AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK BUAH TAKOKAK (Solanum torvum Swartz.)
SKRIPSI
REISA ASTRI KUSUMA F24070022
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012 i
ANTIOXIDANT ACTIVITY OF TURKEY BERRY FRUIT EXTRACT (Solanum torvum Swartz.)
Reisa Astri Kusuma, Nuri Andarwulan Departement of Food Science and Technology, Faculty of Agricultural Technology, Bogor Agricultural University, IPB Darmaga Campus, PO Box 220, Bogor, West Java, Indonesia. Phone: 62 856 94307442, e-mail:
[email protected]
ABSTRACT
Turkey berry fruit (Solanum torvum Swartz.) is one of indigenous fruit vegetables that widely used in traditional medicine. Because, it has some functional properties such as antioxidant, antibacterial, antifungal, and antiviral. The functional properties come from the activity of some phytochemicals compound that Turkey berry fruit contents, such as phenolics and non phenolics. This research was designed to identify the chemical content of Turkey berry fruit, change content, and antioxidant activity of crushed form. The research method consisted of treatment phase of fresh Turkey berry fruit through the destruction process and extraction phase of Turkey berry fruit powder with organic solvents (methanol, etil acetat, and hexane). The results showed that methanol extract of both whole and crushed Turkey berry fruit, contains alkaloids, flavons, tannins, and saponins. The etil acetat and hexan extracts of both whole and crushed form, contains alkaloids, flavons, terpenoids, and saponins. Thus, the presence of phenolic compounds in Turkey berry fruit can be affected by Phenylalanin Ammonia Lyase (PAL) activity, but not always influenced by the total anthocyanin. In addition, the antioxidant activity (DPPH assay) between whole and crushed Turkey berry fruit extracts is not significantly different (p>0.05) by t-test. It was demonstrated that the destruction process has a little affecting to the presence of phenolic compounds that act as antioxidants, such as anthocyanin. However, the antioxidant activity of extracts is not always determined from total phenolic, but depending on the ability of -OH group to donate H atoms and to bind with free radicals rapidly. The antioxidant activity of Turkey berry fruit extract was slightly be affected by ascorbic acid (vitamin C) compound.
Keywords: Turkey berry fruit extract, phenolic, antioxidant, phytochemical
ii
REISA ASTRI KUSUMA. F24070022. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah Takokak (Solanum torvum Swartz.). Di bawah bimbingan Nuri Andarwulan. 2012.
RINGKASAN Takokak sebagai salah satu jenis sayuran indigenous yang mengandung komponen bioaktif (fenolik dan non fenolik) yang baik untuk tubuh. Salah satu bagian dari tanaman takokak yang dapat dimakan (edible portion) adalah buah takokak. Buah takokak berfungsi sebagai antioksidan, kardiovaskuler, aktivitas agregasi anti-platelet, aktivitas antimikroba manusia dan isolat klinik dan sedatif, digestif, hemostatik, serta aktivitas diuretik. Tujuan penelitian ini untuk identifikasi kandungan zat atau senyawa kimia dalam buah takokak dan perubahan kadar serta aktivitas antioksidannya pada hancuran buah. Metode penelitian yang dilakukan terdiri atas tahap pemberian perlakuan sampel segar dengan membagi sampel menjadi dua perlakuan, yaitu buah takokak utuh atau tanpa penghancuran dan hancuran buah takokak serta tahap pengekstraksian sampel bubuk buah takokak dengan pelarut organik (metanol, etilasetat, dan heksan). Kadar air buah dan hancuran buah segar takokak sebesar 80.94% berat basah dan 84.32% berat basah, sedangkan kadar air buah dan hancuran buah takokak setelah di freeze dryer adalah 7.72% berat basah dan 8.50% berat basah. Kemudian, diketahui pula bahwa analisis kualitatif fitokimia ekstrak takokak dari beberapa pelarut, dimana ekstrak buah utuh dan hancuran buah untuk jenis pelarut metanol mengandung alkaloid, fenol, flavonoid jenis flavon, tanin, dan saponin. Sementara itu, ekstrak buah utuh dan hancuran buah untuk jenis pelarut etil asetat dan heksan mengandung alkaloid, flavonoid jenis flavon, terpenoid, dan saponin. Kandungan total fenol ekstrak buah dan hancuran buah takokak tertinggi diperoleh dari pelarut etil asetat, yaitu secara berurutan sebesar 218.62 mg/100 gram ekstrak dan 204.14 mg/100 gram ekstrak. Yield ekstrak buah dan hancuran buah takokak tertinggi berasal dari metanol sebanyak 0.0330% dan 0.0246%. Total fenol buah dan hancuran buah takokak sebesar 33.04 mg/100 gram dry basis dan 24.63 mg/100 gram dry basis. Total antosianin buah dan hancuran buah takokak berturut-turut sebesar 17.93 mg/100 gram dry basis dan 34.01 mg/100 gram dry basis. Total asam askorbat buah dan hancuran buah takokak adalah 447.91 mg/100 gram dry basis dan 384.55 mg/100 gram dry basis. Kemudian, aktivitas PAL buah dan hancuran buah takokak sebesar 1.37 µmol trans cinnamic acid/mg protein/menit dan 0.76 µmol trans cinnamic acid/mg protein/menit. Aktivitas antioksidan buah dan hancuran buah takokak dalam % inhibisinya adalah 84.18% dan 87.37%, sedangkan dalam nilai AEAC-nya sebesar 0.23 mg/ml dan 0.24 mg/ml. Secara umum, parameter-parameter aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak secara statistik dengan uji t-test berbeda nyata pada taraf signifikansi 5% (p<0.05) untuk total asam askorbat dan aktivitas PAL buah takokak dengan hancuran buah takokak. Kedua nilai ini pun menunjukkan bahwa nilai buah takokak lebih tinggi daripada nilai hancuran buah takokak. Berbeda dengan nilai total antosianin buah yang lebih rendah daripada hancuran buah takokak dan berbeda nyata pada taraf signifikansi 5% (p<0.05). Sementara itu dengan uji t-test, nilai total fenol dry basis buah dan hancuran buah takokak tidak berbeda nyata pada taraf signifikansi 5% (p>0.05), tetapi nilai buah takokak ini tetap relatif lebih tinggi dibandingkan nilai hancuran buahnya. Nilai aktivitas antioksidan ekstrak buah dan hancuran buah takokak, secara statistik dengan uji t-test tidak menunjukkan adanya perbedaan nyata pada taraf signifikansi 5% (p>0.05), namun aktivitas antioksidan buah sedikit lebih rendah daripada hancurannya.
iii
Kemudian secara statistik, hasil ANOVA untuk nilai total fenol dan yield ekstrak buah takokak dari setiap pelarut, yaitu metanol, etil asetat, dan heksan menunjukkan adanya beda nyata pada taraf signifikansi 5% (p<0.05). Hasil uji lanjut Duncan pun menunjukkan adanya perbedaan nilai total fenol dan yield ekstrak pelarut metanol dengan pelarut etilasetat dan heksan, tetapi berdasarkan pengaruh perlakuan, nilai total fenol dan yield ekstrak buah tanpa penghancuran tidak berbeda nyata pada taraf signifikansi 5% (p>0.05) dengan total fenol dan yield ekstrak hancuran buah. Keberadaan senyawa fenolik pada buah takokak yang diuji ini dapat dipengaruhi oleh aktivitas PAL, namun tidak dipengaruhi oleh total antosianinnya. Selain itu, aktivitas antioksidan ekstrak buah dan hancuran buah yang tidak berbeda nyata secara statistik menunjukkan bahwa proses penghancuran tidak terlalu mempengaruhi keberadaan senyawa fenolik yang berfungsi sebagai antioksidan, seperti antosianin. Hal ini dikarenakan, aktivitas antioksidan ekstrak tidak selalu ditentukan dari nilai total fenolnya, akan tetapi dipengaruhi pula oleh kemampuan gugus –OH untuk mendonorkan atom H dan berikatan secara cepat dengan radikal bebas. Aktivitas antioksidan ekstrak pun sedikit dapat dipengaruhi oleh senyawa asam askorbat (vitamin C).
iv
AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK BUAH TAKOKAK (Solanum torvum Swartz.)
SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor
Oleh REISA ASTRI KUSUMA F24070022
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
v
Judul Skripsi
: Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah Takokak (Solanum torvum Swartz.)
