Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D

Identifikace proteinů v proteomice

Identifikace proteinů

Molekulovou hmotnost nativního proteinu separovaného ELFO lze potvrdit hmotovou spektroskopií MALDI TOF, ESI TOF.

Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

Sekvenční analýza se provádí způsoby: 1.Edmanovou degradací (přímé sekvencování) a 2. hmotovou spektrometrií (nepřímé sekvencování, fingerprinting, „de novo“ sekvencování). ) V obou p případech p pak na základě p získaných sekvencí následuje hledání v databázích proteinů Pro přímé P ří é sekvencování k á í je j nutný ý blotting bl i nativního i íh proteinu i nebo jeho peptidových fragmentů (připravených in-solution štěpením a následně separovaných ELFO Schäger/von Jagow) na PVDF membránu. Po obarvení membrány amidočerní 10B se vyříznou příslušné pásy (1D) nebo skvrny (2D) a fragmenty membrány se vloží do reakční cely proteinového sekvenátoru. sekvenátoru

„Fingerprint“

DIGE

Diferenční 2D elektroforéza

 Proteinové mapy  (2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra)  Peptidové mapy  (2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra, MS spektra)  Charakteristické a specifické polohy skvrn, píků – „otisky otisky prstů“ pro každý např. např buněčný proteom nebo pro každý protein

Výsledné „mapy“ proteinů se porovnávají s kontrolními vzorky (pacienti s konkrétním onemocněním a zdraví pacienti). Po „vyříznutí“ oblasti vykazující odlišnost je provedena analýza MS.


Fragmentace proteinů, polypeptidových řetězců

Edmanovo odbourávání Po odštěpení PTC PTC--derivátu následuje jeho analýza (zjištění retenčního času na HPLC koloně) s detekcí při 270 nm. Běžně je takto možné získat 30 - 40 aminokyselin z N N-konce, konce, samozřejmě s narůstající chybou (reakce není 100% ní). Za ideálních podmínek maximálně 100 aminokyselin. V automatickém proteinovém sekvenátoru (dodávají např. y Applied pp Biosystems, y Shimadzu)) jje analyzovaný y ýp protein či firmy peptid imobilizován. Buď na disku ze skleněných vláken (kovalentní vazba nebo adsorpce) nebo na membráně PVDF (ProSorb patrony nebo po blottingu). blottingu) Reagencie ke vzorku vstupují a jsou odváděny nejlépe v plynné ffázi. i Doba trvání jednoho cyklu analýzy činí č 30 30--60 min. min Je třeba připočítat eluci standardů aminokyselin a tzv. prázdný run.

Edmanovo odbourávání Pro analýzu Edmanovou degradací jsou nutná množství vzorku 2020-50 pmol, pmol nejlépe však 200 pmol, konkurenční MS nyní zvládá fmoly (nanosprej ESI Qq TOF MS), dosud však není tolik rozšířená. ro šířená Podmínkou pro úspěšnou sekvenční analýzu Edmanovou cestou je volný N-konec peptidu či proteinu. proteinu Často je však N-konec chemicky blokován (acetylace, acetylace, pyroglutamová kyselina). kyselina Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst - zde nízký výtěžek v daném cyklu. cyklu Automatizace

Hmotnostní spektrometrie (mass spectometry, MS) MS)

Princip ESI TOF MS a MALDI TOF MS

 Je metoda pro separaci látek podle rozdílů hmoty (m (m) a náboje (z (z) s využitím elektrického a magnetického pole.  Určovanou fyzikální veličinou je podíl hmoty a náboje (m/z), při znalosti náboje j umožňuje j určit molekulovou hmotnost.  Velmi citlivá metoda, stačí několik iontů k získání měřitelného signálu, poměr m/z může být stanoven s přesností 10 10-4. 4


 Původně aplikována pro malé těkavé látky, či derivatizované netěkavé látk (i látky (ionizace i paprskem k elektronů l kt ů - EI, EI chemická h i ká ionizace i i s nosným ý plynem).  S objevem šetrnějších technik ionizace (ESI, MALDI) je možné měřit i velké molekuly (např. proteiny, lipidové komplexy, polysacharidy). y y)

Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Laserová desorpční ionizace s pomocí matrice

Metoda MALDI MS (od 1988) 1988) je rozšířeným nástrojem pro separaci přírodních látek látek, peptidů, peptidů proteinů a dalších biobiomakromolekul (oligonukleotidy, sacharidy, lipidy) lipidy).. Vzorek je na nerezové destičce ukotven v netěkavé matrici (kokrystalizace). Používá se např. kyselina nikotinová nebo 2,5dihydroxybenzoová. Vzorek (1 mg/mL) se nanese v 0.5 l na nerezovou destičku a nechá se vysušit. vysušit Pak se aplikuje 0.5 0 5 l matrice a opět se nechá vysušit. Destička se vloží do přístroje, zacílí se laserový p paprsek p se („ („fire“), („fire“) e ), ) transfer s e eenergie e g e způsobí působ ionizaci. o c.S Směrovaný ě ov ý energetický impuls poskytuje vysoké výtěžky iontů intaktního analytu, dosahuje se subpikomolární sensitivity.

SELDI – surface enhanced laser desorption desorption/ionisation /ionisation array chip

hmotová spektrometrie výhody jednoduchost rychlost hl t selektivita

nevýhody nízká citlivost nízká přesnost urč. m/z nízké rozlišení


Identifikace pomocí HPLC-ESI-MS/MS

MS je často propojena s jinými analytickými technikami technikami: ať už separačními nebo bez separace. Vznikají tak systémy GCMS, LC-MS, CE-MS ale i MS-MS. K Kromě ě tandemové t d é MS (MS-MS) (MS MS) mohou h být spojeny j ažž tři i více í analyzátorů („multiple“ MS). První vybírá studované látky ze směsi, druhý je fragmentuje, třetí analyzuje vzniklé fragmenty. Pro identifikaci látek ve složitých směsích; nikoli na základě m/z, ale podle fragmentačních obrazů („patterns“). Ve spojení s chromato či elfo metodou slouží MS jako detektor s vysokým rozlišením. rozlišením Taková on-line on line analýza pak dává okamžité výsledky na rozdíl od off-line detekce. Klíčové je propojení přístrojů. LC LC-MS MS v biochemii pro peptidy a proteiny, GC GC-MS MS pro těkavé LMW látky, CE-MS široký záběr od LMW po proteiny, DNA, viry etc.

vyříznout proužek rozřezat omýt Příprava (redukce) (alkylace) štěpení proteasou

rozvolnění l ě í S-S S S vazeb b

DTT, dithiothreitol

IAA, jódoctová kys.

2 5 kD 2,5

3 fragmenty (2 kD, 6 kD, 8 kD)

2. Separace peptidů chromatografií (HPLC)

m/z

UVabs

4. MS/MS spektrum

d lší další fragmentace

Time (min) m/z

5 Určení části sekvence .. M G A D D H D K L .. 5. 6. Srovnávání s databázemi, identifikace

vzorku

proč redukce a alkylace?

KONTAMINACE! – keratiny (kůže, vlasy, srst, vlna) – detergenty d (SDS (SDS, T Triton i atp.))

3. MS vybraného štěpu

protein II (16 kD)

Hledáním v databázi je pak proteinový vzorek identifikován, nebo se zjistí, že jde o protein, který dosud v databázi není. není.

trypsin denaturace > lepší proteolýza ochrana oxidovaných reziduí Cys agresivní proteasa vysoká ká primární i á í specificita, ifi it nízká sekundární prům. m/z fragmentu ~ 1.5 kDa štěpí: arginyl-X, lysyl-X; ale ne X=prolyl

1. Štěpení proteinu trypsinem

Předpodkladem pro vyhledávání jsou naměřené přesné m/z hodnoty peptidových fragmentů, použítí specifické proteasy a přesná m/z intaktního p p proteinu. Pro štěpení se používají endoproteasy endoproteasy, tedy proteolytické enzymy, které k é štěpí š ě í uvnitř i ř proteinové i é molekuly. l k l Důraz ů se klade kl d na specifitu použité proteasy, používají se proto vysoce specifické enzymy, enzymy jako je trypsin z hovězího či vepřového pankreatu (EC 3.4.21.4) nebo Lys C proteasa z Bacillus licheniformis ((EC 3.4.21.50). ) Trypsin yp štěpí p za bazickými ý zbytky y y Arg a Lys, proteasa Lys C za zbytkem Lysinu. Podobně Glu C proteasa ze Staphylococcus aureus V8 (EC 3.4.21.19) štěpí za Gl Specificky Glu. S ifi k lze l štěpit š ě i chemicky h i k použitím ži í CNBr. CNB

Identifikace proteinů – „peptide fingerprinting”

Peptide Mass Fingerprinting - PMF, MALDI TOF MS

štěpení p proteázou p ((trypsinem) yp ) protein I (12 kD)

DNA (i EST), proteinová databáze

2 fragmenty (4 kD, 8 kD)

protein II (16 kD) 3 fragmenty (2 kD, 6 kD, 8 kD)

generování teoretických trypsinových štěpů ze známých či předpokládaných proteinových i ý h sekvencí k í

masses (m/z) 940.421 - ELSDIAR 1093.477 - QLLLTADDR 1341.556 - PHSHPALTPEQK 1469.633 - PHSHPALTPEQKK 1488.645 - GILAADESTGSIAKR 1646.650 - LQSIGTENTEWENRR 2122 975 - IGENHTPSALAIMENANVLAR 2122.975 2241.903 - YTPSGQAGAAASESLFISNHAY

MALDI ToF


protein I

4000

8000

m/z

8000

m/z

protein a: 3 3, 5, 5 9, 9 12 kD protein b: 2, 7, 9 kD protein c: 4, 8 kD protein d: 3, 9, 12 kD protein e: 2, 6, 8 kD

protein II 2000

6000

Srovnání experimentálně stanovených velikostí peptidů s teoretickými štěpy

Bioinformatika pro MS oorganismy ga s y se se sekvenovaným ve ova ý ge genomem o e PMF, statistická shoda predikovaných m/z tryptických peptidů (i silico (in ili digest) di ) s experimentálními i ál í i PC programy p g y MASCOT ((firma Matrixscience), ), SEQUEST, Q , ProteinProspector organismy s nesekvenovaným ne genomem hledání na základě evoluční homologie proteinových sekvencí MS BLAST BLAST:: MS driven Best Local Alignment Search Tool MultiTag ulti ag (S. Sunyaev Su yaev et al., al., Anal. a.C Chem. e . 2003, 003, in ppress) press ess) ess)

Charakterizace koko- a posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS fosforylace, sulfatace, glykosylace, N-koncové modifikace Význam: důležité pro regulaci buněčné distribuce a modulaci funkcí p proteinů. Př. fosforylace y - p přenos signálu g v buňce,, glykosylace - vliv na funkční, strukturní a imunologické vlastnosti proteinů. Výhoda MALDI MS analýzy v tomto případě spočívá ve velké přesnosti určení molekulové hmotnosti, hmotnosti citlivosti a rozlišení. rozlišení Typický protokol pro analýzu proteinové modifikace začíná p vzorku,, enzymobe y modifikaci. Pak se analyzuje y j rozdíl štěpením v molekulové hmotnosti určitého peptidu spočítané na základě sekvence a odečtené z MS spektra spektra.. Pro složitost některých ěk ý h směsí ě í je j výhodnější ýh d ější použít ží MALDI PSD MS/MS nebo b LC MS.


