Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D

Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D.

KLONOVÁNÍ Konstrukce vhodného rekombinantního plasmidu pro uchování a expresi vybraných genů Škola molekulárních biotechnologií

Molekulární klonování: klonování:

• multi multikrokový krokový proces který vytvoří kolekci definovaných fragmentů dané DNA • spojení vybraných DNA fragmentů (většinou jednoho genu) se speciálním nosičem – vektor • přenos vzniklého konstruktu do živých buněk (často baktérie) • mnohonásobné namnožení vložených ý DNA fragmentů g replikaci p v živé buňce – DNA KLONY

Buněčné klonování: klonování: • vytváření geneticky identických buněk (organismů) • v živé přírodě přirozené:

kolonie baktérii řízkování rostlin jjednovaječná j dvojčata j umělé ►

k4

Využití molekulárního klonování

• uchovávání, zmnožení a manipulace s genetickou informací (cDNA a genomové knihovny) • produkce proteinů pro různorodé využití • vnášení nových či pozměněných genů do organismů (GMO, genová terapie)

farmaceutika

zemědělství

základní výzkum průmysl

medicína

Snímek 3 k4

retinis pigmentosa 5 milionu lidi na svete photoreceptor glycoprotein peripherin kokos; 18.4.2010

RESTRIKČNÍ MíSTA MAJÍ BOD SYMETRIE

RESTRIKČNÍ ENDONUKLEASY (restrikční enzymy II třídy)


•

rozpoznávají specifické sekvence dsDNA a štěpí jji ve stejném j místě

•

rozpoznávací místo je 4-8 bp dlouhé

•

štěpí dlouhé fragmenty dsDNA na kratší

•

štěpí vždy znovu opakovatelným způsobem

•

pocházejí především z bakterií

•

ochrana p před cizorodou DNA především bakteriofágovou

•

modifikačně-restrikční enzymový systém (RE + specifická modifikační metylasa)

•

Přes 120 rozpoznávacích míst

•

dodnes popsaných více než 800 RE

tupé konce

 RE mohou na DNA vytvářet TUPÉ nebo LEPIVÉ konce  restrikční sekvence jsou většinou symetrické.  nukleotidy vytvářejí PALINDROM • Palindrom: sekvence se čte stejně j v obou směrech jak ve 5’  3’ tak ve směru 5’  3’ na komplementárním řetězci řetězci.

EcoRI

TUPÉ KONCE – nespecifické spojení

LEPiVÉ É KONCE –

specifické spojení

Existují RE se stejnou rozpoznávací sekvencí lišící se pouze typem vzniklých konců (5´- či 3´- lepivé) KpnI vs. Asp718 - izoschizomery Asp718

+

5´přesahující konec

KpnI 3´přesahující 3 přesahující konec

+

TAKTO VZNIKLÉ KONCE SE NEDAJÍ LIGOVAT ! Existují různé RE které mají konce kompatibilní EcoRI vs. MfeI

Existují RE se stejnou restrikční sekvencí lišící se pouze typem vzniklých konců (5´- či 3´- lepivé) KpnI vs. Asp718 - izoschizomery

EcoRI

+

Lepivé konce: konce: každý DNA fragment (jakéhokoli původu) tvoří štěpením stejnou RE dvě jednovláknové identické sekvence (čtené ve směru 5 5’ - 3 3’)).

Kompatibilní konce: konce:

BamHI

GˇGATCC

BglII

AˇGATCT

MfeI

+


Počet nukleotidů v restrikčním místě dané RE determinuje průměrnou délku fragmentů g DNA získaných ý naštěpením p danou RE jjj Pravděpodobnost že dané restrikční místo bude nalezeno v genomu: 1) 44 = 256 bp 2) 46 = 4096 bp 3)) 48 = 64 000 bp p průměrná vzdálenost mezi restrikčními sekvencemi v DNA = 4n n = # bází v restrikčním místě

GTAC

GAATCC

GCGGCCGC • dvě odlišné DNA mající stejné rozpoznávací místo pro danou RE se mohou vzájemně spojit v rekombinantní DNA molekulu • rek rekombinant ombinantní ní DNA mole molekula kula:: je nová kombinace nukleotidů v DNA která se nevyskytuje volně v přírodě

KONTIGY – parciální štěpení 3.4 kb

3.5 kb

1.5 kb

6.5 kb

4.5 kb

full digest partial digest

15 kb

15 kb

10 kb

10 kb

8.0 kb

8.0 kb

7.0 kb

7.0 kb

5.0 kb

5.0 kb

2.0 kb 1.0 kb

2.0 kb

ELFO full digest

1.0 kb

ELFO partial digest

Separace z gelu A klonování do vhodného vektoru (BAC)

STAR AKTIVITA • •


1. 2. 3 3. 4. 5.

– nespecifické náhodné štěpení

DOUBLE DIGEST

– kombinace dvou RE v jedné reakci

působení ů b í RE je j velmi l i citlivé itli é na iiontovou t sílu íl roztoku t k a charakter h kt přítomných solí. pokud nejsou zachovány specifické podmínky pro danou RE ta může ůž mít ít ttzv. star t aktivitu kti it

při vysoké koncentraci glycerolu při vysoké koncentraci enzymu při ři nízkých í ký h iiontových t ý h silách ilá h při vysokých hodnotách pH vp přítomnosti některých ý organických g ý látek (DMSO, ( etanol, etylenglykol, dimethylformamid)

htt // http://www.fermentas.com/en/tools/doubledigest f t / /t l /d bl di t

Štěpení na koncích fragmentu DNA Sekvence

R t ikč í enzym Restrikční BamHI

Delka sekvence

CGGATCC CGGGATCC CGCGGATCC GGAATTC CGGAATTC CCGGAATTC CAAGCTT CCAAGCTT CCCAAGCTT GGGTACC GGGGTACC CGGGGTACC TTGCGGCCGC TTTGCGGCCGC AAATATGCGGCCGC GCGGCCGC ATAAGAATGCGGCCGC AAGGAAAAAAGCGGCCGC CCCGGG CCCCGGG CCCCCGGG TCCCCCGGG CCTCGAG CCCTCGAG CCGCTCGAG

EcoRI HindIII KpnI NotI

SmaI XhoI

8 10 12 8 10 12 8 10 12 8 10 12 12 16 0 20 24 28 6 8 10 12 8 10 12

2 hod

% štěpení p 20 hod

10 >90 >90 >90 >90 >90 0 0 10 0 >90 >90 0 10 10 0 25 25 0 0 10 >90 90 0 10 10

25 >90 >90 >90 >90 >90 0 0 75 0 >90 >90 0 10 10 0 90 >90 10 10 50 >90 90 0 25 75

N NotII AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGCTGCATACTGAGGCAGT ATGCTGCATACTGAGGCAGTCCAGATCA………ATGCGCGCTAAACCGTAAACTAG TACGACGTATGACTCCGTCAGGTCTAGT………TACGCGCGATTTGGCATTTGATC CGATTTGGCATTTGATCCCTAGGCGC

http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp

forward primer

reverse primer

BamHI


Templát např. genomická DNA

T4 DNA ligasa g

XXXXXXXXXXXXXXXXXXATGCTGCATACTGAGGCAGTCCAGATCA………ATGCGCGCTAAACCGTAAACTAGXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXTACGACGTATGACTCCGTCAGGTCTAGT………TACGCGCGATTTGGCATTTGATCXXXXXXXXXXX

