Uji Toksisitas Subkronik Dekokta Kombinasi Imperata cylindrica, Gynura procumbens, dan Syzygium polyanthum Terhadap Hiperplasia Lamela Insang Danio rerio Ardita Nadia Putri, Arif Yahya, M. Zainul Fadli Fakultas Kedokteran Universitas Islam Malang E-mail:
[email protected] Abstract. Decocta of Imperata cylindrica, Gynura procumbens, and Syzygium polyanthum (IGS) known as antihypertensive remedies. IGS combined decoction contains flavonoids as antioxidant also toxic compounds such as p-hydroxybenzoic and saponin. This study was conducted to determined IGS subchronic toxicity indicated by hyperplastic lamelar of Danio rerio gills as an animal model. The number of hyperplastic cells were associated with the given dosage of IGS . Research employs control group post test only design. 18 Zebrafish (Danio rerio) were divided into 3 groups. Control group (K0) was treated with standard food in an aquarium with 1000 ml of distilled water for 14 days. Treatment groups was given by 932 mg/L (P1) and 1864 mg/L (P2) of IGS combined decoction for 14 days. Hematoxylin-Eosin (HE) stains were given on microscopic slides. The number of hyperplastic cells are the calculated by using binocular microscope with 1000 times magnification. The results then analyzed by One Way ANOVA then followed by post hoc test using Tukey Test. Result meaningful if p<0,05. The combination of IGS decoction at 932 mg/L can increased the number of hyperplastic cell on gill lamelae, whereas at dose of 1864 mg/L shows a significant elevation. The IGS combined decoction at 1864 mg/L can lead to mild hyperplasia on Danio rerio gills. Keywords: Imperata cylindrica, Gynura procumbens, Syzygium polyanthum, subchronic toxicity, gill hyperplasia
Indonesia sangat kaya akan berbagai keanekaragaman hayati, bangsa Indonesia juga memiliki pengetahuan tentang pengobatan tradisional dari berbagai macam herbal yang diturunkan secara turun-menurun yang biasa disebut dengan jamu.1 WHO memperkirakan sebanyak 80% orang di dunia masih menggantungkan dirinya pada pengobatan tradisional terutama obat yang berasal dari tanaman2. Beberapa herbal yang diketahui bermanfaat sebagai anti hipertensi karena mengandung antioksidan yaitu, akar alang-alang (Imperata cylindrica Akar alang-alang mengandung flavonoid, fenol dan, senyawa potasium yang memiliki fungsi salah satunya peluruh kemih (diuretik)3, kemudian daun sambung nyawa (Gynura procumbens) yang daunnya mengandung 4 senyawa flavonoid, tanin, saponin, dan, triterpenoid.4 Serta daun salam (Syzygium polyanthum) yang telah diteliti juga mengandung flavonoid dan menunjukkan aktivitas antioksidan dan mampu mengontrol HDL kolesterol.5 Tetapi, selain kandungan antioksidan terdapat pula kandungan phydroxibenzoat yang dapat menyebabkan penurunan fungsi mitokondria sehingga mengakibatkan deplesi ATP dan saponin yang bersifat toksik bagi sel6,7.
Penggunaan obat hipertensi baik dengan obat kimia sintetik maupun obat herbal selalu dalam jangka waktu yang lama, sehingga dapat menyebabkan penumpukan senyawa metabolit di dalam organ-organ penting tubuh, misalnya di hepar, saluran pencernaan ataupun renal. Organorgan tubuh akan bekerja keras untuk menyaring dan membuang senyawa-senyawa yang tidak dibutuhkan oleh tubuh yang akan menyebabkan reaksi komplikasi pada organ-organ tersebut.8 Pada penelitian Putry (2014) disebutkan paparan dekokta kombinasi akar alang-alang, daun sambung nyawa dan daun salam selama 14 hari dengan dosis 932 mg/L dan 1864 mg/L dapat menyebabkan nekrosis pada sel hepatosit. Danio rerio digunakan sebagai hewan coba karena berpotensi untuk mengetahui mekanisme toksisitas karena berperan penting sebagai bioindikator. Selain itu Danio rerio juga memiliki banyak kesamaan dengan struktur kromosom pada manusia.9 Insang Danio rerio diketahui berperan sebagai regulator ion dan pengatur keseimbangan asam basa.10 Pada manusia fungsi tersebut analog dengan ginjal.11 Berdasarkan uraian di atas, maka peneliti ingin mengetahu dosis toksik dan efek yang timbul dari pemberian akar Imperata cylindrica, daun Gynura procumbens dan daun Syzygium polyanthum terhadap lamela insang Danio rerio.