MALDI MS p pro studium vyšší y struktury y proteinů p Studium prostorové struktury proteinů (zvl. terciární a kvarterní) má význam z důvodu těsného vztahu struktura - funkce. funkce Poznání struktury tedy může poskytnout informace o funkci proteinu. Pro studium struktury proteinů se běžně používá řada spektro spektro-skopických metod (Krystalografie - difrakce paprsků X, NMR spektroskopie a další). Dávají poměrně jasné výsledky, ale jejich nevýhodou může být zejména časová náročnost a nároky na vyšší množství materiálu. materiálu Poskytují rovněž značná množství dat, dat jejichž vyhodnocování je opět náročné. Technikou MS je možné studovat například přístupnost určitých povrchových regionů proteinů s použiím metody zvané protein mass fingerprinting (PMF).

Ověření účinnosti separace, čistoty a charakterizace produktů

Purifikace biopolymerů  Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství)  Vstupní podmínky:

 Nároky na čistotu:


Oveření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace pomocí HPLC (iontová, SEC, afinitní chromatografie, hydrofobní) Ověření čistoty proteinů, polypeptidů pomocí elektroforézy

Volba separační metody (výtěžek, časová náročnost, nabohacení)  srážení, vysolování – na počátku, kdy je koncentrace produktu vysoká ((> 1mg/ml) g )  IEC – separace látek podle náboje, změna kapalné fáze (equilibrace), zakoncentrování? (objem eluentu), optimalizace podmínek separace, kapacita kolon přiměřená přiměřená, relativně levná  GPC - separace látek podle Mr a tvaru, odsolení, změna kapalné fáze (equilibrace), šetrná, levná, jednoduchá, nezávislé na koncentraci produktu, typu kapalné fáze x zdlouhavá, zředění látky, malá kapacita kolon (1% Vt), často řadíme po vysolování  HIC – metoda silně závislá na experimentálních podmínkách, optimalizace podmínek (návaznost separačních kroků), objem vzorku pouze 1 – 5 % V kolony, vysoká kapacita, cena přiměřená  AC (IAC) – vysoce soce specifická metoda metoda, vysoká soká kapacita kapacita, sniž snižuje je počt počty separačních kroků, cena různá podle typu ligandu, regenerace kolony

dostupnost materiálu, typ vstupního materiálu stabilita produktu nároky na čistotu terapeutické účely (> (> 99%) farmaceutický průmysl diagnostické testy (20 – 90%) výzkum, katalýza reakcí potravinářství kosmetický průmysl (70 – 90%) ultračisté lt či té analytické l ti ké standardy t d d (95 – 99%)

 Počet purifikačních kroků: minimali ace ztrát, minimalizace trát časová časo á a finanční náročnost by b měla odpovídat nárokům na čistotu a účelu využití, možnost automatizace

Řazení separačních kroků  techniky s vysokou kapacitou → techniky s nízkou kapacitou  za sebou metody separující látky na jiném principu (Mr, náboj, povrchové vlastnosti apod apod.))  produkt jedné metody by měl být výchozím materiálem pro další (po (p vysolování y nejde j IEC bez GPC)) (IEC a AC vyžadují definované složení kapalné fáze)  předcházet tvorbě dimerů, polymerů, agregátů  vliv agregátů na účinnost separace (přídavek detergentů?)


Podmínky kolonové separace

Kontrola stupně purifikace

 typ náplně (bobtnání, stabilita, chemická inertnost), parametry kolony, kolony (s rostoucím průměrem a klesající délkou kolony klesá rozlišení, u LPLC vliv difúze na rozmývání zón)  zapojení kolon v sérii  recyklace vzorku  rychlost průtoku (flow rate, s rostoucí rychlostí roste rozmývání zón x čas, stabilita produktu x NK)  pracovní tlak, teplota  ekvilibrace náplně  min. mrtvé objemy  objem nanášeného vzorku (flow adaptor)  regenerace kolony kolon  skladování, konzervace, sterilizace

   

Hodnocení účinnosti purifikace a kritéria čistoty 

2 parametry – výtěžnost (návratnost - ztráty) a stupeň přečištění (kolik balastu se odstranilo)

 

výhoda u biologicky aktivních látek (enzymy) vždy se hodnotí biologická aktivita, objem eluentu a obsah bílkovin



kritéria čistoty – homogenita preparátu, krystalizace (1 pík u HPLC neznamená vždy homogenitu) – ověřit si různými metodami u biologicky aktivních látek kontaminující doprovodná biol. aktivita, přítomnost izoforem (pI), pozor na proteázy



 hodnocení homogenity 1. rozpustnost produktu (saturační křivka s ostrým přechodem v místě nasycení roztoku) 2. analytická ultracentrifugace (60tis./ot./min, fotometricky) 3. centrifugace v gradientu hustoty (1 frakce, - čas) 4. SDS SDS--PAGE a další elektroforetické metodyy 5. Imunochemické metody

prvotní průběžná (tzv (tzv. postupná eliminace) finální včetně strukturní charakterizace produktu celkové množství produktu, biologická aktivita, výtěžnost, stupeň obohacení (koncentrace)

 Požadavky na čistotu

podle účelu použití (technické, purifikované, vysoce purifikované) Technické – frakcionovaná precipitace, kompromis mezi čistotou a cenou Purifikované – vyšší nároky na čistotu, cena, separace více metod za sebou Vysoce purifikované – vysoká cena cena, výzkum – strukturní studie studie, klinická diagnostika, kalibrátory, standardy, terapeutické účely (původ)

Koncentrace produktů a jejich konečná úprava  zakoncentrování přečištěného produktu  odpařováním (x stabilita)  mrazová sublimace (lyofilizace) – hygroskopický prášek (sole ∆pH, (sole, ∆pH organická rozpouštědla) – denaturace, denaturace fragmentace  precipitace a resolubilizace  ultrafiltrace (rychlost sedimentace, rovnováha)  krystalizace (náročné, (náročné zdlouhavé)

SDS--PAGE SDS

Charakterizace produktů molekulová hmotnost celé molekuly, molekuly dílčích podjednotek (SDS--PAGE, SEC) (SDS • tvar a Mr – ultracentrifugace • izoelektrický bod pI - IEF • spektrální vlastnosti (UV (UV--VIS, cirkulární dichroismus, NMR spektroskopie • analýza primární struktury, sekvence monomerů • peptidové mapování s MS analýzou • rentgenostrukturní analýza •

Prokázání identityy  reakcí se specifickou Ab imunoblot  uvolnit elektroelucí a následně MS analýzu

Eluo ované pro oteiny

Nenav vázané prroteiny

Stan ndardy

Půvo odní vzorrek


Účinnost separace směsi v gelech o různé porozitě

Sledování čistoty proteinů  Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu  Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba h b stanovit t it molekulovou l k l hmotnost izolovaného proteinu (SDS elektroforézou)

 metoda pro sledování čistoty produktu – průběžné, konečné  citlivost metody – μg až ng! podle typu vizualizace  vizualizace všech, všech i kontaminujících složek  široké rozmezí Mr látek - zvolit vhodnou porozitu gelu nejlépe gradientové gely gelu,  detekce kontaminace NML problematická  průkaz ů produktu ve směsi (Mr, standard)  průkaz rozpadových fragmentů (Mr, Imunoblot)  kvantifikace (denzitometricky) omezená  možnost následné MS analýzy ý y „„bandů“


Izolace IgG1 - hyperimunní sérum

Porozita gelu a Mr separovaných látek

Afinitní chromatografie MPC MPC-protein t i A

10% gel SDS-PAGE barveno Coomasie Blue Mr

Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu Homogenát

Frakční vysolování

1

2

Iontoměničová Molekulové síto chromatografie (gelová filtrace)

3

4

Afinitní chromatografie

5

serum

E1

E2

Mr

Purifikace u ace trypsinu t yps u na a koloně o o ě s pp-a aminobenzamidinem obe a d e

Detekce konkrétního proteinu Western blot s imunochemickou detekcí

Identifikace antianti-CA I protilátek izolovaných afinitní chromatografií

Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE) transfer f proteinů i ů z gelu l na membránu bá = Western blot detekce proteinu protilátkou (k (komplexu l primární i á í a sekundární k dá í protilátky) tilátk )


vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence

W. blot

Sekundární protilátky konjugované s enzymem či flfluorescenční č í značkou čk

Primární protilátka

membrána s navázanými proteiny

Hodnocení čistoty výchozího materiálu před enzymovou fragmentací

Porovnání Laemmli versus Schäger/von Jagow - separace trypsinů -

Tris–Tricine–SDS-PAGE: gel—16,5% T, 3% C ((MW 1–70 kDa), ), detection with silver staining, g, positions: (1) non-digested native CA I, (2) non-digested unfolded CA I, (3) unfolded CA I digested g 3 h by y immobilized trypsin, y ((4)) molecular marker (10–250 kDa)

Zleva standardy 29, 29 45, 45 66, 66 97, 97 116 a 200 kDa; hovězí trypsin; vepřový trypsin; cytochrom c (12 kDa); standardy, hovězí trypsin; vepřový trypsin; křenová peroxidasa (40 kDa). Proteiny naneseny po 7 mg. mg


Vizualizace fosforylovaných proteinů - specifické barvení ProQ Diamond II

Tris--Tricine Tris Tricine--SDS SDS--PAGEPAGE-urea pro Abeta peptidy + blotting M1

1

2

3

4

5

6

7

8 9 10 APP alfa

1-37 1-38 1-39 1-40 1-42 Abeta standards

Čísla udávají množství proteinu v mg/band

D il í í k l b Detailní snímek gelu barveného 180 minut a odbarvovaného přes noc éh 180 i db éh ř Detekce na přístroji Molecular Imager FX (Bio‐Rad Laboratories): Ex/Em: 532nm/602nm

Analýzy elučních frakcí pomocí SDS-PAGE a IMUNOBLOTu

Original CSF

Eluting fraction

Lane 1, 2 and 10: synthetic y Abeta Standard mix 1-37,, 1-38,, 1-39,, 1-40,, 1-42 Lane 3: CSF (#3131) which was sent to Pardubice Lane 4: Original sample (CSF UPCE) Lane 5: Eluting fraction IP 1 g fraction IP 1 (1:4 ( Lane 6: Eluting diluted)) Lane 7: Eluting fraction IP 2 Lane 8: Eluting fraction IP 2 (1:4 diluted) Western blot, University of Duisburg (Hermann) Lane 9: Eluting fraction IP 2 (1:8 diltuted)

HA štěpená Hyaluronidázou v čase

Z Bílk Z. Bílková á et al., l Proteomics P i 5, 639 – 647, 2005 200 4

SDS-PAGE

5

6

4

7

5

6

25 kDa

Eluce pH 3 6

37 kDa

Myelinový bazický protein !! (MS analýza)

PAAG gely reprezentují eluční frakce z imunosorbentu Ademtech 5B2 Ab.