Nastavení PCR reakce (templát + primery)

•

AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGCTGCATACTGAGGCAGT ATGCTGCATACTGAGGCAGTCCAGATCA………ATGCGCGCTAAACCGTAAACTAG TACGACGTATGACTCCGTCAGGTCTAGT………TACGCGCGATTTGGCATTTGATC CGATTTGGCATTTGATCCCTAGGCGC

P d kt PCR reakce Produkt k – restrikce t ik (d (double bl di digest) t)

• •

NotI

(

)

AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGCTGCATACTGAGGCAGTCCAGATCA………ATGCGCGCTAAACCGTAAACTAGGGATCCGCG TTCCTTTTTTCGCCGGCGTACGACGTATGACTCCGTCAGGTCTAGT………TACGCGCGATTTGGCATTTGATCCCTAGGCGC

n

•

BamHI

Ligace do vektoru AGCTGC CGCATGCTGCATACTGAGGCAGTCCAGATCA………ATGCGCGCTAAACCGTAAACTAGG GATCTTCCAT TCGA CGGCGTACGACGTATGACTCCGTCAGGTCTAGT………TACGCGCGATTTGGCATTTGATCCCTAG AAGGTA

•

vektor

vektor

enzym izolovaný z T4 bakteriofága infikujícího E li katalyzuje E.coli, k t l j tvorbu t b fosfodiesterové f f di t é vazby b mezi 5´fosfátovou skupinou jednoho a 3ÓH skupinou sousedního nukleotidu. reakce vyžaduje energii jednoho ATP používá se ke spojování lepivých i tupých konců dvou restrikčních fragmentů DNA, DNA připojování různých adaptorových sekvencí k DNA a cirkulizaci DNA Reakce se provádí většinou za snížené teploty (15-16°C) aby se snížila kinetická energie molekul a zabránilo se tak nekomplementárnímu spárování lepivých konců. zápor: nízká aktivita enzymu – dlouhý reakční čas.

pg9

Alkalická fosfatasa • •

„Mung bean“ nukleasa •

Klenowův fragment DNA polymerasy

h d lý ffosfátů hydrolýza fá ů z 5´konců 5´k ů DNA nebo b RNA vláken lák CIAP (calf intestine AP) • •

5´-vyčnívající konec

30´ 37 30´ 37°°C

3´-recesivní konec

(15 (15´´ 37 37°°C

15´ 15´ 56 56°°C ) 2x

tupý konec

15´ 37 15´ 37°°C

15´ 15´ 56 56°°C

odstraňování jednovláknových 3' i 5' konců s dvouvláknové DNA

DNA polymerasa l zbavená b á své é 5´5´ 3éxonukleasové 3´ kl é aktivity kti it zaplňování jednovláknových 5' konců na dvouvláknové DNA

Snímek 19 pg9

ZINC FINGER NUCLEASES

proofreading 3-5 pokud neni muze delat A overhangy 5-3 odstranuje primery co stoji v ceste, nema Klenowuw fragment zaplnuje 5 vycnivajici seka 3 vycnivajici galuszka; 21.4.2010

CÍLENÁ Í Á MANIPULACE V GENOMU příprava p p knockoutovaných ý linií organismů g


pg5

PŘIROZENÁ O REKOMBINACE oprava dvouřetězcových zlomů reakce na poškození DNA

HR – homologní rekombinace NHEJ – nehomologní lepení konců


chimerické proteiny vytvořené spojením Fok I nukleasy a specifických sekvencí zvaných „zinkové zinkové prsty“ prsty



Snímek 22 pg5

The enzyme FokI, naturally found in Flavobacterium okeanokoites, is a bacterial type IIS restriction endonuclease consisting of an N-terminal DNA-binding domain and a non-specific DNA cleavage domain at the C-terminal.[1] Once the protein is bound to duplex DNA via its DNA-binding domain at the 5'-GGATG-3': 5'-CATCC-3' recognition site, the DNA cleavage domain is activated and cleaves non-specifically between nine and 13 nucleotides downstream of the recognition site. galuszka; 21.4.2010

Testování specifity ZFN

pg6 pg7

Knock-out genu pomocí ZFN

Shukla et al (2009): Precise genome modification in the crop species using ZFN. Nature 459

KLONOVACÍ VEKTORY

Snímek 25 pg6

CCR5 - chemokinovy receptor klinicke testy 18 pacientu deletovany homozygot je immunni vuci AIDS

A) Bakteriální a kvasinkové – PLASMIDY

galuszka; 21.4.2010

pg7

alela pouze u kavkazoidni rasy, zafixovala se zřejmě během morovych pandemii galuszka; 21.4.2010

•

přirozené součástí bakteriálních buněk nesoucí vlastní genetickou informaci ve formě dsDNA (rezistence k antibiotikům antibiotikům, metabolismus nezvyklých substrátů apod.) 2-100kb

•

replikují se nezávisle na baktérii

•

vlastní plasmidové vektory vznikly úpravou přirozených 1970 - pBR (Bolivar a Rodriguez) •


• • • •

4.36 kb menší než je přirozeně se vyskytující v E.coli oriV vlastní počátek replikace rezistence k Amp a Tc unikátní restrikční místa kapacita p pro p inzertovou DNA 1-5 kb

počátek replikace oriV

MCS (multiple ( cloning site - polylinker)

• cca 300 bp • kóduje sekvenci „antisense“ RNA, která iniciuje DNA replikaci (slouží jako primer) • regulace: „high copy plasmid“ např. ColE1

Unikátní synteticky vytvořená sekvence, obsahující za sebou jdoucí restrikční místa f k frekventovaných t ý h restrikčních t ikč í h endonukleas

ori

j inkompatibilita p • vzájemná


izolace plasmidové DNA

agarosová elektroforesa plasmidové DNA

• metoda alkalické denaturace • ccc plasmidová DNA je stabilnější v alkalickém pH • linearní genomická DNA se při pH 12 - 12.5 denaturuje a pak při rychle neutralizaci precipituje • v přítomnosti SDS a neutralizaci octanem sodným se precipitují i proteiny a RNA

ccc – covalently closed circle oc – open p circle genomická DNA oc forma plasmidu ccc forma plasmidu linearizovaný plasmid 8 kb 6 kb 4 kb 3 kb

ccc

oc

izolace plasmidové DNA

pg4

Kolony s křemičitým nosičem nebo aktivními DEAE skupinami

Snímek 31 pg4

DEAE cistci pro transfekce chaotropni sul jsou obecně iontové sloučeniny, které snižují strukturovanost vody. Ve vodě v tekutém stavu totiž vznikají přechodně vodíkové můstky mezi kyslíkem a vodíkem sousedních molekul, takže je určitým způsobem "strukturovaná". V molekulární genetice je využíván fakt, že molekuly DNA v přítomnosti chaotropních solí adherují na SiO2, tedy obecně na skleněný povrch. ionty guanidinu. galuszka; 20.4.2010