Nama
: Reisa Astri Kusuma
NIM
: F24070022
Tanggal ujian tugas akhir : 8 Mei 2012
vi
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI
Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul “Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah Takokak (Solanum torvum Swartz.)“ adalah hasil karya saya sendiri dengan arahan Dosen Pembimbing Akademik dan belum diajukan dalam bentuk apapun pada perguruan tinggi manapun. Sumber Informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, Mei 2012 Yang membuat pernyataan,
Reisa Astri Kusuma F24070022
vii
©Hak cipta milik Reisa Astri Kusuma, tahun 2012 Hak cipta dilindungi Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya
i
BIODATA PENULIS
Penulis bernama Reisa Astri Kusuma, dilahirkan di Bogor, 4 Agustus 1989. Penulis merupakan anak kedua dari lima bersaudara, dari pasangan Sopiyan dan Lies Pramita Roosana. Pendidikan formal ditempuh penulis di TK Pertiwi Bogor (19941995), SD Pertiwi Bogor (1995-2001), SLTP Negeri 1 Bogor (2001-2004), dan SMA Negeri 3 Bogor (2004-2007). Penulis melanjutkan pendidikan tingginya di Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB) di tahun 2007. Selain mengikuti kegiatan perkuliahan, penulis juga aktif terlibat di berbagai kegiatan kampus. Penulis pernah menjabat sebagai Sekretaris Departemen Pemberdayaan Sumber Daya Mahasiswa (PSDM) BEM Fateta IPB (2008-2009), Bendahara II BEM Fateta IPB (2009-2010), dan Sekretaris I Kabinet Badan Eksekutif Mahasiswa Keluarga Mahasiswa IPB (2010-2011). Penulis pun banyak terlibat dalam kepanitiaan, antara lain penulis pernah menjabat sebagai Bendahara HACCP VII Himpunan Mahasiswa Ilmu dan Teknologi Pangan-HIMITEPA IPB (2009), Ketua Panitia Site Visit BEM Fateta IPB (2009), Panitia Techno-F Masa Perkenalan Fakultas (2009), BAUR HIMITEPA (Masa Perkenalan Himpunan Profesi Mahasiswa Ilmu dan Teknologi Pangan) IPB (2009), dan kepanitiaan lainnya. Penulis juga aktif mengikuti beberapa kegiatan kreativitas mahasiswa berupa perlombaan dan karya tulis ilmiah, yaitu Program Kreativitas Mahasiswa bidang Penelitian dan Kewirausahaan pada tahun 2010 dan 2011. Selain itu, penulis bersama tim pernah mengikuti paper dalam rangkaian acara 10th National Student Conference ”Food Globalization : New Technology in An Era of Change” di Universitas Katolik Soegijapranata dan tim demo masak produk berbasis ”Non Beras dan Terigu” pada acara Food Fair Lomba Diversifikasi Pangan Lokal di Universitas Pasundan, Bandung. Penulis mengakhiri masa studi di IPB dengan menyelesaikan skripsi yang berjudul “Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah Takokak (Solanum torvum Swartz.)”. Penulisan ini dapat terlaksana di bawah bimbingan Dr. Ir. Nuri Andarwulan M.Si.
ii
KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat, karunia dan ridho-Nya sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. shalawat serta salam tercurah kepada Baginda Rasullah SAW beserta keluarga, sahabat, dan kerabatnya. Penelitian yang berjudul “Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah Takokak (Solanum torvum Swartz.)” dilaksanakan di Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, SEAFAST, dan PACL Departemen AGH. Dengan telah selesainya penelitian hingga tersusunnya skripsi ini, penulis ingin menyampaikan penghargaan dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Keluarga besarku (Mama, Papa, Aa Tiyas, dan ketiga adik tersayangku, yaitu Bella, Iqbal, dan Faras) yang telah banyak memberikan keceriaan, do’a dan dukungan penuh dalam benuk apapun terhadap penulis selama penelitian dan penyelesaian tugas akhir ini. Terima kasih juga kepada keluarga besar dari pihak Mama dan pihak Papa atas doa dan dukungannya. 2. Ibu Dr. Ir. Nuri Andarwulan, M.Si yang dengan kesabaran membimbing, mengarahkan, dan mencurahkan ilmu yang sangat berharga kepada penulis selama penyelesaian tugas akhir ini. 3. Bapak Ir. Subarna, M.Si dan Ibu Nur Wulandari, S.TP, M.Si selaku dosen penguji yang telah meluangkan waktunya untuk menguji penulis dan memberikan masukan untuk perbaikan skripsi ini. 4. Pandudamai dan keluarga yang telah banyak membantu dan mengisi hari-hari penulis. 5. Teman satu bimbingan dan seperjuangan, Yolanda Sylvia (Cipi). 6. Sahabat-sahabat tersayang :Ichonk, Lieya, Siti NMS, “Saudara kembar” Raissa, Icha SIL 45, Ayu, Kak Oni, Rosy, Tiara, Nadiah, dan Wida yang telah membantu, memberi dukungan secara moril dan keceriaan kepada penulis. 7. Teman-teman terbaik: tim PSDM BEM-F Semut Merah (Hergha, Imam, Ismet, Kak Nurwan, Docik, Ririn, Mba Risma), kakak dan teman-teman BEM-F Semut Merah dan BEM-F Merah Saga, Para pimpinan dan adik-adik BEM KM IPB BERSAHABAT, teman-teman wisma Zulfa, Arief Sangun, Epi, Anza, Eny, dan Angger. 8. Teman-teman ITP: Irsyad, Kanov, Rini, Adi, Okky, Tami, Cifar, Dati, Punjung, Mitha, Puji, Atika, Imel, Annisa SL, Renny, Dhina, Alya, (Alm) Rina, Lia, Cherish, Lukman, Dimas, Bertha, Esty, Yessica, Ulfa, Anya, Khafid, Riffi, Ria, Uswah, Rozak, Malik, Opa, Leo, Nurina, Ratih, Ayu, Nida, Mike, Mba Mus, Elvita, Euis, Mizu, Hilda, Bore, Iqbal, Yunita, Andika, Gilang, Balqis, Wildan, Kak Manik, Kak Sarah, Kak Riza, dan Kak Dewi. 9. Keluarga besar ITP 44 dan 45, A22 TPB, dan Asrama A3 Lorong 7 10. Laboran Departemen ITP (Mba Vera, Pak Yahya, Pak Rojak, Pak Wahid, Mas Aldi, Bu Antin, Pak Sobirin), laboran dan staff SEAFAST, dan laboran PACL Departemen AGH Pak Bambang dan Rohmat atas segala bantuannya selama penelitian. 11. Seluruh staf UPT ITP khususnya Ibu Novi dan Mba Ani. 12. Para guru dan dosen yang telah berjasa dan berkontribusi selama saya mengeyam pendidikan sejak jenjang TK hingga Perguruan Tinggi. 13. Semua pihak yang telah banyak membantu dan tidak bisa disebutkan secara satu persatu. Penulis berharap semoga tulisan ini dapat memberikan manfaat bagi pembacanya. Terima kasih. Bogor, Mei 2012 Reisa Astri Kusuma
iii
DAFTAR ISI Halaman
KATA PENGANTAR……………………………………………………………………..………......iii DAFTAR ISI…………………………………………………………………………………………...iv DAFTAR TABEL…...………………………………………………………………………………....vi DAFTAR GAMBAR……………………………..……………………………………………..…….vii DAFTAR LAMPIRAN………………………………………...……………………………………..viii I. PENDAHULUAN ......................................................................................................................... 1 A. LATAR BELAKANG ............................................................................................................. 1 B. TUJUAN PENELITIAN .......................................................................................................... 2 II. TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................................................... 3 A. TAKOKAK (Solanum torvum Swartz.) .................................................................................... 3 B. KOMPONEN BIOAKTIF ........................................................................................................ 4 1. SENYAWA FENOLIK .................................................................................................. 4 2. SENYAWA NON FENOLIK ......................................................................................... 7 a. ASAM ASKORBAT (VITAMIN C) ....................................................................... 7 b. ALKALOID ........................................................................................................... 8 c. TERPENOID/STEROID......................................................................................... 8 d. SAPONIN .............................................................................................................. 8 C. AKTIVITAS PHENYLALANIN AMMONIA LYASE (PAL) ....................................................... 8 III. METODOLOGI PENELITIAN................................................................................................. 10 A. BAHAN DAN ALAT ............................................................................................................ 10 1. BAHAN ....................................................................................................................... 10 2. ALAT .......................................................................................................................... 10 B. METODE PENELITIAN ....................................................................................................... 11 1. PEMBERIAN PERLAKUAN SAMPEL SEGAR ......................................................... 12 2. PENGEKSTRAKSIAN SAMPEL BUBUK .................................................................. 13 C. METODE ANALISIS ............................................................................................................ 14 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................................. 19 A. PENGARUH PERLAKUAN TERHADAP KOMPONEN BIOAKTIF BUAH TAKOKAK .... 19 1. KANDUNGAN ANTOSIANIN BUAH TAKOKAK ..................................................... 21 2. KANDUNGAN ASAM ASKORBAT (VITAMIN C) BUAH TAKOKAK ..................... 22 3. PHENYLALANIN AMMONIA LYASE BUAH TAKOKAK ............................................. 23 iv
B. KUALITATIF DAN KUANTITATIF KOMPONEN BIOAKTIF EKSTRAK BUAH TAKOKAK ................................................................................................................................ 25 1. KUALITATIF FITOKIMIA EKSTRAK BUAH TAKOKAK ........................................ 26 2. TOTAL FENOL DAN YIELD EKSTRAK BUAH TAKOKAK .................................... 28 3. TOTAL FENOL BUAH TAKOKAK ............................................................................ 31 C. AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK BUAH TAKOKAK ............................................. 32 V.SIMPULAN DAN SARAN ......................................................................................................... 38 A. SIMPULAN .......................................................................................................................... 38 B. SARAN ................................................................................................................................. 38 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................................................... 39 LAMPIRAN ................................................................................................................................... 44
v
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 1. Komposisi kimia buah takokak dalam tiap 100 g .............................................................. 4 Tabel 2. Hasil kualitatif komponen bioaktif (fitokimia) ekstrak sayuran buah famili Solanaceae .... 27 Tabel 3. Rekapitulasi nilai total fenol, total antosianin, dan total asam askorbat sayuran buah dari famili Solanaceae .......................................................................................................... 36
vi
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1. Gambar 2. Gambar 3. Gambar 4 Gambar 5. Gambar 6. Gambar 7. Gambar 8. Gambar 9. Gambar 10. Gambar 11. Gambar 12.