7

5 4

25 kDa

Eluce pH 2,5 25 2 1

PrP

Imunoblot

37 kDa 25 kDa

a

PAA gel, 10%, 5% zaostřovací, TBE pufr pH 8,4. Separace 20 min při 125 V a 20 mA/1 gel a potom do konce 200 V a 40 mA/1 gel

7

37 kDa

b

Gely reprezentují eluční frakce získané z imunosorbentů Ademtech 5B2 Ab (a) a perlové celulózy 9H7 Ab (b). Průkaz PrP specificky pomocí anti-PrPHRP 3F4 (imunoblot).

HPLC proteinů, peptidů, polysacharidů


    

Gelová permeační chromatografie Iontově výměnná chromatografie Hydrofóbní interakční chromatografie Afinitní chromatografie R Reverzní í HPLC

Gelová permeační chromatografie v HPLC módu  Rigidní nosič silikagel (povahou aniont, hydrofóbní)  Semirigidní nosič PS  Modifikované povrchy – biokompatibilita (Silikagel modif. hydrofilním polymerem)  Částice 5 – 10 µm, sférické  Částice s uniformní porozitou  Průtoky do 0,5 ml  Teplota 4°C – 37°C

HPLC – analytické uspořádání Preparativní

Analytické

 Částice 5 – 10 µm

Č 1,8 – 3,5 µm • Částice

 Kolona 30,0 – 21,2 mm x 250 mm

• Kolona 2,5 – 4,6 mm x 150 – 250 mm

 (semiprep. 7,8 mm)

• Průtoky 10ky µl/min

 Průtoky 10tky ml/min

Obj vzorku k µll • Objem

 Objem vzorku ml

• Kapacita kolony - µg

 Kapacita kolony – mg

• Předkolona

 Recyklace vzorku

• Monolitické kolony

 Sériové řazení kolon

• Kapilární kolony

 Předkolona

• Nano-HPLC

Iontově výměnná chromatografie v HPLC módu První typ v HP módu (HPIEC) Silikagelové ionexové pryskyřice Nové materiályy - PS-DVB, alumina, PES-PA Pelikulární hydrofilní polymery Odolnost vůči tlaku Preparativní uspoř. - částice až 25 µm (40% hydratace)  Anal. uspoř. – částice 5 – 10 µm, menší stupeň hydratace (10 ( – 20%) %)  Separace x eluce – pH a iontová síla mob. fáze      


RP--HPLC RP

RP--HPLC RP

 Nejvhodnější pro separaci proteinů, peptidů  podmínky, podmínk kdy kd nedochází nedochá í k denaturaci denat raci  Závislost retence peptidů na malé změně obsahu organického modifikátoru  Silikagel modifikovaný různě dlouhými alkylovými řetězci – endcapping, endcapping omezená chemická stabilita!  Polymerní kolony PS-DVB – pH 2 – 12  Zirkoniové – výborná chemická a tepelná stabilita  Monolitické materiály  Částice 5 – 8 µm (lze až 40 µm)  Velikost p pórů 90 Å 300 Å 4000 Å

 Detekce UV-VIS (205 nm, nm 215 nm, nm 252 nm, nm 280 nm)  Průtoky do 1 ml/min  Teplota  Stacionární fáze – pro silně hydrofobní – C4, C5 pro hydrofilní peptidy – C8, C8 C18  Organický modifikátor – acetonitril, metanol, isopropanol (gradient)

Příklady

 Alternativní stacionární fáze f – monolitické kolony, kapilární kolony – 150 x 0,32 mm; průměr 3,5 µm, průtok 3 µl/min

Purifikace biopolymerů

Shrnutí……. Shrnutí

 Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství)  Vstupní podmínky:

 Nároky na čistotu:


dostupnost materiálu, typ vstupního materiálu stabilita produktu nároky na čistotu terapeutické účely (> (> 99%) farmaceutický průmysl diagnostické testy (20 – 90%) výzkum, katalýza reakcí potravinářství kosmetický průmysl (70 – 90%) ultračisté lt či té analytické l ti ké standardy t d d (95 – 99%)

 Počet purifikačních kroků: minimali ace ztrát, minimalizace trát časová časo á a finanční náročnost b by měla odpovídat nárokům na čistotu a účelu využití, možnost automatizace

Volba separační metody (výtěžek časová náročnost, (výtěžek, náročnost nabohacení nabohacení))  srážení, vysolování – na počátku, kdy je koncentrace produktu vysoká ((> 1mg/ml) g )  IEC – separace látek podle náboje, změna kapalné fáze (equilibrace), optimalizace ti li podmínek d í k separace, kkapacita it kkolon l přiměřená, ři ěř á relativně l ti ě levná  GPC - separace p látek podle p Mr a tvaru, odsolení, změna kapalné p fáze (equilibrace), šetrná, levná, jednoduchá, nezávislé na koncentraci produktu, typu kapalné fáze x zdlouhavá, zředění látky, malá kapacita kolon (1% Vt), často řadíme po vysolování  HIC – metoda silně závislá na experimentálních podmínkách, optimalizace podmínek (návaznost separačních kroků), objem vzorku pouze 1 – 5 % V kolony, vysoká kapacita, cena přiměřená  AC (IAC) – vysoce specifická metoda, vysoká kapacita, snižuje počty separačních kroků, cena různá podle typu ligandu, regenerace kolony

Řazení separačních kroků  techniky s vysokou kapacitou → techniky s nízkou kapacitou  za sebou metody separující látky na jiném principu (Mr (Mr,, náboj, povrchové vlastnosti apod.)  produkt jedné metody by měl být výchozím materiálem pro další (po vysolování nejde IEC bez GPC) (IEC a AC vyžadují definované složení kapalné fáze)  předcházet tvorbě dimerů, polymerů, agregátů  vliv agregátů na účinnost separace (přídavek detergentů?)


Praktické příklady

Sledování průběhu separace

 Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku)  chromatografie s hydrofóbní interakcí  Ionexová chromatografie g ((eluce vysokou y iontovou silou))  chromatografie s hydrofóbní interakcí

Metoda

Celková bílkovina

Celková aktivita

Specifická aktivita

Přečištění

Výtěžek

extrakt

100

100

1

-

100 %

 Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence (odstranění fragmentů a komplexů)

HIC

50

99

1 1.99 99

1 1.99 99

99 %

IEX

25

75

3

3.0

75 %

NEVHODNÉ Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok  dialýza, dialýza ultrafiltrace)

Ověření účinnosti separace, čistoty a charakterizace produktů

Oveření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace pomocí HPLC (iontová, SEC, afinitní chromatografie, hydrofobní) Ověření čistoty proteinů, polypeptidů pomocí elektroforézy

Kontrola stupně purifikace    

prvotní průběžná (tzv (tzv. postupná eliminace) finální včetně strukturní charakterizace produktu celkové množství produktu, biologická aktivita, výtěžnost, stupeň obohacení (koncentrace)

 Požadavky na čistotu

podle účelu použití (technické, purifikované, vysoce purifikované) Technické – frakcionovaná precipitace, kompromis mezi čistotou a cenou Purifikované – vyšší nároky na čistotu, cena, separace více metod za sebou Vysoce purifikované – vysoká cena cena, výzkum – strukturní studie studie, klinická diagnostika, kalibrátory, standardy, terapeutické účely (původ)

Hodnocení účinnosti purifikace a kritéria čistoty 

2 parametry – výtěžnost (návratnost - ztráty) a stupeň přečištění (kolik balastu se odstranilo)

 

výhoda u biologicky aktivních látek (enzymy) vždy se hodnotí biologická aktivita, objem eluentu a obsah bílkovin



kritéria čistoty – homogenita preparátu, krystalizace (1 pík u HPLC neznamená vždy homogenitu) – ověřit si různými metodami u biologicky aktivních látek kontaminující doprovodná biol. aktivita, přítomnost izoforem (pI), pozor na proteázy




 hodnocení homogenity 1. rozpustnost produktu (saturační křivka s ostrým přechodem v místě nasycení roztoku) 2. analytická ultracentrifugace (60tis./ot./min, fotometricky) 3. centrifugace v gradientu hustoty (1 frakce, - čas) 4. SDS SDS--PAGE a další elektroforetické metodyy 5. Imunochemické metody

Charakterizace produktů molekulová hmotnost celé molekuly, molekuly dílčích podjednotek (SDS(SDS-PAGE, SEC) • tvar a Mr – ultracentrifugace • izoelektrický bod pI - IEF • spektrální vlastnosti (UV(UV-VIS, cirkulární dichroismus, NMR spektroskopie • analýza primární struktury, sekvence monomerů • peptidové mapování s MS analýzou • rentgenostrukturní analýza •

Zakoncentrování produktů a jejich konečná úprava  zakoncentrování přečištěného produktu  odpařováním (x stabilita)  mrazová sublimace (lyofilizace) – hygroskopický prášek (sole ∆pH, (sole, ∆pH organická rozpouštědla) – denaturace, denaturace fragmentace  precipitace a resolubilizace  ultrafiltrace (rychlost sedimentace, rovnováha)  krystalizace (náročné, (náročné zdlouhavé)

Elektromigrační g metody y


Princip elektroforézy Separační metoda využívající různé pohyblivosti různých iontů ((složek směsi)) ve stejnosměrném j ((homogenním) g ) elektrickém poli. Pohyblivost P h bli t separovaných ý h iiontů tů závisí á i í také t ké na:  použitém elektrolytu (kapalné fázi)  chemické vlastnosti a porozita nosiče Většinu biologicky zajímavých látek lze ve vodném prostředí převést ř é t na elektricky l kt i k nabité bité čá částice částice. ti . Metodika: Metodika: disociace disociace, změna pH pH, adsorpce iontů jiného druhu, chemickou vazbou - tvorbou tzv. ionogenních komplexů.

Jevy doprovázející elektroforézu

Elektroendoosmóza

Produkce Jouleova tepla S rostoucím napětím (Ohm Ohmův ův zákon) roste elektrický proud proud:: I = U/R U/R.. práci,, energie Pokud el. el. proud nekoná mechanickou nebo chemickou práci

• na vnitřním povrchu kapiláry v místě styku s vodivým roztokem vzniká elektrická dvojvrstva

přeměňuje j na teplo teplo: p : Jouleovo se bez užitku p

• p pevná část ((stěna kapiláry) p y) je j nabitá nepohyblivým plošným záporným elektrickým nábojem

teplo p

Chlazení g gelů u vysokonapěťové y p – voda, termostat, led

elektroforézy y

Elektroendoosmóza Uplatňuje u kapilární elektroforézy elektroforézy.. Stěny kapilár jsou vyrobeny z kkremičitého ičitéh skla kl a vlivem li di disociace i silanolových il l ý h skupin k i mají jí záporný á ý náboj. náboj. K záporným nábojům se váží pozitivně nabité ionty (“counterions ((“ counterions”), counterions ”), ), vytváří stacionární vrstvu (Sternova) Sternova). V následující vrstvě jsou však tyto ionty již mobilní (Guy(Guy-Chapmanova vrstva) vrstva).

