volt, mind az aktivitás, mind az M1 képződés szintjén. Mivel a rekombináns enzimekkel nyert adatokat óvatossággal kell kezelni, vagyis kiterjeszteni azokat csak megfelelő „scaling” módszerek alkalmazása után lehet, meghatároztuk az egyes izoenzimek relatív részvételét. A módszerünk az irodalomból ismert RAF számításon alapult, amelyhez a szükséges Vmax értékeket a laboratóriumban határoztuk meg. Ez alapján igazoltuk, hogy a döntő szerep a CYP2D6 izoenzimé a metil-hidroxiláció mint fő CYP-mediált biotranszformációs lépés katalízisében. A CYP2D6 specifikus gátló ellenanyaggal végzett kísérleteink is ezt igazolták: az ellenanyag 70%-ban gátolta az M1 képződését. A kémiai gátlószerek közül az S-mefenitoin (CYP2C19 kompetitív gátlószer) mintegy 22%-ban, a kinidinével kb. megegyező mértékben gátolta az anyavegyület fogyását, de az M1 képződés gátlására gyakorolt hatása gyengébb volt (16%). Ezzel ellentétben a rekombináns enzimekkel végzett kísérletek alapján a CYP2C19 a második legaktívabb izoformának bizonyult. A RAF számolás utáni becslés azonban megmutatta, hogy a rekombináns CYP2C19 enzimmel kapott adatok felülreprezentálják az enzim tényleges szerepét: a CYP2C19 jelentősége elhanyagolható a CYP2D6-éhoz képest, tehát alacsony gyógyszerszinteknél nem lesz számottevő. Az ellenanyagokkal kapott eredményeket óvatosan kell értelmezni, mivel a kecske szérum önmagában meggyorsította a tolperizon bomlását. A kísérletek szerint a CYP2D6 jelentősége a nagyobb koncentrációkat elérve csökken, míg a CYP2C19-é fokozódik. Ez a jelenség magyarázható a hidroxiláció kinetikájának jellemzésére végzett kísérletek adataival, amelyek szerint a CYP2D6 kis Km-mel (1,8 μM) és kis Vmax-szal (9,3 pmol/min/pmol) rendelkező enzim, míg a CYP2C19 nagyobb Km-jéhez (24,4 μM) nagyobb Vmax érték (33,7 pmol/min/pmol) társul. Tehát azt valószínűsítjük, hogy nővekvő tolperizon koncentrációknál a CYP2C19 szerepe nő.
58
Eredményeink szerint a CYP1A2 szintén részt vesz a biotranszformációban, de enzimkinetikai paraméterei (magas Km és Vmax) alapján szerepe nem lehet jelentős, mindazonáltal a májban lévő relatív mennyisége alapján (13%) mégsem elhanyagolható. Mivel a CYP1A2 nem polimorf, relatív részvétele megnövekedhet egy olyan egyedben, aki mind a CYP2D6-ra, mind a CYP2C19-re nézve PM fenotípusú. A furafillinnel, mint a CYP1A2 specifikus, mechanizmus-alapú gátlószerével végzett kísérleteink szerint az M1 képződés 25%-os gátlása felülreprezentálja az enzim tényleges hozzájárulását e metabolikus lépéshez. Kísérleteink szerint mind a ketokonazol, mind a szulfafenazol kb. egyenlő mértékű gátló hatást mutatott. Ebből azt a következtetést vonhatnánk le, hogy a CYP3A4 vagy a CYP2C9 is részt vesz a metabolizmusban. Ezt a feltételezést azonban más módszerekkel nem sikerült igazolnunk. Elképzelhető, hogy sem a ketokonazol, sem a szulfafenazol nem szelektíven gátolt az alkalmazott koncentrációban [107]. Kimutattuk, hogy a tolperizon szubsztrátja az FMO3 enzimnek, NHA csak nagyon kis reakciósebességet sikerült mérnünk. A tiokarbamid, az enzim kompetitív inhibitora még magas, 10 mM koncentrációban sem gátolta a metabolizmust. Az FMO3 index reakció gátlása tolperizonnal is azt mutatta, hogy NHA kimérhető a gátlási állandó (≈1 mM), annak magas értéke arra utal, hogy in vivo ezen enzim közreműködése semmiképp sem számottevő. Összefoglalva a tolperizon metabolizmusával kapcsolatos eredményeinket: kimutattuk, hogy in vitro körülmények között mind CYP-mediált, mind CYP független biotranszformációs utak részt vesznek a tolperizon metabolizmusában. A CYP-mediált folyamatok közül a hidroximetil-tolperizon képződést azonosítottuk, mint fő reakcióutat. Ezt a lépést elsősorban a CYP2D6 katalizálja, de a CYP2C19 és a CYP1A2 szerepét is igazoltuk, valamint bizonyítottuk a CYP2B6 részvételét. Kimutattuk továbbá, hogy az FMO3, ha kis mértékben is, de részt vesz a metabolizmusban. A képződött metabolitok, valamint a gátlási kísérletek egy eleddig nem azonosított mikroszomális karbonilreduktáz részvételére utalnak. Adataink birtokában összeállítottunk egy sémát a feltételezett és igazolt in vitro metabolikus útvonalakról (16. ábra).
59
M?
M?
CYP2B6
FMO3
CH3 CH3
C CH CH2
N
O
CYP2D6
Reduktáz
CYP2C19 CYP1A2
CH3 CH3
CH CH CH2
CH3 N
OH CH2
OH
C CH CH2
N
O
M1 CYP2D6
Reduktáz
CYP2C19 CYP1A2
CH3 OH CH2
CH CH CH2
N
OH
M2
16. ábra. A tolperizon in vitro metabolizmusának vázlata. A fekete vonallal jelzett képletek és nyilak azonosított szerkezetek és átalakulásokat, míg a szürke képletek és szaggatott nyilak feltételezett folyamatokat jelölnek.