Buah takokak (Solanum torvum Swartz.) .................................................................. 3 Senyawa umum fenol ............................................................................................... 4 Struktur dasar kation flavilium.................................................................................. 5 Reaksi antara DPPH dan antioksidan ........................................................................ 6 Reaksi metabolisme asam askorbat (vitamin C)......................................................... 7 Biosintesis senyawa yang melibatkan enzim PAL ..................................................... 9 Tahap-tahap penelitian aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak ............................ 12 Warna bubuk hancuran buah dan buah takokak ......................................................... 20 Total antosianin buah takokak berdasarkan dry basis ................................................ 22 Total asam askorbat (vitamin C) buah takokak berdasarkan dry basis.......................... 23 Aktivitas Phenylalanin Ammonia Lyase (PAL) buah takokak .................................... 24 Ekstrak buah takokak pelarut heksan (a), etil asetat (b), dan metanol (c); Ekstrak hancuran buah takokak pelarut heksan (d), etil asetat (e), dan metanol (f) .................. 26
Gambar 13. Total fenol ekstrak buah takokak untuk perlakuan (buah dan hancuran buah) dan jenis pelarut ............................................................... 29 Gambar 14. Yield ekstrak buah takokak untuk perlakuan (buah dan hancuran buah) dan jenis pelarut ....................................................................................................... 30 Gambar 15. Total fenol buah takokak berdasarkan dry basis .................................................. ..... 32 Gambar 16. Aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak berdasarkan % inhibisi (a) dan AEAC (b)........................................................................................................... ..... 33
vii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Kadar air buah takokak segar ................................................................................... 45 Lampiran 2. Kadar air bubuk buah takokak kering beku............................................................... 46 Lampiran 3. Total antosianin buah takokak.................................................................................. 47 Lampiran 4. T-Test antosianin dry basis buah takokak................................................................. 48 Lampiran 5. Total asam askorbat buah takokak............................................................................ 49 Lampiran 6. T-Test vitamin C dry basis buah takokak ................................................................. 50 Lampiran 7a. Standar protein BSA ................................................................................................ 51 Lampiran 7b. Total protein buah takokak (metode Lowry) ............................................................. 52 Lampiran 7c. Standar trans-cinamic acid ..................................................................................... 53 Lampiran 7d. Aktivitas Phenylalanin Ammonia Lyase (PAL) buah takokak ................................... 54 Lampiran 8. T-Test aktivitas PAL buah takokak ........................................................................... 55 Lampiran 9a. Standar asam galat ................................................................................................... 56 Lampiran 9b. Total fenol ekstrak buah takokak ............................................................................. 57 Lampiran 9c. Total fenol ekstrak hancuran buah takokak ............................................................... 58 Lampiran 10a. Hasil uji ANOVA total fenol ekstrak buah takokak.................................................. 59 Lampiran 10b. Hasil uji lanjut Duncan total fenol ekstrak buah takokak untuk jenis pelarut ........................................................................................................... 61 Lampiran 10c. Hasil uji ANOVA total fenol ekstrak buah takokak untuk faktor interaksi perlakuan dan jenis pelarut..................................................................................... 62 Lampiran 10d. Hasil uji lanjut Duncan total fenol ekstrak buah takokak untuk faktor interaksi perlakuan dan jenis pelarut....................................................................... 63 Lampiran 11. Yield ekstrak buah takokak .................................................................................... 64 Lampiran 12a. Hasil uji ANOVA yield ekstrak buah takokak ........................................................ 66 Lampiran 12b. Hasil uji lanjut Duncan yield ekstrak buah takokak untuk jenis pelarut .................... 68 Lampiran 12c. Hasil uji ANOVA yield ekstrak buah takokak untuk faktor interaksi perlakuan dan jenis pelarut..................................................................................... 69 Lampiran 12d.Hasil uji lanjut Duncan yield ekstrak buah takokak untuk faktor interaksi perlakuan dan jenis pelarut..................................................................................... 70 Lampiran 13. Total fenol buah takokak (berdasarkan yield ekstrak tertinggi, yaitu ekstrak metanol) .................................................................................................... 71 Lampiran 14. Hasil T-Test total fenol dry basis buah takokak ........................................................ 73 Lampiran 15. Aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak berdasarkan % inhibisi .......................... 74 Lampiran 16. T-Test DPPH ekstrak buah takokak berdasarkan % inhibisi ...................................... 75 Lampiran 17. Standar asam askorbat ............................................................................................. 76 Lampiran 18. Aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak berdasarkan AEAC ............................... 77 Lampiran 19. T-Test DPPH ekstrak buah takokak berdasarkan AEAC ........................................... 78
viii
I.
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menghambat terjadinya proses oksidasi pada tahap inisiasi dan propagasi (Velioglu et al. 1998). Senyawa antioksidan ini dapat mencegah penyakit kanker maupun penyakit degeneratif lainnya. Sumber antioksidan dapat diperoleh dari antioksidan alami. Sumber antioksidan alami dapat berasal dari tumbuhan, salah satunya adalah berasal dari sayuran indigenous. Menurut Somantri (2006) dalam Soetiarso (2010), secara alamiah definisi sayuran indigenous atau sayuran lokal adalah sayuran yang beradaptasi di suatu daerah dan dapat tumbuh dengan baik, dalam arti potensi dari tanaman tersebut dapat terekspresi secara penuh. Sayuran indigenous merupakan jenis sayuran atau pangan esensial yang kaya akan kandungan zat gizi mikro berupa vitamin dan mineral, serat pangan, dan zat non gizi (fitokimia). Hasil penelitian Andarwulan et al. (2010) dan Andarwulan et al. (2012) menyebutkan bahwa dari sejumlah sayuran indigenous yang diteliti telah diketahui mengandung senyawa fenolik termasuk di dalamnya senyawa flavonoid, yaitu flavonol (quercetin, kaempferol, dan myricetin) dan flavon (apigenin dan luteolin). Selain itu, sayuran indigenous pun memiliki aktivitas antioksidan yang relatif tinggi. Adanya kandungan-kandungan tersebut menjadikan sayuran indigenous memiliki banyak manfaat bagi kesehatan tubuh, seperti fungsinya sebagai antioksidan. Namun, hingga saat ini perhatian masyarakat terhadap sayuran indigenous masih saat kurang bahkan hampir terlupakan, sehingga perlu adanya usaha pembudidayaan dan penyampaian informasi ilmiah secara luas dan lengkap mengenai kandungan senyawa kimia yang bermanfaat untuk kesehatan ini. Dengan demikian, secara tidak langsung akan mendukung penyelamatan sumber daya alam sayuran indigenous sebagai salah satu sumber pangan sehat. Salah satu contoh sayuran indigenous adalah buah takokak. Buah takokak (Solanum torvum Swartz.) merupakan salah satu bagian dari tanaman takokak yang biasanya dapat dimakan (edible portion). Bagian tanaman ini diketahui mengandung glukoalkaloid, solasonine, sterolin (sitosterol-D glucoside), protein, lemak, dan mineral (Yuanyuan et al. 2009). Buah takokak pun mengandung berbagai jenis vitamin, seperti vitamin A, vitamin B1, dan vitamin C (Sirait 2009). Adanya kandungan komponen-komponen bioaktif itulah, buah takokak dapat berfungsi sebagai antioksidan, kardiovaskuler, aktivitas agregasi anti-platelet, aktivitas antimikroba manusia dan isolat klinik dan sedatif, digestif, hemostatik, serta aktivitas diuretik (Agrawal et al. 2010). Komponen bioaktif yang berperan sebagai antioksidan dapat berasal dari senyawa fenolik dan senyawa non fenolik. Seperti penelitian Rahmat (2009) yang menyatakan bahwa buah takokak mengandung senyawa fenolik berupa flavonoid, yaitu flavonol (quercetin, miricetin, dan kaempferol) dan flavon (luteolin dan apigenin). Menurut Apriady (2010) bahwa buah takokak juga mengandung asam fenolat (asam klorogenat, asam kafeat, dan asam ferulat) yang merupakan senyawa fenolik. Buah takokak memiliki kandungan total asam fenolat tertinggi kedua setelah kedondong cina, yaitu sebesar 179.11 mg/100 gram dry basis. Selain itu, buah takokak memiliki total antosianin sebesar 22.09 mg/100 gram dry basis (Kurniasih 2010). Nilai konsentrasi antosianin yang diteliti oleh Kurniasih (2010) memiliki konsentrasi antosianin tertinggi kedua setelah bunga kecombrang. Kemudian, senyawa antioksidan buah takokak juga mengandung senyawa non fenolik berupa karotenoid dan asam askorbat. Menurut Kurniasih (2010) bahwa buah takokak mengandung total karotenoid sebesar 4.10 mg/100 gram dry basis, β-karoten sebesar 0.66 mg/100 gram dry basis, dan total asam askorbat sebesar 639.98 mg/100 gram dry basis.
1
Buah takokak sebagai salah satu jenis sayuran indigenous dapat digunakan sebagai bahan pangan maupun obat tradisional. Sebagai bahan pangan, buah takokak biasanya dimakan mentah (lalapan) atau ditambahkan pada jenis masakan lainnya. Begitu pula jika buah takokak digunakan sebagai obat tradisional, yaitu dapat dimakan langsung dalam kondisi mentah, direbus, atau dibalut langsung pada bagian yang terluka. Berdasarkan kegunaannya itulah, hal ini akan berkaitan dengan bentuk bahan yang diperoleh dan diinginkan, seperti dalam bentuk hancuran, kering (bubuk), dan ekstrak, sehingga berpengaruh juga terhadap daya simpan bahan itu sendiri. Dengan demikian, penelitian ini diharapkan mampu mengidentifikasi beberapa kandungan senyawa kimia dalam buah takokak yang diuji dan mengetahui perubahan kadar serta aktivitas antioksidan buah takokak yang mengalami proses penghancuran berdasarkan manfaat buah takokak sebagai bahan pangan sehat dan sekaligus sebagai obat tradisional. Kemudian, adanya perbedaan bentuk bahan yang diperoleh akibat suatu perlakuan akan memberikan informasi mengenai kandungan senyawa bioaktif yang relatif masih terkandung baik di bahan tersebut.
B. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah untuk identifikasi kandungan zat atau senyawa kimia dalam buah takokak dan perubahan kadar serta aktivitas antioksidannya pada hancuran buah.
2
II. TINJAUAN PUSTAKA A. Takokak (Solanum torvum Swartz.) Takokak termasuk tanaman kelas Dicotyledonae, famili Solanaceae, genus Solanum, dan spesies Solanum torvum Swartz. Beberapa wilayah Indonesia memiliki nama lain dari tanaman takokak, seperti terong pipit (Sumatera), terong rimbang (Melayu), takokak (Jawa Barat) dan terong cepoka, atau poka, cong belut atau cokowana (Jawa Tengah). Takokak berasal dari kepulauan Antilles yang penyebarannya sampai ke negara-negara tropika termasuk Indonesia. Tanaman ini tumbuh di daerah pulau Sumatera, Jawa, dataran rendah yang ketinggiannya sekitar 1-1.600 meter di atas permukaan laut (dpl), di tempat yang tidak terlalu berair, agak ternaungi dengan sinar matahari sedang dan tumbuh secara tersebar. Tanaman takokak merupakan tanaman perdu yang tumbuh tegak dan tinggi tanaman sekitar 3 m. Bentuk batang bulat, berkayu, bercabang, berduri jarang dan percabangannya simpodial dengan warna putih kotor. Daun takokak tunggal, berwarna hijau, tersebar, berbentuk bulat telur, bercangap, tepi rata, ujung meruncing dan panjangnya sekitar 27-30 cm dan lebar 20-24 cm, dengan bentuk pertulangan daunnya menyirip dan ibu tulang berduri. Ciri-ciri bunga takokak, antara lain majemuk, bentuk bintang, kelopak berbulu, bertajuk lima, runcing, panjang bunga kira-kira 5 mm, benang sari lima, tangkai panjang kira-kira 1 mm dan kepala sari panjangnya kira-kira 6 mm berbentuk jarum, berwarna kuning, tangkai putik kira-kira 1 cm yang berwana putih, dan kepala putik kehijauan (Sirait 2009). Buah takokak berbentuk buni, bulat, licin, dan bergaris tengah 12-15 mm, ketika masih muda buah berwarna hijau (Gambar 1) dan setelah tua warnanya menjadi jingga.
Gambar 1. Buah takokak (Solanum torvum Swartz.)
Takokak mengandung berbagai bahan kimia (Tabel 1). Kandungan kimia yang terdapat pada buah dan daun mengandung alkaloid steroid yaitu jenis solasodine 0.84%, sedangkan kandungan buah kuning mengandung solasonine 0.1%. Kemudian, buah mentahnya pun mengandung chlorogenin, sisologenenone, torvogenin, vitamin A, neo-chlorogenine, dan panicolugenine, serta akarnya mengandung jurubine (Sirait 2009). Buah takokak ini pun diketahui mengandung glukoalkaloid, solasonine, sterolin (sitosterol-D glucoside), protein, lemak, dan mineral (Yuanyuan et al. 2009). Farmakologi Cina menyebutkan bahwa buah takokak memiliki rasa pahit, pedas, sejuk dan agak beracun. Takokak pun mampu melancarkan sirkulasi darah, menghilangkan rasa sakit (analgetik) dan menghilangkan batuk (antitusif) (Rahmat 2009). Takokak memiliki aktivitas pembersih superoksida yang tinggi yakni di atas 70%. Kandungan kimia yang terdapat pada takokak mampu bertindak sebagai antioksidan dan dapat melindungi jaringan tubuh dari efek negatif radikal bebas. Kemudian, takokak berfungsi sebagai anti radang karena memiliki senyawa sterol carpesterol dan
3
juga sebagai alat kontrasepsi karena buah dan daunnya mengandung solasodine 0.84%, yang merupakan bahan baku hormon seks untuk kontrasepsi (Sirait 2009). Tabel 1. Komposisi kimia buah takokak dalam tiap 100 g Komposisi
Satuan
Jumlah
Air
g
89
Protein
g
2
Lemak
g
0.1
Karbohidrat
g
8
Serat
g
10
Kalsium
mg
50
Fosfor
mg
30
Ferum
mg
2
Vitamin A
I.V.
750
Vitamin B1
mg
0.08
Vitamin C
mg
80
Sumber : Sirait (2009)
B. Komponen Bioaktif Komponen-komponen bioaktif pada suatu bahan, khususnya tanaman sayuran indigenous dapat berasal dari senyawa fenolik dan senyawa non fenolik. Beberapa komponen bioaktif yang termasuk senyawa fenolik adalah fenol, flavonoid termasuk antosianin dan tanin. Sementara itu, beberapa komponen bioaktif yang termasuk senyawa non fenolik adalah asam askorbat (vitamin C), alkaloid, terpenoid/steroid, dan saponin.
1.
Senyawa Fenolik
Menurut Suradikusumah (1989), senyawa fenol mencakup sejumlah banyak senyawa yang umumnya mempunyai sebuah cincin aromatik dengan satu atau lebih gugus hidroksil. Senyawa fenol cenderung untuk larut dalam air karena paling sering bergabung dengan gula glikosida. Selain itu, senyawa fenol dapat bergabung juga dengan protein, alkaloid, dan terpenoid yang terdapat dalam rongga sel. Struktur umum senyawa fenol seperti pada Gambar 2.
Gambar 2. Senyawa umum fenol
4
Senyawa fenol dalam bahan pangan dapat dikelompokkan menjadi tiga, antara lain fenol sederhana dan asam fenolat (p-kresol, 3-etil fenol, 3,4-dimetil fenol, hidroksiquinon, vanillin, asam galat), turunan asam hidroksisinamat (p-kumarat, kafeat, asam ferulat, dan asam klorogenat), dan flavonoid (katekin, proantosianin, antosianidin, flavon, flavonol, dan glikosida) (Ho 1992). Flavonoid ditemukan pada tumbuhan tingkat tinggi, dimana senyawa ini yang menyebabkan tumbuhan berwarna merah, ungu, biru, dan kuning.Terdapat sepuluh golongan flavonoid yang telah diketahui, yaitu antosianin, leukoantosianidin, flavonol, flavan, glikoflavon, biflavonil, kalkon, auron, flavon, dan isoflavon (Suradikusumah 1989). Menurut Pratt (1992), flavonoid adalah senyawa alami hasil fotosintesis yang mengandung cincin aromatik yang dapat diganti gugus hidroksi atau alkoksinya. Senyawa ini terdapat pada semua bagian tumbuhan, seperti daun, buah, kayu, dan kulit kayu. Biosintesis senyawa fenol dan flavonoid saling berhubungan, dimana biosintesis diawali oleh jalur sikimat untuk kemudian menghasilkan senyawa-senyawa yang berfungsi sebagai prekursor atau substrat senyawa lainnya. Rangkaian jalur sikimat akan menghasilkan penta-O-galloll-glukosa untuk selanjutnya akan menghasilkan senyawa-senyawa golongan tanin yang terhidrolisis, yaitu golongan gallotanin dan ellagitanin (Crozier et al. 2006, Dewick 2009). Selain itu, jalur sikimat ini pun nantinya akan menghasilkan salah satu senyawa, seperti p-koumaril-CoA yang bekerja sinergis dengan senyawa malonil Co-A menghasilkan senyawa turunan flavonoid lainnya, antara lain isoflavon, antosianin, proantosianidin (tanin terkondensasi), flavon, dan flavonol (Winkel BSJ 2006). Antosanin berasal dari bahasa Yunani, yaitu “anthos” yang berarti bunga dan “kyanos” yang berarti biru gelap dan termasuk salah satu senyawa flavonoid. Antosoanin merupakan zat warna kemerahan yang mudah larut air dan banyak ditemukan di dunia tumbuhan. Pigmen antosianinlah yang menyebabkan bagian tumbuhan (daun, bunga, buah, dan sayur) berwarna merah, jingga, ungu, dan biru (Bridle dan Timberlake 1997, Elbe dan Schwartz 1996). Secara kimia, semua antosianin merupakan turunan dari kation flavilium (3,5,7,4’ tetrahidroksiflavilium) yang merupakan struktur dasar dari antosianidin (Bridle dan Timberlake 1997). Struktur dasar kation flavilium dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Struktur dasar kation flavilium
Secara kimia, semua antosianin merupakan turunan suatu struktur aromatik tunggal, yaitu “cyanidin” (sianidin), dan semuanya terbentuk dari pigmen sianidin dengan penambahan atau pengurangan gugus hidroksil atau dengan metilasi atau glikosilasi, sehingga senyawa antosianin memiliki gugus polar. Perbedaan warna alami pigmen antosianin ini dipengaruhi oleh hidroksilasi dan metilasi, hidroksilasi akan meningkatkan warna biru, sedangkan metilasi meningkatkan warna merah (Kumalaningsih 2006). Terdapat enam antosianidin yang umumnya ditemukan, antara lain sianidin, pelargonidin, delfinidin, peonidin, petunidin, dan malvidin. Sianidin merupakan antosianidin yang jumlahnya paling banyak.