• z kapalné části se kladné ionty připojí ke stěně kapiláry (dvojvrtva), ionty se pohybují k anodě • pohyblivá vrstvička se žene kapilárou a strhne t h sebou b celý lý průřez ůř kapaliny k li v kapiláře • roztok putuje kapilárou celý najednou (u elektroforézy putují jen ionty).

Typy elektroseparačních metod


   

Volná elektroforéza Zónová elektroforéza Isoelektrická fokusace p elektroforéza Kapilární

   

Vertikální x Horizontální 1D nebo 2D rozměrná Nativní x Denaturační podmínky Analytická x Preparativní

Zónová elektroforéza - Elektroforéza na nosiči provádí se na hydrofilních porézních nosičích, nerozpustných ve vodě, s minimální i i ál í adsorpční d č í schopností, h tí zabraňuje b ň j zpětnému ět é mísení í í rozdělených složek

Nosiče

P í Papírová á elektroforéza l kt f é – nosičem ič elektrolytu l kt l t jje chromatografický h t fi ký papír í – analýza bílkovin; dělení nízkomolekulárních látek, aminokyselin Elektroforéza na tenké vrstvě – nosičem elektrolytu (H2O + pufr) je vrstva silikagelu nebo škrobu na skleněné podložce. Gelová elektroforéza – agar, agaróza, agaróza, PAAG, porozita gelu gradient porozity gradient pH Provedení:

Gelová elektroforéza

Aparatury pro trubičkové gely

horizontální

vertikální

plošné, v trubičkách, vertikální , horizontální


Kombinovaná elektroforéza dělení je využito (kromě.el.náboje) ještě dalších odlišností – např. velikosti a molární hmotnosti iontů iontů. Nosičem elektrolytu je obvykle gel (porozita SDS-PAGE elektroforéza – dělení látek podle Mr gelu) př. SDS(zvýšení účinnosti separace, citlivosti detekce)

Použití 1. pro účely analytické i preparativní (méně) 2 k separaci velkých molekul (proteiny nebo NK) 2. 3. k separaci menších molekul (cukry, peptidy nukleotidy)

2D elektroforéza – kombinace izoleektrické fokuzace s gelovou chromatografií Elektrochromatografie – dvourozměrná – jeden směr chromatografie, druhý směr elektroforéza, Elektrodialýza, Elektroultrafiltrace, Elektroultrafiltrace

Faktory ovlivňující pohyblivost látky 1. 2 2. 3. 4.

Celkový povrchový náboj separované látky Velikost a tvar molekuly Porosita gelu pH a složení elektrolytu

Elektrodesorpce – eluce složek afinitní chromatografie elektrickým polem. Blotting (Western blotting, Immunoblotting)

Dva hlavní typy PAAG elektroforézy Nativní gelová (nedenaturační) elektroforéza • Probíhá bez denaturačních činidel. • Proteiny migrují gelem podle svého celkového náboje velikosti a tvaru a podle velikosti pórů v gelu. gelu

Proteiny jsou tepelně denaturov denaturová ány ve vzorkovém pufru obsahujícím dodecyl sulf sulfá át sodný (SDS) (SDS)-- zachována je tak pouze jejich primární struktura (var 2 – 3 min.) Denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj daný vazbou SDS – migrace tedy závisí závisí pouze na jejich molekulové l k l é hmotnosti h t ti

SDS gelová elektroforéza • Proteiny jsou denaturovány dodecylsíranem sodným (SDS) a βmerkaptoetanolem (zruší disulfidické vazby). • Pohyblivost P h bli závisí á i í na molekulové l k l é hmotnosti h i polypeptidových l id ý h řetězců ř ě ů (Mr) Mr) • Vhodná pro analýzu makromolekulárních komplexů. •

•

Akrylamid rylamidový ový gel gel:: pevná a inertní matrix ide deá ální pro separaci protein proteinů ů Menší velikost pórů než u agarosy agarosy

Aniontový detergent, detergent, solubilizuje solubilizuje a denatur denaturuje uje protein proteinyy Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru poměru, asi 1 1,4 4g SDS/g proteinu

PAA gelová elektroforéza - PAGE Gel z polymerovaného akrylamidu Polymer vytváří síť (podle koncentrace akrylamidu určitá velikost ok sítě) Molekuly se dělí podle své velkosti (malé rychleji, velké pomaleji).

Laemmliho diskontinuální systém Používá se dvou gelů tzv. zaostřovacího („stacking“) gelu nahoře a separačního („running („running“)) gelu dole. Liší se hodnoty pH 6, 8 a 8, 3 elektrodový pufr se pak liší od obou gelových pufrů. Mobilita separovaných proteinů mezi a) mobilitou iontu ve stacking gelu Cl--, tzv. leading ion = vedoucí Cl


b) mobilitou iontu v katodovém pufru (glycin, pK 9.6, tzv. trailing ion = zakončující). Ionty i proteiny migrují do zaostřovacího gelu (5%) koncentrují se do velmi úzké zóny

Co obsahuje vzorkový pufr pro SDSSDS-PAGE? Tris pufr utváří vhodné pH

Barvení proteinových gelů  

SDS (dodecyl sulf sulfá át sodný sodný)) detergent poskytující proteinům negativní náboj Glycerol vzhledem ke své vyšší specifické hmotnosti zajišťuje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení Bromophenol Blue Blue““ barvivo umižňující sledovat průběh elektroforézy (pohyb čela v gelu) 2-ME (DTT)

  

stříbrem Coomassie blue Fluorescenční luorescenční barviva RI Specifické barvení pro fosfo--, glykofosfo glyko-


Molekulová hmotnost proteinů

Gel – 10%, Mr marker pozice 5

velikost měřena v daltonech (Da) či kilodalton kilodaltonech ech (kDa) D Dalton lt = jednotka j d tk atomové t é hmotnosti h t ti =p přibližně se rovná hmotnosti atomu H (1,66 x 10 -24 g) = definován d fi á ttaké ké jjako k 1/16 h hmotnosti t ti atomu t O Průměrná amino aminokyselina kyselina = 110 Da Průměrný nu nukkleotidový leotidový pár = 649 Da

Nanesení vzorku

Separace látek podle jejich Mr

Určování molekulové hmotnosti proteinů


Účinnost separace směsi v gelech o různé porozitě

Porozita gelu a Mr separovaných látek

PAGE elektroforézy - modifikace

PAGE elektroforéza – preparativní verze

1) Nativní (různé pH, pufry – Tris, MES, MOPS, HEPES) 2) SDS-PAGE – tris/tricine– pro proteiny menší než 14 kDa (urea) 3) SDS-PAGE – tris/borát/EDTA – elektroforéza pro gp, SDS se neváže áž na cukerné k é složky l žk 4) Afinoforéza – polymer modifikovaný látkou vykazující afinitu k jedné ze separovaných složek (např. lektinová, chelatační) 5)) Imunoelektroforéza, I l k f é IImunofixace fi


Izoelektrická fokuzace

Izoelektrická fokuzace Isoelektická fokusace se provádí buď v trubičkách nebo v plochých p ý gelech,, stripech. g stripech p . Hotové IEF g gely y s amfolyty yy nebo immobiliny se dodávají komerčně spolu s přístroji pro auomatizovanou IEF IEF.. Vzorky se obvykle nanášejí na katodové straně straně.. Denaturující podmínky při IEF - 9 M močovina nebo neionogenní g detergenty g y ((Triton X-100 100)). Využití:: stanovení pI, kontrola homogenity, isoenzymy Využití

Preparativní IEF Provádí se v chlazených vertikálních skleněných kolonách kolonách,, které jsou naplněny roztokem amfolytů - stabilizováno gradientem sacharosy (viz centrifugace), Ficol Ficol,, Perkol Perkol.. Na konci separace se kolona vypustí do zkumavek ve sběrači frakcí frakcí.. Zařízení Rotofor (Bio (Bio--Rad) membranový b ý systém té zón ó brání bá í smísení separovaných vzorků

Separace izoenzymů ( ∆pI pI))

Dvojrozměrná j ((2D)) elektroforéza p proteinů

2D gelová elektroforéza

Kombinuje použití IEF a SDS-PAGE pro účely studia proteomu, vypracováno O´Farrellem O Farrellem v 70. letech. , Umožňuje rozlišení až 10 000 proteinů.

Rozdělí současně stovky i tisíce proteinů P t i jsou Proteiny j rozprostřeny tř na ploše l š

Proteiny se nejprve rozdělí podle jejich pI v gradientu pH pH. Po separaci v prvním rozměru je provedena elektroforéza v gelu. Proteiny migrují ve druhém rozměru v závislosti na své velikosti.


Separace izoforem ( ∆pI pI))

Blotting proteinů a nukleových kyselin blotting (angl. blot = skvrna, kaňka, česky přenos) pásy separované látky (např. SDS-PAGE) se přenášejí elektroforézou na membránu (NC, PVDF), kde jsou uchyceny adsorpcí nebo kovalentní vazbou. vazbou DNA analýza (Southern blotting, Southern 1975) RNA analýza (Northern blotting, Alwine et al., 1977) PROT analýza (Western blotting, Towbin et al., 1979) 1. fáze: fáze: klasická SDS SDS--PAGE (separace podle Mr Mr)) 2. fáze fáze:: blotování působením elektrického p p proudu dojde j kp přeblotování p proteinů z g gelu do membrány 3. fáze fáze:: vyvíjení vizualizace přenesených proteinů, nespecifické nebo specifické barvení Ponceau S, Fast Green nebo Amidočerni10 B.


Rozdělení metod blottingu podle provedení

Sestava při blotování

Difúzní blotting - prostá difúze v tanku s přenosovým pufrem, dlouhá doba 36-48 hodin, velkou nevýhodou ý difuze do stran - zhoršení rozlišení vlastní elektroforetické separace. Kapilární blotting - celá jednotka je zatížena, suchý papír nasává kapilárními silami pufr, vzorek je tak tažen z gelu na membránu. Trvá zhruba 12 hodin. Vakuový blotting - místo kapilárních sil vzorek tažen vakuem. Podstatně rychlejší (30 min). Výhodou též ostřejší pásy (potlačení difuze). difuze) Elektroblotting - nejrychlejší a nejúčinnější metoda. Hnací silou je v tomto případě ří dě síla íl elektrického l k i kéh pole. l Podle P dl provedení d í se rozlišuje liš j tzv. „tankový (tank, wet)“ blotting a „polosuchý (semi-dry)“ blotting. Jediný pro vysokomolekulární biopolymery.

Detekce konkrétního proteinu Western blot s imunochemickou detekcí Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE) transfer f proteinů i ů z gelu l na membránu bá = Western blot detekce proteinu protilátkou (k (komplexu l primární i á í a sekundární k dá í protilátky) tilátk )

vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence

W. blot

Primární protilátka

membrána s navázanými proteiny

Sekundární protilátky konjugované s enzymem, fluor. fl značkou, čk ale l i koloidním zlatem, zlatem, radioaktivně,, radioaktivně luminiscenčně. luminiscenčně. Detekce glykoproteinů Schiffovou reakcí,, alcianovou modří,, vazbou lektinů lektinů..