DEAE matrice Výtěžky: 1ml LB média 10μ 10μg DNA (high(high-copy plasmid) 1ml LB média 0.5μ 0.5μg DNA (low(low-copy plasmid)

křemičitá matrice + chaotropní sůl

k5

lytický y ý a lysogenní y g cyklus y virů

KLONOVACÍ VEKTORY B) Virové - BAKTERIOFÁGY Á • bakteriální viry s dvouřetězcovou lineární DNA • klonovací kl í kkapacita it 2-25kb inzertu i t • mnohonásobné množení v závislosti na hostitelské bakterii cos cos

BAKTERIOFÁG lambda

49kb

• střední tř d í část čá t genomu neníí důležitá důl žitá pro lytický růst a lze ji nahradit inzertovou DNA


• snadná manipulace díky cos místům (lepivé konce) na koncích λ DNA, které umožňují její cirkulaci • cirkuluje se pouze bakteriofág, který má vzdálenost mezi cos místy 37-52kb • tvorba cDNA a genomových knihoven

Snímek 33 k5

střední část je důležitá pro lysogenni rust a integrraci do genomu

KLONOVACÍ VEKTORY

kokos; 18.4.2010

B) Virové - BAKTERIOFÁGY

Bakteriofág se rozpěstovává na bakteriálním koláči popř popř. v tekuté suspenzi vhodné baktérie

lýzované bakterie tvoří tzv. PLAKY


PG1

KLONOVACÍ VEKTORY

C) bakteriálně-virové bakteriálně virové - KOSMIDY • odvozené z plasmidu do kterého byly naklonovány cos místa bakteriofága λ • inzertová DNA je naklonována do lineárního kosmidu a sbalena in vitro virovým i ý mechanismem h i a infikována i fik á do d bakterie b kt i • v bakterii je pak cirkulována a replikuje se dál jako plasmid • malá velikost cca 5kb – není p potřeba infekčních lytických y ý λp proteinů,, pouze p selekční marker k antibiotiku, velikost inzertové DNA se může pohybovat až k 47kb

Snímek 35 PG1

KOSMIDY nemají lytické geny, replikují se jako bakteriofág ale nelýzují bakterii, s prazdnýma se manipuluje jako s plasmidy. Replikuji se pomaleji než plasmidy KONKATEMERY - cirkularní kosmid se naštípe jedním lepivým a jedním tupym aby nedochazelo k cirkulaci galuszka; 18.2.2008

k6

A phagemid or phasmid is a type of cloning vector developed as a hybrid of the filamentous phage M13 and plasmids to produce a vector that can grow as a plasmid, and also be packaged as single stranded DNA in viral particles. Phagemids contain an origin of replication (ori) for double stranded replication, as well as an f1 ori to enable single stranded replication and packaging into phage particles. Many commonly used plasmids contain an f1 ori and are thus phagemids. Similarly to a plasmid, a phagemid can be used to clone DNA fragments and be introduced into a bacterial host by a range of techniques (transformation, electroporation). However, infection of a bacterial host containing a phagemid with a 'helper' phage, for example VCSM13 or M13K07, provides the necessary viral components to enable single stranded DNA replication and packaging of the phagemid DNA into phage particles. These are secreted through the cell wall and released into the medium. Filamentous phage retard bacterial growth but, in contrast to lambda and T7 phage, are not generally lytic. Helper phage are usually engineered to package less efficiently than the phagemid so that the resultant phage particles contain predominantly phagemid DNA. F1 Filamentous phage infection requires the presence of a pilus so only bacterial hosts containing the F-plasmid or its derivatives can be used to generate phage particles kokos; 22.4.2010

D) bakteriálně-virové - FASMIDY (phagemid) k6 • odvozené od bakteriofága M13 s malou ssDNA (6.4kb), který se po infekci do bakterie replikuje jako kruhovitá dsDNA (plasmid, snadná manipulace, restrikce) • infekční fágové částice však opět obsahují pouze ssDNA (vhodný zdroj pro izolaci ssDNA např. p p pro hybridizaci) y ) • do infekčních částic mohou být sbaleny částice až dvakrát větší než je fágová DNA • Do buňky jde jako plasmid plasmid, pokud chceme produkovat virové částice, částice necháme buňku infikovat pomocným fágem „helper phage“

KLONOVACÍ VEKTORY

E)) kvasinkové - YAC umělé kvasinkové chromosomy y (yeast artificial chromosomes) • patří mezi kyvadlové vektory (shuttle vector) • v bakterii jako kruhová dsDNA (plasmid) • vedle sekvencí bakteriálního plasmidu obsahují části kvasinkového chromozomu (centromera, počátek replikace, dvě telomery)

konkatemer

manipulace i l s k kosmidem id

• lilinearizací i í se chromozom h aktivuje kti j (oddělení ( dděl í telomer od sebe) 2000kb • obrovská klonovací kapacita až 2000kb • nestabilita a složitá manipulace (protoplasty)

k8

KLONOVACÍ VEKTORY

F)) bakteriální - BAC umělé bakteriální chromosomy y (bacterial artificial chromosomes)

Snímek 38 k8

par A B C dulezite pro rozdelovani do dcerinych bunek repE helikasa musi se rust v bakteriich s deletovanyma rekombinasama

odvozené od E.coli F-plasmidu (fertility plasmid), „low copy“ 1-2 kopie na b ňk buňku

kokos; 22.4.2010

VÝHODY oproti YAC:


- stabilita (cirkulární) - snadná manipulace - potlačení rekombinace

Vhodné fragmenty genomické DNA pro ligaci jsou získány pulsní gelovou elektroforesou

INVITROGEN

VELKÝ VÝZNAM PŘI MANIPULACI S CELÝMI GENOMY

SCREENING BACových knihoven pomocí „3D„3D-poolování“


SELEKČNÍ MARKERY geny nesené na klonovacím vektoru, vektoru exprimované současně s transgenem, na jejichž fenotypovém projevu lze transformované buňky snadno selektovat

1) geny kódující resistenci vůči ANTIBIOTIKU INHIBITORY SYNTÉZY BAKTERIÁLNÍ BUNĚČNÉ STĚNY

•

AMPICILIN gen Amp koduje -laktamasu která štěpí -laktámový kruh penicilinových antibiotik CEFOTAXIM

SELEKČNÍ MARKERY

1) geny kódující resistenci vůči ANTIBIOTIKU •

HYGROMYCIN B ((interferuje j s velkou ribozomální p podjednotkou j a zabraňuje j elongaci g syntetizovaného peptidu) gen způsobující rezistenci hgh kóduje fosforylasu inaktivující toto

 antibiotikum. PůSOBÍ I NA EUKARYOTICKÉ BUŇKY!!! (selekce transgenních rostlin) •

• INHIBITORY SYNTÉZY PROTEINů CHLORAMFENIKOL,, KANAMYCIN CHLORAMFENIKOL (vážou se na ribozomální podjednotky) gen Cml kóduje chloramfenikol acyltransferasu gen Kan kóduje aminoglykosid fosfotransferasu