5
Menurut Markakis (1982), molekul antosianin disusun dari sebuah aglikon (antosianidin) yang teresterifikasi dengan satu atau lebih gula (glikon). Beberapa faktor utama yang menyebabkan keragaman adalah sifat gulanya (biasanya glukosa, dapat juga galaktosa, ramnosa, xilosa atau arabinosa), jumlah unit gula (mono, di, atau triglikosida), dan posisi gula (biasanya pada 3-hidroksil atau 3- dan 5-hidroksil) (Suradikusumah 1989). Sebagai glikosida, antosianin larut dalam air, tetapi setelah mengalami hidrolisis maka bentuk non glikosidanya (antosianidin) kurang larut dalam air (Wijaya et al. 2001). Jenis pigmen yang terdapat dalam bunga dan buah sebagian besar tidak berada dalam bentuk antosianidin, melainkan dalam bentuk glikosilasi, sehingga pigmen antosianin menjadi lebih stabil dan larut dalam air. Faktor yang mempengaruhi kestabilan antosianin dalam bahan pangan adalah suhu, cahaya, pH, oksigen, asam askorbat, gula dan produk turunannya, logam, kondensasi, dan sulfur dioksida (Markakis 1982). Antosianin akan lebih stabil pada larutan yang bersifat asam daripada larutan yang bersifat netral atau basa (Jackman dan Smith 1996). Dalam larutan (medium) asam tampak berwarna merah dan ketika pH meningkat akan menjadi lebih berwarna biru. Komponen senyawa fenol biasanya bersifat polar dan memiliki fungsi sebagai penangkap radikal bebas dan peredam terbentuknya oksigen singlet (Kumalaningsih 2006). Menurut Gordon (1990), senyawa fenol jika berdiri sendiri bersifat tidak aktif sebagai antioksidan. Aktivitas antioksidan senyawa fenol dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain agen pengkelat, pH lingkungan sekitar, kelarutan, ketersediaan senyawa fenol dalam suatu bahan, dan stabilitas senyawa fenol itu sendiri (Tang 1991). Berbagai macam metode pengukuran aktivitas antioksidan telah banyak dilakukan untuk melihat dan membandingkan aktivitas antioksidan pada berbagai macam sumber antioksidan. Salah satu metode pengukuran aktivitas antioksidan yang dapat digunakan, yaitu metode DPPH. Metode DPPH merupakan metode yang murah, sederhana, dan cepat dalam mengukur aktivitas antioksidan suatu bahan pangan dengan melibatkan penggunaan radikal bebas 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Metode ini pun dapat digunakan untuk sampel padat atau cair dan tidak spesifik untuk komponen antioksidan tertentu, akan tetapi berlaku untuk aktivitas antioksidan seluruh sampel (Prakash et al. 2012). DPPH merupakan senyawa radikal bebas yang bersifat stabil sehingga dapat bereaksi dengan atom hidrogen yang berasal dari suatu antioksidan membentuk DPPH tereduksi (Molyneux 2004). Prinsip metode DPPH adalah atom hidrogen dari suatu senyawa antioksidan akan membuat larutan DPPH berubah warna dari ungu menjadi tidak berwarna yang dapat diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm akibat dari terbentuknya DPPH tereduksi (DPPHH) (Gambar 4) (Sharma dan Bhat 2009). Semakin tinggi kemampuan suatu senyawa antioksidan dalam meredam radikal DPPH, maka warna yang dihasilkan akan semakin kuning dan mendekati jernih yang ditandai dengan semakin kecilnya nilai absorbansi yang terukur.
Gambar 4. Reaksi antara DPPH dan antioksidan (Prakash et al. 2012)
6
Aktivitas antioksidan dapat dinyatakan dengan persentase penghambatan (inhibisi) yang diperoleh dari nilai absorbansi blanko dikurangi dengan absorbansi sampel (Sandrasari 2008, Andarwulan et al. 2010). Selain itu, aktivitas antioksidan dapat dinyatakan dengan nilai AEAC (Ascorbic Acid Equivalen Antioxidant Capacity) (Prangdimurti et al. 2010). AEAC merupakan nilai kapasitas atau aktivitas antioksidan bahan dalam mereduksi radikal bebas DPPH yang setara dengan kemampuan radikal bebas asam askorbat atau vitamin C.
2.
Senyawa Non Fenolik
a.
Asam Askorbat (Vitamin C)
Sumber vitamin C sebagian besar berasal dari sayuran dan buah-buahan, terutama buah-buahan segar. Karena itu vitamin C sering kali disebut fresh food vitamin. Buah yang dikonsumsi dalam kondisi segar mengandung asam askorbat (vitamin C) yang lebih tinggi dan kehilangan kapasitas antioksidan dalam buah lebih rendah dibandingkan buah yang telah mengalami pemanasan atau proses pengolahan (Kalt et al. 1999). Maka dari itu, vitamin C merupakan vitamin yang mudah larut air, dan mudah rusak oleh oksidasi, panas, sinar, enzim, alkali, oksidator, dan katalis tembaga dan besi. Oksidasi dapat dihambat dengan membiarkan vitamin C dalam kondisi asam atau pada suhu rendah (Winarno 1997). Struktur kimia vitamin C terdiri dari rantai enam atom C dan kedudukannya tidak stabil (C6H8O6), karena mudah bereaksi dengan oksigen di udara (teroksidasi) secara reversibel. Bentuk asam askorbat yang ada di alam adalah L-asam askorbat. Asam L-askorbat dengan adanya enzim asam askorbat oksidase akan teroksidasi menjadi asam L-dehidroaskorbat. Asam ini secara kimia juga sangat labil dan mengalami perubahan lebih lanjut menjadi asam L-diketogulonat yang tidak lagi memiliki keaktifan sebagai asam askorbat. Suasana basa menyebabkan asam L-diketogulonat teroksidasi menjadi asam oksalat dan asam L-treonat (Safaryani et al. 2007). Reaksi metabolisme asam askorbat (vitamin C) dapat dilihat pada Gambar 5. Vitamin C merupakan zat antioksidan yang tangguh, karena berfungsi menjaga kesehatan sel, meningkatkan penyerapan asupan zat besi, dan memperbaiki sistem kekebalan tubuh. Selain itu, fungsi vitamin C sebagai penjaga dan pemelihara kesehatan pembuluh-pembuluh kapiler, kesehatan gigi dan gusi, menghambat produksi nitrosamin yang merupakan zat pemicu kanker, dan membantu penyembuhan luka (Kumalaningsih 2006).
Gambar 5. Reaksi metabolisme asam askorbat (vitamin C)
7
b. Alkaloid Alkaloid merupakan salah satu golongan senyawa organik yang utama. Alkaloid dapat ditemukan pada tumbuhan dan hewan. Namun dalam dunia tumbuhan, senyawa alkaloid merupakan golongan senyawa organik (metabolit sekunder) terbesar diantara senyawa lainnya baik secara jumlahnya maupun penyebarannya (Astuti et al. 1995). Alkaloid pada tumbuhan telah diketahui pada 40 suku dari tumbuhan berbunga. Umumnya, suku tumbuhan itu termasuk kelas dikotil dan hanya sedikit pada monokotil. Alkaloid sering bersifat racun bagi manusia dan memiliki banyak kegiatan fisiologi yang menonjol, sehingga digunakan secara luas dalam bidang pengobatan (Harborne 1996). Berdasarkan strukturnya, jenis alkaloid sangatlah banyak dan beragam. Hanya saja sebagian besar alkaloid memiliki kerangka polisiklik dengan kandungan atom karbon, oksigen, nitrogen, hidrogen, dan substituen yang tidak begitu beragam. Umumnya, alkaloid tidak berwarna walaupun masih ada yang berwarna, bersifat basa sehingga jika ditambahkan asam akan membentuk garam, dan larut dalam pelarut organik.
c.
Terpenoid/Steroid
Terpenoid terdapat dalam senyawa tumbuhan, memiliki struktur siklik dan satu gugus fungsi atau lebih (hidroksil, karbonil, dan lain-lain). Umumnya, terpenoid larut lemak dan berada di dalam sitoplasma sel tumbuhan. Penggolongan senyawa terpenoid, berdasarkan kemudahannya dalam menguap dibagi menjadi tiga golongan, yaitu : mudah menguap (monoterpen dan seskuiterpen sebagai minyak atsiri), sulit menguap (diterpenoid), dan tidak menguap (triterpenoid dan steroid) (Direja 2007). Triterpenoid merupakan senyawa berkerangka karbon dari enam satuan isoprene dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon asiklik, yaitu skualena. Triterpenoid dibagi menjadi empat golongan senyawa, yaitu triterpena, steroid, saponin, dan glikosida jantung. Sterol adalah triterpena yang kerangka dasarnya sistem cincin siklopentana penhidrofenantrena.
d. Saponin Saponin adalah senyawa glikosida triterpena dan sterol yang tersebar luas pada tumbuhan tingkat tinggi. Saponin merupakan senyawa aktif permukaan dan bersifat seperti sabun serta dapat dideteksi dengan kemampuannya membentuk busa yang mantap (tahan lama) ketika diekstraksi dan menghemolisis darah. Saponin memiliki sifat antimikroba, baik triterpen maupun steroidal (Naidu 2000). Saponin memiliki rasa pahit menusuk dan menyebabkan bersin serta iritasi pada selaput lendir.