Elektroblotting

SDS--PAGE – široké uplatnění SDS


p  detekce kontaminace NML problematická  průkaz produktu ve směsi (Mr, standard)  průkaz rozpadových fragmentů (Mr, Imunoblot)  kvantifikace ((denzitometricky) y) omezená

Eluo ované pro oteiny

Nenav vázané prroteiny

porozitu g gelu,,  široké rozmezí Mr látek - zvolit vhodnou p nejlépe gradientové gely

Stan ndardy

 citlivost metody – μg až ng! podle typu vizualizace  vizualizace všech, i kontaminujících složek x imunoblott (identifikace)

 Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu  Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba h b stanovit t it molekulovou l k l hmotnost izolovaného proteinu (SDS elektroforézou)

Půvo odní vzorrek

Sledování čistoty proteinů

 čistota produktu – průběžné, konečné monitorování

Prokázání identity y  reakcí se specifickou Ab imunoblot  uvolnit elektroelucí a následně MS analýzu

 možnost následné MS analýzy „bandů“

Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu Homogenát

Frakční vysolování

1

2

Iontoměničová Molekulové síto chromatografie (gelová filtrace)

3

4


5

Izolace IgG1 - hyperimunní sérum Afinitní chromatografie MPC MPC-protein t i A

10% gel SDS-PAGE barveno Coomasie Blue Mr

serum

E1

E2

Mr


Purifikace u ace trypsinu t yps u na a koloně o o ě s pp-a aminobenzamidinem obe a d e

Identifikace antianti-CA I protilátek izolovaných afinitní chromatografií

Hodnocení čistoty výchozího materiálu před enzymovou fragmentací

Vizualizace fosforylovaných proteinů - specifické barvení ProQ Diamond II

Tris Tricine SDS PAGE Tris–Tricine–SDS-PAGE: gel—16,5% T, 3% C (MW 1–70 kDa), detection with silver staining, positions: (1) non-digested native CA I, (2) non-digested unfolded CA I, (3) unfolded CA I digested 3 h by immobilized trypsin, (4) molecular molec lar marker (10–250 (10 250 kDa)

Čísla udávají množství proteinu v mg/band

D il í í k l b Detailní snímek gelu barveného 180 minut a odbarvovaného přes noc éh 180 i db éh ř Detekce na přístroji Molecular Imager FX (Bio‐Rad Laboratories): Ex/Em: 532nm/602nm

TrisTris-Tricine Tricine--SDS SDS--PAGE PAGE--urea pro Abeta peptidy + blotting M1

1

2

3

4

5

6

7

Analýzy elučních frakcí pomocí SDS-PAGE a IMUNOBLOTu

8 9 10

4

APP alfa

SDS-PAGE

5

6

4

7

5

6

7

37 kDa 25 kDa


1-37 1-38 1-39 1-40 1-42

37 kDa

Myelinový bazický protein !! (MS analýza)

PAAG gely reprezentují eluční frakce z imunosorbentu Ademtech 5B2 Ab.

25 kDa

Eluce pH 3 7

Abeta standards

Original CSF

Eluting fraction

5 4

Eluce pH 2,5 25 2 1

PrP

Imunoblot

37 kDa 25 kDa

Lane 1, 2 and 10: synthetic y Abeta Standard mix 1-37,, 1-38,, 1-39,, 1-40,, 1-42 Lane 3: CSF (#3131) which was sent to Pardubice Lane 4: Original sample (CSF UPCE) Lane 5: Eluting fraction IP 1 g fraction IP 1 ((1:4 diluted)) Lane 6: Eluting Lane 7: Eluting fraction IP 2 Lane 8: Eluting fraction IP 2 (1:4 diluted) Western blot, University of Duisburg (Hermann) Lane 9: Eluting fraction IP 2 (1:8 diltuted)

HA štěpená Hyaluronidázou v čase

6

a

b

Gely reprezentují eluční frakce získané z imunosorbentů Ademtech 5B2 Ab (a) a perlové celulózy 9H7 Ab (b). Průkaz PrP specificky pomocí anti-PrPHRP 3F4 (imunoblot).

HPLC proteinů, peptidů, polysacharidů

PAA gel, 10%, 5% zaostřovací, TBE pufr pH 8,4. Separace 20 min při 125 V a 20 mA/1 gel a potom 200 V a 40 mA/1 gel

    

Gelová permeační chromatografie Iontově výměnná chromatografie Hydrofóbní interakční chromatografie Afinitní chromatografie RP HPLC RP-HPLC


HPLC – analytické uspořádání Preparativní

Analytické

 Částice 5 – 10 µm

Č 1,8 – 3,5 µm • Částice

 Kolona 30,0 – 21,2 mm x 250 mm

• Kolona 2,5 – 4,6 mm x 150 – 250 mm

 (semiprep. 7,8 mm)

• Průtoky 10ky µl/min

 Průtoky 10tky ml/min

Obj vzorku k µll • Objem

 Objem vzorku ml

• Kapacita kolony - µg

 Kapacita kolony – mg

• Předkolona

 Recyklace vzorku

• Monolitické kolony

 Sériové řazení kolon

• Kapilární kolony

 Předkolona

• Nano-HPLC

Gelová permeační chromatografie v HPLC módu  Rigidní nosič silikagel (povahou aniont, hydrofóbní)  Semirigidní nosič PS  Modifikované povrchy – biokompatibilita (Silikagel modif. hydrofilním polymerem)  Částice 5 – 10 µm, sférické  Částice s uniformní porozitou  Průtoky do 0,5 ml  Teplota 4°C – 37°C

Iontově výměnná chromatografie v HPLC módu  První typ v HP módu (HPIEC)  Silikagelové ionexové pryskyřice  Nové materiály - PS-DVB, alumina, PES-PA  Pelikulární hydrofilní polymery  Odolnost vůči tlaku  Preparativní uspoř. - částice až 25 µm (40% hydratace)  A Anal. l uspoř. ř – částice čá ti 5 – 10 µm, menší ší stupeň t ň hydratace h d t (10 – 20%)  Separace x eluce – pH a iontová síla mob. fáze

Kombinace SEC (IEC) + ELFA

RP--HPLC RP

RP--HPLC RP

 Nejvhodnější pro separaci proteinů, peptidů

 Detekce UV-VIS (205 nm, 215 nm, 252 nm, 280 nm)

 podmínky, kdy nedochází k denaturaci  Závislost retence peptidů na malé změně obsahu organického modifikátoru

 Průtoky do 1 ml/min  Teplota


g modifikovaný ý různě dlouhými ý alkylovými y ý řetězci –  Silikagel endcapping, omezená chemická stabilita!

 Stacionární fáze – p pro silně hydrofobní y – C4,, C5 pro hydrofilní peptidy – C8, C18

y kolony y PS-DVB – p pH 2 – 12  Polymerní

 Organický g ý modifikátor – acetonitril,, metanol,, isopropanol p p (gradient)

 Zirkoniové – výborná chemická a tepelná stabilita  Monolitické materiály  Částice 5 – 8 µ µm ((lze až 40 µ µm))  Velikost pórů 90 Å 300 Å 4000 Å

 Alternativní stacionární fáze – monolitické kolony, kapilární kolony – 150 x 0 0,32 32 mm; průměr 3 3,5 5 µm, µm průtok 3 µl/min

Výsledek purifikace

Identifikace proteinů

Březen 2011


Identifikace proteinů v proteomice

„Fingerprint“

A) Molekulovou hmotnost a identifikace analytu

 Proteinové mapy  2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra

B)) Identifikace – tzv. sekvenční analýza ý

 Peptidové mapy  2D elektroforeogramy elektroforeogramy, HPLC spektra spektra, CZE spektra, MS spektra

ELFO (Imunoblot) + MS (MALDI TOF, ESI TOF)

1. Edmanovou degradací (přímé sekvencování) 2. Hmotovou spektrometrií (nepřímé sekvencování, fingerprinting, „de novo“ sekvencování)

DIGE

+ Informační databáze

 Charakteristické a specifické polohy skvrn, píků – „otisky prstů“ ů“ pro každý např. buněčný proteom nebo pro každý protein

Diferenční 2D elektroforéza

Fragmentace proteinů, polypeptidových řetězců

Výsledné „mapy“ proteinů se porovnávají s kontrolními vzorky (pacienti s konkrétním onemocněním a zdraví pacienti). Po „vyříznutí“ oblasti vykazující odlišnost je provedena analýza MS.

Edmanovo odbourávání množství vzorku min min.. 20 20--50 pmol pmol, opt. 200 pmol konkurenční MS nyní zvládá fmoly (nanosprej ESI Qq TOF MS) Podmínkou je volný N-konec peptidu či proteinu. proteinu


Často je však N-konec chemicky blokován (acetylace, acetylace, pyroglutamová kyselina kyselina). Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst - zde nízký výtěžek v daném cyklu. Automatizace

Edmanovo odbourávání možné získat 30 - 40 aminokyselin z N-konce, N konce samozřejmě s narůstající chybou (reakce není 100% ní). Za ideálních podmínek maximálně 100 aminokyselin. V automatickém proteinovém sekvenátoru (dodávají např. firmy Applied Biosystems, Shimadzu) je analyzovaný protein či peptid imobilizován Buď na disku ze skleněných vláken (kovalentní vazba imobilizován. nebo adsorpce) nebo na membráně PVDF (ProSorb patrony nebo po blottingu). Reagencie ke vzorku vstupují a jsou odváděny nejlépe v plynné fázi. Doba trvání jednoho cyklu analýzy činí 3030-60 min. min Je třeba připočítat eluci standardů aminokyselin y a tzv. p prázdný ý run. Po odštěpení PTC PTC--derivátu následuje jeho analýza (zjištění retenčního času na HPLC koloně)) s detekcí při 270 nm.

Hmotnostní spektrometrie (MS)  Je metoda pro separaci látek podle rozdílů hmoty (m (m) a náboje (z (z) s využitím elektrického a magnetického pole.  Určovanou fyzikální y veličinou jje p podíl hmoty y a náboje j ((m/z), ) při znalosti náboje umožňuje určit molekulovou hmotnost.  Velmi citlivá metoda, stačí několik iontů k získání měřitelného signálu, poměr m/z může být stanoven s přesností 10-4.

 techniky ionizace (ESI, MALDI) - lze měřit i velké molekuly (např. proteiny, lipidové komplexy, polysacharidy). l h id )


Princip ESI TOF MS a MALDI TOF MS

Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Laserová desorpční ionizace s pomocí matrice

Metoda MALDI MS (od 1988) 1988) je rozšířeným nástrojem pro separaci přírodních látek, peptidů, proteinů a dalších biobiomakromolekul (oligonukleotidy oligonukleotidy, g y, sacharidy, y lipidy). lipidy) p y). Vzorek na nerezové destičce ukotven v netěkavé matrici t i i (kokrystalizace). (k k t li ) Používá P ží á se např. ř kyselina k li nikotinová nebo 2,5-dihydroxybenzoová. Destička se vloží do přístroje, j zacílí se laserový ý paprsek („ („fire fire“) “), transfer energie způsobí ionizaci.