AMPICILIN

SELEKČNÍ MARKERY

2) geny kódující enzymy narušující NUTRIČNÍ NEDOSTATEČNOST (ztráta autotrofie) - používají se především pro selekci transgenních kvasinek •

Gen URA3 kóduje enzym orotidin 5´-fosfát dekarboxylasu, enzym metabolické dráhy uracilu

•

LYS2 kóduje aminoadipát reduktasu (biosyntéza lyzinu)

•

ADE2 (C1-tetrahydrofolát syntasa), LEU2 (- izopropylmalát dehydrogenasa), TRP1 (fosforibozylanthranilát izomerasa)

Princip selekce: pro transformaci daného plasmidu se použijí specifické kmeny kvasinek deficientní pro daný gen, selekce se pak provádí na minimálním médiu (bez živin). Příklad: kmen Saccharomyces cerevisiae INVSc1 genotyp: MATa his31 leu2 trp1-289 ura3-52 //MAT  his3 s31 leu2 eu ttrp1-289 p 89 u ura3-52 a3 5 fenotyp: His-, Leu-, Trp-, Uratzn. že tento kmen je autotrofní na histidin, leucin, tryptofan a uracil a na médiu bez těchto živin neporoste kyvadlový vektor pro transformaci kvasinek 

INHIBITORY SYNTÉZY PROTEINů

TETRACYKLIN (zabraňuje vazbě aminoacyl tRNA k ribozomu) gen Tet kóduje membránový protein, který aktivně transportuje TC ven z buňky

INHIBITORY TRANSKRIPCE A REPLIKACE

ACTINOMYCIN D (inhibuje transkripci tím, že se váže na specifické úseky DNA) RIFAMPICIN (inhibuje prokaryotní RNA polymerasu, ale i chloroplastovou a mitochondriální, proto je toxicky i pro člověka) ZEOCIN – glykopeptid izolovaný ze Streptomyces, který štěpí po vstupu do buňky jakoukoliv DNA. Rezistentní gen Sh ble kóduje inhibiční protein (13.6 kDa) tohoto glykopeptidu. koncentrace účinné pro selekci: Baktérie 25 50 g/mL 25-50 Kvasinky 50-300 g/mL Savčí buňky 50-1000 g/mL

 ZEOCIN

SELEKČNÍ MARKERY

3) blue/white bl / hit screening i ttestt ((α α-komplementace) k l t )

• pomocný test pro selekci transformovaných bakterií či bakteriofágu • klonovací vektor nese gen lacZ+ který kóduje enzym -galaktosidasu (štěpí laktosu na galaktosu l kt a glukosu) l k ) • MCS je umístěn uvnitř tohoto genu, a po vložení inzertu se tento gen stává neaktivní

X-GAL

 galaktosa

uvolní l í se modré barvivo

Ampicilin (zabije netransformované bakterie)  X-GAL (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl (5 Bromo 4 chloro 3 indolyl b-D-galaktopyranosid) b D galaktopyranosid) umělý substrát  IPTG (isopropyl-1-thio--D-galaktopyranosid)  induktor exprese lacZ genu

lytický y ý a lysogenní y g cyklus y virů


SELEKČNÍ MARKERY

4) lysogenní l í selekce l k bakteriofágových b kt i fá ý h vektoru kt LAMBDA FIX II VEKTOR ( bakteriofágový vektor)

• red a gam geny se nacházejí ve střední části (stuffer) a jsou nahrazeny inzertem. inzertem Bakteriofág s inzertem je tudíž Spi- a může být vyselektován na P2 lysogenním kmeni

Heterologní expresní systémy

red/gam+

• Bakteriální B kt iál í

• selekce se provádí na speciálním kmeni E.coli (lysogenní pro P2 bakteriofága, tzn. že hostitelská buňka je již napadená jiným bakteriofágem) • Pokud má  vektor genotyp red/gam+ na daném kmeni neroste je tzv. tzv Sensitivní k P2 interferenci (Spi+ fenotyp)

struktura lambda bakteriofága g



12 kb



• Kvasinkové • Hmyzí buňky

red/gam-

• Savčí buňky • Transgenní rostliny

příliš malý nesbalí se do kapsidy inzert (genomová knihovna)


charakteristika

E. coli

kvasinky

hmyzí buňky

savčí buňky

buněčný růst

rapidní (30min)

rapidní (90min)

pomalý (18-24h)

pomalý (24 h)

minimální

komplexní medium

komplexní medium

požadavky na růstové medium

minimální

cena růstového media

nízká

nízká

vysoká

vysoká

množství exprimovaného proteinu

velké

malé až velké

malé až velké

malé nebo střední

e tracel lární exprese extracelulární e prese

sekrece do inkluzních tělísek

sekrece do media

sekrece do media

sekrece do media

rekombinatní genetická informace je vklonována do vhodného expresního plasmidu plasmidu, nedochází k integraci do genomu TA klonování

posttranslační modifikace

skládání proteinů

obvykle nutné dodatečné složení

ěkt ý h v některých případech nutné dodatečné složení

řádně složené proteiny

řádně složené proteiny

N-glykosylace

-

vysoký obsah manosy

jednoduché, bez sialové kyseliny

komplexní

O-glykosylace

-

+

+

+

fosforylace

-

+

+

+

acetylace

-

+

+

+

acylace

-

+

+

+

γ-karboxylace

-

-

-

+

Taq polymerasy bez 3´ 3´- 5´ samoopravné aktivity přidávají na 3´ 3´konce dATP

pg8 Snímek 51

TA TOPO klonování

pg8

The key to TOPO® cloning is the enzyme DNA topoisomerase I, which functions both as a restriction enzyme and as a ligase. Its biological role is to cleave and rejoin DNA during replication. Vaccinia virus topoisomerase I specifically recognizes the pentameric sequence 5´-(C/T)CCTT-3´ and forms a covalent bond with the phosphate group attached to the 3´ thymidine. It cleaves one DNA strand, enabling the DNA to unwind. The enzyme then relegates the ends of the cleaved strand and releases itself from the DNA. To harness the religating activity of topoisomerase, TOPO® vectors are provided linearized with topoisomerase I covalently bound to each 3´ phosphate galuszka; 21.4.2010

linearizovaný ý vektor ošetřen DNA topoisomerasou p I rychlá reakce bez účasti T4 DNA ligasy

rekombinační klonování


• místně specifický p ý rekombinační systém y bakteriofága g lambda – slouží k integraci g do genomu hostitele (aktivuje lysogenní cyklus)

• rekombinace p probíhá v obou směrech a jje katalýzována ý p proteiny y z λDNA i bakteriálními.

attB x attP ↔ attL x attR (“x” znamená rekombinaci).