C. Aktivitas Phenylalanine Ammonia Lyase (PAL) Phenylalanine Ammonia Lyase (PAL) (E.C. 4.1.1.5) merupakan salah satu enzim yang berperan dalam metabolisme sekunder pada tanaman. Enzim ini dapat ditemukan di semua tanaman hijau termasuk cryptogam tertinggi, Basidiomycetes, dan Streptomyces (Camm et al. 1973). Menurut Sadasivam dan Manickam (1996), PAL berperan dalam konversi substrat asam amino aromatik Lfenilalanin menjadi asam trans-sinamat. Senyawa aromatik asam amino fenilalanin terbentuk melalui jalur sikimat dengan menghasilkan shikimic acid yang dilanjutkan dengan pembentukan chorismic 8
acid. Chorismic acid merupakan prekursor terbentuknya senyawa aromatik asam amino fenilalanin, tirosin, dan triptofan. Pada proses pembentukan fenilalanin membutuhkan perubahan chorismic acid menjadi prephenic acid yang dikatalisis oleh chorismate mutase dan mengalami perubahan lanjut secara reversibel menjadi L-arogenic acid. Kemudian, L-arogenic acid berubah menjadi L-fenilalanin dengan dikatalisis oleh arogenate dehydratase (Dewick 2009). PAL adalah enzim kunci di dalam sintesa berbagai senyawa fenolik (Higuchi 1990). Asam sinamat yang dihasilkan dari deaminasi fenilalanin akan dimetabolisme lebih lanjut menjadi asam kumarat, kafeat, ferulat, dan sinapat. Dengan kata lain, asam sinamat berfungsi sebagai prekursor untuk biosintesis senyawa, seperti senyawa koumarin, isoflavonoid, dan lignin. Senyawa tersebut penting bagi tanaman terhadap serangan hama dan penyakit. Hasil penelitian mengenai perubahan aktivitas PAL disertai dengan infeksi fungi, bakteri, dan virus pada tanaman telah dilaporkan. Selain itu, perubahan aktivitas PAL telah diketahui pada beberapa sistem tanaman yang distimulasi oleh sinar atau cahaya (Zucker 1972), seperti tanaman asaparagus. Aktivitas PAL biasanya akan berkaitan dengan total antosianin dan komponen fenol sederhana. Aktivitas PAL suatu buah atau bahan pun akan lebih tinggi ketika sudah dalam keadaan matang daripada masih dalam keadaan mentah (Ju et al. 1995). Beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas PAL adalah cahaya atau sinar, keragaman buah (bahan), perlakuan stress pada tanaman, dan kematangan buah. Biosintesis senyawa-senyawa yang turut melibatkan enzim PAL dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6 . Biosintesis senyawa yang melibatkan enzim PAL (Dewick 2009) 9
III. METODOLOGI PENELITIAN A. Bahan dan Alat 1.
Bahan
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah takokak segar yang diperoleh dari Desa Benteng Gunung Leutik dan salah satu pasar tradisional di kota Bogor. Bahan-bahan lain yang digunakan dalam ekstraksi, antara lain pelarut metanol Pro Analysis (PA) (Merck), pelarut etil asetat (Merck), dan pelarut heksan (Merck), aquades, dan gas nitrogen (N2). Bahan-bahan yang digunakan untuk mengukur total fenol adalah etanol PA (Merck), etanol 95%, pereaksi Folin Ciocalteau 50%, Na2CO3 5%, standar asam galat (Sigma-Aldrich), dan aquades. Bahan-bahan yang digunakan dalam analisis kualitatif komponen bioaktif (fitokimia), yaitu FeCl3 5%, kloroform, Pbasetat, gelatin 1%, amoniak, larutan H2SO4 2N, H2SO4 pekat, asam asetat glacial PA (Merck), larutan HCl 2N, HgCl2, KI (Merck), bismuth subnitrat, iodium (Merck), etanol 95%, dan aquades. Kemudian, bahan-bahan untuk menguji total antosianin, yaitu larutan HCl 5%, aquades, etanol 95%, dan HCl 1.5 N. Bahan-bahan yang digunakan untuk menguji total asam askorbat (vitamin C), antara lain aquades, KI (Merck), I2 (Merck), dan larutan amilum 1%. Bahan-bahan yang digunakan untuk mengukur aktivitas Phenylalanine Amonnia Lyase (PAL), antara lain larutan buffer borat-HCl pH 8.8 (25 mM), larutan buffer borate ph 8.7 (0.2 M), NaOH 0.2 M, larutan mercaptoethanol 5 mM, larutan KOH 0.1 N, reagen A (0.81 M Na2CO3 dalam 500 ml NaOH 1 N, 7 mM K-Na Tartrate.4H2O, H2O sampai 1 L ), reagen B (70 mM K-Na Tartrate.4H2O, 40 mM CuSO4.4 H2O dalam 10 ml NaOH 1 N, H2O sampai 100 ml), reagen C (1 ml Folin Ciocalteau dalam 15 ml H2O), larutan L-Phenylalanine 100 mM, dan larutan Tri Cloroacetic Acid (TCA) 1 M. Bahan yang digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan, antara lain asam askorbat (vitamin C), metanol PA (Merck), larutan DPPH 1 mM, dan aquades.
2.
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat untuk perlakuan sampel dan ekstraksi buah takokak, serta alat untuk analisis. Alat-alat yang digunakan untuk perlakuan sampel segar dan ekstraksi bubuk buah takokak, antara lain blender basah dan kering, baskom, freezer, freeze dryer, plastik HDPE (bening), kemasan alumunium foil, ayakan 20 mesh, alat pengayak, botol-botol kaca gelap, shaker, penyaring vakum, Buchi rotavapor, cawan alumunium, oven, timbangan, neraca analitik, alat pengaduk gelas, sudip, gelas piala, gelas ukur, corong gelas, alumunium foil, dan kertas saring Whatman No.1. Alat-alat untuk analisis total fenol adalah neraca analitik, gelas piala, gelas ukur, tabung reaksi bertutup, labu takar, alat pengaduk gelas, sudip, pipet mohr, mikropipet 10-100 µL dan 500-5000 µL, tabung sentrifuse, vortex, sentrifuse, kuvet, dan spektrofotometer UV-VIS. Analisis kualitatif komponen bioaktif (fitokimia) menggunakan alat-alat berupa neraca analitik, gelas piala, gelas ukur, tabung reaksi bertutup, labu takar, alat pengaduk gelas, sudip, pipet mohr, dan pipet tetes. Alat-alat yang digunakan untuk analisis total antosianin adalah neraca analitik, sudip, gelas piala, gelas ukur, labu takar, corong gelas, kertas saring Whatman No.1, penyaring vakum, pipet mohr, tabung reaksi bertutup, kuvet, dan spektrofotometer UV-VIS. Analisis total asam askorbat (vitamin C) menggunakan alat-alat berupa neraca analitik, sudip, gelas piala, magnetic stirrer, heater,
10
labu takar, corong gelas, erlenmeyer, pipet mohr, pompa vakum, kertas saring Whatman No.1, dan buret mikro. Alat-alat yang digunakan untuk analisis aktivitas Phenylalanine Amonnia Lyase (PAL), yaitu neraca analitik, alat pengaduk gelas, sudip, gelas piala, gelas ukur, tabung reaksi, labu takar, pipet tetes, mikropipet (10-100 µL, 100-1000 µL, 500-5000 µL, dan 1000-10000 µL), corong gelas, penangas air (inkubator), microtube, sentrifuse, kuvet, dan spektrofotometer UV-VIS. Alat-alat yang digunakan untuk analisis aktivitas antioksidan, antara lain neraca analitik, alat pengaduk gelas, sudip, gelas piala, gelas ukur, tabung reaksi bertutup, labu takar, pipet tetes, pipet Mohr, mikropipet (10-100 µL dan 100-1000 µL), corong gelas, alumunium foil, kuvet, dan spektrofotometer UV-VIS.
B. Metode Penelitian Metode penelitian yang dilakukan terdiri atas tahap pemberian perlakuan terhadap sampel segar dan tahap pengekstraksian sampel bubuk buah takokak. Tahap pemberian perlakuan sampel segar bertujuan untuk mengidentifikasi dan memperoleh komponen bioaktif buah takokak dengan memberikan pengaruh penghancuran pada sebagian sampelnya, sehingga dapat diketahui dampaknya dan perbedaannya terhadap kandungan komponen bioaktif dengan buah yang tidak mengalami proses penghancuran. Tahap ini dilakukan dengan membagi sampel menjadi dua perlakuan, yaitu sebagian sampel dalam kondisi buah takokak segar yang tidak dihancurkan dan sebagian lagi dalam kondisi buah takokak segar yang dihancurkan. Lalu, kedua sampel tersebut dianalisis kadar air segarnya. Selanjutnya, sampel buah takokak segar dan hancuran buah takokak segar mengalami proses pengeringan beku menjadi sampel bubuk dan dilakukannya beberapa analisis, seperti analisis kadar air sampel bubuk, total antosianin, total asam askorbat, protein Lowry, dan aktivitas PAL. Hasil analisis yang diperoleh ini untuk selanjutnya dianalisis secara statistik dengan uji t-test, sehingga diketahui perbedaan antara buah dan hancuran buah terhadap total antosianin, total asam askorbat, dan aktivitas PAL-nya. Tahap berikutnya adalah tahap pengekstraksian sampel bubuk dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol, etil asetat, dan heksan, sehingga diperoleh sampel ekstrak dari masingmasing pelarut. Tujuan tahap ekstraksi sampel untuk memperoleh zat atau senyawa kimia (fitokimia) yang berperan sebagai metabolit sekunder dari ekstrak, sehingga dapat diketahui pula perubahan senyawa tersebut dan kadar serta aktivitas antioksidan pada hancuran buah. Sampel ekstrak dianalisis secara kualitatif untuk mengetahui kandungan fitokimianya dan secara kuantitatif dengan mengetahui nilai total fenol ekstrak. Hasil ekstraksi yang diperoleh akan diketahui yield tertingginya untuk kemudian sampelnya digunakan dalam analisis aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak. Yield ekstrak tertinggi diperoleh dari sampel ekstrak metanol untuk buah dan hancuran buah takokak. Hasil analisis dilanjutkan dengan uji statistik berupa ANOVA untuk total fenol ekstrak dan yield ekstrak. Hasil analisis menunjukkan adanya variasi dan perbedaan total senyawa fenolik dan yield akibat pengaruh perlakuan (buah dan hancuran buah) dan jenis ekstrak. Total fenol dan yield ekstrak digunakan untuk perhitungan total fenol buah dan hancuran buah takokak. Hasil perhitungan tersebut lalu dianalisis secara statistik dengan uji t-test. Begitu pula dengan nilai aktivitas antioksidan ekstrak metanol buah dan hancuran buah takokak yang juga dianalisis secara statistik dengan uji t-test. Dengan demikian, dapat diketahui nilai aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak akibat proses penghancuran. Tahap-tahap penelitian yang dilakukan dapat dilihat pada Gambar 7.