SELDI – surface enhanced laser desorption desorption//ionisation

array chip

hmotová spektrometrie výhody jednoduchost rychlost hl t selektivita

nevýhody nízká citlivost nízká přesnost urč. m/z nízké rozlišení

MS je často propojena s jinými analytickými technikami technikami: GC-MS, LC-MS, CE-MS ale i MS-MS (Interphase) Kromě tandemové MS (MS-MS) mohou být spojeny až tři i více analyzátorů („multiple ( multiple“ MS). MS) 1) Výběr studované látky ze směsi 2) Fragmentace 3) Analýza fragmentů Kombinace s chromato či elfo metodou slouží MS jako detektor s vysokým rozlišením - on-line analýza (x offline detekce). detekce) Klíčové je propojení přístrojů. přístrojů LC-MS LC MS v biochemii pro peptidy a proteiny. Spřažení - ESI x MALDI

Identifikace pomocí HPLC-ESI-MS/MS 1. Štěpení proteinu trypsinem

3. MS vybraného štěpu 2 5 kD 2,5


vyříznout proužek rozřezat omýt Příprava (redukce) (alkylace) štěpení proteasou

vzorku

proč redukce a alkylace? rozvolnění l ě í S-S S S vazeb b

2. Separace peptidů chromatografií (HPLC)

m/z

UVabs


4. MS/MS spektrum

d lší další fragmentace

trypsin denaturace > lepší proteolýza ochrana oxidovaných reziduí Cys agresivní proteasa vysoká ká primární i á í specificita, ifi it nízká sekundární prům. m/z fragmentu ~ 1.5 kDa štěpí: arginyl-X, lysyl-X; ale ne X=prolyl

Time (min) m/z

5 Určení části sekvence .. M G A D D H D K L .. 5.

DTT, dithiothreitol

KONTAMINACE! – keratiny (kůže, vlasy, srst, vlna) – detergenty d (SDS (SDS, T Triton i atp.)) IAA, jódoctová kys.

6. Srovnávání s databázemi, identifikace

Identifikace proteinů – „peptide fingerprinting”

Peptide Mass Fingerprinting - PMF, MALDI TOF MS

štěpení p p proteázou ((trypsinem) yp ) protein I (12 kD)

DNA (i EST), proteinová databáze

2 fragmenty (4 kD, 8 kD)


generování teoretických trypsinových štěpů ze známých či předpokládaných proteinových i ý h sekvencí k í

MALDI ToF protein I

4000

8000

m/z

8000

m/z

protein a: 3 3, 5, 5 9, 9 12 kD protein b: 2, 7, 9 kD protein c: 4, 8 kD protein d: 3, 9, 12 kD protein e: 2, 6, 8 kD

protein II 2000

6000

Srovnání experimentálně stanovených velikostí peptidů s teoretickými štěpy

masses (m/z) 940.421 - ELSDIAR 1093.477 - QLLLTADDR 1341.556 - PHSHPALTPEQK 1469.633 - PHSHPALTPEQKK 1488.645 - GILAADESTGSIAKR 1646.650 - LQSIGTENTEWENRR 2122 975 - IGENHTPSALAIMENANVLAR 2122.975 2241.903 - YTPSGQAGAAASESLFISNHAY


SEC + Q TOF MASS

Bioinformatika pro MS

Charakterizace ko ko-- a posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS fosforylace, sulfatace, glykosylace, N-koncové modifikace

organismy o ga s y se se sekvenovaným e o a ý ge genomem o e PMF, statistická shoda predikovaných m/z tryptických peptidů (i silico (in ili digest) di t) s experimentálními i tál í i PC programy p g y MASCOT ((firma SEQUEST, ProteinProspector

Matrixscience Matrixscience), ),

organismy s nesekvenovaným ne genomem hledání na základě evoluční homologie proteinových sekvencí Charakterizace koko- a p posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS

Význam: důležité Vý důl žité pro regulaci l i buněčné b ěč é distribuce di t ib a modulaci d l i funkcí proteinů. Př. fosforylace - přenos signálu v buňce, glykosylace - vliv na funkční, funkční strukturní a imunologické vlastnosti proteinů. Výhoda MALDI MS (FT ICR MS) analýzy v tomto případě spočívá ve velké přesnosti určení molekulové hmotnosti, citlivosti itli ti a rozlišení. liš í Protokol pro analýzu proteinové modifikace 1) štěpením vzorku 2) enzymové modifikaci. Pak se analyzuje rozdíl v Mr určitého peptidu spočítané na základě sekvence a odečtené z MS spektra spektra..

Děkuji za pozornost


Zuzana Bilkova@upce cz [email protected]


Metody izolace a purifikace produktů obrazová příloha

Škola molekulárních biotechnologií Profession, Ol Olomouc, březen bř 2011

Bílková Zuzana

Zdroje proteinů, polysacharidů a jiných ….  mikroorganismy (bakterie, kvasinky, plísně, řasy)  živočišné tkáně (myši, (myši krysy, krysy králíci, králíci jateční zvířata orgány, krev, člověk – tělní tekutiny (krev  plasmin plasmin,, thrombin, thrombin, specifické protilátky ...;; moč  urokinasa ...)  rostlinná pletiva  tělní tekutinyy savců

Cíl izolace





Získání biopolymeru (proteiny, polysacharidy glykoproteiny….) polysacharidy, glykoproteiny ) definované čistoty Zachování biologické aktivity

Získat p produkt o patřičné p čistotě s vynaložením y přiměřeného (optimálního) úsilí a přiměřeného množství peněz

Výchozí materiál - úskalí  Komplexnost biologické matrice ( elké množství (velké množst í doprovodných dopro odných bílkovin bílko in a jiných látek)  Malá množství cílového produktu  Labilita biologické aktivity produktu  Strukturní S labilita

Rozbíjení buněk, tkání, homogenizace

Zásady pro práci s biologickým materiálem 1.

Pokud možno zpracovat co nejdříve

2.

V případě potřeby zmrazit (– (– 20;C, – 80 oC)

3.

Rozmražování – co nejrychleji jy j x postupně p p zvyšovat y teplotu?


Separační metody y A. Separace založené na velikosti molekul

(dialýza a ultrafiltrace, ultrafiltrace centrifugace v hustotním gradientu, gelová filtrační chromatografie)

B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti p proteinů (izoelektrická precipitace, vysolování neutrálními solemi, frakcionace organickými rozpouštědly)

C. Separace založené na základě povrchového náboje (elektroforetické metody, iontově výměnná chromatografie, afinitní chromatografie)

4 4.

Nízká teplota při izolaci

5.

Vhodné pH + iontová síla

6.

Vhodná koncentrace bílkoviny

7.

Zabránit pěnění p

8.

Omezení proteolytické aktivity (směs inhibitorů)

9 9.

Přídavek Příd k specifických ifi ký h lát látek k ((např. ř ME ME, EDTA ...))

Separační metody  Centrifugace a ultracentrifugace  Membránové separace (ultrafiltrace, dialýza)  Selektivní precipitace  Iontově výměnná chromatografie (IEC)  Chromatografie na molekulových sítech (SEC)  Hydrofóbní y chromatografie g (HIC) ( )  Afinitní chromatografie (AC, IAC, HPIAC)  Preparativní elektromigrační techniky

Selektivní precipitace

Separace založené na rozdílné rozpustnosti proteinů Rozpustnost proteinu prudce stoupá, p p , jjeje-li v roztoku o pH nižším nebo v pH vyšším než pI proteinu i (molekuly mají stejné náboje a odpuzují se) se).

1) rozpustnost globulárních proteinů ovlivňuje pH 2) při pH = pI je rozpustnost nejnižší, molekuly mají tendenci se shlukovat – mají 0 náboj 3) protein má celkový povrchový náboj buď kladný nebo záporný (NH3+ nebo COO- postranních řetězců aminokyselin v proteinu) t i ) 4) princip izoelektrické precipitace - každý protein má jiné pI a vysráží se ze směsi proteinů v roztoku, který má pH = jeho pI pI.. pH roztoku je nižší

pI

náboj proteinu

+

Frakcionovaná precipitace - vysolování

pH roztoku je vyšší náboj proteinu

-

Precipitace

Hydrofilní aminokyseliny interagují s molekulami vody a vytvářejí s ní vodíkové můstky (čím více hydrofilních skupin, tím více je protein rozpustný)

 Bílkoviny aktivní v nativním stavu, srážením ke změnám konformace molekuly (porušení fyz fyz..-chem.vlastností chem chem.vlastností), vlastností)), musí vlastností) biol.. aktivita zajištěna návratem do fyziol biol fyziol.. Podmínek

 Přidání soli do roztoku odebírá proteinu vodní plášť

 Nezaměňovat s denaturací - Ireverzibilní precipitace –– sole těžkých ý kovů,, koncentrované minerální kyseliny, y y, orga orgag nické kyseliny, teplo

 Interakce protein/protein je silnější než protein/roztok

rozpustn nost


Selektivní precipitace

vysolování

vsolování

 Molekuly M l k l proteinu t i koagulují k l jí (agregují) díky hydrofóbním interakcím

I

Při vysoké iontové síle se protein kompletně vysráží (mezi 39 a 75 %).

 Látky používané pro separaci bílkovin – EtOH EtOH,, NaCl, NaCl,  ((NH4)2SO4 - rozpustnost se málo mění s teplotou, saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3), levný, čistý  Filtrace nahrazena centrifugací

Srážení organickými polymery a sloučeninami

Srážení organickými rozpouštědly  Kompletně mísitelné s vodou  Musí mít dobrý precipitační efekt  Srážení za nízké teploty (< 0 °C) C)!!! !!! X denaturace proteinu

Princip identický jako srážení s org. org. rozpouštědly  DEAE d dextran, t PEG PEG, Polyakrylová P l k l á kyselina k li  Rivanol (2 (2--ethoxyethoxy-6,9 6,9--diaminoakridinlaktát)  Kaprylová kyselina

 EtOH EtOH,, aceton, MetOH, MetOH, propanol, dioxan 1) etanol sníží dielektrickou konstantu (nižší než voda) 2)) sníží se stupeň p ionizace a zvýší ý p přitažlivé síly y mezi opačnými p ý náboji, tím se sníží rozpustnost.