• selekce antibiotikum a gen ccdB mezi rekombinantními místy, protein ccdB inhibuje bakteriální DNA gyrasu a způsobuje smrt buněk nesoucí prázdný vektor vstupní vektor

destinační vektor


Klasické klonování do vstupního vektoru: • pENTR vektory udržované v E.coli kmen DB3.1 (mutovaná gyrasa tak, že je necitlivá na ccdB inhibici) • po rekombinaci dvojitá selekce (1) na antibiotikum a (2) v sensitivním kmeni k ccdB – nerostou nezrekombinované plasmidy • 100% účinné není třeba selektovat pozitivní klony

• Invitrogen dodává všechny typy vektorů kompatibilních pro rekombinantní klonování • reakce trvá 1 hodinu při laboratorní teplotě • zachovávání čtecích rámců (ORF), žádné složité plánování


přímá amplifikace s primery obsahující rekombinační sekvence:

attB1 attB2

rekombinace do donorového vektoru: • pENTR a pDONR: pDONR: pomocné vektory • pDEST: pDEST: cílové vektory k použití LR reakce se účastní integrasa a ekscionasa (α (αDNA) a IHF (integration host factor) z bakterie

BP reakce se účastní IHF a integrasa


PG2 Snímek 58 PG2

N-terminal 6xHis tag umožňuje žň j velice li úči účinnou purifikaci ifik i proteinu pomocí metal-chelatační chromatografie popř. detekci pomocí Anti-HisG protilátky p y EK rozpoznávací sekvence pro specifickou enterokinas odštěpuje enterokinasu, odštěp je His-tag His tag T7 transcription termination region silný ý terminační systém y T7 bacteriofága g T7 promotor přesná heterogenního proteinu

a

silná

exprese

Ribosome binding site TOPO klonovací místo pro PCR produkt Xpress™ epitop (Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp(Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys) umožňuje detekci fúzního proteinu pomocí Anti-Xpress™ protilátky

gen pro rezistenci k ampicilinu umožňuje selekci plasmidu v E. coli pUC origin zajišťuje vysokou replikaci plasmidu a růst E. coli C-terminal V5 epitope tag umožňuje detekci fúzního pomocí Anti-V5 protilátky

proteinu

T7 bakteriofág, nejsilnější známy promotor, T7 RNA polymerasa je v baktérii pod IPTG inducibilním promotorem galuszka; 11.3.2007

PG3

exprimovaný p ýp protein

usnadnění izolace rekombinantního proteinu koncové značky

nejpoužívanější N a C-terminální značky (tagy):  His His--tag pro metal chelatační chromatografii (Ni)  FLAG epitope epitope - tag DYKDDDDK reverse primerTAG

„“

signální peptid

exprimovaný protein

V5 epitop

his tag

ATGforward primer

detekce

x-press

„ “

signální peptid



(Sigma; specifická protilátka) CBP - calmodulin binding peptide (26 AK) AK) CBD - cel elllulose binding domain

reverse primerTAG

exprimovaný protein

forward primer

detekce

izolace proteinu z bakteriální kultury:

• pokud je protein ukládán do inkluzních tělisek tělisek, rozbití buněk tepelným šokem, případně sonifikací nebo lysozymem

IB

imidazol wash I

• poté je nutno protein renaturovat - SLOŽITÉ!!!!

bakt.extrrakt

• pokud je ukládán do inkluzních tělísek, oddělení nerozpustné frakce a d denaturace t 9M močovinou č i nebo b guanidium idi chloridem hl id

wash II

galuszka; 11.3.2007

100mM

celulosa váže aromatické residua AK

200mM

FLAG hydrofilní epitop rozpoznatelný specifickou protilátkou

0.5mM

PG3

IB

Snímek 60

1M

izolace

marker


 his tag

izolace




k1

tagy založené na sacharidsacharid-vazebných proteinech

k2 k3

Snímek 62 k1

inteiny - proteinové introny kokos; 17.4.2010

k2

MBP - maltosa binding protein - amylosa CBP - intein – chitin binding protein - chitin

kokos; 17.4.2010

k3

15 -30 uvolneni represe az 1000 kopii kokos; 17.4.2010

Nejpoužívanější laboratorní kmeny E.coli

Který kmen E.coli zvolit?

tonA tonA mutace chrání bakterii před napadením T1 a T5 fágem, chrání tak vaše klony lacZ.M15 lac Z.M15 částečná delece wild-typového lacZ genu, po vložení plasmidu dochází k tzv.α- komplementaci potřebné pro blue/white screening na miskách s X-gal endA1 endA1 deficience endonukleasy I zaručuje kvalitní izolaci plasmidové DNA lacIq Iq qp produkuje j lacZ represor p negativně g regulující g j transkripci p z lacZ promotoru; p ; zrušení přídavkem p IPTG lac mcrA, mcrA, mcrBC, mcrBC, a mrr mutace v těchto genech zaručuje možnost klonování i methylované genomové DNA recA1 recA1 zabraňuje rekombinaci mezi plasmidovou a bakteriální DNA F´ episom je potřebný pro produkci ssDNA kóduje protein tvořící tzv pilus na vnější membráně E.coli

The most likely mutation is in the rop gene because rop mutants have increased plasmid copy number, and temperature sensitive mutations are most often due to changes in protein structure. An alternative explanation is that the mutation destablizes a stem-loop structure in the RNA which plays a role in regulation. (It is possible to obtain temperature sensitive mutations that decrease the stability of nucleic acid hybrids but, since most nucleic acid hybrids involve a considerable number of base pairs, a single nucleotide substitution is unlikely to have a substantial effect on the Tm of the hybrid. Furthermore, in this case the hybrid is between complementary strands so a nucleotide substitition would result in a different base pair at that position, not mispairing at that position.)

kmen

mutace

účel

firma

BL21(DE3)

deficientní na proteasy

obecná exprese

Stratagene

BL21 (DE3) pLysS

deficientní na proteasy, exprese lysosymu

přesně řízená exprese

Novagen

BL21 Star (DE3)

RNaseE mutant

exprese s redukovanou degradací RNA

Invitrogen

DB3.1

gyrA462 gyrA462 alela

propagace GATEWAY vektorů s toxickým genem ccd ccdB B

Invitrogen

DH5 DH5λλ

první laboratorní kmen

propagace plasmidu, klonování.

Life Technologies

Origami (DE3)

trxB a gor mutant

exprese, tvoří disulfidické můstky v cytoplasmě

Novagen

Rosetta

Geny pro argU, argW, glyT, IleX, leuW, metT, proL, thrT, thrU, and tyrU

exprese eukaryotních genů

Novagen

Top10

ara mutant

propagace plasmidu, klonování.

Invitrogen

regulace exprese pod T7 promotorem •

exprese naklonovaného genu je kontrolována velice silným promotorem z bakteriofága T7, který původně řídí expresi genu 10 pro obalový protein

•

pro expresi je nutno dodat do hostitelským buněk T7 RNA polymerasu a to buď infekcí bakteriofágem bakteriofágem, nebo její indukovanou expresi.

