Publikálva: Lırincz, A. – Neményi, M. (2002): Az in vitro sejtfeltárás hatékonyságát befolyásoló fizikai tényezık (2. rész). Laboratóriumi Információs Magazin, Biofizika rovat. XI. évfolyam, No. 2. pp. 36-38.
Az in vitro sejtfeltárás hatékonyságát befolyásoló fizikai tényezık Felhasznált anyagok és módszerek A felhasznált anyagok és eszközök három csoportra bonthatóak A, az alkalmazott kezelı berendezések, B, vizsgált szuszpenzió és C, a detektálási rendszerek, melyeket az 1. ábra mutat sematikusan. C.3.
B.
C.1.
A.3.
A.4.
1.
A.1.2, A.2.
A.5.
ábra: A felhasznált anyagok és eszközök: A.1., A.2. ultrahang frekvencia generátor és erısítı, A.3. ultrahang rezonátor, A.4. termosztát, A.5. analitikai mérleg, B. kísérleti szuszpenzió, C.1. audio detektor egység, C.3. biológiai detektor egység.
Az 1. ábrán látható mőszerek és berendezések részei az „A.1.” ultrahang frekvencia elıállító készülék, melynek jelgeneráló egysége szinusz jelformát állít elı, 1 [kHz] – 16 [MHz] frekvencia tartományban, mely 1 [kHz] frekvencia tartományonként történı manuális frekvenciaállítási lehetıséget biztosít. A készülék az aktuálisan alkalmazott frekvencia értéket egy monitor egységen jelzi ki. Az „A.2.” ultrahang erısítı, fıleg a megahertzes frekvencia tartományokra tervezett, de 100 [kHz] – 2 [MHz] frekvencia tartományban viszonylag jó közelítéssel lineáris, azonos mértékő erısítési szintet ad. Az 50 [ ] impedancia érték mellett 0-40 [W] erısítést tesz lehetıvé, valamint az erısítés mértékét egyenfeszültségben adja meg, melyet kalibrációs görbe segítségével és a sugárzási felület ismeretében [W/cm2] értékre tudunk vonatkoztatni. A vizsgálatainkban folyamatos hullám (CW) módot alkalmaztunk, a célszerően tervezett rezonátorunkból adódóan legfıbbképpen longitudinális hullámformát
elıállítva. A rezonátor kialakítása kiválóan alkalmas az álló és a haladó sík hullámok kialakítására, így a szuszpenzióban található részecskék célirányos manipulációjára, illetve inaktiválására is. A tömeg mérésére az 1. ábrán „A.4.” jelzéső analitikai mérleget alkalmaztuk. A besugárzott szuszpendáló anyagként „B” 0,5-1 órán át, pihentetett, 20 [ºC] hımérséklető csapvizet alkalmaztunk, szuszpendált anyagként liofilizált Saccharomyces cerevisiae élesztıt használtunk. Az alkalmazott detektálási rendszerek „C” több módszer eszközeit foglalják magukban, ezzel kapcsolatban megkülönböztethetjük a „C.1.” audio, „C.2.” vizuális és a „C.3.” biológiai detektálási módszerek eszközeit és berendezéseit. Az audionális módszer eszközeinek „C.1.” alkalmazásával cél fıleg a tranziens kavitáció jellegzetes sziszegı, pattogó hangjának detektálása audionális módszerekkel, melynek fı részei a mikrofon és oszcilloszkóp. A „C.2.” vizuális módszer azt jelenti, hogy a szemmel követhetı hullámjelenségeket, a kezelési idı függvényében folyamatosan nyomon kísérjük, ami például az álló hullám, vagy a gomolygó áramlás, vagy a folyadék sugár kialakulása lehet, a tapasztalt jelenségeket az idı függvényében pedig dokumentáljuk. A „C.3.” biológiai módszer a vitális festés metilénkék festékkel. Célunk a módszer felhasználásával az ultrahang hatására a mikroorganizmusok életképességében beállt változások megfigyelése az alkalmazott kezelési idı függvényében. Az