11
Pemberian perlakuan sampel segar
Buah takokak segar
Hancuran buah takokak segar
Kadar air bubuk t-test
Total antosianin Kadar air sampel segar
t-test
Total asam askorbat Bubuk buah takokak
Metode pengeringan beku sampel segar
Bubuk hancuran buah takokak
Protein Lowry Aktivitas PAL
t-test Kualitatif fitokimia Total fenol
Bubuk buah takokak
Bubuk hancuran buah takokak
Pengekstraksian sampel bubuk
Ekstrak metanol
Metode maserasi
Ekstrak etil asetat
Aktivitas antioksidan
ANOVA
t-test
Kualitatif fitokimia Total fenol
ANOVA
Kualitatif fitokimia Ekstrak heksan
Total fenol
ANOVA
Gambar 7. Tahap-tahap penelitian aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak
1.
Pemberian Perlakuan Sampel Segar
Kondisi awal sampel buah takokak yang digunakan adalah sampel segar. Kemudian, sampel segar ini dibuat menjadi dua perlakuan berupa buah utuh atau tanpa proses penghancuran dan hancuran buah. Tujuannya untuk mengidentifikasi dan memperoleh komponen bioaktif buah takokak dengan memberikan pengaruh penghancuran pada sebagian sampelnya, sehingga dapat diketahui dampaknya dan perbedaannya terhadap kandungan komponen bioaktif dengan buah yang tidak mengalami proses penghancuran. Tahap ini diawali dengan penimbangan sampel segar buah takokak yang telah dipisahkan dari tangkainya sebanyak 1-2 kg, lalu sampel dicuci bersih dan ditiriskan. Selanjutnya, buah takokak dibagi menjadi dua perlakuan, yaitu sebagian dalam keadaan buah utuh dan sebagian lagi dihancurkan dengan blender basah menjadi hancuran buah. Proses penghancuran buah takokak dengan menghancurkan sampel secara bertahap atau sedikit demi sedikit, yaitu sekitar 500 gram sampel 12
dihancurkan selama ± 10-15 menit tanpa penambahan air hingga keseluruhan bentuk hancuran sampel yang diperoleh relatif sama (homogen) untuk setiap kali proses penghancurannya. Sampel buah utuh dan hancuran buah yang telah diperoleh dimasukkan ke dalam plastik HDPE (bening) ukuran 1 kg, dimana hingga ¾ bagian plastik diisi oleh sampel. Khusus sampel hancuran buah dibuat rata atau pipih sesaat setelah dimasukkan ke dalam plastik agar pembekuan sampel nantinya lebih merata. Setelah semua sampel dimasukkan ke dalam masing-masing plastik, secara bersamaan sampel lalu dimasukkan ke dalam freezer dan posisi sampel diletakkan dalam keadaan horizontal (mendatar). Selanjutnya, setiap sampel diukur pula kadar air segarnya, sehingga dapat diketahui kadar air buah segar dan hancuran buah segar takokak. Sampel buah segar dan hancuran buah segar takokak dibekukan terlebih dahulu selama satu malam dalam freezer dan keesokan harinya dikeringkan dengan alat freeze dryer selama ± 48 jam. Sampel kering hasil pengeringan beku ini dihancurkan dengan blender kering untuk mendapatkan sampel bubuk takokak dan dimasukkan ke dalam kemasan alumunium foil. Lalu, sampel ini disimpan dalam freezer hingga diperoleh jumlah sampel yang relatif dapat mencukupi proses analisis sampel selanjutnya. Dengan kata lain, sampel diperoleh secara kumulatif dari hasil beberapa kali proses pengeringan beku. Sampel kering diayak dengan ayakan berukuran 20 mesh, sehingga diperoleh bubuk takokak berukuran homogen. Kemudian, sampel bubuk takokak dimasukkan kembali dalam kemasan alumunium foil dan disimpan dalam freezer, sehingga sampel lebih awet selama penyimpanan. Sampel bubuk buah dan hancuran buah takokak ditentukan kadar airnya. Selain itu, beberapa analisis lainnya yang dilakukan dengan menggunakan sampel bubuk buah dan hancuran buah, antara lain analisis total antosianin, total asam askorbat, protein Lowry, dan aktivitas Phenylalanine Ammonia Lyase (PAL).
2.
Pengekstraksian Sampel Bubuk
Tahap berikutnya adalah tahap pengekstraksian sampel bubuk takokak dengan beberapa pelarut organik. Hal ini bertujuan untuk memperoleh zat atau senyawa kimia (fitokimia) yang berperan sebagai metabolit sekunder dari ekstrak, sehingga dapat diketahui pula perubahan senyawa tersebut dan kadar serta aktivitas antioksidan pada hancuran buah. Tahap ekstraksi sampel dilakukan dengan melarutkan bubuk buah dan hancuran buah takokak dalam pelarut organik dengan perbandingan sampel dan pelarutnya 1:10 (Batubara et al. 2009 yang dimodifikasi). Sampel bubuk ditimbang sebanyak ± 10 gram, lalu dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer dan ditambahkan pelarut yang berbeda, yaitu metanol PA, etil asetat, dan heksan, sebanyak 100 ml sehingga sampel terendam sempurna dan ditutup dengan aluminium foil dan disimpan di dalam shaker selama 24 jam pada suhu ruang kemudian disaring vakum. Ampas masing-masing sampel dimaserasi kembali selama 24 jam di dalam shaker pada suhu ruang dan diulangi hingga tiga kali, dimana larutan sampel menjadi berwarna pudar. Hasil filtrat masing-masing sampel diakumulasi dan diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 40°C untuk mendapatkan ekstrak pekatnya. Kemudian, sampel ekstrak buah dan hancuran buah takokak dianalisis secara kualitatif untuk mengetahui komponen bioaktif (fitokimia) ekstrak dan secara kuantitatif berupa analisis total fenol ekstrak dan analisis aktivitas antioksidan ekstrak buah dan hancuran buah takokak.
13
C. Metode Analisis 1.
Analisis Kadar Air (AOAC 1984)
Penetapan kadar air merupakan cara untuk mengukur banyaknya air yang terdapat di dalam suatu bahan pangan. Analisis kadar air dilakukan pada sampel buah segar takokak (awal) dan pada sampel takokak setelah dikering bekukan. Penentuan kadar air ini dilakukan dengan metode pengeringan dengan oven biasa. Prinsip dari metode ini adalah air dikeluarkan dari sampel dengan cara menguapkan air yang terdapat dalam bahan pangan. Persiapan yang perlu dilakukan adalah cawan alumunium yang akan digunakan terlebih dahulu dikeringkan dalam oven pada suhu 1000C selama 15 menit kemudian didinginkan dalam desikator selama 10 menit. Selanjutnya cawan ditimbang dengan menggunakan neraca analitik. Sampel ditimbang sebanyak kurang lebih 2 gram kemudian dikeringkan dalam oven selama kurang lebih 6 jam. Setelah itu, didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Pengeringan sampel kembali ke dalam oven hingga diperoleh berat kering yang relatif konstan (tetap). Berikut perhitungan kadar air berdasarkan % bb (basis basah), yaitu: Kadar air (% bb) = W-(W1-W2) x 100% W dimana:
W = bobot contoh sebelum dikeringkan (g) W1 = bobot (contoh + cawan) sesudah dikeringkan (g) W2 = bobot cawan kosong (g)
2.
Analisis Total Antosianin
a.
Ekstraksi Antosianin (Raharja dan Dianawati 2001)
Sebanyak ± 1 gram sampel bubuk diekstraksi dengan larutan HCl 5% dalam aquades. Ekstraksi dilakukan dengan merendam bahan didalam wadah botol kaca yang berwarna gelap dengan larutan HCl 5% tersebut (1:10), kemudian campuran disimpan di dalam lemari pendingin bersuhu 40C selama semalam. Setelah itu campuran tersebut disaring dengan kertas saring Whatman No.1 dengan menggunakan penyaring vakum dan filtrat yang diperoleh dianalisis kandungan antosianinnya dengan metode Less dan Francis (1972).
b. Penentuan Konsentrasi Total Antosianin (Less dan Francis 1972 yang dimodifikasi) Sebanyak 0.5 ml filtrat hasil ekstraksi diencerkan hingga 5 ml dengan etanol 95 %: HCl 1.5 N (85:15). Filtrat kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 535 nm. Total antosianin dihitung dengan rumus : [ ] Antosianin (mg/ 100 g sampel) = (Absorbansi x Faktor Pengenceran) x 100 98.2 x Wsampel (g) 14
Faktor 98.2 adalah nilai ε (serapan molar) dari pigmen antosianin dalam pelarut etanol 95%:HCl 1.5 N (85:15).
3.
Analisis Total Asam Askorbat (Jacobs 1951 yang dimodifikasi)
a.
Ekstraksi Sampel
Sebanyak ± 5 gram sampel bubuk dimasukkan dalam labu takar 50 ml dan ditambahkan aquades sampai tera, kemudian disaring dengan penyaing vakum untuk memisahkan filtrat.
b. Pembuatan Larutan Iodium Larutan iodium 0.01 N dibuat dengan cara mencampurkan 2 gram KI dan 1.269 gram I2, kemudian dilarutkan sampai volume 1 liter dengan aquades selama semalam untuk melarutkan iod secara sempurna.
c.