•

v sytému pCR®T7 TOPO® TA Expression je exprese T7 RNA polymerasy indukována lacZ promotorem pomocí IPTG a tento systém je uložen v genomu hostitelských buněk


•

před indukci IPTG probíhá bazální exprese T7 RNA polymerasy, pokud je p ý p produkt toxickýý p pro bakterii, nedojde j k selekci, selektují j se exprimovaný pouze mutované klony, které neprodukují rekombinantní protein

•

kmen E.coli BL BL21 21(DE ((DE3 3) nese v g genomu T7 RNA polymerasový y ýg gen pod lacZ promotorem, tento konstrukt je vložen do genu pro integrasu, jehož inaktivaci se zabrání lyzi, vyštěpení fágové částice v nepřítomnosti pomocného fága. Přirozený lac represor, jehož gen je taktéž vložený do genomu bakterie, bakterie brání expresi bez přítomnosti induktoru (IPTG)

•

někdy ovšem i přesto dochází k bazální expresi T7 RNA polymerasy a pokud je pod T7 promotor vložen gen produkující toxický produkt pro E.coli může docházet k redukci růstu, smrti baktérie či nestabilitě plasmidu. Kmen BL BL21 21(DE (DE3 3)LysS navíc obsahuje T7 lysozym (produkovaný genem LysS), uložený na speciálním vektoru s nízkou expresíí a nezávislou á i l selekci l k i na chloramfenikol. hl f ik l

•

T7 lysozym je schopen se vázat na T7 RNA polymerasu a inhibovat b ál í transkripci, bazální t k i i exprese indukovaná i d k á IPTG je j daleko d l k silnější il ější a T7 RNA polymerasa se dostane z této inhibice

•

T7 lysozym l j bifunkční je bif kč í enzym, který kt ý má á navíc í vlastní l t í lytickou l ti k f k i funkci, naštěpuje bakteriální peptidoglykanovou stěnu a usnadňuje tak následnou izolaci exprimovaného proteinu.

kmeny E.coli vhodné pro expresi - BL21(DE3) nebo BL21(DE3)LysS

Jaké geny lze v E.coli exprimovat?

• •

většinu z prokaryotických organismů eukaryotní geny jejichž produkty nepodléhají posttranslačním modifikacím většina cytosolárních proteinů (není glykosylovaná) geny kódované chloroplastovou nebo mitochondriální DNA

•

všechny geny jejichž produkty nepotřebujeme v aktivní formě

• •

(podobný (p ýg genetický ý kód,, evoluční příbuznost) p )


stabilizace exprimovaného proteinu

kvasinkové expresní systémy • • • 2004

• •

jednoduchá a levná exprese v eukaryotním organismu rychlá propagace a jednoduchá média jednoduchá manipulace s genem (klonovací systémy kompatibilní s bakteriálními, „shuttle shuttle“ vektor vektor) většinou lze produkovat nativní proteiny z vyšších eukaryot (správná posttranslační modifikace – glykosylace, folding) jednoduchý a prozkoumaný systém pro sekreční expresi do média

hostitelské organismy:

SUMO peptide – Small Ubiquitin like MOdifier ochrana před proteolýzou zvyšování rozpustnosti proteinu zvyšuje množství exprimovaného proteinu

k9 k10

Saccharomyces cerevisiae

Sumo proteasa

(od 1979)

Snímek 71 k9 k10

SHUTTLE VEKTOR • GAL1 GAL1 promotor zajišťuje induktivní expresi vloženého genu • T7 promotor/priming site umožňuje in vitro transkripci a sekvenaci inzertu • Multiple cloning site má 9 jedinečných klonovacích míst • CYC1 CYC1 terminátor transkripce, transkripce stabilizuje mRNA transkript • pMB pMB1 1 origin (pUC (pUC--derived) udržuje „high copy“ replikaci v E. coli • Ampicillin resistance gene selekce v bakterii • URA URA3 3 selekce kvasinek v uracil-deficientním médiu • 2 μ origin udržování replikace v kvasince • f1 origin produkce single-stranded DNA

Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces y p pombe Pichia pastoris Hansela polymorpha Kluyveromyces lactis Yarrowia lipolytica

epimerasa galaktosy UDP-glucosa na UDP galaktosa kokos; 22.4.2010

CYC1 cytochrom c oxidase kokos; 22.4.2010



SEKRECE HETEROLOGNÍHO PROTEINU V KVASINKÁCH • sekrece proteinu v kvasinkách je komplexní proces a není zde obecně akceptovaný sekreční signální g peptid • některé heterologní jsou sekretovány úspěšně pod svým vlastním signálem

REGULACE EXPRESE • u kmene INVSc1 jje transkripce p z GAL1 p promotoru inhibována p přítomnosti glukosy v médiu • transkripce je indukována odstraněním glukosy a přidáním galaktosy jako zdroje uhlíku do média • alternativně se může kvasinková kultura propagovat v médiu obsahující rafinosu, která neinhibuje ani neindukuje galaktosový promotor a transkripce se spustí pouze přídavkem galaktosy, bez nutnosti odstraňování rafinosy


HOSTITELSKÉ BUŇKY A) standardní kmen E. E coli např. např TOP10F který slouží pro namnožení plasmidu plasmidu, jeho udržování a manipulaci s ním. B) kmen S.cerevisiae INVSc1 Genotyp: MATa his3 D1 leu2 trp1-289 ura3-52/MATa his3 D1 leu2 trp1-289 ura3-52 Fenotyp: His-, Leu-, Trp-, UraINVSc1 je diploidní kmen autotrofní na histidin, leucin, tryptofan, a uracyl.

g10

Pichia pastoris

• v ideálních případech poskytuje 10 až 100 krát vyšší výtěžky než klasická Saccharomyces • klonování a manipulace s Pichii je velmi obdobná jako pro Saccharomyces • selekce – zeocin nebo nutriční autotrofie přirozeně sekretuje j daleko méně vlastních p proteinů než Saccharomyces y • Pichia p zjednodušuje izolací rekombinantního proteinu Pi hi pastoris Pichia t i jje methylotrofní th l t f í organismus i tzn. t jako j k zdroj d j uhlíků hlíků využívá ží á metanol t l • nejdříve ho oxiduje na formaldehyd (dva geny pro alkoholdehydrogenasu) za přítomností kyslíku, proces probíhá v peroxizomech jelikož vzniká toxický peroxid vodíku. vodíku Kvasinková AOX má velice slabou afinitu ke kyslíku a proto je AOX exprimováná ve velice velkém množství (5% veškeré mRNA). • toho využívá heterologní expresní systém, systém kdy je transgen vložen pod AOX promotor.