adatrögzítést a biológiai mikroszkópból egy CCD kamerán keresztül beérkezett kép számítógépes file formátumba történı rögzítése biztosítja. A kezeléseket 1,117 [MHz] frekvencián 9 [W/cm2] ultrahang teljesítmény mellett végeztük 20 [˚C] hangtér hımérséklet mellett 20 [ml] sejtszuszpenzió jelenlétében, 3,2 illetve 7,04 [g/l] sejtkoncentráció + 3 csepp 1 % koncentrációjú metilénkék oldat mellett. A kezelési idı során 15 másodpercenként 0,02 ml szuszpenzió mintát vettünk ki automata pipettával steril pipetta heggyel egy-egy mikroszkóp tárgylemezre, amelyekbıl késıbb, egy idıponthoz tartozó több látótér leszámolásának átlagaként kaptuk meg az egy idıponthoz tartozó relatív sejtszám értékeket, amit azután táblázatos, illetve grafikonos formában kiértékeltünk. Ezután vettük fel a különbözı szuszpenzió koncentrációkhoz tartozó túlélési görbéket. A kísérletek folyamán, a hangtérben mőszeresen és érzékszervileg tapasztalt hullámjelenségeket szintén az idı függvényében dokumentáltuk, majd végül az eredményeket összevetettük. Eredmények és értékelésük A 3. ábrán a jellemzı kiindulási állapot látszik, ahol megfigyelhetı, hogy a sejtek legnagyobb hányada vitalitást tükröz, nem színezıdött és az élesztıre jellemzı morfológiájú. A 4. ábrán a kezelés alatti állapot látható, ahol már a sejtek egy része a kezelés hatására elpusztult, lyukas, festıdött, a citoplazma és a sejtszervek nagy része az extracelluláris térbe áramlottak. Az 5. ábrán pedig a kezelés végsı stádiuma figyelhetı meg, ahol az alkalmazott módszer alapján kimondható, hogy az összes sejt elpusztult.
Forrás: Lırincz Attila, 2001’ 2.
ábra: kezelés elıtti kiinduló állapot
Forrás: Lırincz Attila, 2001’ 3.
ábra: kezelés alatti állapot
Forrás: Lırincz Attila, 2001’ 4. ábra: a sejtek inaktiválódása után, a kezelés végsı stádiuma, A két különbözı sejtkoncentráció (3,2 illetve 7,04 [g/l]) mellett tapasztalt túlélési dinamika a 6. ábrán figyelhetı meg (1. táblázat). Jól látszik a két különbözı koncentrációhoz tartozó túlélési görbe közti különbség. Az alacsonyabb sejtkoncentrációhoz tartozó görbe
exponenciális túlélési dinamikát mutat. A második, magasabb sejtkoncentrációjú szuszpenzió esetében azonban három szakaszt különíthetünk el a túlélési görbében. Az elsı szakasz (I) a relatív sejtszám gyors csökkenését mutatja, ahol a haladó hullám dominál, erıs sugárnyomás érvényesül a hangtérben a szemcsék magas szintő adszorpciója miatt, kavitáció nélkül. Ebben a szakaszban is csökken a sejtek vitalitása, ezt a szakirodalom is megállapítja. A második szakaszban (II) a sejtszám csökkenésének megtorpanása jellemzı, ami az állóhullám felépülésének köszönhetı. A szuszpendált szemcsék jól megfigyelhetıen az állóhullám nyomási csomósíkjaiban stabilizálódnak. A harmadik szakaszban (III), az állóhullám hatására létrejött szemcse aggregáció miatti szedimentáció hatására részlegesen letisztult hangtérben az ultrahang adszorpció csökkenésének hatására megnövekvı akusztikus nyomás amplitúdó miatt megindul a kavitáció, melynek zaját detektáltuk. Ebben a szakaszban már szintén exponenciális túlélési dinamika érvényesül. A hangtér letisztulása, a kiülepedés miatt nem okoz nagymértékő sejtvédı hatást a kavitációval szemben, mivel a kavitáció