Jurnal Kedokteran Komunitas
Dengan demikian diharapkan dapat menghindari efek samping yang tidak diinginkan dari penggunaan herbal tersebut. Seperti yang dituliskan pada surat Al Maidah ayat 32, bahwa memelihara kehidupan sesama manusia itu sangat penting12 METODE PENELITIAN Desain Penelitian Penelitian ini menggunakan metode eksperimental laboratorium dengan desain penelitian control group post test only dengan menggunakan hewan coba Danio rerio berumur tiga bulan yang telah diadaptasi selama 3 hari sebanyak 18 ekor. Hewan coba diberi paparan dekokta kombinasi akar Imperata cylyndrica, daun Gynura procumbens dan daun Syzygium polyanthum selama 14 hari. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Islam Malang, pada bulan Juni - September 2014. Ethical clearance Penelitian ini telah disetujui pada bulan April 2014 dan mendapat surat laik etik dari Komisi Etik Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya No. 426/EC/KEPK-S1-PD/07/2014. Pengelompokan Hewan Coba Pembagian kelompok perlakuan dilakukan secara randomisasi dibagi ke dalam 3 kelompok yaitu kelompok kontrol (tanpa perlakuan), P1 (932 mg/L kombinasi IGS) dan P2 (1864 mg/L kombinasi IGS). Penentuan dosis pajanan subkronik menggunakan dosis secara berturut-turut yang akan mengikuti progresi geometris13 yaitu : YN = Y1 x RN-1 YN adalah dosis ke-n merupakan dosis pertama RN-1 merupakan faktor pemicu; R=2 N adalah dosis deret pertama
Pembuatan Ekstrak Akar Alang-alang, Daun Sambung Nyawa dan Daun Salam Penelitian ini menggunakan simplisia akar Imperata cylindrica, daun Gynura procumbens dan daun Syzygium polyanthum yang memenuhi persyaratan diperoleh dari Balai Page | 2
Volume 3, Nomor 1, Desember 2015
Materia Medika, Batu dan telah disertifikasi. Selanjutnya daun dan akar disortasi untuk memisahkan bagian tanaman yang dibutuhkan, kemudian dibersihkan dan dikeringkan dengan cara di oven pada suhu 40-60ºC atau dijemur dibawah sinar matahari hingga kering. Simplisia selanjutnya diekstraksi menggunakan metode dekoktasi. Dekok merupakan sediaan cair yang dibuat dengan mengekstraksi sediaan herbal akar Imperata cylindrica, daun Gynura procumbens dan daun Syzygium polyanthum dengan perbandingan berat 5:5:4 (dalam gram) dimasukkan dalam air sebanyak satu liter pada suhu 90ºC selama 30 menit.9 Ekstrak kemudian disaring, lalu didinginkan dan dimasukkan ke dalam akuarium. Pengambilan Sample dan Pembedahan Hewan Coba Pengambilan sampel organ dan pembedahan hewan coba diawali dengan proses penghilangan kesadaran hewan coba dengan cara memasukkan ikan kedalam toples kaca yang telah diisi air 5 ml. Kemudian ditutup rapat dan ditunggu beberapa menit sampai ikan pingsan, dan dilakukan pembedahan. Pembuatan Preparat Histologi Pembuatan preparat diawali dengan melakukan pembedahan pada ikan, lalu organ yang akan dperiksa direndam dalam larutan neutral buffered formalin, lalu di dehidrasikan dan disimpan dalam lilin parafin. Selanjutnya di potong dengan ketebalan 4µm dengan menggunakan mikrotom, lalu dilakukan pengecatan haematoxylin dan eosin (HE) dan di amati di bawah mikroskop. Teksnik Penghitungan Hiperplasia Lamela Setelah didapatkan preparat yang telah kering, dilakukan pengamatan dan penghitungan jumlah hiperplasia lamela insang menggunakan pernghitungan sebagai berikut: Kerusakan total (100%) = U x (n) LP x skor maksimal Keterangan: U: banyaknya ulangan (n) LP: banyaknya ulangan lapang pandang Skor maksimal: 3
Ardita Nadia Putri,Uji Toksisitas Subkronik Dekokta Kombinasi Imperata cylindrica