60
6. KÖVETKEZTETÉSEK Dolgozatomban a gyógyszerkutatás preklinikai fázisában alkalmazott két, in
vitro metabolizmus modell előrejelző értékét vizsgáltam. Az első modell egy vasporfirin
alapú,
kémiai-biomimetikus
oxidációs
rendszer,
amellyel
egy
adott
molekulakönyvtár HTS platformon történő szűrése valósítható meg NO-donor sajátság szempontjából. A másik modell segítségével, humán máj mikroszomális és rekombináns
humán
CYP
enzimek
felhasználásával,
a
tolperizon
in
vitro
metabolizmusát térképeztük fel. A dolgozat új tudományos megállapításai a következők: 1. Létrehoztunk
és
ismert
NO-donorokkal
validáltunk
egy
HTS
alapú
biomimetikus rendszert tesztvegyületek NO-donor sajátságainak szűrésére. A VPYRRO/NO, mint májszelektív NO donor molekulával kapott eredményeink arra utalnak, hogy a modell előrejelző értéke korlátozott abban az esetben, ha konszekutív enzimatikus lépések szükségesek a NO képződéséhez. A validált biomimetikus oxidációs rendszer segítségével adott, kémiai hasonlóság alapján létrehozott
molekulakönyvtárból azonosítottuk az elsődleges találatokat
(„primary hits”) mint legaktívabb NO donor sajátságú vegyületeket, tehát kimutattuk, hogy a rendszer alkalmas HTS platformon történő szűrésre NOdonor sajátság szempontjából. 2. In
vitro
körülmények
között,
patkány
mikroszomális
CYP
enzimek
felhasználásával sikerült igazolni, hogy a biomimetikus oxidációs rendszer képes modellezni a CYP-katalizált átalakulást az úgynevezett peroxid sönt reakcióútvonalon. NO képződést a CYP teljes katalitikus ciklusának működésével, vagyis NADPH hozzáadásával nem sikerült kimutatni. Ez az eredmény összhangban azokkal a megfigyelésekkel, amelyek szerint a NO CYPkatalizált keletkezése N-hidroxi-argininből és analóg N-hidroxi vegyületekből a teljes ciklus mechanizmusával nem, míg a peroxid sönt útvonalat föltételezve jól magyarázható.
61
3. In vitro metabolizmus módszerekkel, humán máj mikroszóma frakciót felhasználva azonosítottuk a tolperizon metabolizmusában fontos szerepet játszó enzimeket. LC/MS méréseink alapján a fő in vitro metabolitok a következők: 1. hidroximetil-tolperizon, 2. ennek redukált formája és – indirekt bizonyítékok alapján – 3. az anyavegyület karbonil-redukált metabolitja. Kimutattuk, hogy a karbonil-redukált metabolit képződése általános CYP gátlószerekkel nem gátolható, míg a többi metabolit mennyisége e gátlás hatására csökken. Azt tapasztaltuk továbbá, hogy míg a Clint legfeljebb 60 %-kal volt gátolható ezen gátlószerek hatására, addig a kizárólag CYP enzimek révén keletkező hidoximetil-tolperizon egyáltalán nem volt kimutatható. Ezen eredményekből arra következtettünk, hogy a metabolizmusban egy mikroszomális, CYPfüggetlen karbonil reduktáz is részt vesz. 4. A klasszikus CYP reakció fenotípus meghatározás módszereivel igazoltuk, hogy a CYP2D6 játszik kulcsszerepet a tolperizon in vitro átalakításában a legjelentősebb, metil-hidroxilációs útvonalon. Kimutattuk, hogy a CYP2C19 és a CYP1A2 szintén részt vesz a tolperizon hidroxilációban, hozzájárulásuk azonban a CYP2D6 izoenzimhez viszonyítva nem jelentős. 5. A relatív aktivitási faktor (RAF) alapú relatív enzimrészvétel-becslés alapján a CYP2D6 döntő szerepét megerősítettük: kimutattuk, hogy mintegy 95%-ban ez az enzim felelős a mikroszomális tolperizon-hidroxilációért, mint a fő, CYPmediált metabolikus átalakításért. 6. Rekombináns enzimek felhasználásával a CYP2B6-ról kimutattuk, hogy részt vesz a tolperizon metabolizmusában, a képződött metabolitot azonban nem sikerült azonosítanunk. Az FMO3 enzimről igazoltuk, hogy in vitro körülmények
között
kimutatható
ugyan
a
hozzájárulása
a
tolperizon
metabolizmusához, de a mért paraméterek alapján arra következtettünk, hogy in
vivo ez a hatás nem releváns.
62
7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönöm témavezetőmnek, Dr. Tihanyi Károlynak, a Richter Gedeon Rt főosztályvezetőjének, hogy a doktori munkámat támogatta és mindvégig buzdított. Nagyon sokat tanultam tőle mind a kutatás módszertanát, mind a kutatói hozzáállást és gondolkozásmódot illetően. Köszönöm Dr. Szombathelyi Zsoltnak, a Richter Gedeon Rt. kutatási igazgatójának a támogató hozzájárulását. Hálás vagyok Kiss Bélának, a Molekuláris Farmakológiai Laboratórium vezetőjének: támogatása sokat jelentett nekem. Köszönöm Dr. Szőke Éva professzorasszonynak a hathatós támogatást. Örülök, hogy együtt dolgozhattam Dr. Balogh György Tiborral, akiben kiváló kutatót ismertem meg, és akivel gyümölcsöző munkakapcsolatot alakítottunk ki a biomimetikus oxidációs téma kapcsán. A vele folytatott beszélgetések mindig inspirálóan hatottak a munkámra. Köszönöm Dr. Keserű György Miklósnak, hogy annak idején hozzám fordult ötletével és így részt vehettem egy számomra új és nagyon izgalmas téma kidolgozásában. Köszönöm Dr. Molnár Lászlónak és Dr. Kirschner Norbertnek a dolgozat előzetes bírálatát. Köszönöm kollégáimnak, Dr. Szeberényi Szabolcsnak a sok új ötletet és javaslatot és Dr. Leibinger Jánosnak az LC/MS mérésekben nyújtott segítségét, Merkl Péternének és Borsos Mariannának a mindennapi labormunkában nyújtott sok segítségét. Hálás vagyok Nagy Zoltánnak, a Bioekvivalencia csoport vezetőjének, hogy bokros teendői mellett néhány mérésre időt tudott szakítani. Köszönöm kollégáimnak, Benkő Bernadettnek, Borbás Tímeának és Elekes Ottíliának, hogy jó légkört teremtettek a munkához, és ha nehézségeim támadtak, mellém álltak. Végül, de nem utolsó sorban köszönöm családomnak a bátorítást, a türelmet és a rengeteg segítséget.
