Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka

Práce s inkluzními tělísky

Inkluzní tělíska

Refoldování A Agregáty át proteinů t i ů s nesprávnou á kkonformací f í v cytoplazmě t l ě nebo jádru buněk

Fúzní proteiny Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy a její p od separace rekombinantního proteinu

Původ: Virové infekce – akumulace virových kapsidových proteinů Např. Negriho těliska (Vzteklina), Guarnieriho tělíska (Neštovice), Cucumber mosaic virus… Jiné patologické stavy Např. Lewyho tělíska uvnitř neuronů (Parkinsonova choroba), inkluze hemoglobinu (thalasémie)…

Mgr. Michal Křupka Ústav imunologie LF UP Ústav

Agregace g g rekombinantního p proteinu v expresních p buňkách E. coli

Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka

Inkluzní tělíska

Nativní at lyzát y át Cílový protein v

Částice tvořené agregovaným rekombinantním proteinem

peletě

Rozpustný p ý

Nerozpustný

protein

Protein v inkluzních tělíscích

Purifikace za

Protein je obsažen zpravidla v chybné konformaci a není funkční

V některých ěkt ý h případech ří d h llze ttvorbě bě inkluzí i kl í zabránit např. kultivací za nižší teploty, fúzí s „tagy“, koexprese chaperonů….

Cílový protein v

supernatantu t t

Až 70 % rekombinantních proteinů (hlavně eukaryotického původu) je exprimováno v E.coli ve formě inkluzních tělísek

Pro získání funkčního produktu je třeba solubilizace inkluzních tělísek a následná renaturace produktu

Centrifugace

Purifikace za

Denaturačních

Denaturačních

podmínek

podmínek Photo from Webpages of The Working Group Downstream Processing at the Department of Biotechnology, University of Natural Resources and Applied Life Sciences Vienna , Vienna, Austria

Nativní čistý produkt

Renaturace

Denaturovaný čistý produkt


Kultivace expresního kmene E. coli do O.D.600 = 0,6

Indukce exprese (1mM IPTG), kultivace indukovaných E. coli 3 – 4 hod. 37°C

Inkluzní tělíska Denaturace a solubilizace (8M Urea Urea, 6M Guanidin hydrochlorid, hydrochlorid mercaptoethanol)

Izolace bakteriální biomasy (centrifugace)

Lýza buněk – Lysozym, sonikace, opakované zamražení

Centrifugace, promytí pelety pufrem

Inkluzní tělíska

Renaturace (refolding refolding)) Rekonstituce nativní (funkční) konformace proteinu po předchozí denaturaci Převedení do nativních podmínek, odstranění chaotropního (denaturačního) činidla a jjeho nahrazení p pufrem (PBS, ( , Tris…,, fyziologické y g pH p a osmolalita)) Cílem je získat rozpustný protein v aktivní formě, tj. plnící svoji biologickou funkci (antigen, enzym…) Úspěšnost procesu obtížně predikovatelná Průměrná výtěžnost bioaktivního proteinu kolem 25 %

http://www.news.cornell.edu/stories/Aug06/ProteinFoldingScheraga.kr.html

Purifikace za denaturačních podmínek (afinitní chromatografie)

Čistý denaturovaný solubilní protein

Renaturace…

Metody renaturace proteinů Dialýza – odstranění nízkomolekulárních látek přes membránu o definované pórovitosti jednoduchá nebo gradientová pórovitosti,

Ředění – postupné přidávání roztoku proteinu do nadbytku pufru Renaturace na koloně - afinitní nebo gelová chromatografie Aditiva přidávaná do renaturačních pufrů (snižují agregaci proteinů,

umožňují tvorbu disulfidických vazeb) Arginin (0,5 – 1M) Glycerol Oxidovaný a redukovaný glutathion Dithiotreitol Polyethylen glykol Detergenty EDTA

Metody ověření nativní konformace renaturovaných proteinů

Výsledek renaturace výrazně variabilní mezi jednotlivými proteiny – nutná optimalizace metodiky pro každý jednotlivý protein

Enzymová aktivita Imunogenita Reakce s protilátkami proti konformačním epitopům

Protein refolding kits - komerční sady pufrů s gradientem koncentrací jednotlivých složek - usnadnění nalezení optimálních renturačních podmínek

Vazba na receptor nebo ligand Spektroskopické metody Databáze renaturačních postupů pro jednotlivé proteiny:

http://clims.med.monash.edu.au/ Chow MK, Amin AA, Fulton KF, Whisstock JC, Buckle AM, Bottomley SP. (2005) REFOLD REFOLD: An A analytical l ti l database d t b off protein t i refolding f ldi methods. th d Protein P t i Expr Purif.