Penghitungan dilakukan secara manual menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1000 kali. Pengamatan diambil dari lima lapang pandang dan dilakukan oleh tiga orang untuk menghindari subjektifitas. Gambaran hiperplasia lamela dapat diidentifikasi dengan penebalan jaringan epitel di ujung filamen yang memperlihatkan bentuk seperti pemukul bisbol (clubbing distal) atau penebalan jaringan epithelium yang terletak di dekat dasar lamela13 Teknik Analisa Data Data yang diperoleh dianalisa menggunakan One Way ANOVA kemudian dilanjukan dengan uji Post Hoc menggunakan uji Tukey. Hasil bermakna jika nilai signifikan p<0,05. Tabel 1. Skoring Kerusakan Histologi No. Score Keterangan 1. 0 Tidak ada kerusakan (Normal) atau perubahan histologi pada insang ikan zebra (Danio rerio) berupa hiperplasia lamela sekunder dalam satu lapang pandang 2. 1 Terdapat kerusakan (Ringan) atau perubahan histologi pada insang ikan zebra (Danio rerio) berupa hiperplasia lamela sekunder sebanyak <30% dalam satu lapang pandang 3. 2 Terdapat kerusakan (Sedang) atau perubahan histologi pada insang ikan zebra (Danio rerio) berupa hiperplasia lamela sekunder sebanyak 30% - 70% dalam satu lapang pandang 4. 3 Terdapat kerusakan (Berat) atau perubahan histologi pada insang ikan zebra (Danio rerio) berupa hiperplasia lamela sekunder sebanyak >70% dalam satu lapang pandang
HASIL PENELITIAN Karakteristik Populasi Hewan coba yang digunakan adalah Danio rerio dewasa, berjenis kelamin jantan, berusia 3 bulan. Jumlah sampel berjumlah 18 ekor yang dibagi dalam 3 kelompok perlakuan. Sebelum diberikan perlakuan, dilakukan adaptasi pada hewan coba selama 3 hari di dalam aquarium berisi aquades dengan pH 7. Pada kelompok kontrol negatif, tidak diberikan paparan IGS dalam 1 liter aquades, pada P1 diberikan 923 mg IGS dalam 1 liter aquades dan pada P2 diberikan 1864mg IGS dalam 1 liter aquades. Pemberian paparan dilakukan selama 14 hari, dan dekokta diganti setiap hari. Ringkasan karakteristik populasi penelitian ini dapat dilihat pada tabel 2. Tabel 2. Karakteristik Populasi Kelompok K0 P1 Perlakuan Lama 3 hari 3 hari adaptasi Usia 3 Bulan 3 Bulan Pemberian 0 mg/L 932 Dekokta mg/L IGS Lama 14 hari 14 hari Pajanan Jumlah 6 6 hewan per kelompok
P2 3 hari 3 Bulan 1864 mg/L 14 hari 6
Efek Dekokta Kombinasi Akar Imperata cylindrica, Daun Gynura procumbens, dan Daun Syzygium polyanthum terhadap Hiperplasia Lamela Insang Ikan Zebra (Danio rerio) Rata-rata nilai skoring dan persentase kerusakan lamela insang yang ditimbulkan dari pemberian dekokta kombinasi IGS pada Danio rerio dapat dilihat pada tabel 3.
3 | Page
Jurnal Kedokteran Komunitas
Tabel 3. Rata-Rata Nilai Skoring dan Presentase Kerusakan Lamela Insang Ikan Zebra Kerusakan Rata-rata nilai Perlakuan Persentase skoring ± Standar (%) Deviasi 0,9333 ± K0 (kontrol) 21.33 0,24221a 1,1333 ± P1 24 0,10328a,b 1,4000 ± P2 25,33 0,17889b Persentase kerusakan akibat nekrosis tertinggi pada perlakuan P2 dengan nilai 25,33% sedangkan kerusakan terendah pada perlakuan kontrol dan sebesar 21,33%, sedangkan pada P1 sebesar 24%. Data hasil kerusakan kemudian dianalisis secara statistik dengan uji Oneway Anova dan terjadi perbedaan signifikan pada P2 dengan kontrol. Perlakuan kontrol (K0) ikan zebra tanpa pemberian paparan ramuan kombinasi dekokta herbal menunjukkan lamela insang mengalami hiperplasia. Kerusakan akibat hiperplasia pada perlakuan kontrol (K0) dapat dilihat pada gambar 1.
