Tematika
Az élő sejt fizikai Biológiája: motorfehérjék, egyensúlytól távoli folyamatok
• Motorfehérjék működése. A munkaciklus • Egyensúlytól távoli folyamatok. Erővezérelt fehérjegombolyodás.
• Bemutatások: in vitro motilitási próba. Az
Kellermayer Miklós
atomerőmikroszkóp. Titin kitekerés AFM-mel.
Termikus kilincskerék
MOTORFEHÉRJÉK
Brown-féle kilincskerék mechanizmus
1. Specifikus citoszkeletális filamentumhoz kapcsolódnak (DE…)
m
2. Elmozdulást és erőt generálnak
kbe kki F
3. Kémiai energiát használnak fel Diffúzió
A motorfehérjék típusai
In vitro aktomiozin motilitás
1. Aktin alapú Miozinok: Konvencionális (miozin II) és nem-konvencionális Miozin szupercsalád (I-XXIV osztályok). Plusz vég irányába mozognak.
Myosin
2. Mikrotubulus alapú a. Dineinek: Ciliáris (flagelláris) és citoplazmáris dineinek. A mikrotubulus mentén a minusz vég irányába mozognak. b. Kinezinek: Kinezin szupercsalád: konvencionális és nem-konvencionális. A mikrotubulus mentén a plusz vég irányába mozognak. c. Dinaminok: MT-függő GTPáz aktivitás Biológiai szerep: vakuoláris fehérjeválogatás (pinchase enzimek)?
ent
lam
in fi
Act
HMM 1 mM ATP 30 mM MgCl2
Microscope coverslip
Immobile fraction
3. DNS alapú mechanoenzimek DNS és RNS polimerázok, vírus kapszid csomagoló motor, kondenzinek A DNS fonal mentén haladnak és fejtenek ki erőt
Mobile fraction (1.3 μm/s)
4. Rotációs motorok F1F0-ATP szintetáz Bakteriális flagelláris motor 5. Mechanoenzim komplexek Riboszóma
A miozin II
A miozin szupercsalád ≥50% homológia a tagok között processzív
könnyűláncok
2 db alfa-hélixből “coiled-coil”
nyaki v. pánt régió
"konvencionális" 2-fejű
Regulatórikus ATP-kötő zseb csupasz zóna
“miozin fejek”
“miozin fejek”
Nyak Aktin-kötő hely
Minusz vég irányába mozog
Esszenciális
miozin farok
Konverter
Dineinek
A miozin fej (Subfragment-1)
Típusok: axonemális és citoplazmáris. Sok alegységes fehérjék (Mr~500 kDa) A minusz vég irányába mozognak. Koordinált működésük meghajlítja a ciliumot.
A motor domén mutációi hipertrofiás kardiomiopátiához vezetnek.
Processzív motorok. Plusz vég irányába mozognak. Vesicular transport minusz vég irányába mozog
Dinaminok Vakuoláris fehérjeválogatás GTPázok
Switch domén: hasonlóság a miozinhoz és G-fehérjékhez. “pinchase” funkció
Vírus portális motor
DNS Motorok
Különleges DNS motor Processzív motorok
T7 DNS Polimeráz
φ29 bacteriofág portális motor
RNS Polimeráz , Wang et al. 1998.
RNS Polimeráz
DNS mechanoenzimek Kondenzinek SMC fehérjecsalád SMC = "structural maintenance of chromosomes"
MukBEF nanomechanika és kondenzációs model
ROTÁCIÓS MOTOROK I:
ROTÁCIÓS MOTOROK II:
F1F0-ATP SZINTETÁZ
Bakteriális flagellum motor
20 nM ATP 200 nM ATP
Diszkrét 120˚ rotációs lépések
Fordulatszám: > 20000 rpm Fogyasztás: 10-16 W Hatásfok: > 80% Energiaforrás: protonok
Kinosita
Erővezérelt fehérje-kitekeredés
Mechanoenzim komplex Riboszóma
k0off Titin I55-62 rekombináns fragmentum kitekerése
G
Tranzíciós állapot
Fxß
Kitekert állapot
3 Natív állapot
2
Reakció koordináta
xß ΔL
1
Funf =
Wen et al. Nature 2008
2.7 nm-es lépések (egy triplett) 0.078 s transzlokációs idő Transzlokációval csatolt helikáz aktivitás
200 pN
Kitekerési erő
50 nm
ΔL = 29,8 ± 3,5 nm
kBT ⎛ rxβ ⎞ ln 0 kBT ⎟⎠ xβ ⎜⎝ kunf
A mechanikai stabilitás biológiai logikája Titin I55-62: viszkoelasztikus molekulaszakasz Az I55-62 fragmentum kitekeredési görbéje
Szerkezetet összetartó H-hidak párhuzamos csatolása
Nagy kitereredési erő
Szerkezetet összetartó H-hidak soros csatolása
