Allergen Standardization and Major Allergens Myth or Reality?

Allergen Standardization and Major Allergens – Myth or Reality? VÁCLAV ŠPIČÁK Dětské oddělení FN Na Bulovce, Praha Subkatedra AKI IPVZ Praha

SOUHRN Autor komentuje současné problémy standardizace alergenových extraktů a hodnotí význam i úlohu stanovení hlavních alergenů v kvalitě standardizace. Poznání hlavních alergenů je důležité pro pochopení alergenové zkřížené reaktivity. Hlavní alergeny mají zásadní význam pro kvalitu alergenových vakcín. Klíčová slova: standardizace alergenových extraktů, hlavní alergeny SUMMARY Actual problems of the allergen standardization and the importance of the determination of major allergens are discussed. Major allergens play the essential role in the cross-reactivity.The measurement of the major allergens has an important position in the quality of allergen vaccines. Key words: allergen standardization, major allergens

Alergenová imunoterapie má za sebou více než 100 let života. První imunizační návrh podal v prvním roce 20. století H. Curtis a o deset let později publikoval Noon první výsledky (7). Jeho práce (1911) je již dávno zařazena do zlatého fondu alergologické literatury. Prvním předpokladem úspěšné imunoterapie bylo a stále je poznání alergenu. Přelomem v tomto směru byly práce Marshovy, který první navrhl nomenklaturu alergenů založenou na prvních definovaných ukazatelích (2). Obraz alergenu jako blíže nedefinovaného biologického materiálu posunul k přesnější charakteristice antigenně účinné látky. Následně se pak poprvé objevuje pojem hlavní alergen. ALERGEN je definován jako antigen navozující přecitlivělost založenou na imunologickém mechanismu. Dnes dodáváme – IgE zprostředkovaném. Názvosloví alergenů se postupně opírá o: – biochemické separační postupy a určení biologicky nejaktivnější frakce,

– purifikaci extraktů a jejich biologickou odpověď v kožních testech (90% pozitivita prick-testu hlavního alergenu), – techniku využití monoklonálních protilátek, určení aminokyselinových sekvencí a sekvencí z DNA klonů. Vývoj v tomto směru není ukončen. V roce 1986 tvořilo skupinu prvních 26 definovaných alergenů, dnes se počítají na stovky. Zařazení do nomenklatury předpokládá: 1. Definici strukturálních molekulových vlastností: – purifikaci alergenového proteinu, – stanovení molekulární hmotnosti a podílu uhlovodanů, – určení nukleotidových a aminokyselinových sekvencí, – přípravu monospecifických monoklonálních protilátek. 2. Průkaz IgE zprostředkované reakce: – minimum vyšetření u 50 alergických jedinců vyjadřuje prevalenci specifických IgE protilátek, – biologickou účinnost potvrdí kožní testy, stanovení histaminu ze žírných buněk či reakce bazofilů, – vazebná aktivita IgE po depleci alergenu z alergenové vakciny, – srovnání vazebné aktivity IgE u alergenů přírodních a rekombinantních. Hlavním alergenem je označen alergen, na nějž reaguje specifickou IgE protilátkou více než 50 % jedinců, kteří jsou na tento alergenový druh přecitlivělí. Alergeny kompletní jsou alergeny spouštějící tvorbu specifické IgE protilátky a současně jsou biologicky účinné; Nekompletní alergeny jeví pozitivitu v kožním testu, ale negativitu ve specifickém IgE; Nerelevantní alergeny vykazují pozitivní specifickou IgE protilátku, ale dávají negativní kožní test. Jsme tedy trvale svědky existence řady různých molekulárních forem. Za isoalergen považujeme alergen pocházející z jediného druhu, který má s dalším alergenem podobnou molekulární velikost, identické biologické vlastnosti a více než 67% identitu aminokyselinových sekvencí (jeden z projevů zkřížené reaktivity). K tomu, aby se bílkovinná látka stala alergenem, je třeba souhry více faktorů. Na příkladu pylů je možno uzavřít, že protein se stává alergenem, když se dostává na slizniční povrch v dostatečném množství. Hraje tu roli rychlost solubility alergenu. Některé alergeny se prezentují T buňkám snadněji. Například jsou to alergeny, které se vyznačují enzymatickou aktivitou a snadnějí prostupují slizniční bariérou. Důležitou úlohu hrají vzájemně se překřižující senzibilizační účinky, jak o tom na jiném místě píše M. Fuchs. Konečně význam mají i podpůrné faktory zevního prostředí, kde na prvním místě je třeba zmínit pasivní kouření dětí i dospělých, vliv NO2 i jiných chemických škodlivin a působení virových infekcí (1, 8, 10, 11, 12). Všechna tato hlediska je třeba vnímat a respektovat v naší diagnostické i terapeutické praxi a musí k nim přihlížet i výrobci alergenových extraktů. Stará praxe založená na empirii se přesouvá k medicíně založené na důkazech. V roce 1993 publikovala EAACI svá doporučení ke specifické alergenové imunoterapii a odstartovala řešení standardizačního programu alergenových produktů. V lednu 1997 zasedá v Ženevě expertní mezinárodní panel a v roce 1998 vydává WHO „Position Paper - Allergen Immunotherapy: Therapeutic vaccines for allergic diseases“ (14). Jednou z klíčových kapitol tohoto dokumentu je standardizace alergenových extraktů. Ve svém podání se nás snaží poučit na toto téma R. Hochová (viz Diskusní fórum str. 162). Zdá se však, že některá důležitá hlediska opomíjí.

