APPENDIKS A PROSEDUR KERJA DAN ANALISA

APPENDIKS A PROSEDUR KERJA DAN ANALISA 1. Pembuatan sodium Sitrat (C6H5Na3O7 2H2O) 0,1 M 1. Mengambil dan menimbang sodium sitrat seberat 29.4 gr. 2. Melarutkan dengan aquades hingga volume 1000 ml. 2. Pembuatan asam sitrat (C6H8O7) 0,1 M 1. Mengambil dan menimbang asam sitrat seberat 19.2 gr. 2. Melarutkan dengan aquades hingga volume 1000 ml. 3. Prosedur pembuatan larutan buffer sitrat 0,1 M pH 5,5 1. Mencampurkan 152 ml larutan asam sitrat 0,1 M dengan 848 ml larutan sodium sitrat 0,1 M. 2. Mengecek pH dengan pH universal untuk mendapatkan pH 5,5 dengan menambahkan larutan asam sulfat (1N) atau larutan sodium hidroksida (1N). 4. Prosedur pembuatan media pertumbuhan untuk Trichoderma reseei 1. Menimbang 1.95 gr PDA dan melarutkan dalam 50 ml aquades. 2. Memanaskan dan mengaduk larutan hingga jernih seperti minyak 3. Menuangkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml 4. Mensterilisasi dalam autoclave pada T=121 oC selama 10 menit 5. Mendinginkan tabung reaksi dalam posisi miring 5. Prosedur regenerasi bakteri Trichoderma reseei 1. Mengambil tabung reaksi yang berisi media agar miring PDA 2. Menginokulasikan bakteri Trichoderma reseei dengan kawat ose ke dalam media agar tersebut. 3. Menginkubasi dalam inkubator pada T=32 oC selama 7 hari

6. Prosedur Persiapan dedak gandum 1. Memilih dedak gandum yang berwarna coklat terang 2. Menghaluskan menggunakan mortar 3. Mengayak menggunakan screener 40 mesh 7. Prosedur pembuatan media fermentasi enzim 1. Menimbang 1 gram MgSO4.7H2O, 1.5 gram KH2PO4, 0.15 gram CaCl2, 0.2 gram FeSO4, 0.2 gram MnSO4, 2 gram yeasts ekstrak dan 5 gr xilan oat spelt. 2. Menambahkan larutan buffer sitrat pH 5,5 hingga volume 1 liter. 3. Mengaduk dengan pengaduk magnet hingga homogen. 4. Melakukan sterilisasi menggunakan autoclave pada T=121 oC selama 10 menit. 8. Membuat enzim kasar 1. Menimbang 10 gr dedak gandum 40 mesh dan memasukannya kedalam erlenmeyer 500 ml 2. Menambahkan 25-30 ml media fermentasi 3. Mensterilisasi dengan autoclave pada T=121 oC selama 10 menit 4. Menginokulasi T.reseei sebanyak 2 cm2 dalam erlenmeyer yang berisi dedak gandum dan media fermentasi. 5. Menginkubasikan substrat dedak gandum dan larutan garam mineral yang berisi suspensi jamur pada inkubator pada suhu suhu 32 C selama 7 hari 6. Media fermentasi yang telah ditumbuhi jamur ditambahkan dengan 100 ml larutan Buffer sitrat pH 5,5 yang mengandung 0,1 % Tween-80 kemudian mengocok pada orbital shaker pada 175 rpm selama 135 menit

A-2

7. Melakukan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 1 jam untuk mendapatkan cairan enzim (supernatant). 8. Melakukan filtrasi dengan menggunakan kertas saring untuk memisahkan filtrat dengan mycelia beserta endapan media di dalamnya. 9.

10.

11.