Volume 3, Nomor 1, Desember 2015
Gambar 2. Gambaran mikroskopis lamela ikan zebra pada kelompok P1 dengan pewarnaan HE perbesaran 1000x. Lamela yang mengalami hiperplasia ditunjukkan dengan anak panah. Pada gambar 3, terlihat bahwa perlakuan dengan pemberian paparan ramuan kombinasi dekokta herbal selama 14 hari dengan dosis 1864 mg/L ( P2 ) dapat menyebabkan hiperplasia yang lebih kuat secara signifikan dibanding K0.
Gambar 3. Gambaran mikroskopis lamela ikan zebra pada kelompok P2 dengan pewarnaan HE perbesaran 1000x. Lamela yang mengalami hiperplasia ditunjukkan dengan anak panah.
Gambar 1. Gambaran mikroskopis lamela ikan zebra pada kelompok kontrol dengan pewarnaan HE perbesaran 1000x. Lamela yang mengalami hiperplasia ditunjukkan dengan anak panah. Perlakuan dengan pemberian paparan ramuan kombinasi dekokta herbal selama 14 hari dengan dosis 932 mg/L (P1) menunjukkan lamela mengalami hiperplasia dapat dilihat pada gambar 2.
Page | 4
Rata-rata kerusakan
Ardita Nadia Putri,Uji Toksisitas Subkronik Dekokta Kombinasi Imperata cylindrica
1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
b a
a,b
K0
P1
P2
Kelompok Perlakuan
Gambar 4. Histogram hiperplasia lamela insang Danio rerio setelah diberi pajanan 14 hari PEMBAHASAN Penelitian ini menggunakan hewan coba Danio rerio berjenis kelamin jantan, berusia 3 bulan dalam kondisi sehat ditandai dengan gerakan berenang aktif. Jumlah sampel sebanyak 18 ekor dan dibagi dalam 3 kelompok perlakuan. Hewan coba Danio rerio dipilih karena berpotensi sebagai bioindikator pada uji toksisitas, mudah dalam perawatan,14 dan memiliki respon yang sensitif terhadap toksisitas obat yang diberikan.15 Sebelum diberikan paparan dilakukan fase adaptasi selama 3 hari. Hal ini dimaksudkan agar hewan coba dapat menyesuaikan diri dengan lingkungan eksperimen. Hewan coba Danio rerio diberikan pajanan akar Imperata cylindrica, daun Gynura procumbens dan daun Syzygium polyanthum dengan dosis 932 mg/L dan dosis 1864 mg/L. Paparan ini diberikan selama 14 hari. Efek Dekokta Kombinasi Akar Imperata cylindrica, Daun Gynura procumbens, dan Daun Syzygium polyanthum terhadap Hiperplasia Lamela Insang Ikan Zebra (Danio rerio) Pemberian dekokta kombinasi IGS pada dosis 932 mg/L (0,24221 ± 0,594 mg/L) dapat menyebabkan hiperplasia pada lamela insang Danio rerio tetapi tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dibandingkan kelompok kontrol (0,10328± 0,647 mg/L) (Tabel 1 dan Gambar 2). Sedangkan pada paparan dosis 1864mg/L jumlah hiperplasia lamela insang terjadi peningkatan
signifikan (0,17889 ± 0,608 mg/L). Persentase jumlah peningkatan hiperplasia lamela insang ini tergolong ringan. Berdasarkan penelitian Anggara (2014) nilai Lethal Concentration (LC50) dekokta kombinasi akar alang-alang, daun sambung nyawa dan daun salam selama 96 yaitu 5,680 mg/ml dengan konversi 5680 mg/L yang tergolong dalam ketoksikan ringan. Selain itu, pada penelitian Putry (2015) dan Lathifa (2015) dekokta kombinasi akar alangalang, daun sambung nyawa dan daun salam dalam dosis dan jangka waktu yang sama dapat menyebabkan nekrosis ringan terhadap sel hepatosit ikan zebra dan perubahan pola renang. Pada gambaran histologis, Insang terdiri atas lamela primer yang terbentuk dari dua garis memanjang dan lamela sekunder. Lamela Sekunder tersusun atas lapisan halus dan pipih. Lapisan ini tersusun