intenzív hangtérbeli folyadékáramlást indukál, amely hatására a sejtek kavitációs buborékkal történı találkozása biztosított, így folyamatosan megtörténik az inaktiválódás. Az 7. ábrán, a két különbözı kiinduló sejtkoncentrációjú szuszpenzió túlélési görbéi látszanak. Megfigyelhetı, hogy a két különbözı sejtkoncentrációhoz, sıt a magasabb kiinduló koncentrációjú szuszpenzióban kialakuló eltérı jelenségekhez is, különbözı „D” értékek tartoznak (2. táblázat). Az egyes jelenségek úgy hatnak, mintha nem ugyanazt a kezelést kapná a két minta. Ez azért van, mivel a különbözı sejtkoncentrációk hatására más-más jelenségek jutnak érvényre a hangtérben, melyek a most tárgyalt sejtkárosító hatáson túl egyéb hatásokat is kifejtenek a szuszpendált részecskékre. Az alapanyag 5,6*109 /g kiinduló sejtszámú. 1. táblázat: túlélı sejtszámok alakulása az idı függvényében Kezelési idı (sec)
0
Átl. túlélı sejtszám (%) 3,2 [g/l] Átl. túlélı sejtszám (%) 7,04 [g/l]
15
30
45
60
80,25 30,5 14,8 7,25 3,75 80
75
90 105 120 135 150 180 200 240 270 280
1
0
62 39,8 34,3 30,8 30,3 29 27,8 26,5 18,5 10,5 6,5 3,75
2
0,8
Relatív élı sejtszám alakulása a kezelési idı függvényében, különbözı kiindulási koncentrációk esetén
Relatív élı sejtszám (%)
90
I.
80 70
II.
60 50
III.
7,04 [g/l]
40 30 20
3,2 [g/l]
10 0 0
15
30
45
60 75
90 105 120 135 150 165 180 195 210 225 240 255 270 285 Kezelési idı (s)
5. ábra: túlélı sejtszámok alakulása az idı függvényében
0
A Saccharomyces cerevisiae élesztı túlélési görbéi 20 [°C] hımérsékleten, 9 [W/cm2] ultrahang besugárzás hatására, különbözı kiinduló sejtkoncentrációk mellett
8
Állóhullám, számított 7,04 [g/l]
7 6
Lg N
5 4 3 2 Kavitáció, szám ított 3,2 [g/l]
1
Akusztikus áramlás, számított 7,04 [g/l]
Kavitáció, szám ított 7,04 [g/l]
0 0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
Kezelési idı (sec)
6. ábra: a különbözı kiinduló koncentrációkhoz tartozó túlélési görbék
2. táblázat: tizedelıdési idık a különbözı szuszpenzió koncentrációk és az eltérı hangtérbeli jelenségek mellett Kiinduló szuszpenzió koncentráció (g/l) N (db/ml) 7 3,2 1,792*10 7,04
7,25
Kavitáció
D (sec) 44,05
7
7,59
Akusztikus áramlás
140
7
7,18
Állóhullám
433
7
7,11
Kavitáció
99
3,942*10
1,516*10 1,304*10
logN
Akusztikai jelenség
Következtetések, javaslatok Az ultrahangtérbeli jelenségek tudatos megválasztásával tehát célirányos tevékenységet folytathatunk. Azonban az ultrahang felhasználásának akár az elızıekben ismertetett egyszerő sejtfeltárási felhasználási célhoz szükséges kísérleti paraméterek nem megfelelı megválasztása a hangtérben nem kívánatos jelenségek megjelenését eredményezheti, amelyek megnehezíthetik, vagy ellehetetleníthetik az ultrahangos munkát, akár egy egyszerő kereskedelmi roncsolónál is. Az ultrahangos munka alapvetı követelménye kell, hogy legyen a jelenségcentrikus nézıpont, még abban az esetben is, ha a kísérleti körülményeket nem lehet állandósítani. Irodalomjegyzék 1. 1. Bíró, I. (1976): Mikrobiológiai Gyakorlatok. ATE Mezıgazdaságtudományi Kar, Tejgazdaságtani és Mikrobiológiai Tanszék. P.: 64. 2. 2. Blackshear, P. L. – Blackshear, G. L. (1987): Mechanical hemolysis. In: Skalak, R. – Chien, S. eds. Handbook of bioengineering. New Zork: McGraw-Hill, pp. 15.115.9.