Alacsony kitereredési erő
20 Gyakoriság 15
3
10 5
2
0
ΔL
1
0
100 200 300 Kitekeredési erő (pN)
200 pN
Mechanikai stabilitás alapja:
400
Az Ig domén első és utolsó ß-láncait összetartó, párhuzamosan csatolt H-hidak
ΔL = 29,8 ± 3,5 nm
50 nm
Titin nanomanipulálás erővisszacsatolt lézercsipesszel
Konstans-erő kísérlet egyetlen titinmolekulán “High-force clamp”
Referencia jel (erő) T12 anti-titin ellenanyaggal bevont gyöngy
Mért jel (+/-) (erő)
Csapdázott gyöngy
Mozgatott gyöngy
Erő (pN)
120 80
Kv
ázi
40
erő
rám
pa
0 3000
Σ
“Low-force clamp” Kiteredési görbe
titin sulfo-SANPAH keresztkötővel bevont latex gyöngy
mozgatható mikropipetta
Feedback vezérlés
Vezérelt kimenet (+/-) (piezo mogás)
Megnyúlás (nm)
2500
2000
1500
1000
Visszatekeredési görbe 0.0
0.2
0.4
0.6
Idő
(103
0.8
s)
1.0
6
x10
~20-perces adatsor
Doménkitekeredés hirtelen ugrásokban
Titin kitekeredés konstans erőnél Lépcsőméret eloszlás
30
Freqency
3800
15
Doméncsoportok korrelált szerkezeti elrendeződést mutatnak “fej”
“farok”
10
Monoexponenciális Singleexponential fit görbeillesztés
3000
0
40
50
60
~28 nm lépcsők 20
25
Idő (s)
3
30 x10
2600 15
30
Erőfüggő sebességi állandók
1484
15
10
20
Step size (nm)
1590
2800
5
10
20
1
3
25 x10
Idő (s)
A várttól eltérések mutatkoznak a lépcsőméret eloszlásban, a monoexponenciális idő-megnyúlás görbe lefutásában és az erőfüggő sebességi állandó összefüggésben.
Topografikus magasság (nm)
Autokorreláció függvény
0
-1
3200
0
1696
Rate constant (s )
3400
1.6 1.2 0.8 0.4 0 4 0 -4
5
1802
Megnyúlás (nm)
3600
Megnyúláslépcsők többsége: egyedi doménkitekeredési esemény
20
0 4000
Megnyúlás (nm)
Erő (pN)
100
Megnyúlás (µm)
Erő (pN)
28.02 ± 14.06 SD 25
200
400
600
800
Axiális távolság (nm)
Kitekeredési ugrások
Kellermayer et al. BBA Bioenergetics 2003
5-10 doménből álló csoportok kooperatíven tekeredhetnek ki.
0.1
Idő (s) 94 97 100
130
Feedback force (pN)
Szerkezeti átmenetek alacsony erőnél
Titin gombolyodás konstans erőnél 100
Kitekert állapot
2000
50 pN
Megnyúlás (µm)
0
Nagy lépcső Sima
Kitekeredés
T12 9D10 (PEVK)
20 pN
5 pN
Z
Szerkezeti fluktuációk (A fázis időtartama rövidül az erő csökkenésével)
Erő (pN)
500
30
40
50
60
70
80
“Teljesen” feltekert állapot 90
3
x10
Idő (s)
Az elsimult és nagy, lépcsőszerű átmeneteket a PEVK doménben kialakuló rövid- és hosszútávú elektrosztatikus kölcsönhatások okozhatják, amelyek a mechanikai fáradás alapjául szolgálnak. Megnyúlás (μm)
Fluktuációk 4 pN
Domén unfolding
Fluktuációk ~700 nm
Idő (s)
Végső kontrakció (ritkán tapasztalható)
Trombitás et al. J. Struct. Biol. 1998.
Titin T12 és 9D10 ellenanyagokkal megragadva
Elsimult átmenet
Idő (s)
Gyors kontrakció (entrópikus kollapszus)
1000
10 pN
Nagy lépcső (>100 nm)
1500
Erő (pN)
Megnyúlás (μm)
30 pN
Megnyúlás (nm)
40 pN
Megnyúlás (μm)
60 pN
Erő (pN)
Erő (pN)
70 pN
Erő (pN)
Domén kitekered és
80 pN
Az erőt ~3 pN alá kell csökkenteni jelentős domén visszatekeredéshez. A fluktuáció diffuzív keresés a konformációs térben. Részleges viszatekeredés: doméncsoportok kooperatívan tekeredhetnek.
Részleges refolding
Megnyúlás (μm)
Molekuláris fáradás
Idő (s)
Megnyúlás (nm)
Erő (pN)
A visszatekeredési útvonal változatos még egyetlen molekula esetén is Erővezérelt ki- és visszatekeredés 100 0
1500
1000
500
0 60
80
100
120
Idő (s)
140
160
180
3
x10
Titinben: -Kooperatív kitekeredés -Mechanikai fáradás -Diffuzív keresés a konformációs térben -Kooperatív visszatekeredés -Mechanikai erő és random fehérjeszakaszok modulálhatják a gombolyodás folyamatát