Zabránění tvorby inkluzních tělísek v E.coli - Exprese při nižší teplotě – laboratorní teplota přes noc x 37°C 4 hodiny - Koexprese chaperonů - Výběr vhodného fúzního peptidu - Použití speciálních kmenů bakterií pro expresi eukaryotických proteinů -Exprese p v eukaryotických y ý vektorech – Pichia, Saccharomyces, y savčí a hmyzí y

Kmeny E. coli vhodné pro expresi eukaryontních proteinů Origami – kmen odvozený z E. coli K-12 mutantní v genu pro thioredoxin reduktázu (trxB) a glutathion reduktázu (gor), zvyšuje tvorbu cysteinových můstků v cytoplasmě Rosetta – obsahuje sekvence pro tRNA pro kodony AUA, AGG, AGA, CUA, CCC a GGA vzácné u E. coli

systémy Rosseta – gami – kombinuje vlastnosti obou předchozích kmeny, tj, tvorbu disulfidových můstků s rozeznáváním eukaryotických kodonů


„Tagy“ (značky, kotvy) fúzované s rekombinantními

Fúzní proteiny p y

proteiny

Proteiny vzniklé na základě spojení dvou nebo více genových sekvencí původně kódujících odlišné produkty

Význam: - Identifikace, vizualizace a kvantifikace exprimovaných proteinů pomocí protilátkových nebo ligandových konjugátů - Umožnění afinitní purifikace

Požadavky: -Možnost jednokrokové afinitní purifikace -Minimální Minimální efekt na terciální strukturu proteinu a jeho aktivitu -Možnost snadného a specifického odstranění z molekuly proteinu -Možnost snadné a přesné detekce proteinu v průběhu purifikace -Použitelnost v prokaryotických i eukaryotických expresních systémech

Sekvence plasmidu (Novagen)

Krátké oligopeptidové značky

Peptidový řetězec thrombin

enterokinase

C- term

N- term

GST

His S

His

His-tag Hi t Hi Hi Hi Hi Hi Hi (0,84 His-His-His-His-His-His (0 84 kD kDa)) T7-tag Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly (1 kDa) V5-tag g Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr y y y p Xpress epitope Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys S-tag Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser (1,75 kDa) pancreatic ribonuclease C-myc Glu-Gln-Lys-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu (1,2 kDa) SBP-tag Met-Asp-Glu-Lys-Thr-Thr-Gly-Trp-Arg-Gly-Gly-His-Val-Val-Glu-Gly-LeuAl Gl Gl L Gl Gl L A Al A L Gl His-His-Pro-Gln-Gly-Gln-ArgAla-Gly-Glu-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg-Ala-Arg-Leu-GluHi Hi P Gl Gl Gl A Glu-Pro (4,03 kDa) Poly-arginine-tag Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg (0,8 kDa) Strep-Tag Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (1kDa) FLAG-Tag N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C (1 kDa) Calmodulin binding peptide Lys Lys-Arg-Arg-Trp-Lys-Lys-Asn-Phe-Ile-Ala-Val-SerArg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala-Ala-Asn-Arg-Phe-Lys-Lys-Ile-Ser-Ser-Ser-Gly-Ala-Leu (2,96 kDa)

Doménové a proteinové značky

Celulose binding domains (3 – 20 kDa) Glutathione S-transferase tag (GST) N-term protein (26 kDa) Maltose-binding protein (MBP) protein (40 kDa) Thioredoxin (TrxA) protein Transcription termination anti-termination factor (NusA) protein Protein disulfide isomerase I (DsbA) protein


His tag

Purifikace s použitím metaloafinitní t l fi it í chromatografie h t fi

Krátká sekvence (6 aa) ý j neovlivňuje j vlastnosti Většinou výrazněji proteinu – enzymová aktivita, struktura, imunogenita Afinita k atomům přechodných kovů Ni2+, Co2+, Zn2+, Cu2+ - purifikace pomocí metaloafinitní chromatografie, metodiky pro nativní i denaturační postup, kovy kotveny nejčastějí pomocí NTA ((nitrilotriacetic acid). ) Ni a Cu – silnější vazba, Zn a Co slabší – nižší výtěžek, ale vyšší čistota Anti-His A i Hi protilátky, ilá k Ni Ni-NTA NTA konjugáty k j á – umožňují detekci na Western blotu i kvantifikaci rekombinantního proteinu (ELISA, Dot blot)