63
8. IRODALOMJEGYZÉK
[1] Wrighton SA, Vandenbranden M, Stevens JC, Shipley LA, Ring BJ, Rettie AE, Cashman JR. (1994) In vitro methods for assessing human hepatic drug metabolism: their use in drug development. Drug Metab Rev 26:483. [ 2 ] Yuan R, Parmelee T, Balian JD, Uppoor RS, Ajayi F, Burnett A, Lesko LJ, Marroum P. (1999) In vitro metabolic interaction studies: experience of the Food and Drug Administration. Clin Pharmacol Ther 66: 9-15. [3] Bjornsson TD, Callaghan JT, Einolf HJ, Fischer V, Gan L, Grimm S, Kao J, King SP, Miwa G, Ni L, Kumar G, McLeod J, Obach RS, Roberts S, Roe A, Shah A, Snikeris F, Sullivan JT, Tweedie D, Vega JM, Walsh J and Wrighton SA. (2003) The conduct of in vitro and in vivo drug-drug interaction studies: a Pharmaceutical Research and Manufacturers of America (PhRMA) perspective Drug Metab Dispos 31:815-832. [4] Walsky RL and Obach RS (2004) Validated assays for human cytochrome P450 activities. Drug Metab Dispos 32:647-660. [5] Miskolczi P, Vereczkey L and Frenkl R (1987) Gas-liquid chromatographic method for the determination of tolperisone in human plasma: pharmacokinetic and comparative bioavailability studies. J Pharm Biomed Anal 5:695-700. [6] Vereczkey L, Monostory K és Veres Zs. (1998) Human gyógyszermetabolizáló enzimek. I. Oxidációs enzimek. Acta Pharmaceutica Hungarica 68:276-283. [7] Fürst Zsuzsanna (szerk.): Farmakológia Medicina, 2001 [8] Nebert DW, Nelson DR and Feyereisen R (1989) Evolution of the cytochrome P450 genes. Xenobiotica 19: 1149-1160. [9] Stier A (1976) Lipid structures of drug metabolizing enzymes. Biochem Pharmacol 25: 109-113. [10] Garfinkel D (1958) Studies on pig liver microsomes.I. Enzymic and pigment composition of different microsomal fractions. Arch Biochem Biophys 77:493-509. [11] Klingenberg M (1958) Pigments of rat liver microsomes Arch Biochem Biophys 75:376-386. [12] Omura T and Sato R (1962) A new cytochrome in liver microsomes. J Biol Chem 237: 1375-1376
64
[ 13 ] Omura T and Sato R (1964) The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. J Biol Chem 239: 2370-2385. [14] Lewis David FV (2001) Guide to Cytochrome P450. Structure and Function. Taylor and Francis, London and New York. [15] Rodrigues DA (ed.) (2002) Drug-drug interactions. Marcel Dekker, Inc., New York, Basel [16] Gonzalez FP (1989) The molecular biology of cytochrome P450s. Pharmacol Rev 40:243-288. [17] Rendic S and DiCarlo FJ (1997) Human cytochrome P450 enzymes: a status report summarizing their reactions, substrates, inducers, and inhibitors. Drug Metab Rev 29:413-580. [ 18] Yamazaki H, Komatsu T, Takemoto K, Saeki M, Minami Y, Kawaguchi Y, Shimada N, Nakajima M and Yokoi T. (2001) Decreases in Phenytoin Hydroxylation Activities Catalyzed by Liver Microsomal Cytochrome P450 Enzymes in Phenytoin-Treated Rats. Drug Metab Dispos 29: 427-434. [19] Moridani MY, Scobie H, Jamshidzadeh A, Salehi P and O'Brien PJ (2001) Caffeic Acid, Chlorogenic Acid, and Dihydrocaffeic Acid Metabolism: Glutathione Conjugate Formation. Drug Metab Dispos 29: 1432-1439. [20] Guengerich, F.P. (1990) Enzymatic oxidation of xenobiotic chemicals Crit Rev Biochem Mol Biol 25:97-153. [ 21 ] Groves JT, Nemo TE and Myers RS (1979) Hydroxylation and epoxidation catalyzed by iron-porphine complexes. Oxygen transfer from iodosylbenzene. J Am Chem Soc 101:1032-1033. [22] Ortiz de Montellano PR (ed.) (1995) Cytochrome P-450: Structure, Mechanism and Biochemistry, Plenum Press, New York. [ 23 ] Groves JT and Viski P (1990) Asymmetric hydroxylation, epoxidation, and sulfoxidation catalyzed by vaulted binaphthyl metalloporphyrins J Org Chem 55:3628-3634 [24] Groves JT and Viski P(1989) Asymmetric hydroxylation by a chiral iron porphyrin. J Am Chem Soc 111: 8537-8538 [25] Groves JT and Myers RS (1983) Catalytic asymmetric epoxidations with chiral iron porphyrins. J Am Chem Soc 105: 5791-5796 [26] Hanson RM(1991) The synthetic methodology of nonracemic glycidol and related 2,3-epoxy alcohols. Chem Rev 91:437-476
65
[ 27 ] Balogh György Tibor: Biológiai oxidációk biomimetikus modellezése. Ph.D. értekezés 2003, Budapest [ 28 ] Balogh GT and Keserű GM (2004) Metalloporphyrin mediated biomimetic oxidations. A useful tool for the investigation of cytochrome P450 catalyzed oxidative metabolism. ARKIVOC 2004(vii) 124-139. [ 29 ] Groves JT, Gross Z and Stern MK (1994) Preparation and Reactivity of Oxoiron(IV) Porphyrins. Inorg Chem 33: 5065-5072. [30] Dicken CM, Lu FL, Nee MW and Bruice TC (1985) Kinetics and mechanisms of oxygen transfer in the reaction of p-cyano-N,N-dimethylaniline N-oxide with metalloporphyrin salts. 