atas dua epitel yang dipisahkan oleh sel pilar. Pada celah antar epitel ini terdapat pembuluh darah. Pembuluh darah ini menghubungkan pembuluh aferen dan eferen yang berjalan di sepanjang lamela primer.16 Insang berperan sebagai organ respirasi, osmoregulasi dan ekskresi10. Dekokta campuran IGS yang dipaparkan pada hewan coba ini akan masuk melalui lamela primer kemudian akan didistribusikan ke lamela sekunder untuk pertukaran O2.17 Zat aktif yang terkandung dalam ramuan ini akan ikut tersaring oleh lamela sekunder.18 Jika zat ini bersifat toksik, maka lamela insang akan melakukan respon adaptif untuk mengeluarkan toksikan. Respon ini berupa peningkatan mukus yang akan terakumulasi pada ujung lamela. Jika jumlah mukus yang terakumulasi terlalu banyak, maka akan memperberat kerja insang. Insang akan melakukan kompensasi ddengan cara menambah jumlah sel pada lamela yang dikenal dengan hiperplasia.19 Ketika fungsi lamela terganggu, maka akan terjadi gangguan pada sistem organ yang lain. Karena proses pertukaran O2 dengan CO2 pun akan terganggu. Faktor-faktor yang mempengaruhi kerja zat adalah dosis dan paparan berulang. Dosis yang berlebih dan paparan berulang berpotensi menyebabkan kerusakan pada organ tubuh, contohnya renal yang berfungsi sebagai organ
5 | Page
Jurnal Kedokteran Komunitas
ekskresi. Kerusakan pada sel-sel renal akan dapat mengganggu fungsi organ tersebut. Akar Imperata cylindrica, daun Gynura procumbens dan daun Syzygium polyanthum mengandung zat aktif seperti flavonoid, fenol, tannin, terpenoid dan quercetin3,4,5. Dalam dosis terapi, zat aktif tersebut berkhasiat untuk menurunkan tekanan darah3, selain itu dapat berperan sebagai antioksidan alami yang melindungi sistem biologis dan menghambat oksidasi sel dengan cara mereduksi, menangkap oksigen aktif dan radikal bebas, terutama superoksida20. Selain itu juga terdapat zat aktif lain yang dikenal toksik yaitu p-hydroxybenzoic dan saponin.6,7 Toksikan yang terserap melalui insang Danio rerio seperti p-hydroxybenzoic dapat mengakibatkan penurunan fungsi mitokondria yang akan menyebabkan deplesi ATP di dalam insang. Dari kejadian tersebut, maka terjadi penumpukan jumlah ion Ca++ yang akan memicu aktivasi sinyal transduction pathway dan penumpukan mukus sebagai perlindungan insang terhadap penumpukan ion Ca++ 21,22 dan sebagai respon sitotoksik yang disebabkan oleh saponin. Aktivasi sinyal transduction pathway akan meningkatkan proliferasi sel lalu terjadi hiperplasia.6,23,24 Pada hasil penelitian didapatkan bahwa semua kelompok perlakuan mengalami perubahan histopatologi berupa hiperplasia lamela insang dengan nilai rata-rata kerusakan setiap kelompok <50%. Berdasarkan hasil analisa data, terdapat perbedaan secara signifikan pada dosis 1864 mg/L dengan tingkat kerusakan sel lamela insang Danio rerio dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif. Kerusakan sel berbanding lurus dengan peningkatan dosis dekokta kombinasi IGS. KESIMPULAN Berdasarkan hasil analisa data dan pembahasan pada penelitian ini dapat disimpulkan bahwa: Pemberian pajanan secara subkronik dekokta kombinasi Imperata cylindrica, Gynura procumbens dan Syzygium polyanthum pada 1864 mg/L dapat menyebabkan hiperplasia sel lamela insang Danio rerio yang lebih kuat dibanding kontrol negatif dan P1 (932 mg/L), namun kerusakan ini masih tergolong ringan.