Obrázky převzaty z webů Qiagen a KPL

Různé formáty, nejčastěji vázáný kov Ni nebo Co, opakované použití


Proteinové „tagy“ (GST, MBP,TrxA, NusA, DsbA)

Schéma p purifikace proteinu p fúzovaného s Maltose binding protein na imobilizované amylóze

Z š jí rozpustnost Zvyšují t t exprimovaných i ý h proteinů t i ů v E. E coli, li mohou h zabránit b á it ttvorbě bě inkluzních tělísek GST a MBP mohou sloužit k afinitní p purifikaci, k TrxA, NusA a DsbA musí být ý připojena peptidová značka Velice často ovlivňují aktivitu a imunogenitu rekombinantního proteinu – nutno odstranit po purifikaci

Web of New England Biolabs

Štěpné místo

Odstranění fúzních značek

thrombin

enterokinase

Vložení nukleotidové sekvence pro peptid rozeznávaný specifickou proteázou GST

Používané proteázy: Enterokináza Th Thrombin bi Faktor Xa Tobacco etch virus (TEV) proteáza

His S

enterokináza

thrombin

GST

S

His

GST

His S

+

+

+

+

enzym

enzym

Oddělení p produktů štěpné p reakce N t éd Nutné další lší purifikační ifik č í kroky k k - odstranění značek – afinitní nebo gelová chromatografie -odstranění d t ě í enzymu – vhodné h d é použít žít značený č ý enzym – afinitní fi it í metody t d

Tag•off™ rEK Cleavage/Capture Kit Kit založený na purifikované katalytické jednotce lidské enterokinázy Obsahuje ředící a reakční pufry, kontrolní protein a EKapture™ agarózu Umožňuje rychlé a snadné odstranění enzymu

- metody iontoměničové nebo gelové chromatografie Pro některé aplikace stačí inaktivace proteázy - inhibitory však jsou často toxické (PMSF – T+)

Protein p24 HIV/pET200 před a po odstranění afinitního tagu, reakce 16 hod při pokojové teplotě

Někdy je možno provést štěpení již na afinitní koloně – eluční krok


Komplikace proteázového odštěpení značek

-

Oddělení proteázy, odštěpeného peptidu a nerozštěpených proteinů od správně štěpeného proteinu vyžaduje další purifikační kroky

-

Proteázy mohou štěpit protein nespecificky nespecificky, případně může protein přirozeně obsahovat rozeznávanou sekvenci

-

Štěpné místo může být nepřístupné díky konformaci proteinu

-

Štěpení vyžaduje dlouhou dobu, často při pokojové teplotě – problém u málo stabilních proteinů

-

Metoda je relativně nákladná

Autokatalitická technika odštěpení p fúzní kotvy y Samoštěpící moduly, aktivace nízkomolekulární látkou po odmytí kontaminujících proteinů

Inteiny „proteinové introny“, popsány roku 1987 S Samoštěpící ště í í aktivita kti it Fúze s rekombinantními proteiny – spojka mezi cilovým proteinem a značkou značkou, např např. Chitin binding protein Štěpení po přídání thiolu – DTT, mercaptoethanol Web of New England Biolabs


Systém y založený ý na autokatalytickém y jádře j sortázy yA Staphylococcus aureus (SrtAc)

Self processing module (SPM) Základem doména proteinu FrpC Neisserie meningitidis Štěpení indukováno vápenatými ionty

Ostatní možnosti tvorby y fúzních p proteinů

„Trimer tag“ – kolagenová doména C- terminální repetitivní sekvence kolagenu

- Ovlivnění struktury vzniklého proteinu - Sekrece proteinu v savčích buňkách – sekvence odvozené z imunoglobulinů Humanizace“ produktu – monoklonální protilátky -„Humanizace - Ovlivnění imunogenity proteinu – „molekulární adjuvans“ - a mnoho h d dalších lší h

Imunomodulační fúzní proteiny

Tvorba chimerických a humanizovaných monoklonálních protilátek

Fúze antigenu s imunomodulačním proteinem – cytokiny, chemokiny, heat shock proteins, kostimulační molekuly….

ATG

ATG

ATG ATG

hsp70mm p24 p

p24

hsp70mm p

hsp70mm p24

His

V5

His

V5

His

V5

STOP

His

V5

STOP

STOP

STOP

DNA constructs used in the experiment


Děkuji za pozornost

Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka

Recommend Documents