2. Amine oxidation and oxygen transfer to hydrocarbon substrates accompanying the reaction of p-cyano-N,N-dimethylaniline N-oxide with meso-(tetraphenylporphinato)iron(III) chloride. J Am Chem Soc 107: 57765789. [31] De Poorter B, Ricci M and Meunier B(1985) Oxone as oxygen donor in the catalytic hydroxylation of saturated hydrocarbons. Tetrahedron Lett. 26: 44594462. [32] De Poorter B, Ricci M and Meunier B (1985) Catalytic hydroxylation of saturated hydrocarbons with the sodium hypohalite/manganese porphyrin system. J Mol Catal 31, 221-224. [33] Penner-Hahn JE, McMurry TJ, Renner M, Latos-Grazynsky L, Eble KS, Davis IM, Balch AL, Groves JT, Dawson JR and Hodgson KO (1983) X-ray absorption spectroscopic studies of high valent iron porphyrins. Horseradish peroxidase compounds I and II and synthetic models.J Biol Chem 258, 12761-12764. [34] Penner-Hahn JE, Eble KS, McMurry TJ, Renner M, Balch AL, Groves JT, Dawson JR and Hodgson KO (1986) Structural characterization of horseradish peroxidase using EXAFS spectroscopy. Evidence for Fe = O ligation in compounds I and II. J Am Chem Soc 108: 7819-7825. [35] Masumoto H, Takeuchi K, Ohta S and Hirobe M. (1989) Application of chemical P450 model systems to studies on drug metabolism. I. Phencyclidine: a multifunctional model substrate. Chem Pharm Bull 37(7):1788-1794. [36] Chauncey MA and Ninomiya S (1990) Metabolic studies with model cytochrome P-450 systems. Tetrahedron Lett 31(41):5901-5904. [37] Bernadou J, Bonnafous M, Labar G, Loiseau P, and Meunier B (1991) Model systems for metabolism studies. Biomimetic oxidation of acetaminophen and
66
ellipticine derivatives with water-soluble metalloporphyrins associated to potassium monopersulfate Drug Metab Dispos 19: 360-365. [38] Andersen KE, Begtrup, Chorghade MS, Lee EC, Lau J, Lundt BF, Petersen H, Sørensen PO and Thøgersen H (1994) The synthesis of novel GABA uptake inhibitors. Part 2. Synthesis of 5-hydroxytiagabine, a human metabolite of the GABA reuptake inhibitor tiagabine. Tetrahedron 50(29):8699-8710 [39] Carrier MN, Battioni P and Mansuy D (1993) Studying drug metabolic oxidation with biomimetic metalloporphyrin systems: problems and solutions in the case of lidocaine. Bull Soc Chim Fr 130:405-416 [40] Keserű GM, Balogh GT, Czudor I, Karancsi T, Fehér A and Bertók B (1999) Chemical models of Cytochrome P450catalyzed insecticide metabolism. Application to the oxidative metabolism of carbamate insecticide. J Agric Food Chem 47:762-769 [41] Joo H, Lin Z and Arnold FH (1999) Laboratory evolution of peroxide mediated cytochrome P450 hydroxylation. Nature 399:670-673. [42] Greiner István, Keserű György Miklós és Szombathelyi Zsolt (2004) Nagy átersztőképességű módszerek a gyógyszerkutatásban. Magyar Kémikusok Lapja 59:208-213. [43] Griffith OW and Stuehr DJ (1995) Nitric oxide synthases: properties and catalytic mechanism. Annu Rev Physiol 57:707-736 [44] Keserű GM, Balogh GT and Karancsi T (2000) Metalloporphyrin catalyzed oxidation of N-hydroxyguanidines: a biomimetic model for the H2O2-dependent activity of nitric oxide synthase. Bioorg Med Chem Lett 10:1775-1777. [45] Andronik V, Boucher JL, Delaforge M, Henry Y and Mansuy D(1992) Formation of nitric oxide by cytochrome P450-catalyzed oxidation of aromatic amidoximes. Biochem Biophys Res Commun 185: 452-458. [46] Rodrigues AD nad Rushmore TH (2002) Cytochrome P450 Pharmacogenetics in drug developement: in vitro studies and clinical consequences. Curr Drug Metab 3:289-309. [ 47 ] Ritschel WA and Kearns GL (1999, 5th edition) Handbook of basic pharmacokinetics. An APHA Handbook [ 48 ] Bugrim A, Nikolskaya T and Nikolsky Y (2004) Early prediction of drug metabolism and toxicity: systems biology approach and modeling Drug Discov Today 9:127-135
67
[49] Venkatesh S and Lipper RA (2000) J Pharm Sci Role of the development scientist in compound lead selection and optimization. 89(2):145-154 [50] Lin JH (2000) Sense and nonsense in the prediction of drug-drug interactions. Curr Drug Metab 1:305-331 [51] LeCluyse EL (2001) Human hepatocyte culture systems for the in vitro evaluation of cytochrome P450 expression and regulation. Eur J Pharm Sci 13:343-368 [52] Worboys PD and Carlile DJ (2001) Implications and consequences of enzyme induction on preclinical and clinical drug development. Xenobiotica 31:539-556 [53] Rodrigues AD (1999) Integrated cytochrome P450 reaction phenotyping: Attempting to bridge the gap between cDNA-expressed cytochromes P450 and native human liver microsomes. Biochem Pharmacol 57:465-480. [54] Störmer E, von Moltke LL and Greenblat DJ (2000) Scaling drug biotransformation data from cDNA-expressed CYP to human liver: a comparison of relative activity factors and human liver abundance in studies of mirtazapine metabolism. J Pharmacol Exp Ther 295:793-801. [55] Venkatakrishnan K, von Moltke LL, Court MH, Harmatz JS, Crespi CL, and Greenblatt DJ. (2000) Comparison between cytochrome P450 (CYP) content and relative activity approaches to scaling from cDNA-expressed CYPs to human liver microsomes: ratios of accessory proteins as sources of discrepancies between the approaches. Drug Metab Dispos, 28:1493-1504. [56] Wen Xia (2002) In vitro approaches in evaluation and prediction of drug-drug interactions involving the inhibition of cytochrome P450 enzymes. Academic dissertation. http://ethesis.helsinki.fi [ 57 ] Venkatakrishnan K, von Moltke LL and Greenblatt D (2001) Human drug metabolism and the cytochromes P450: application and relevance of in vitro models. J Clin Pharmacol 41:1149-1179 [58] von Moltke LL, Greenblatt DJ, Grassi JM, Granda BW, Venkatakrishnan K, Duan SX, Fogelman SM, Harmatz JS and Shader RI. (1999) Citalopram and desmethylcitalopram in vitro: human cytochromes mediating transformation, and cytochrome inhibitory effect. Psychiatry 46:839-849. [ 59 ] von Moltke LL, Greenblatt DJ, Granda BW, Duan SX, Grassi JM, Venkatakrishnan K, Harmatz JS and Shader RI (1999) Zolpidem metabolism in vitro: responsible cytochromes, chemical inhibitors, and in vivo correlations. Br J Clin Pharmacol 48:89-97.