 Přídavky Příd k některých ěkt ý h látek lát k (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin  pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno  Při vyšší teplotě může více probíhat proteolýza

 Při této metodě denaturujeme a souč souč.. precipitujeme y cílová bílkovina ((enzym) y ) musí zůstat z balastní bílkoviny, 85 - 90 % v nativním stavu.  Denaturační vlivy – T, pH, org org.. rozpouštědla

Kapalinová chromatografie v nízkotlakém uspořádání

Tepelná denaturace

%


Srážení selektivní denaturací

Low pressure liquid chromatography LPLC

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Bílkovina 1 Bílkovina 2

Nízkotlaká (LPLC), střednětlaká (FPLC) a vysokotlaká (HPLC) chromatografie Kolonová (CC), na tenké vrstvě (TLC), na papíře (PC), vsádková (batch-wise)

teplota

Preparativní p účely y ….. Gelová chromatografie Ionexová chromatografie g Chromatografie s hydrofóbní interakcí Afinitní chromatografie


Chromatografické metody – základní charakteristika  Distribuce složek mezi dvěma fázemi  mobilní a stacionární fáze  M Mobilní bil í fá fáze  kapalina k li (k (kapalinová li á chromatografie); h t fi ) plyn l (plynová chromatorafie) chromatorafie)  Stacionární fáze  částečky tuhé fáze, tenká vrstva kapaliny na částicích částicích, kapalina v pórech chrom chrom. nosiče nosiče, film kapaliny na vnitřní straně kapiláry  Opakovaný transport složek do stacionární fáze a zpět do fáze mobilní

Instrumentace pro LPLC        

Pumpa – peristaltická nebo gravitace Gradient – směšovač mob. fází Podmínky separace – izokratické izokratické,, gradientové přímo p pumpou p na kolonu Dávkování – p Kolony – skleněné, plastové, kovové (nerezové) Detekce – spektrofotometrická 254, 254 280 nm nm,, …nm …nm Vyhodnocování – zapisovač Sběrač frakcí – programovatelný

Terminologie

Eluční objem Mrtvý objem Retenční poměr Kapacitní poměr Účinnost kolony y (teoretické patro)  Rozlišení elučních křivek (selektivita, kapacitní poměr, účinnost)  ………     

Chromatografická sestava pro preparativní účely

KOLONY

HighHigh-through put system ……

MIKROKOLONY


KOLONA pro prep prep.. uspořádání Částice sorbentu

Vzorový chromatogram pro LPLC


TVARY CHROMATOGRAFICKÝCH PÍKů

Iontově výměnná chromatografie  Založena na silných elektrostatických silách mezi ionizovanými funkčními skupinami měniče a ionty látek v okolním roztoku (analyt, i t solí ionty lí apod.) d)  Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný p ý náboj,j, afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje  V případě proteinů hraje zásadní roli pH prostředí, mobilní fáze!

Celulosové a dextranové nosiče

Ionexová chromatografie eluce prtoeinů vysokou iontovou silou

Katexy – záporný náboj  vazba kationtů ), sulfopropyl sulfopropyl(SP) p py ((SP)) OSO3 OSO3-silné – sulfo ((S), slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO COO-Anexy – kladný náboj  vazba aniontů slab sl abé é – diethylaminoethyl (DEAE) silné – triethylaminoethyl (TEAE)

Stacionární fáze organické polymery, materiály na bázi silikagelu

 Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny  pH < pI  bílkovina nese kladný náboj  separace na katexu  pH > pI  bílkovina nese záporný náboj  separace na anexu  pH = pI  celkový náboj bílkoviny je nulový  nelze provést ionexovou chromatografii nebo tzv. negativní izolaci (např. IgG ze séra)

Ionexová chromatografie

Typická Typic ká ionex ionexová ová chromatografie

 Nanášení vzorku – nízká iontová síla


 Eluce – gradientová Zvyšováním iontové síly Změnou pH retenci lze ovlivnit i teplotou p nebo přídavkem p org org. g. modifikátoru

Praktické využití

 purifikace a zakoncentrování proteinu,  výměna pufru, separace látek s podobnou iontovou povahou (silné i slabé elektrolyty)  separace neiontových látek

Typická Typic ká IEC

Loading ends, Low salt wash begins

1M

Salt gradient

0

Protein absorbance

II Loading starts

Peak of unbound protein

Salt gradient begins

III

Salt gradient ends

I Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II) and tightly bound (III) proteins

Gelová permeační chromatografie  Gelová filtrační chromatografie  Molekulová vylučovací chromatografie  Chromatografie g na molekulových ý sítech  SEC – size exclusion chromatography


Částice sorbentu

Gelová permeační chromatografie

Optimální gel pro gelovou filtraci Inertní matrice gelu - chemicky stabilní při různém pH, T

Pořadí eluce : největší> největší >střední střední> >nejmenší molekula Jev stérického vyloučení (exkluze) větších molekul, molekul malé molemolekuly pronikají do nitra částic gelu (permeace permeace)) a zpožďují se. Ke skutečné rovnováze mezi koncentrací látek vně a uvnitř částic nedochází.

Mechanicky stabilní gel (deformace při tlaku) Velikost gelových částic nesmí být ani příliš malá (rozdělení je přesnější, ale pomalejší) ani příliš velká (rozdělení je rychlejší ale může být nepřesné) rychlejší, nepřesné). Na rychlou chromatografii tedy použijeme gel s hrubšími zrny. Na vysoký stupeň rozlišení použijeme gel s malými zrny.

Určení Mr z kalibrační křivky

Odsolování (rychlejší alternativa k dialýze)  Záznam průběhu odsolování

Jednotlivé frakce proteinů se detekují spektrofotometrem.


Rychlost průtoku proteinu je přímo úměrná velikosti molekuly Rozlišení elučních křivek lze ovlivnit pouze účinností a správnou p volbou molekulového síta

Parametry kolony

DEXTRANOVÉ GELY

 Objem vzorku < 2 % objemu kolony!!!

 Sephadex G-10, G-15 pro odsolování peptidů, AMK)  Sephadex G G-25, 25 G-50 G 50 pro odsolování proteinů  Sephadex G-75 až G-200 separace proteinů podle Mr do 600 kDa

 Celkovýý objem j kolonyy VT = VM + Vs – VGM  VGM - objem gelové matrice  VM - mrtvý objem (aplikace inertní látky na kolonu, Blue dextran 2MDa) objem, 2MDa), objem co zaujímá mobilní fáze (VM = MR pro inert)  VS - objem stacionární fáze

 Kav = (VR + VM) / Vs  Kav ~ Kd distribuční koeficient  VR – retenční objem (eluční objem)

 Exclusion limit  Exclusion volume  Matrice hydroxypropylované – LH -20 pro separaci TG, MK, Stab objem v prostředí ethanolu, Stab. ethanolu chloroformu


AGAROSOVÉ GELY    

Přečištěný agar (zbaven polysacharidů) Zesíťování 2 2,3 2,33-dibrompropanolem, dibrompropanolem epichlorhydrinem CL (cross(cross-linked) – stupeň zesíťování S h Sepharose CL CL--2B

POLYAKRYLAMIDOVÉ GELY • kopolymerací akrylamidu s N,NN,N-methylenbisakrylamidu • Bio Bio--Gel PP-2

Využití SEC (GPC) v praxi  Skupinová separace (odsolení, odstranění extrakčního činidla, detergentu, NML od ostatních, pro labilní proteiny (x dialýza)  Frakcionace (purifikační metoda) rozdělení látek podle Mr  Stanovení molekulové hmotnosti  U Určení č í di distribuce t ib biopolymerů bi l ů a syntetických t ti ký h polymerů l ů

• Bi BioBeads B d S-X1 – na bázi bá i polystyrenu l t ((vhodné h d é pro lilipofilní fil í polymery a velké organické látky v organických rozpouštědlech

 Analýza a monitorování vazby ligandu na biopolymer

Hydrofóbní chromatografie (HIC)

Princip separace HIC

 Hydrophobic interaction chromatography  adsorpční chromatografie g (hydrofóbní (hydrofóbní y povrch))  Separace na nepolární (obrácené) fázi ~ RP RP--LC  Nosiče pro HIC jsou méně hydrofóbní než pro RPRPLC – lze tak použít jemné eluční podmínky s cílem zachovat biologickou aktivitu separované látky  vhodná pro biopolymery  - malá selektivita (separace ( látek na základě jejich rozdílné hydrofobicity  + dostatečná kapacita

• sorpce molekul „zdánlivě“ hydrofilních proteinů na nosič s hydrofóbními p y klastry y • eluce potlačením hydrofóbních interakcí (snížením iontové síly, přídavkem org org.. rozpouštědla, detergentu) • nebezpečí denaturace proteinu (v případě silné il é vazby) b ) • interakci podporuje vysoká iontová síla mobilní bil í fáze fá

Nosiče pro HIC

Hydrofobní chromatografie

 Matrice methakrylátové (silně hydrofóbní) hydrofóbní)  Matrice polysacharidové (spíše hydrofilní pro hydrofilní proteiny s hydrofóbními kapsami)

 Stacionární fáze – - C8, -fenyl y s vysokou y koncentrací solí  Mobilní fáze – vodné roztoky (např. 1,7 M (NH4)2SO4)  Eluce – snižováním iontové síly


   

Phenyl, Octyl, Phenyl, Octyl, Butyl Sepharose Fast Flow (FF) Butyl + Methakrylátová báze HEMA--co HEMA co--EDMA Sepharon HEMA Použití purifikace a zakoncentrování bílkovin, možno použít přímo po vysolování síranem amonným

Hydrophobic interaction chromatography of ββ-glucosidase from the digestive juice of the palm on PhenylPhenyl-Sepharose CLCL-6B.

Co to je HILIC chromatography chromatography? ? HIC x HILIC  Hydrofilní interakční chromatografie  (Hydrophilic interaction chromatography) chromatography)  pro velmi polární a hydrofilní látky (x RPRP-LC) – polární báze, kyseliny, AMK, peptidy, sacharidy Nízké pracovní tlaky tlaky, vysoké průtoky Dobrá symetrie píků polárních látek Rychlá eluce hydrofóbních komponent Stacionární fáze – velmi polární – silikagel, vázané polární fáze  Mobilní fáze – jako v RPRP-LC, voda, pufr, organická rozpouštědla p  Retence – čím vyšší obsah organické složky, tím vetší retence    


Afinitní a imunoafinitní chromatografie

Afinitní chromatografie - princip  Využití schopnosti biologicky aktivních látek specifick rozpoznat specificky ro po nat jinou jino molekulu molek l  látky látk mají k sobě afinitu (jsou vzájemně biospecifické)  Typ adsorpční chromatografie využívající specifické interakce (nekovalentní vazby)

AC,, IAC Affinity Chromatography Immunoaffinity Chromatography

 Látka navázaná na nosič  afinitní ligand  Vazba ligandu přes raménko (spacer)

Afinitní páry

Reverzibilní biospecifická interakce enzym

substrát kompetitivní inhibitor koenzym

protilátka

antigen hapten

lektin

Glykoproteiny, oligo(poly)sacharidy

histony

DNA

DNA

Kompl. p NA

buněčný povrchový receptor, léčivo

hormon

Předpoklady pro vznik biospecifického komplexu

Princip afinitní chromatografie

 Sterické (spacer)


 Vazebné (optimální pH, iontová síla)

 Konformační

Princip imunoafinitní chromatografie (IAC, HPIAC)

Eluční techniky Eluce = disociace komplexu ligandligand-cílová látka, při ideální eluci by se měli cílové molekuly úplně uvolnit z afinitního ligandu elučním pufrem Způsoby eluce: 1) eluce náhradou ligandu volným ligandem nebo jeho analogem 2)) eluce kompeticí p cílové molekuly y s jjejím j analogem g 3) eluce změnou pH (kroková či lineární gradientová eluce) 4) eluce změnou iontové síly 5) eluce přídavkem chaotropního iontu, detergentu (např. y amonný, ý, močovina)) thiokyanát


Desorpce

ELUCE

Nosiče v afinitní chromatografii Základní vlastnosti nosiče vhodného pro afinitníchromatografii: velký specifický povrch, makroporézní struktura mechanická stabilita chemická stabilita snadno derivatizovatelný povrch snadno přístupný ligandu cchemicky e c y inertní e t po povrch c zabraňující ab a uj c nespecifické espec c é so sorpci pc dobré chromatografické vlastnosti (průtoková rychlost) Typy nosičů:

jednosložkové x složené vláknitá struktura x partikule


Nosiče v afinitní chromatografii Dělení nosičů pro afinitní chromatografii: Jednosložkové: A) Organické nosiče: nosiče: celulosa ce u osa (Perloza ( e o a MT)) dextran (Sephadex) agarosa (Sepharosa), aj. Obr. 2: CNBr aktivovaná Sepharose B) Anorganické nosiče: nosiče: křemičité nosiče skleněné nosiče, aj.