Alergenový extrakt byl definován jako přípravek získaný extrakcí účinné látky ze zvířecího nebo rostlinného materiálu pomocí vhodného rozpouštědla. Standardizace alergenové vakcíny se opírá o stanovení celkové alergenní účinnosti a síly, o určení biologické účinnosti a o stanovení obsahu hlavních alergenů. K tomu slouží několik metod výrobci alergenů různě využívaných (sIgE, prick-test, inhibice RAST, ELISA techniky, monoklonální protilátky, určení složení). Požadavky na standardizovaný alergenový extrakt lze velmi stručně shrnout do několika bodů (11): 1. definice suroviny, specificita zdroje alergenu, 2. surovina není kontaminována jiným alergenem ani jinou látkou, 3. spektrum hlavních alergenů je přítomno, 4. obsah alergenů je změřen a standardizován, 5. koncentrace hlavního alergenu(ů) je určena, pokud je to dostupné, 6. ověření biologické aktivity extraktu je provedeno. Nejstručnější definice standardizovaného alergenového extraktu = extrakt se známým složením.

Výstupy pro správnou alergologickou praxi 1. Forma aplikace alergenové vakciny Nejobvyklejším standardním podáním je forma injekční. Má výhodu v jistotě, kterou máme při jejím podání, v možnosti jednoduché kontroly spolupráce pacienta. V pediatrické praxi je velmi oblíbené podání sublinguální. Stále více se o něm diskutuje i pro praxi u dospělých. Problémem je udržet aktivní dlouhodobou spolupráci rodičů i pacienta. Přibývá kontrolovaných studií o účinnosti této formy. Dávkování alergenu musí být ve srovnání s injekční formou významně vyšší. Dřívější, u nás velmi často používané, podání per os je nepřijatelné. Při sledování farmakokinetiky značeného alergenu (Parietaria - Par j 1) se potvrdilo, že nedochází k žádnému přímému vstřebání alergenu sliznicí gastrointestinálníhom traktu. Plasmatická radioaktivita se ukazuje až po spolknutí alergenu. Kromě toho alergen zůstával na sliznici velmi dlouhou dobu. Modifikovaný alergen (alergoid) byl detekován v plazmě beze změn (5). 2. Počet alergenů pro úspěšnou vakcinoterapii a dávkování Cílem je posunout alergenovou imunoterapii na místo první volby léčby alergie. Nejběžnější zdroje senzibilizace – roztoči, pyly, kočka - tvoří 10 - 30 různých molekul, které mají vazebnou schopnost k IgE alespoň u některých pacientů. Proto znalost hlavních alergenů je nezastupitelná. Při běžné imunoterapii je koncentrace 10µg hlavního alergenu v jedné dávce potřebná pro dosažení účinku. Mnoho alergenů není v extraktech přítomno v dostatečné koncentraci. Jsou mezi nimi i důležité rozdíly. Například u roztočů koncentrace Der p 2 může být v extraktech 5 - 10x nižší než Der p 1 (a to z bezpečnostních důvodů k zamezení nežádoucí reakce na Der p 1) (10). Dávkování musí vycházet samozřejmě z individuální situace u každého pacienta. Americká FDA schválila například účinný rozsah dávkování pro některé alergeny (4): – Ambrosie: 6 – 24 µg Amb a 1 – Kočka: 11-17 µg Fel d 1 – Dermatophagoides: 7 – 12 µg Der p 1 – Trávy: 7 – 20 µg Gp 5 – Hmyzí jed: 50 – 100 µg Každý výrobce by měl u hlavních a nejčastěji užívaných alergenových extraktů doložit i kvalitativní výchozí základ extraktu v podobě hlavního alergenu. Přibývá kontrolovaných studií, které u jednotlivých výrobců dokládají účinnost, bezpečnost produktů a