68
[60] Lin Y, Lu P, Tang C,Mei Q, Sandig G, Rodrigues AD, Rushmore TH and Shou M (2001) Substrate inhibition kinetics for cytochrome P450-catalyzed reactions. Drug Metab Dispos 29:368-374. [61] Shou M, Grogan J, Mancewicz JA, Krausz KW, Gonzalez FJ, Gelboin HV and Korzekwa KR. (1994) Activation of CYP3A4: evidence for the simultaneous binding of two substrates in a cytochrome P450 active site. Biochemistry 33:64506455. [ 62 ] Shou M, Mei Q, Ettore MW, Dai R, Baillie TA and Rushmore TH (1999) Sigmoidal kinetic model for two co-operative substrate binding sites in a cytochrome P450 active site: an example of the metabolism of diazepam and its derivatives. Biochem J 340:845-853. [63] Houston JB and Kenworthy KE (2000) In vitro-in vivo scaling of CYP kinetic data not consistent with the classical Michaelis-Menten model. Drug Metab Dispos 28:246-254. [64] Hutzler JM and Tracy TS (2002) Atypical kinetic profiles in drug metabolism reactions. Drug Metab Dispos 30:355-362. [65] Schmider J, Greenblatt DJ Harmatz JS and Shader RI (1996) Enzyme kinetic modelling as a tool to analyze the behaviour of cytochrome P450 catalysed reactions: application to amitriptyline N-demethylation. Br J Clin Pharmacol 41:593-604 [66] Venkatakrishnan K, von Moltke LL and Greenblatt DJ (1998) Human cytochromes P450 mediating fenacetin O-deethylation in vitro: validation of the high affinity component as an index of CYP1A2 activity. J Pharm Sci 87:1502-1507. [67] Bourrié M, Meunier V, Berger Y and Fabre G (1996) Cytochrome P450 isoform inhibitor sas a tool for the investigation of metabolic reactions catalyzed by human liver microsomes. J Pharm Exp Ther 277:321-332 [68] Halpert JR, Guengerich FP, Bend JR, and Correia MA (1994) Selective inhibitors of cytochromes P450. Toxicol Appl Pharm 125:163-175. [ 69 ] Guengerich FP (1996) In vitro techniques for studying drug metabolism. J Pharmacokinet Biop 24:521-533. [70] Mayhew BS, Jones DR and Hall SD (2000) An in vitro model for predicting in vivo inhibition of cytochrome P4503A4 by metabolic intermediate complex formation. Drug Metab Dispos 28:1031-1037. [71] Bertelsen KM, Venkatakrishnan K, von Moltke LL, Obach RS and Greenblatt DJ (2003) Apparent mechanism-based inhibition of human CYP2D in vitro by
69
paroxetine: comparison with fluoxetine and quinidine. Drug Metab Dispos 31:289-293. [72] Jemnitz K and Vereczkey L (2002) Prediction of polymorphic N-acetylation of new drug candidates by correlation with human NAT1 and NAT2. Drug Develop Res 51:1-6. [73] Pórszász J, Nador K, Pórszász KG and Barankay T (1961) Pharmacologie einer neuen interneuron-lähmenden Substanz 1-Piperidino-2-methyl-3-(p-tolyl)-propan3-on. Arzneimittel-Forschung 11:257 [74] Ono H, Fukuda H and Kudo Y (1984) Mechanisms of depressant action of muscle relaxants on spinal reflexes: participation of membrane stabilizing action. J Pharm Dyn 7:171-176. [75] Oortgiesen M, van-Kleef RG and Vijverberg HP (1990) Block of deltamethrinmodified sodium current in cultured mouse neuroblastoma cells: local anesthetics as potential antidotes. Brain Res 518:11-18 [76] Pratzel HG, Alken RG, Ramm S (1996) Efficacy and tolerance of repeated oral doses of tolperisone hydrochloride in the treatment of painful muscle spasm: results of a prospective placebo-controlled double-blind trial. Pain 67:417. [77] Nil Nocere 2004 [78] Miyazaki H, Ishibashi M, Takayama H, Abuki H, Idzu G, Morishita N and Ando M (1972) Studies on drug metabolism by gas chromatograph-mass spectrometer. Metabolism of Mydocalm. Proceedings of the 4th Symp. On Drug Metabolism and Action, September 21-22, Sendai, Japan pp.154-164. [ 79 ] Miyazaki H, Ishibashi M, Izawa T, Takayama H and Idzu G (1975) Mass phragmetographic determination of 1-piperidino-2,4’-dimethyl-propiophenone (Mydocalm) by use of 1:1 mixture technique. Chem Pharm Bull 23:837-843 [80] Venkatakrishnan K, von Moltke LL, Obach RS and Greenblatt DJ. (2003) Drug metabolism and drug interactions: application and clinical value of in vitro models. Curr Drug Metab. 4(5):423-59. [81] Sesardic D, Boobis AR, Murray BP, Murray S, Segura J, de la Torre R and Davies DS (1990) Furafylline is a potent and selective inhibitor of cytochrome P4501A2 in man. Br J Clin Pharmacol 29:651-663 [82] Kunze KL and Trager WF (1993) Isoform selective mechanism-based inhibition of human CYP1A2 by furafylline. Chem Res Toxicol 6:649-656
70