Page | 6
Volume 3, Nomor 1, Desember 2015
SARAN Untuk meningkatkan dan mengembangkan penelitian lebih lanjut, peneliti menyarankan : 1. Perlu dilakukan uji toksisitas dekokta kombinasi Imperata cylindrica, Gynura procumbens dan Syzygium polyantuhum terhadap organ lain pada Danio rerio. 2. Perlu dilakukan uji toksisitas kronik dekokta kombinasi akar Imperata cylindrica, Gynura procumbens dan Syzygium polyanthum DAFTAR PUSTAKA 1. Kepmenkes. Kebijakan Obat Tradisional Nasional, 2007. 2. Zhang, Xiaorui. WHO Traditional Medicine 2002-2005. Geneva, 2002 .http://www.wpro.who.int/health_tech nology/book_who_traditional_medicin e_strategy_2002_2005.pdf, (diakses 14 Mei 2014) 3. Mursito, B. Tampil Percaya Diri dengan Ramuan Tradisional. Jakarta: Penebar Swadaya, 2000 4. Suganda, A., Sudiro, I., and Ganthina. Skrining Fitokimia dan Asam Fenolat Daun Dewa (Gynura procumbens (Lour) Merr), Simposium Penelitian Tumbuhan Obat III, Universitas Indonesia, Jakarta, 1988 5. Lelono, R.A.A., S. Tachibana and K. Itoh. In vitro Antioxidative Activities And Polyphenol Content of Eugenia polyantha Wight Grown in Indonesia. Pak. J. Biol. Sci. 12 (2009) 1564-1570. 6. Podolak I, Galanty A, Sobolewska D. Saponins as cytotoxic agents, a review. Phytochem Rev 9 (2010) 425-474. 7. Herdy WW. Efek diuretik infus akar alang-alang (Imperata cylindrica) pada tikus putih betina, 2003 http: //isjd.pdii.lipi.go.id (diakses 10 Mei 2014). 8. Hidayatulloh, M. dan N. Susilaningsih. Uji Toksisitas Subkronis Ekstrak Valerian (Valeriana officinalis) Terhadap Ginjal Tikus Wistar, Skrpsi S-1, Semarang: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, 2010 9. John H. Postlethwait, et al. Zebrafish Comparative Genomics and the Origins
Ardita Nadia Putri,Uji Toksisitas Subkronik Dekokta Kombinasi Imperata cylindrica
10.
11.
12. 13. 14.
15.
16.
17.
of Vertebrate Chromosomes. Genome Research 10 (2000) 1890-1902 Pung PH, Ming YC. Zebrafish As An Animal Model To Study Ion Homeostasis. Pflugers Arch, 465 no. 9 (2000) 1244-1247 Yusuke Ito , Akira Kato , Taku Hirata , Shigehisa Hirose , Michael F. Romero. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. American Journal of Physiology Vol. 306 no. 5 (2013) 315-327 Surat Al-Maidah ayat 32. Al-Qur’an Ronald JR. Fish Pathology. 4th Edition. Hoboken: Wiley-Blackwell; 2012, 72 Barney, R., Maggy, J. Guidance on the housing and care of zebra fish Danio rerio. 2011 Rubinstein, Amy L. Zebrafish assay for drug toxicity screening. Ashley Publication. Atlanta, 2006, 231-232. Joseph AH, Lester JL, Jennifer LM. The Zebrafish: Atlas of Macroscopic and Microscopic Anatomy. New York: Cambridge University Press, Chapter 5, Respiratory System , 2012. 68-74 Steve P, Marc E, Anthony F, Colin B. Fish Physiology: Zebrafish. London: Academic Press; 2010. 291-299
18.
19.
20. 21.
22.
23.
Steve P, Marc E, Anthony F, Colin B. Fish Physiology: Zebrafish. London: Academic Press; 2010. 315-323 Irawan, Indra. (2011), “Efek Pemaparan Copper Sulfat (CuSO4) Terhadapat Daya Tetas Telur, Perubahan Histopatologik Insang Larva Ikan Zebra (Brachydanio rerio)” Journal of Tropical Fisheries (2011) 6(2): 588 – 592 Day L, Shikuma C, Gerachenson M. Mithochondrion. 4. 2004. 95-109. Khaerunnisa ST. Pemanfaatan senyawa bioaktif dari akar alang-alang (imperata cylindrica) sebagai bahan anti oksidan. 2010 http://alumni.unair.ac.id/kumpulanfile/ 512828115_abs.pdf (diakses 10 Mei 2014). Sudarsono, Gunawan, D., Wahyuono, S., Donatus, IA., Purnomo., Tumbuhan Obat II, Hasil Penelitian, Sifat-sifat dan Penggunaan, Pusat Studi Obat Tradisional, Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada, 2002. 96-100. Matsunaga, K., Shibuya, M., Ohizumi, Y. Cylindrene, a novel sesquiterpenoid from Imperata cylindrica with inhibitory activity on contractions of vascular smooth muscle. J Nat Prod , 57(8), (1994) 1183-1184
7 | Page