• často se k heterolognímu proteinu přidává kvasinkový sekreční signál odvozený od S cerevisae genů pro invertasu (SUC2) S.cerevisae (SUC2), kyselou fosfatasu (PHO5) nebo alfa alfa-faktor faktor (MFa1) POSTRANSLAČNÍ ÚPRAVY HETEROLOGNÍHO PROTEINU • N-a O-glykosylace se u kvasinek liší od vyšších eukaryot a způsobuje tvorbu neaktivního heterologního proteinu • např. kvasinky preferuji glykosylaci manosou na zbytky treoninu a serinu zatímco vyšší eukaryota preferuji O-glykosylaci sialovou kyselinou • tyto rozdíly mohou způsobovat špatný folding, nestabilitu či jinou imunogenicitu od původních proteinů p p • N-glykosylace většinou probíhá bez problému • problémy mohou nastat u složitějších proteinů s jejich fosforylací, acetylací, methylací, th l í miristylací i i t l í a isoprenylací i l í • problém jsou nejčastěji kvasinkové endoproteasy, které rády napadají exprimované cizí proteiny

Snímek 74 g10

roste do vysoké density až sirupovitá galuszka; 1.3.2011


Pichia pastoris HIS4 selekce v Pichii ampicilinová selekce v bakterií AOX1 promotor AOX1 terminátor pBR322 bakteriální počátek replikace

Pichia pastoris

f1 produkce ssDNA S – signální sekvence alfa faktoru 3ÁOX1 – ORF pro AOX gen – místo pro homologní rekombinaci

rekombinace a integrace v Pichia pastoris • transformace lineární plasmidovou DNA vede k integraci do genomu kvasinky pomocí homologní rekombinace. • transformanti vykazují vysokou stabilitu i bez selekčního tlaku • integrace na AOX1 lokus – gen narušen • může nastat i mnohonásobná inzerce s p pravděpodobností p 1-10% jjednoduché inzerce

rekombinace a integrace v Pichia pastoris

MNOHONÁSOBNÁ REKOMBINACE A INTEGRACE v

PICHII

různé typy selekce transformované Pichia pastoris

• selekce na základě stupňující se koncentrace antibiotika v médiu • je třeba otestovat stovky kolonií (1-10% účinnost) ANTIBIOTIKA • zeocin 50 μg - 2000 μg /mL • blasticidin • Kanamycin/G418

G418

kanamycin


• nutriční t ič í autotrofie t t fi – gen pro histidinol hi tidi l fosfatasu f f t (hi 4) – lepší (his4) l ší pro udržování dž á í integrity transformanta při kultivacích ve velkých objemech (fermentace) • narušení genu pro AOX1 způsobuje ztrátu aktivity alkohol dehydrogenasy a kvasinka získává MutS fenotyp (methanol utilization slow). Je schopná zpracovávat metanol p pouze AOX2 ((která má daleko nižší aktivitu 5%)) • využívá se toho pro selekci integrantů po transformaci: ti co vyrostou daleko později než ti co mají v sobě cirkulární plasmid a nemají narušený gen pro AOX1

Yarrowia lipolytica y

Pichia pastoris - glykosylace

N-glykany mají vysoký obsah manosy

•

je to lipofilní kvasinka, která spotřebovává jako zdroj uhlíku n-alkány a mastné kyseliny

•

do prostředí sekretuje velké množství extraceluární proteasy (gen XPR2)

•

promotor tohoto genu byl upraven, tak aby nebyl reprimovám okolními vlivy

•

hybridní promotor má 4x opakující se tandemové části z pXPR2 a vykazuje konstitutivní expresi

•

za hybridní promotor je vložená signální sekvence proteasy XPR2 nebo sekretované lipázy

•

klonovací místo SfiI a KpnI (XbaI)


Yarrowia lipolytica y • •

• • •

Heterologní exprese v Yarrowia lipolytica

vektory jsou integrativní (rekombinatní DNA se zabudovává do genomu kvasinky) odvozené od základního plasmidu pBR322 pINA1267 – mono-integrativní (homologní rekombinace na Po1g lokus, který byl klonován do hostitelského kmene kvasinky do Leu2 genu, linearizace přes jedinečné NotI místo pINA1294 – mnohonásobná integrace, do vektoru vložená Ylt1 retraspozonová sekvence, která aktivuje nehomologní rekobinaci do genomu kvasinky hostitelský ý kmen na knockoutoványy geny g yp pro extracelulární p proteasy y do hostitelské Yarrowia je vložen gen Suc2 ze Saccharomyces který umožňuje růst nového kmenu na sacharóze (snadnější propagace)

srovnání s ostatními heterologními systémy exprese p kukuřičného enzymu y cytokinin y oxidasy/dehydrogenasy y y g y Escherichia coli (pTYBII cytosolická exprese s protein fusován s inteinem) 3 dny ± 5 mg/litr média Saccharomyces cerevicae (pYES2 sekrece do média) ± 2 μg/litr média Pichia pastoris pPICZ-A (přirozený signální peptid) ±10 μg/litr média Pichia pastoris pPICZ-α (signální peptid z kvasinky) 1 mg/litr média Yarrowia lipolytica pINA1294 (signální peptid z kvasinky) 5mg/litr média přirozený zdroj – kukuřice (purifikace) 2 μg/kg média kukuřičných zrn

YEAST TWO HYBRID SYSTEM HYBRIDNÍ EXPRESNÍ KNIHOVNY systém pro studium interakce protein - protein, bait vektor (návnada) obsahuje gen pro protein, který studujeme a fish (prey) vektor (obsahuje danou cDNA expresní knihovnu) naklonovaná PRO STUDIUM PROTEIN-PROTEIN cDNA k knihovna ih INTERAKCÍ – význam ý pro studium t di z libovolného euk.organismu regulačních a signálních drah

k kvasinkový i k ý chromozom

3 týdny 3 týdny 1 týden 3 měsíce

mutace místně cílená (site(site-directed mutagenesis)

• gen, či sekvenci kterou budeme chtít mutovat, je třeba mít v libovolném vektoru • navržení dvou reverzně komplementárních primerů, v místě kde chceme mutovat, nesoucí tuto mutaci • vytváří se nové cirkulární DNA nesoucí mutaci, mutaci jsou k sobě komplementární a drží u sebe, mají přerušení v místě konce primerů (tzv. nick) • ošetření restrikční endonukleasou DpnI (štěpí pouze methylovanou DNA, templátový plasmid)) • transformace do bakterie a namnožení mutovaného plasmidu

konstitutivní promotor

2 měsíce

• 100% účinnost úči t neníí třeba tř b selekce l k mutovaný/nemutovaný t ý/ t ý

mutace místně cílená původní sekvence forward primer reverse primer

CÍLENÁ MUTACE

originální plasmid

(site(site-directed mutagenesis)

M G A L L W L 5’ ATG GGA GCT CTA TTA ACC TTA 3’ 3’ TAC CCT CGA GAT AAT TCG AAT 5’ 5’ ATG GGA GCT CTA TTA AGC TTA 3’ M G A L L S L


PfuTURBO termostabilní DNA polymerasa - nejmenší chybovost - 3´- 5éxonukleasová aktivita DpnI

KOZAKOVÁ SEKVENCE je důležitá pro efektivitu translace (umožňuje pevnou vazbu malé ribozomální podjednotky na mRNA) u eukaryot. nastavení PCR s PfuTURBO Taq

obratlovci

gccRccATGG

Drosophila spp. spp

cAAaATG

rostliny

aAcaATGGc

Saccharomyces cerevisiae aAaAaAATGTCt PCR s nízkým počtem cyklů

restrikce s DpnI

XL10-Gold kmen E.coli XL10- nemá knockoutované metyltransferasy transformace a namnožení

syntéza genů na zakázku

Kozak seq.