Membuat larutan Xilan 0,5% 1. Menimbang 0,5 gr xilan oat spelt dan melarutkan dalam 80 ml aquades 2. Memanaskan dan mengaduk pada suhu 60 oC 3. Mengaduk larutan selama 24 jam hingga homogen Membuat reagen DNS (Miller, 1959) 1. Larutkan 8 gr NaOH dalam 100 ml aquades, dan stirrer hingga benar-benar terlarut sempurna. 2. Larutkan 15 gr sodium potassium tartrate dan 4 gr sodium metabisulfit ke dalam 250 ml aquades. 3. Campurkan kedua larutan, 5 gr DNS dan aquades dengan penambahan keseluruhan komponen harus sedikit demi sedikit hingga volume 500 ml. Membuat larutan Xilose 0.03 M 1. Menimbang 0.45 gr D-Xylose 2. Mengencerkan dalam 100 ml buffer sitrat 3. Mengaduk dengan stirer hingga homogen

12. Prosedur pembuatan kurva larutan standar xilosa untuk uji aktifitas enzim xilanase 1. Mengambil 100 ml larutan substrat xilosa 0,03 M. 2. Mengencerkan larutan standar xilose pada berbagai macam konsentrasi (1 :2 , 1 :3 , 1 :4 , 1 :5, dst) dengan penambahan buffer sitrat pH 5,5

A-3

3. Mencampurkan 0,2 ml larutan standar xilose pada berbagai macam pengenceran dengan 1,8 ml larutan xilan 0,5% 4. Menginkubasi larutan pada T 35 oC selama 10 menit 5. Memanaskan dalam air mendidih selama 10 menit 6. Mendinginkan dalam es batu 7. Menambahkan 1 ml aquades 8. Mengukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm 13. Prosedur pretreatment mekanik Bahan baku (Douglas,1988) 1. Mengeringkan bahan baku selama 24 jam pada sinar matahari hingga kering. 2. Mengoven bahan baku pada suhu 100oC selama 2 jam 3. Memotong-motong dengan ukuran 1 cm. 4. Menggiling hingga halus menggunakan mortar atau milling. 5. Mengayak dengan screener lolos ukuran 100 mesh. 14. Pembuatan larutan NaOH 1 %. 1. Menimbang 1 gr NaOH ke dalam aquades sampai volume 100 ml. 2. Mengaduk hingga homogen. 15. Prosedur alakaline pretreatment (pretreatment kimiawi) (Mosier, 2005) 1. Menimbang 5 gram bahan baku 100 mesh 2. Menambahkan larutan NaOH 1 % sebanyak 100 ml 3. Memanaskan larutan pada 70-80 oC selama 6 jam disertai pengadukan dan disertai pendingin (condenser). 4. Menyaring dan mencuci larutan substrat bahan baku dengan aquades hingga larutan substrat mencapai pH 7 5. Mengeringkan dengan oven suhu 100 oC selama 3 jam

A-4

16. Pembuatan larutan kalium dikromat 0,5 N 1. Menimbang padatan kalium dikromat sebanyak 24,54 g. 2. Melarutkan padatan kalium dikromat dengan aquades sampai 1 L. 17. Pembuatan larutan ferro ammonium sulfat (FAS) 0,1 N 1. Menimbang padatan Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O sebanyak 40,5 gram. 2. Melarutkan padatan FAS dengan aquades dan ditambahkan 10 ml larutan asam sulfat pekat sampai volume total 1 L. 18. Pembuatan larutan asam sulfat 3 N 1. Memipet larutan asam sulfat pekat sebanyak 83,5 ml. 2. Mengencerkan larutan asam sulfat pekat sampai mencapai volume total 1 L. 19. Analisa kadar Hemiselulosa (Ramirez,1988) 1. Menimbang sebanyak 1,5 gr Bahan Baku dan memasukkan dalam beaker glass 300 ml. 2. Menambahkan 75 ml larutan NaOH 17,5%, dan langsung mencatat waktu penambahan NaOH 17,5% tersebut. 3. Mengaduk dengan stirrer hingga Bahan Baku terdispersi dalam larutan. 4. Ketika Bahan Baku telah terdispersi seluruhnya, dilanjutkan dengan mengangkat stirrer lalu membilasnya dengan 17,5% NaOH sehingga volume reagen NaOH total yang ditambahkan tepat 100 ml. 5. Setelah 30 menit dari waktu penambahan 17,5% NaOH awal, menambahkan 100 ml aquades lalu mengaduk dengan batang pangaduk. 6. Membiarkan larutan dalam beaker glass selama 30 menit, sehingga didapat total waktu ekstraksi adalah 60 menit. 7. Di akhir waktu 60 menit, mengaduk larutan lalu menyaring dengan kertas saring, membuang 10-20 ml A-5