[ 83 ] Tassaneeyakul W, Birkett DJ, Veronese ME, McManus ME, Tukey RH and Miners JO (1994) Direct characterization of the selectivity of furafylline as an inhibitor of human cytochromes P450 1A1 and 1A2. Pharmacogenetics 4:281-284 [ 84 ] Newton DJ, Wang RW and Lu AYH (1995) Cytochrome P450 inhibitors: Evaluation of specificities in the in vitro metabolism of therapeutic agents by human liver microsomes. Drug Metab Dispos 23:154-158 [85] Baldwin DJ, Bloomer JC, Smith GJ, Ayrton AD, Clarke SE and Chenery RJ (1995) Ketoconazole and sulfaphenazole as the respective and selective inhibitors of P4503A and 2C9. Xenobiotica 25:261-270 [86] Goldstein JA, Faletto MB, Romkes-Sparks M, Sullivan T, Kitareewan S, Raucy JL, Lasker JM and Ghanayem BI (1994) Evidence that CYP2C19 is the major (S)mephenytoin 4‘-hydroxylase in humans. Biochemistry 33:1743-1752 [87] Küpfer A and Preisig R (1984) Pharmacogenetics of mephenytoin: A new drug hydroxylation polymorphism in man. Eur J Clin Pharmacol 26:753-759 [88] Sai Y, Dai R, Yang TJ, Krausz KW, Gonzalez FJ and Gelboin HV and Shou M (2000) Assessment of specificity of eight chemical inhibitors using cDNAexpressed cytochromes P450. Xenobiotica 30:327-343 [89] Poulsen LL, Hyslop RM and Ziegler D (1979) S-oxygenation of N-substituted thioureas catalyzed by the pig liver microsomal FAD-containing monooxygenase. Arch Biochem Biophys 198:78-88 [ 90 ] Schenkman JB, Wilson BJ and Cinti DL (1972) Diethyaminoethyl 2,2diphenylvalerate HCl (SKF-525-A)-in vivo and in vitro effects of metabolism by rat liver microsomes-formation of an oxygenated complex. Biochem Pharmacol 21:2373-2383 [91] Xu D, Voigt JM, Mico BA, Kominami S, Takemori S and Colby HD (1994) Inhibition of adrenal cytochromes P450 by 1-aminobenzotriazole in vitro: selectivity for xenobiotic metabolism. Biochem Pharmacol 48:1421-1426 [92] Grothusen A, Hardt J, Bräutigam L, Lang D and Böcker R (1996) A convenient method to discriminate between cytochrome P450 enzymes and flavin-containing monooxygenases in human liver microsomes. Arch Toxicol 71:64-71 [ 93 ] Madan A, Parkinson A and Faiman MD (1993) Role of flavin-dependent monooxygenases and cytochrome P450 enzymes in the sulfoxidation of S-methyl N,N-diethylthiolcarbamate. Biochem Pharmacol 46:2291-2297 [94] Rodrigues AD (1996) Measurement of human liver microsomal cytochrome P450 2D6 activity using [O-methyl-14C]Dextromethorphan as substrate. Method Enzymol 272: 186-195.
71
[ 95 ] Boobis AR, Murray S, Hampden CE and Davies DS (1985) Genetic polymorphysm in drug oxidation: in vitro studies of human debrisoquine 4hydroxylase and bufuralol 1’-hydroxylase activities. Biochem Pharmacol 34:6571 [96] Anderson CD, Wang J, Kumar GN, McMillan JM, Walle UK and Walle T (1995) Dexamethasone induction of taxol metabolism in the rat. Drug Metab Dispos 23:1286-12901 [97] Miners JO, Smith KJ, Robson RA, McManus ME, Veronese ME and Birkett DJ (1988) Tolbutamide hydroxylation by human liver microsomes. Kinetic characterisation and relationship to other cytochrome P-450 dependent xenobiotic oxidations. Biochem Pharmacol 37:1137-1144 [98] von Moltke LL, Greenblatt DJ, Duan SX, Schmider J, Kudchadker L, Fogelman SM, Harmatz JS and Shader RI (1996) Fenacetin O-deethylation by human liver microsomes in vitro: inhibition by chemical probes, SSRI antidepressants, nefazodone and venlafaxine. Psychopharmacology 128:398-407 [99] Pike MG, Martin YN, Mays DC, Benson LM, Naylor S and Lipsky JJ (1999) Roles of FMO and CYP450 in the metabolism in human liver microsomes of S-methylN,N-diethyldithiocarbamate, a disulfiram metabolite. Alcohol Clin Exp Res 23:1173-1179 [100] Kronbach T, Mathys D, Gut J, Catin T and Meyer UA (1987) High performance liquid chromatographic assay for bufuralol 1’-hydroxylase, debrisoquine 4hydroxylase, and dextromethorphan O-demethylase in microsomes and purified cytochrome P-450 isozymes of human liver. Anal Biochem 162:24-32 [ 101 ] Kakkar T, Boxenbaum H and Mayerson M (1999) Estimation of Ki in a competitive enzyme-inhibition model: comparisons among three methods of data analysis. Drug Metab Dispos 27:756-762 [ 102 ] Alston TA, Porter DJ and Bright HJ (1985) Generation of nitric oxide by enzymatic oxidation of N-hydroxy-N-nitrosamines. J Biol Chem 260:4069-4074 [103] Liu J, Li, C, Waalkes MP, Clark J, Myers P, Saavedra JE and Keefer LK. (2003) The nitric oxide donor, V-PYRRO/NO, protects against acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. Hepatology 37:324-333. [104] Meunier, B. In Metalloporphyrins Catalyzed Oxidations; Montanari F and Casella L (eds.) Kluwer Academic Pub. Dordrecht, 1994 pp1-4. [105] Renaud JP, Boucher JL, Vadon S, Delaforge M and Mansuy D (1993) Particular ability of liver P450s3A to catalyze the oxidation of N omega-hydroxyarginine to citrulline and nitrogen oxides and occurrence in no synthases of a sequence very
72
similar to the heme-binding sequence in P450s. Biochem Biophys Res Commun 192:53-60 [106] Saavedra JE, Billiar TR, Williams DL, KimYM, Watkins SC and Keefer LK. (1997) Targeting Nitric Oxide (NO) Delivery in Vivo. Design of a LiverSelective NO Donor Prodrug That Blocks Tumor Necrosis Factor-a-Induced Apoptosis and Toxicity in the Liver. J Med Chem 40: 1947-1954. [107] Sai Y, Dai R, Yang TJ, Krausz KW, Gonzalez FJ, Gelboin HV and Shou M (2000) Assessment of specificity of eight inhibitors using cDNA-expressed cytochromes P450. Xenobiotica 30:327-343.