dokládají také kumulativní dávky hlavních alergenů, použitých při přípravě alergenového extraktu. Používané vnitropodnikové domácí referenční standardy se tak opírají o přesně definovaný základ. Příkladem je prospektivní studie U. Wahna a spol. s extrakty Dermatophagoides pteronyssinus, v nichž kumulativní dávka Der p 1 byla 98,9 µg a 76,7µg (13). Mezi studiemi se sublingualním podáním lze uvést kontrolovanou dvojitě zaslepenou studii C. Andrého a spol. u pacientů se sezónní alergickou rýmou, v níž výrobní standard indexu reaktivity (100 IR) s pozitivitou kožního prick testu (pupen 7mm) odpovídal obsahu hlavního alergenu 70 µg Amb a 1. Šlo o srovnávací studii s tabletovou formou, v níž jedna tableta 100 IR obsahovala 160µg Amb a 1 (3). Hlavní dovozci alergenových extraktů do ČR splňují současné náročné směry specifické alergenové imunoterapie a dokládají své přípravky kontrolovanými studiemi. Přáli bychom si, aby tomu tak bylo i u našeho domácího výrobce, u něhož tradice výroby alergenů začala dříve než u mnohých výrobců zahraničních. V Evropské unii, která se rozšiřuje, zatím neexistuje ve výrobě alergenových extraktů jednotné značení. V roce 1992 vyšel pokyn EU „Note for Guidance: Allergen Products“ a v roce 1997 byla vydána European Pharmacopoeia Monograph on Allergen Products. Evropští výrobci přijali ve standardizaci alergenových extraktů princip vnitropodnikových standardů (inhouse reference - IHR). Ne všechny referenční standardy jsou charakterizovány shodně, ve stejném stupni kvality a metodicky shodně. Hlavní výrobci respektují v různé míře pravidla, která byla uvedena výše, a odpovídají jak původnímu dokumentu WHO, tak i současnému vývoji poznání (9). V tomto směru je třeba zdůraznit, že hlavní alergeny nejsou „mýtem“, ale skutečností, kterou je třeba ve standardizaci alergenů a ve výrobě alergenových vakcín respektovat. Hlavní alergen jako hlavní složka, spojená s vlastními klinickými projevy alergie, je rozhodujícím kritériem standardizovaného produktu. Naléhavě potřebná je dohoda o „certifikovaných referenčních alergenech“, protože původní referenční alergeny WHO byly připraveny na bázi surovin. Jistou pomocí mohou být také poznatky získané z přípravy rekombinantních alergenů. V březnu 2002 byl zahájen v rámci výzkumného programu Evropské komise projekt (CREATE), jehož cílem je vývoj certifikovaných hlavních alergenů. Podílí se na něm centra z 8 zemí EU, šest výrobců alergenových extraktů a skupina European Allergen Manufacturers Group (EAMG), devět výzkumných laboratoří a konečně 11 klinických center. Cílovým objektem je osm hlavních alergenů (8). V době vstupu do Evropské unie máme naději, že Evropa se sjednotí i formálně v označování alergenových přípravků, v označení kvalitativních i kvantitativních ukazatelů, v označení biologické aktivity alergenových extraktů. To nás, praktikující alergology a klinické imunology, i výrobce alergenových extraktů sloužících k diagnostice i terapii alergických onemocnění, neomlouvá, abychom se neřídili doporučeními WHO, vydanými již dříve, a nerespektovali dnešní vývoj medicíny založené na důkazech v oblasti alergenové imunoterapie.

Prof. MUDr. Václav Špičák, CSc. Dětské odd. FN Na Bulovce Budínova 2 180 81 Praha 8 e-mail: [email protected]

LITERATURA

1. Aalberse RC, van Ree R. What makes an allergen an allergen? 60th Congress AAAAI, workshop 5823, edukační texty, Denver, USA, 2003. 2. Allergen Nomenclature WHO/IUS Subcommittee, Clin. Exp. All. 1995; 25: 27-37. 3. André C, Perrin-Fayolle M, et all. A double-blind placebo-controlled Evaluation of sublingual Immunotherapy with a Standardized Ragweed Extract in patients with seasonal Rhinitis, Int. Arch. Immunol. 2003; 131, in press. 4. Bernstein DI. et all. Allergen Immunotherapy: Increasing Effectiveness and Safety with specific Measures to improve standardized Materials, 6Oth AAAAI Congress Denver 2003, Symposium 2701, 3701, edukační texty. 5. Canonica GW, Passalaqua G. Non-injection routes for Immunotherapy, JACI 2003; 111,3: 437-448. 6. Esch RE. Proposed Nomenclature for Allergen Vaccine Labeling, 60th Congress AAAAI,Denver 2003, Symposium 2701, 3701, edukační texty. 7. Noon I. Prophylactic inoculation against hay fever Lancet 1911; 1: 1572-73. 8. Van Ree R. The role of major allergens in Allergen Standardization, Expressions on Allergen specific Immunotherapy, 2002; 16: 1-4. 9. Rooke MB. Regulation of Allergen Products in Europe: What Now? Where Next? ACI 1996; 8,2: 62-66. 10. Thomas WR. How many Allergens do we really need for successful vaccines? 60th AAAAI Congress 2003,Denver, USA workshop 5823, edukační texty. 11. Thompson PhJ, Stewart GA, Samat JM. Allergens and Pollutants in Allergy from St.Holgate et all., Mosby N.Y. 2001; 213-242. 12. Vieths St. Pollen-related and classical Food Allergens in Fruits, Nuts and Vegetables 60th Congress AAAAI, Symposium Allergen Cross-reactivity 5103, 2003 Denver, USA, edukační texty. 13. Wahn U, Schuster C, Lind P. Loewenstein H. Prospective Study on Immunologic Changes induced by two different Dermatophagoides pteronyssinus extracts JACI 1988; 82,3,1: 360-370. 14. WHO Position Paper Allergen Immunotherapy: therapeutic vaccines for allergic diseases, Allergy Suppl. 1998; 53,44.