filtrat awal, mengumpulkan kira-kira 100 ml filtrat awal dalam erlenmeyer, dan jangan membilas Bahan Baku dengan air. 8. Memipet 50 ml filtrat Bahan Baku dan menambahkan 50 ml H2SO4 3 N. 9. Memanaskan larutan dalam waterbath bersuhu 70-90 oC selama beberapa menit untuk mengkoagulasi betaselulosa, lalu membiarkan endapan dalam larutan mengendap selama semalam (24 jam). 10. Memipet 50 ml larutan jernih hasil presipitasi pada langkah 2, dan menambahkan 10 ml K2Cr2O7 0,5 N lalu menambahkan secara hati-hati 90 ml H2SO4 98%. Membiarkan larutan menjadi panas selama 15 menit. 11. Menambahkan 50 ml aquades dan mendinginkan hingga mencapai temperatur ruangan. Menambahkan 2-4 tetes indikator ferroin lalu menitrasi dengan larutan ferrous ammonium sulfat hingga larutan berubah warna menjadi ungu kecoklatan. 12. Melakukan titrasi blanko dengan mengganti filtrate dengan 12,5 ml NaOH 17,5% ; 12,5 ml aquades dan 25 ml H2SO4 3 N. 13. Menghitung Kadar Hemiselulosa dengan rumus: % Hemiselulosa = Dimana : V4 : volume titrasi filtrat jerami padi setelah presipitasi (ml). V3 : volume titrasi blanko (ml). N : normalitas dari larutan ferrous ammonium sulfat. W : berat dari jerami padi yang digunakan (gram). A : volume filtrat jerami padi yang digunakan (ml). 6,85 : 1 miliequivalent selulosa

A-6

20. Prosedur pembuatan kurva larutan standar xilosa untuk pengukuran konsentrasi xilosa 1. Mengambil 100 ml larutan substrat xilosa 0.03 M. 2. Mengencerkan larutan standar xilose pada berbagai macam konsentrasi (1 :2 , 1 :3 , 1 :4 , 1 :5, dst) dengan penambahan buffer sitrat pH 5.5 hingga volume total 2ml 3. Menginkubasi larutan pada T 35oC selama 10 menit 4. Memanaskan dalam air mendidih selama 10 menit 5. Mendinginkan dalam es batu 6. Menambahkan 1 ml aquades 7. Mengukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm 21. Prosedur degradasi enzimatis 1. Menyiapkan 5 gr bahan baku 100 mesh dari prosedur 14. 2. Menambahkan enzim xilanase sebanyak 2.66 ml/gr (4.177 IU/ml). 3. Menambahkan larutan buffer pH 5.5 sebanyak 100 ml hingga substrat bahan baku terendam. 4. Memanaskan hingga suhu 50 oC selama 120 menit. 5. Mengambil larutan sebanyak 2 ml dan melakukan analisa DNS 6. Menghitung gula yang terbentuk melalui harga absorbansi larutan. 22. Prosedur pembiakan strain Pichia stipitis pada agar miring. 1. Menyiapkan media agar miring dengan melarutkan yeast ekstrak 5 gram, pepton 10 gram, glukosa 20 gram dan bacto agar 16 gram ke dalam 1 L aquades. 2. Menuangkan ke dalam tabung reaksi 5 ml. 3. Mensterilisasi larutan kedalam autoclave, kemudian mendinginkan dengan posisi miring. 4. Menginokulasikan strain Pichia stipitis dan menginkubasikan pada suhu 350C selama 5 hari. A-7