73
9. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ KÖZLEMÉNYEK Dalmadi B, Leibinger J, Szeberényi S, Borbás T, Farkas S, Szombathelyi Z, Tihanyi K. (2003) Identification of metabolic pathways involved in the biotransformation of tolperisone by human microsomal enzymes. Drug Metab Dispos; 31(5):631-636. György T. Balogh, Balázs Dalmadi, Attila Bielik and György M. Keserű (2005) Identification of Nitric Oxide Donors by Biomimetic HTS Application. Comb Chem
High T SCR; 8(4):347-352. EGYÉB KÖZLEMÉNYEK Mező G, Dalmadi B, Mucsi I, Bősze S, Rajnavölgyi É, Hudecz F. (2002) Peptide based vaccine design: synthesis and immunological characterization of branched polypeptide conjugates comprising the 276-284 immunodominant epitope of HSV 1 glycoprotein D. J Pept Sci; 8(3):107-117. Szökő É, Tábi T, Borbás T, Dalmadi B, Tihanyi K and Magyar K (2004) Assessment of the N-oxidation of deprenyl, methamphetamine and amphetamine enantiomers by chiral capillary electrophoresis: An in vitro metabolism study.
Electrophoresis; 25: 2866-2875. AZ ÉRTEKEZÉSHEZ KAPCSOLÓDÓ ELŐADÁSOK, POSZTEREK Dalmadi Balázs, Leibinger János, Szeberényi Szabolcs, Borbás Tímea, Pásztor Gabriella, Farkas Sándor, Tihanyi Károly A tolperisone in vitro metabolikus vizsgálata
A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság Farmakokinetika és Gyógyszermetabolizmus Szekciója Szimpóziuma. Mátraháza, 2002. április 4-6.
Balázs Dalmadi, János Leibinger, Tímea Borbás, Szabolcs Szeberényi and Károly Tihanyi Kinetic characterization of tolperisone hydroxylation by human microsomal enzymes
8th European ISSX Meeting April 27-May 1, 2003 Dijon, France (poszter) Absztrakt: Drug Metab Rev 35:188 (No 236). Dalmadi Balázs és Tihanyi Károly Predikció és korlátai az ADME területén
Magyar Toxikológusok Társasága Kongresszusa, 2003. november 6-8., Zalakaros. Mészárosné Pásztor Gabriella, Dalmadi Balázs, Kapás Margit, Tihanyi Károly Tolperizon és dextromethorphan farmakokinetikai interakciójának vizsgálata in vitro és in vivo
Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság Farmakokinetika és Gyógyszermetabolizmus Szekciója Szimpóziuma. Mátraháza, 2004. április 15-17. Balogh György Tibor, Dalmadi Balázs, Bielik Attila, Keserű György Miklós Nitrogén monoxid donorok azonosítása biomimetikus HTS segítségével
Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium. Eger, '04, 2004. szeptember 20-21. EGYÉB ELŐADÁSOK, POSZTEREK Dalmadi Balázs és Rajnavölgyi Éva Az immunválasz hatékonyságának növelése influenza vírus hemagglutinin molekulából származó szintetikus peptidek immunkomplexben történő oltásával
A Magyar Immunológiai Társaság XXVII. Kongresszusa 1998. szeptember 30-október 2 , Harkány.
75
Dalmadi Balázs, Horváth Attila, Tóth Gábor, Gergely János, Rajnavölgyi Éva Virális fehérje epitopokat magukban foglaló szintetikus peptidek immunogenitásának fokozása peptid specifikus ellenanyag segítségével
A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya 4. Munkaértekezlete, 1999 május 10-13, Eger. (poszter) Tímea Borbás, Balázs Dalmadi, János Leibinger, Szabolcs Szeberényi, Zsolt Szombathelyi and Károly Tihanyi Co-expression of CYP and FMO isoforms based on enzymatic activity in rat and in human liver microsomes
8th European ISSX Meeting April 27-May 1, 2003 Dijon, France. (poszter) Borbás Tímea, Benkő Bernadett, Dalmadi Balázs, Győrke Imola, Tihanyi Károly Humán hepatocita citokróm P450 izoenzimek adatainak statisztikai kiértékelése
Magyar Gyógyszerésztudományi Társaság Ipari Szervezete Gyógyszer az ezredfordulón V. Konferenciája. Az európai csatlakozás küszöbén. Sopron, 2004. március 25-27. (poszter) Borbás Tímea, Benkő Bernadett, Galgóczy Kornél, Dalmadi Balázs, Győrke Imola, Tihanyi Károly Streptozotocin-indukálta diabétesz hatása a hepatikus és intesztinális gyógyszermetabolizmusra patkányban
Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság Farmakokinetikai és Gyógyszermetabolizmus Szekciója Szimpóziuma. Mátraháza, 2004. április 15-17.