C) Syntetické nosiče: nosiče: polyakrylamid (Enzacryl) metakrylát (Spheron), aj.

Složené: polysacharidpolysacharid-polyakrylamid (Sephacryl HR) magnetické částice (Magnogel)

Nosiče v afinitní chromatografii

Ligandy a jejich imobilizace

Volba nosiče: záleží na typu ligandu, průtokové rychlosti, podmínkách separace, p p , aplikaci p

vlastnosti ligandu: 1) specifická a reverzibilní vazba na izolovanou látku 2) přítomnost chemicky modifikovatelné skupiny pro vazbu na nosič

Nosič

Aplikace

Celulosa (vláknitá, (vláknitá granulární)

vsádkové uspořádání


Celulosa (partikule)

nízkotlaké kolonové uspořádání

Dextran

vhodný pro vazbu protein. a lektin. ligandů

Agarosa

nízko nízko-- až střednětlaké kolonové uspořádání

Polyakrylamid

nízko nízko-- až střednětlaké kolonové uspořádání

Magnetické nosiče

vsádkové a „on„on-line“ (MSFB) uspořádání

Kř ičité nosiče Křemičité ič

vysokoúčinné k úči é chromatografické h t fi ké separace

Skleněné nosiče

vysokoúčinné chromatografické separace

Ligandy a jejich imobilizace Postup imobilizace ligandu: vazba ligandu na nosič musí být pevná => aktivace nosiče před vazbou ligandu

Činidla užívaná pro aktivaci nosiče: 1) Kyan bromid (CNBr-act. Sepharose 4B) 2) Oxidace jodistanem 3) Karbodiimid (např. CDI, EDAC)+S-NHS 4) Thiol (Thiol (Thiol-act. act Sepharose 4B) 5) Triazin 6) Epoxy (Epoxy (Epoxy-activated activated Sepharose 6B) 7) Hydrazidem akt. nosič

používané ligandy: 1) proteiny (např. enzymy, koenzymy, Ab, Ag, protein A) 2) nukleové kyseliny (DNA i RNA) 3) lektiny (např. Concanavalin A) 4) te textilní tilní bar barviva i a (např (např. Cibacron Bl Blue, e Orange A A, Green A)

Orientované imobilizace ligandů – protilátek


Kovalentní vazba ligandu na COO COO--částice

Orientovaná imobilizace ligandu - glykoproteinů

Kovalentní vazba ligandu neorientovaně i t ě

Protein A (G, L) – dvojí využití

HPIAC – high g p pressure immunoaffinityy chromatography g p y

Izolace IgG g molekul i jjejich j p podtříd Imobilizace IgG molekul

Protein A – Staphylococcus aureus Protein G – rod Streptococcus Protein L – ros Peptostreptoroccus

Fibrinogen g in human plasma, using an antifibrinogen immobilized antibody tib d column l

Magnetické částice

Kolonové uspořádání

Macroporous bead cellulose 100 – 250 μm (750 x)

ø

Alginate acid-coated magnetite particles (-COOH)

ø

7 -10 10 μm (zv. ( 4 000 x) )

Vsádkové uspořádání


Poly(GMA) microparticles 2,9 μm (5 000 x)

ø

Magnetická separace PolyNIPAM nanoparticles (-COOH) 0,29 μm (electron. microscopy, 50 000 x)

MSFB

Princip magnetické separace Magnetické mikročástice Magnetické jjako integrální g součást průtokového systému

MSFB (magnetically stabilized fluidized bad)


Výhody magnetických nosičů

Schematický diagram strategie analýzy p proteinů

 Vysoká rychlost separace (zkrácení doby reakce, separace, prodloužení životnosti reaktorů)  Vysoká reprodukovatelnost reakcí díky nulovým ztrátám nosiče  Snadná manipulace a práce se systémem   Postup separace šetrný vůči fragilním bílkovinám a bioaktivním látkám ((- centrifugace)  Vše probíhá v jednom reakčním prostředí - snižuje se pracnost, riziko kontaminace a inaktivace substrátu

Chromatografie na imobilizovaných barvivech  Dye-binding chromatografphy  Reaktivní barviva vázaná na chromatografických nosičích  Barviva částěčně podobná některým kofaktorům  Izolace enzymů i neenzymových bílkovin (např. albumin apod.)  Cibacron Blue 3G pro NAD+ a NADP+ dependentní dehydrogenázy  Procion Red HE 3B pro NADP+ dependentní enzymy

Chelatační afinitní chromatografie IMAC – immobilized metal affinity chromatography Vzájemná interakce mezi biopolymerem v roztoku a ionty kovů vázanými na pevné fázi Chelatační ligand g – např. p IDA ((iminodiacetát iminodiacetát)) Ionty „měkkých“ kovů – Zn Zn,, Cu, Cu, Ni, Co, Fe, Fe, Mn, Mn, Mg Nosiče – biopolymery ((agarosa agarosa,, sepharosa) sepharosa) Stabilita x reverzibilita (ligand--kov versus ligand (ligand ligand--peptid, protein) Koordinační K di č í vazba b mezii akceptorem elektronů (kovem) a donorem elektr. elektr. (AMK – His, Cys, Cys, Trp – vysoká elektronová hustota R)

IMAC pro izolaci rekombinantních proteinů  1 kroková purifikace rekombinantních proteinů obsahujících tzv. tzv histidinovou kotvu (His-tag)

Shrnutí……. Shrnutí

 Interakce kovových iontů (Ni22+) s exponovanými histidylovými zbytky na povrchu molekuly proteinu


 Vhodné i pro nekorektní formy rek. Proteinů, tzv. inkluzní j se rozpouštějí p j vysokou y koncentrací močovinyy tělíska,, jež nebo guanidinium chloridu, protože se IMAC dá provádět i za denaturačních podmínek!!  Renaturace (refolding) proteinů zachycených na koloně postupným snižováním denaturačního činidla

Základní zásady purifikačních kroků  Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením  velké množství levného vstupního materiálu  Později metody s vysokým rozlišením a vyšším výtěžkem, kapacita méně významná  ve vzorku již investovaná práce, množství cílového proteinu je menší  Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků (např. dialýza nebo ultrafiltrace  možné snížení výtěžku díky ztrátám)  Jednotlivé separační metody pokud možno neopakovat  Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu, polysacharidu!!

Praktické příklady  Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku)  chromatografie s hydrofóbní interakcí  Ionexová chromatografie g ((eluce vysokou y iontovou silou))  chromatografie s hydrofóbní interakcí  Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence (odstranění fragmentů a komplexů)

NEVHODNÉ Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok  dialýza, dialýza ultrafiltrace)


Sledování průběhu separace

Metoda

Celková bílkovina

Celková aktivita

Specifická aktivita

Přečištění

Výtěžek

extrakt

100

100

1

-

100 %

HIC

50

99

1 1.99 99

1 1.99 99

99 %

IEX

25

75

3

3.0

75 %

Membránové separační metody

Ultrafiltrace centrifugace a Ultrafiltrace, dialýza

Separační p metody y založené na rozdílné velikosti molekul

DIALÝZA – odstranění nízkomolekulárních látek Dialyzační střívka

 Využití polopropustných membrán, které umožňují průchod malých molekul

(Cut off – limitní Mr)

 Membránová filrace (ultrafiltrace)  rozdělení molekul z roztoku na základě jejich velikosti; zakoncentrování proteinů, odstranění nízkomolekulárních látek (např. solí). y tlaku Probíhá za vyššího  Dialýza  difuze nízkomolekulárních látek membránou; oddělením solí po vysolování bílkovin

Koncentrační gradient částic s povrchovým nábojem  Propustnost membrány pro rozpuštěné látky  Velikost povrchu membrány  Pohyb částic < 1000 Da 


Elektrodialýza

Filtrace

Membránová filtrace

ULTRAFILTRACE


Membránová filtrace (ultrafiltrace) speciální membrány s definovanou velikosti pórů - tzv. tzv cut-off limit

Afinitní ultrafiltrace – funkcionalizace povrchu membrán ligandem

Membrány  Na základě chemického složení rozeznáváme membrány organické (polymerní) a anorganické. Starší generace polymerních membrán byla vyrobena na bázi přírodních polymerů (celulosa a její deriváty)  syntetické polymery, např. polysulfon, polyamid, polyetherimid, polyethersulfon, polyvinylidenfluorid, polytetrafluorethylen, l t t fl th l kt é jsou které j chemicky h i k a fyzikálně f ikál ě stabilnější (odolnost vůči organickým rozpouštědlům, pH, teplotě)  Poslední generací jsou anorganické (keramické) membrány vyrobené z oxidů hliníku hliníku, zirkonu a titánu titánu, silikátových materiálů, karbidů, zeolitů apod., které vynikají extrémní pevností a odolností

Typy membrán     

a) isotropní membrána – homogenní vrstva b) asymetrická membrána - aktivní vrstva (tloušťka < 1 μm μm)) porézní nosná vrstva (~100 μm μm)) c) kompozitní membrána - aktivní vrstva (tloušťka < 1 μm μm)) porézní vrstva, nosná podložka (100 - 200 μm μm))

     

selektivita, propustnost ionaktivní membrána, afinitní membrána jednosměrná filtrace, příčný tok zanášení membrány („fouling („fouling““ efekt) chemické nebo fyzikální metody regenerace sterilace, životnost membrány

Filtrace – membrány NC

0,45 µm 0,20 µm ≤ 20 kDa 0 0,10 10 µm ≤ 7 kDa kD


Filtrace – membrány NC

Centrifuga – výkyvný a úhlový rotor

Ultracentrifugace

Frakční centrifugace, ultracentrifugace

 Centrifugace se používá k oddělení hrubých směsí buněčných komponent.  Při kvantifikaci k tifik i rychlosti hl ti pohybu h b molekul l k l v roztoku t k v centrifugačním t if č í poli li používáme sedimentační koeficient (s) dle rovnice: s = m(1 (1 – f f kde m je hmotnost částice,  je parciální specifický objem (reciproká h d t hustoty hodnota h t t částice), čá ti )  je j hustota h t t média, édi f frikční f ikč í k koeficient fi i t (závisí na tvaru molekuly)  (1 – ) vyjadřuje schopnost prostředí nadnášet částice  Sedimentační koeficient se obvykle vyjadřuje v jednotkách: Svedberg (S); S = 10-13 s.  Čím je hodnota S nižší, nižší tím pomaleji částice sedimentuje. sedimentuje  Na tomto principu je založena gradientová nebo jinak zonální centrifugace vedoucí k oddělení částic na základě hodnoty jejich sedimentačních koeficientů.


Rychlostní gradientová centrifugace

Rovnovážná centrifugace

Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D

Recommend Documents