23. Pembuatan kurva standar sel Pichia stipitis. 1. Menumbuhkan yeast Pichia stipitis ke dalam media agar plate yang telah disterilisasi dan mengandung 10 g/L yeast ekstrak, 20 g/L pepton, 20 g/L xilosa dan 20 g/L agar. Mikroorganisme ditumbuhkan pada suhu 35 oC selama 3 hari. 2. Koloni pada agar plate dipindahkan ke dalam media filter-sterilized yang mengandung 1,7 g/L yeast nitrogen base (tidak mengandung asam amino dan ammonium sulfat), 2,27 g/L urea, 6,56 g/L pepton dan 20 g/L xilosa. Koloni ditumbuhkan selama 1 hari. 3. Sel disentrifugasi pada 5000 rpm selama 15 menit dan supernatant dipisahkan dari sel. 4. Mensentrifugasi kembali untuk menghilangkan nutrient yang tersisa dengan menambahkan aquades pada 5000 rpm selama 15 menit. 5. Sel diambil dan dikeringkan pada suhu 100 oC selama 4 jam. 6. Melarutkan sel dengan aquades dengan konsentrasi 1 g/L sampai dengan konsentrasi 10 g/L. 7. Mengukur absorbansi larutan sel dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm terhadap larutan blanko, dimana dalam hal ini larutan blanko adalah aquades. 8. Membuat kurva standar sel Pichia stipitis antara konsentrasi sel terhadap absorbansi. 24. Penghitungan konsentrasi sel Pichia stipitis. 1. Menumbuhkan yeast Pichia stipitis ke dalam media agar plate yang telah disterilisasi dan mengandung 10 g/L yeast ekstrak, 20 g/L pepton, 20 g/L xilosa dan 20 g/L agar. Mikroorganisme ditumbuhkan pada suhu 30 oC selama 3 hari. 2. Koloni pada agar plate dipindahkan ke dalam media filter-sterilized yang mengandung 1,7 g/L yeast nitrogen base (tidak mengandung asam amino dan ammonium A-8

3. 4. 5.

6.

sulfat), 2,27 g/L urea, 6,56 g/L pepton dan 20 g/L xilosa. Koloni ditumbuhkan selama 1 hari. Sel disentrifugasi pada 5000 rpm selama 15 menit dan supernatant dipisahkan dari sel. Sel ditimbang dan disuspensi dengan aquades steril. Mengukur konsentrasi sel dengan mengukur absorbansi larutan sel dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm terhadap larutan blanko, dimana dalam hal ini larutan blanko adalah aquades. Membandingkan dengan kurva standar untuk mendapatkan konsentrasi sel.

25. Prosedur boiling & overliming pretreatment (Nigam,2001) 1. Menyiapkan 100 ml larutan hasil degradasi pada prosedur no.21 pada erlenmeyer 250 ml. 2. Menambahkan beberapa tetes larutan Ca(OH)2 2 N hingga larutan mencapai pH 10. 3. Memanaskan hingga mendidih selama 15 menit. 4. Menyaring endapan yang terbentuk menggunakan kertas saring. 5. Menambahkan beberapa tetes larutan asam sulfat 2 N hingga larutan mencapai pH 5.5. 26. Prosedur pembuatan nutrient untuk fermentasi 1. Menimbang 1.7 gr yeast extract, 2.27 gr urea, dan 6.56 gr pepton. 2. Melarutkan dalam 20 ml aquades. 3. Mengaduk larutan hingga homogen 27. Prosedur fermentasi xilosa dengan Pichia stipitis (Agbogbo, 2007) 1. Mengambil 100 ml larutan substrat yang mengandung xilosa kedalam erlenmeyer 250 ml. 2. Menambahkan 2 ml nutrient ke dalam larutan substrat A-9

3. Melakukan sterilisasi alat dan bahan di dalam autoclave 4. Menambahkan 14 ml inokulum strain Pichia stipitis dengan berat sel tertentu ke dalam substrat 5. Menginkubasi pada suhu 350C selama 8 hari pada inkubator air shaker dengan kecepatan 100 rpm. 6. Setelah fermentasi selesai, cairan disentrifuge dan disaring untuk mendapatkan filtratnya. Cairan dianalisa kadar etanol dan xilosanya.

A-10