AtCKX1 AtCKX2 HvCKX2

-6 -5 -4 U A A

G A A

U A G

A A A

-3 -2 -1 start codon +4 +5 +6 A C A A U G G C U 60% 100% 70% G C G

A A C

A A C

A A A

U U U

G G G

G G A

$159

turnaround time 12#

$0.39/bp

$0.39/bp

$0.39/bp

12#

12#

17#

A U G

syntéza DNA ochrana NN-bází

Minimum charge 0 – 999 bp 1000 – 1999 bp 2000 – 3000 bp price/bp

G C G

FOSFORAMIDIT


odchylky v genetickém kódu

Syntéza umělého genu

snižují výtěžek heterologní exprese výjimky:

jiná preference: kodón pro arginin (6 různých): CGU CGA CGG CGC

AGA AGG

E. coli AGA 2 2.2% 2% AGG 1.6%

H. sapiens

AGA 18.9% 18 9% AGG 11.0%

AGA 11 11.9% 9% AGG 12.1%

sekvenace DNA

Optimalizace syntetického genu firmou Mr.GENE 1. Úprava p kodonů 2. Vyvarování se terciárním strukturám mRNA 3. Vyhledávání specifických motivů např. Shine Dalgarnova sekvence 5' Shine-Dalgarnova 5 -AGGAGGU-3 AGGAGGU 3' polyadenylační signály

Arabidopsis th.

(Sangerova metoda)

asymetrická PCR amplifikuje pouze jeden řetězec dsDNA • • • •

PCR s jedním primerem a dideoxyribonukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) did dideoxyribonukleotidy ib kl tid značené č é 4 flfluorescenčními č í i markery k velice citlivé elektroforetické rozdělení v kapiláře fluorimetr s automatickým vyhodnocením

dideoxyribonukleotid

sekvenace DNA

(Sangerova metoda)

sekvenace DNA

(Sangerova metoda)

vyhodnocení dříve elektroforeticky ve čtyřech reakcích

dnes: jedna reakce, čtyři různě fluorescenčně značené did dideoxyribonukleotidy, ib kl tid detekce d t k při ři čtyřech různých emisních vlnových délkách


• univerzální primery, nebo vlastní • jedna sekvenační reakce „přečte“ cca 700700-900 bp

SEKVENAČNÍ ZAKÁZKOVÝ SERVIS: 250250-500 CZK na jednu sekvenaci

NOVÉ METODY SEKVENCOVÁNÍ: Pyrosekvencování

1. Izolace genomové DNA a restrikce na vhodné fragmenty (300(300-800 bp) 2 Zatupení konců a navázání adaptorové sekvence s biotinovou 2. značkou (modrá) a druhé bez (červená) 3. Navázání na kuličky se streptavidinem 4. Nanesení na mikroreaktorovou destičku 5. Provedení emulsního PCR (červený a modrý primer)

DNA polymerasa dNTP mix ATP sulfurylasa Adenosine 5 fosfosulfát Luciferasa Luciferin Apyrasa

6 Paralelní 6. P l l í pyrosekvencování k á í ve všech š h jjamkách ká h


Roche 454/GS FLX Sequencing Technology

Illumina/Solexa

1.

4.

„Bridge Bridge“ PCR

2.

5.

metoda cyklické reverzibilní terminace 3.

6.

cyklická reverzibilní terminace

Chemické štěpení ve vodném prostředí za katalýzy paladiem DEALLYLACE

Illumina/Solexa - vyhodnocení

SROVNÁNÍ platforma

Příprava templátu

chemismus

Délka jednoho čtení (bp)

Doba běhu

Přečtené Gb na jeden běh

Cena přístroje (USD)

ROCHE 454

Fragmentace + emulsní PCR

ILLUMINA SOLEXA

Fragmentace + „bridge“ PCR

Cena přečtení lidského genomu

pyrosekvencování

330

8 hod.

0 45 0.45

1 000 000 500 000 1.000.000 500.000

Cyklická reverzibilní terminace

35

9 dní

35

200 000 540 000 200.000 540.000


ROCHE 454 + dlouhé běhy, lze dělat i de novo nekomplikované genomy (mikroorganismy + rychlé y y v homopolymerních p y repeticích p (AAAAAAAAA, ( , GGGGGGGGGGG)) -- chyby ILLUMINA/ + nejpoužívanější jp j SOLEXA + obrovský rozsah, resekvenace celého genomu v jednom běhu -- nízká multiplexita

Pyrosekvencování a technologie Roche 454 umožnili rozvoj metagenomiky:

ODSEKVENOVANÉ GENOMY

• Rychlé a levné sekvencování genomů jednotlivců • Nelze sekvencovat neznáme genomy, kvůli obtížnosti přiřazení (repetice) pouze ty u kterých je znám homologický genom (stejného biologického druhu)

Metagenomika studium biologické rozmanitosti a genetického materiálu celé komunity (mikro)organismů přímo v jejich přirozeném prostředí bez nutnosti jejich kultivace v laboratoři (např. z půdy, střevní mikroflora)

Metagenom celková genetická iinformace f komunity k it organismů

X

Genom celková genetická informace jednoho organismu


Střevní mikroflóra P J P. J. Turnbaugh et al. al (2006) An A obesity-associated b it i t d gutt microbiome i bi

with increased capacity for energy harvest. Nature. Dec 21;444(7122):1027-31.

• Apendikální mikrobiální DNA z ob/ob ob/ob, ob/+ ob/+, +/+ myši • Složení mikroflóry střeva závislé na obezitě

• změny v zastoupení bakteriálních kmenů Bacteroidetes a Firmicutes • změny y v metabolickém potenciálu p střeva (ukládání ( energie) g )

DNA mamuta - Mammoth Project Hendrik N. Poinar et al (2006):

Metagenomics to Paleogenomics: Large-Scale Large Scale Sequencing of Mammoth DNA. Science Jan. 20, 311 (5759): 392-394.

•DNA extrahována z 1 g mamutí kosti (28000 let, ze Sibiře) – 100 ml

• DNA fragmenty 500 – 700 bp • „454“ sekvenování • 28 miliónů bp • 302 692 čtení • 45,4% čtení se přirovnalo se sekvencí slona afrického, 1,4% - s lidskou a 1,2% se psí sekvencí. sekvencí

největší význam DIAGNOSTIKA •

zlevnit přesekvencování lidského genomu na 1.000 USD (do roku 2015) (nové levnější přístupy: SOLID Applied Biosystems, HELIOS)

•

CANCER GENOME ATLAS

•

TRANSCRIPTOME SEQUENCING (RNA(RNA-seq) – výhoda oproti DNA čipům je že 100% postihuje alternativní sestřih a alelickou variabilitu

•

SINGLE MOLECULE SEQUENCING (Helios) (H li ) – preinplantační i l t č í diagnostika

•

SOLID PHASE CAPTURE – NimbleGene™ NimbleGene™ čip vyrobený pro vychytání kodujících sekvencí a regulačních oblastí z fragmentované genomické DNA před vlastním vysokoúčinným sekvencováním

Autor prezentace: Doc. Mgr. Petr Galuszka, Ph.D

Recommend Documents