SZABADALMI BEJELENTÉSEK Tihanyi, Károly; Kocsis, Pál; Németh, György; Tarnawa, István; Dalmadi, Balázs: Combination of dextromethorphan and a substituted phenylpiperidine compounduseful for treating spasticity and pain. WO-2004089352 21 October 2004.
76
Összefoglaló Az eredeti gyógyszerkutatásban uralkodó kiélezett verseny megköveteli, hogy olyan technikákat alkalmazzunk, amelyek segítségével egy adott molekula tulajdonságai, fejleszthetősége a K+F minél korábbi szakaszában megjósolhatók. Egy másik, szintén egyre fontosabb törekvés olyan robusztus módszerek kifejlesztése, amelyek nagyszámú molekula hatékony szűrését teszik lehetővé (HTS). Az in vitro technikák megfelelő alternatívát jelentenek az állatkísérletekhez képest, amennyiben munka- és költséghatékonyabbak, valamint humán eredetű sejtek, sejtfrakciók felhasználásával jó közelítés nyerhető a klinikai történésekre vonatkozóan. Dolgozatomban az in vitro metabolizmus alapú rendszerek prediktív értékét két szinten vizsgáltam: az első egy biomimetikus, szintetikus metalloporfirin alapú validált kémiai rendszer, amelynek HTS alapon történő használatával nitrogén-monoxid (NO) donor sajátságú molekulák hatékony szűrése valósítható meg. Az e szűrésből származó molekulák NO donor sajátságát patkány mikroszomális CYP enzimeket fölhasználva is igazoltuk. Az eredmények alapján bizonyítottuk, hogy a biomimetikus rendszer jól modellezi a citokróm P450 (CYP) peroxid sönt útvonalán zajló NO termelést. Az in vitro módszerek másik szintjét jelentik azok a vizsgálataink, amelyekben humán mikroszomális enzimeket – máj mikroszómát és rekombináns humán mikroszomális enzimeket – használtunk annak földerítésére, hogy tesztvegyületünk, a tolperizon milyen mértékben és mely enzimek közreműködésével metabolizálódik. Kimutattuk, hogy a tolperizon viszonylag alacsony biológiai hasznosíthatósága az intenzív „first pass” metabolizmusnak köszönhető. LC/MS méréseink alapján a fő metabolitok az anyavegyület hidroxilált, karbonil-redukált és ez utóbbi hidroxilált metabolitja. A gátlási kísérleteink alapján a karbonil-redukált metabolit mennyisége nem csökken CYP gátlószerek jelenlétében, míg a hidroxi-metabolitok termelődése hatékonyan gátolható. Igazoltuk, hogy a fő CYP mediált in vitro biotranszformációs lépés a metil-hidroxiláció, amelyet elsősorban a CYP2D6 izoenzim katalizál, de kimutatható a CYP2C19 és a CYP1A2 izoenzim részvétele is. Mindezekből arra következtettünk, hogy a tolperizon metabolizmusához a jelentős mértékű CYP mediált biotranszformáció mellett egy eddig nem azonosított, CYP független mikroszomális karbonil reduktáz is hozzájárul. I.
Dalmadi B, Leibinger J, Szeberenyi S, Borbas T, Farkas S, Szombathelyi Z, Tihanyi K. (2003) Drug Metab Dispos; 31(5):631-636 (IF:3,652)
II.
György T. Balogh, Balázs Dalmadi, Attila Bielik and György M. Keserű (2005)
Comb Chem High T SCR; 8(4):347-352. (IF:2,534)
Summary The in vitro metabolism techniques play an emerging role in drug development. Here, the predictive value of the two levels of these techniques is discussed. The first level of modelling is the chemical-biomimetic level, where metalloporphyrin catalyzed biomimetic oxidation was used for the identification of nitric oxide (NO) donors with diverse chemical structure. Methodology was validated by testing known NO donors. Efficient automation of the test allowed us to investigate a subset of our corporate library. Several hits identified in this campaign were validated in both the chemical and also microsomal model that revealed all hits to be active in the biological system, as well. One of the hits showed comparable activity to V-PYRRO/NO, the prototypic liver selective NO donor. The other level is the biochemical-biolgical one where human microsomal (HLM) and recombinant enzymes were used to study the in vitro metabolism of tolperisone. LC/MS measurements revealed methyl-hydroxylation (metabolite at M=261; M1) as the main metabolic route in HLM, however metabolites at 247 and M=263, were also detected. The latter was identified as carbonyl-reduced M1, the former was assumed to be the carbonyl reduced parent compound. Isoform-specific P450 inhibitors, inhibitory antibodies and experiments with recombinant CYPs pointed to CYP2D6 as the prominent enzyme in tolperisone metabolism. CYP2C19, CYP2B6 and CYP1A2 are also involved to a smaller extent. Hydroxymethyl-tolperisone formation was mediated by CYP2D6, CYP2C19, CYP1A2, but not by CYP2B6. Experiments using nonspecific P450 inhibitors - SKF-525A, 1-aminobenzotriazole, 1-benzylimidazole and anti-NADPH-P450-reductase antibodies resulted in 61%, 47%, 49% and 43% inhibition of intrinsic clearance in HLM, respectively, whereas hydroxymethyl-metabolite formation was inhibited completely by nonspecific chemical inhibitors and by 80% with antibodies. Therefore, it was concluded that tolperisone undergoes CYP-dependent and CYP-independent microsomal biotransformations about to the same extent. On the basis of metabolites formed and indirect evidences of inhibition studies a considerable involvement of a microsomal reductase is assumed. I.
Dalmadi B, Leibinger J, Szeberenyi S, Borbas T, Farkas S, Szombathelyi Z, Tihanyi K. (2003) Drug Metab Dispos; 31(5):631-636 (IF:3,652)
II.
György T. Balogh, Balázs Dalmadi, Attila Bielik and György M. Keserű (2005)
Comb Chem High T SCR; 8(4):347-352. (IF:2,534)