3. 3. Brayman, A. A. – Azadniv, M. – Miller, M. W. – Chen, X. (1994): Bubble recycling and ultrasonic cell lysis in a stationary exposure vessel. J. Acoust. Soc. Am. Vol. 96. pp. 627-633. 4. 4. Deák, T. (1997): Élelmiszeripari Mikrobiológia. Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetem, Tartósítóipari Kar. Pp.: 51-54. 5. 5. Eckart, C. (1948): Phys. Rev. 73, p.68. 6. 6. Frizzel, L. A. (1988): in Suslick, S. K. (1988): Ultrasound, Its Chemical, Phisical, and Biological Effets. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim. 7. 7. Fry, F. J. (1978): Ultrasound: Its Applications in Medicine and Biology. Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam-Oxford-New York. 8. 8. Horbenko, I. G. (1977): Ultrahang a gépiparban. Mőszaki Könyvkiadó, Budapest. p. 186. 9. 9. Gröschl, M. – Trampler, F. – Benes, E. – Nowotny, H. (1999): Analysis os composite resonators for ultrasonic micromanipulation and separation. Acustica – acta acustica 85, Supplement 1, p. S92, as well as in Journal of Acoustical Society of America Vol. 105, p. 1018, February 1999. 10. 10. Liebeskind, D. – Bases, R. – Elequin, F. – Neubrot, S. – Leifer, R. – Goldberg, R. – Koenigsberg, M. (1979): Diagnostic ultrasound: effects on the DNA and growth patterns of animals cells. Radiology. Vol. 131, pp. 177-184. 11. 11. Loverock, P. – ter Haar, G. (1991): Synergism between hyperthermia, ultrasound and gamma irradiation. Ultrasound in Med & Biol., Vol. 17, pp. 607-612. 12. 12. Lırincz, A. – Neményi, M. (2001): Cell decrease by ultrasonic effect on yeast (Saccharomyces cerevisiae) suspension and the limit concentration of cavitation. Phisical Methods In Agriculture, Praha, Aug. 28-30. 13. 13. Miller, M. W. – Miller, D. L. – Brayman, A. A. (1996): A review of in vitro bioeffects of inertial ultrasonic cavitation from a mechanistic perspective. Ultrasound in Med & Biol., Vol. 22, No. 9, pp. 1131-1154. 14. 14. Miller, D. L. – Thomas, R. M. (1994): Cavitation dosimerty: estimates for single bubbles in rotating-tube exposure system. Ultrasound in Med & Biol., Vol. 20, pp. 197-193. 15. 15. Suslick, S. K. (1988): Ultrasound, Its Chemical, Phisical, and Biological Effets. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim. 16. 16. Tar, F. (1982): Ultrahangfizika. Kohó- és Gépipari Továbbképzı és Módszertani Intézet, Budapest. 17. 17. Tarnóczy, T. (1963): Ultrahangok. Mőszaki Könyvkiadó, Budapest. p.271. 18. 18. Thacker, J. (1973): An approach the mechanism of killing cells in suspension by ultrasound. Biochem. Biophis. Acta. 304, 240. 19. 19. Veit, I. (1977): Mőszaki Akusztika. Mőszaki Könyvkiadó, Budapest. p.: 169. 20. 20. Walsh, P. – Radel, S. - McLoughlin, A. J. –Gherardini, L. – Benes, E. (1999): Evaluation of the effect of immobilisation techniques and low intensity ultrasonic waves on brewer’s yeast cells. Poster presentation, to be published in Proc. of the Ninth European Congress on Biotechnology, Brussels, July 11th – 15th, 1999.