Penentuan Konsentrasi Asam Askorbat
Sebanyak 1 ml filtrat hasil ekstraksi diencerkan ke dalam 10 ml air dan diambil 2 ml filtrat hasil pengenceran yang dimasukkan ke dalam erlenmeyer, lalu ditambahkan dengan 0.4 ml larutan amilum (soluble starch) 1%. Larutan kemudian dititrasi dengan 0.01 N iodium. Titik akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan menjadi semburat biru. 1 ml 0.01 N iodium setara dengan 0.88 mg asam askorbat. Konsentrasi asam askorbat dihitung dengan rumus: [ ] vitamin C (mg/ 100 g sampel) = (titer (ml) x 0.88 mg x Faktor Pengenceran) x 100 Wsampel (g)
4.
Analisis Protein Lowry (Waterborg 2002 yang dimodifikasi)
a.
Ekstraksi
Homogenisasi 100 mg jaringan tumbuhan dengan 1 ml buffer. Sentrifuse sampai homogen pada kecepatan pada kecepatan 12000 g selama 20 menit, kemudian ambil bagian supernatannya. Buffer yang digunakan sama dengan buffer untuk analisis PAL.
b. Pengukuran Sebanyak 5-200 µl supernatan ditambahkan air sampai dengan 1 ml, lalu tambahkan sebanyak 0.90 ml reagen A dan kocok hingga homogen. Inkubasi larutan selama 10 menit dalam suhu 500 C dan dinginkan sejenak. Sebanyak 0.10 ml reagen B ditambahkan ke dalam larutan tersebut dan dikocok untuk kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Terakhir, larutan ditambahkan dengan 3 ml reagen C dan dikocok serta diinkubasi kembali selama 10 menit pada suhu 500 C. Larutan tersebut lalu diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang (λ) 650 nm. 15
Perhitungan protein dinyatakan dalam satuan µg per gram, seperti berikut ini: Protein (µg/gram) = Protein ekstrak (µg/ml) x Volume ekstrak (ml) x Faktor Pengenceran Bobot contoh (g)
5.
Analisis Aktivitas Phenylalanine Ammonia Lyase (PAL) (Sadasivam dan Manickam 1996)
a.
Ekstraksi Enzim
Homogenisasi 500 mg bahan sampel (plant material) dalam 5 ml buffer borat-HCl 25 mM pH 8.8 dingin yang mengandung 5 mM mercaptoethanol (0.4 mL/L). Sentrifuse sampai homogen pada kecepatan 12000 g selama 20 menit. Supernatan digunakan sebagai sumber enzim.
b. Penentuan Aktivitas Phenylalanine Ammonia Lyase (PAL) Pencampuran 0.5 ml buffer borat, 0.2 ml larutan enzim (enzyme solution), dan 1.3 ml air dalam tabung uji. Reaksi dimulai dengan penambahan 1 ml larutan L-Phenylalanine. Inkubasi larutan selama 30-60 menit pada suhu 320C. Hentikan reaksi dengan menambahkan 0.5 ml Tricholoro Acetic Acid 1 M. Sementara itu, untuk perlakuan kontrol dilakukan dengan menambahkan L-Phenylalanine setelah penambahan Tricholoro Acetic Acid. Pengukuran absorbansi sampel dilakukan pada 290 nm. Larutan standar yang digunakan adalah asam trans-cinnamic.
6.
Analisis Kualitatif Fitokimia
Tujuan tahap analisis kualitatif komponen bioaktif (fitokimia) untuk mengetahui jenis komponen bioaktif sampel ekstrak takokak secara kualitatif sebagai senyawa metabolit sekundernya. Sampel ekstrak yang diuji adalah ekstrak buah takokak (metanol PA, etil asetat, dan heksan) dan ekstrak hancuran buah takokak (metanol PA, etil asetat, dan heksan), sehingga total sampel ada enam jenis.
a.
Golongan Alkaloid (Houghton dan Raman 1998 yang dimodifikasi)
Sebanyak 1 ml ekstrak ditambahkan 10 ml kloroform dan beberapa tetes amoniak, lalu diasamkan dengan beberapa tetes asam sulfat 2 M. Hasilnya akan terbentuk 2 fase, fase asam diambil dan dibagi ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung reaksi pertama ditambahkan 3 tetes pereaksi Dragendorf, tabung kedua ditambahkan 3 tetes pereaksi Mayer, dan tabung ketiga ditambahkan 3 tetes pereaksi Wagner. Hasil uji positif untuk peraksi Dragendorf jika terdapat endapan berwarna jingga. Hasil uji positif dengan pereaksi Mayer jika terdapat endapan berwarna putih. Hasil uji positif dengan pereaksi Wagner jika terdapat endapan berwarna merah kecoklatan. Pembuatan pereaksi Mayer dengan melarutkan 1.36 g HgCl2 dalam 60 ml air suling. Pada bagian lain dilarutkan pula 5 g KI dalam 10 ml air suling. Kedua larutan ini kemudian dicampurkan dan diencerkan dengan air suling sampai 100 ml. Pereaksi ini disimpan dalam botol berwarna coklat, agar tidak rusak karena cahaya. Pereaksi Dragendorff dibuat dari 8 g KI yang dilarutkan dalam 20 ml air suling, sedangkan pada bagian lain 0.85 g bismuth sub nitrat dilarutkan dalam 10 ml asam asetat 16
glacial dan 40 ml air suling. Kedua larutan dicampurkan. Pereaksi ini disimpan dalam botol berwarna coklat. Untuk penggunaannya satu larutan ini diencerkan dengan 2/3 bagian larutan 20 ml asam asetat glacial dalam 100 ml air suling. Pereaksi Wagner dibuat dari 1.27 g iodium dan 2 g KI yang dilarutkan dalam 5 ml air suling. Kemudian larutan ini diencerkan menjadi 100 ml dengan air suling. Jika terdapat endapan dilakukan penyaringan dan disimpan dalam botol yang berwarna coklat.
b. Golongan Tanin (Harborne 1996) Sebanyak 1 ml ekstrak (2 mg dalam 5 ml etanol) ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan. Kemudian ditambahkan gelatin 1%. Jika terdapat endapan putih berarti positif tanin.
c.
Golongan Flavonoid (Harborne 1996)
Sebanyak 1 mg sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform, kemudian sebanyak 1 ml sampel cair ditetesi Pb-asetat. Hasil uji positif untuk flavon bila terbentuk warna jingga atau krem. Kalkon bila terbentuk warna jingga tua dan auron bila terbentuk warna merah.
d. Golongan Terpenoid dan Steroid (Uji Lie-Bermann-Burchard) (Harborne 1996) Sebanyak 1 ml ekstrak dilarutkan dalam 2 ml kloroform, lalu ditambahkan 10 tetes asam asetat glacial dan 3 tetes asam sulfat pekat. Larutan dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Hasil uji positif terpenoid jika terbentuk warna merah atau ungu. Hasil uji positif steroid jika tebentuk warna merah yang lalu mengalami perubahan warna menjadi biru atau hijau.
e.
Golongan Saponin (Harborne 1996)
Sebanyak 1 ml ekstrak ditambahkan 10 ml air panas lalu didinginkan dan di-vorteks selama 10 detik. Apabila terbentuk buih yang mantap selama sekitar 10 menit, artinya ekstrak mengandung senyawa saponin. Buih yang mantap jika tingginya 1-10 cm dan tidak hilang jika ditambahkan HCl 2N.
7.
Analisis Total Fenolik (Folin Ciocalteau) (Shetty et al. 1995 yang dimodifikasi)
Analisis total fenol bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa fenol pada sampel. Sampel ekstrak (metanol, etil asetat, dan heksan) ditimbang sebanyak ±100-200 mg dan dilarutkan dalam etanol PA hingga volume larutannya 2 ml, kemudian vortex selama 2 menit dan larutan inilah yang menjadi larutan stok ekstrak yang dapat disimpan dalam suhu dingin atau freezer. Lalu, larutan tersebut disentrifus pada kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Supernatan ekstrak yang diambil sekitar 12.5-100 µL, sedangkan larutan standar yang diambil sebanyak 0.5 ml dan masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan dengan 0.5 ml etanol 95%, 2.5 mL aquades,
17
dan 2.5 ml reagen Folin Ciocalteau 50%. Campuran tersebut didiamkan selama 5 menit, lalu ditambahkan 0.5 ml Na2CO3 5% dan divortex. Sampel kemudian disimpan di ruang gelap selama 1 jam. Pengukuran absorbansi sampel dilakukan pada 725 nm dengan larutan standar yang digunakan adalah asam galat dengan variasi konsentrasi 50, 100, 150, 200, dan 250 mg/L.
8.
Analisis Aktivitas Antioksidan Metode DPPH (Andarwulan et al. 2010 yang dimodifikasi)
Sampel yang diuji berupa ekstrak metanol buah dan hancuran buah yang dibuat dalam konsentrasi 200 ppm berdasarkan nilai total fenolnya. Sebanyak 100 µl larutan sampel atau standar dimasukan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 4 ml metanol (sebagai blanko adalah 4 ml metanol). Suspensi tersebut kemudian ditambahkan 1 ml larutan DPPH 0.5 mM dan dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Seluruh reaksi dilakukan pada ruang gelap. Campuran tersebut diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang, kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam bentuk persentase penghambatan (% inhibisi) terhadap radikal DPPH dengan perhitungan sebagai berikut: (%) inhibisi = (Absorbansi blanko - Absorbansi sampel) x 100% Absorbansi blanko Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam bentuk AEAC (Ascorbic Acid Equivalent Antioxidant Capacity), yaitu dengan menggunakan asam askorbat sebagai standar antioksidan. Nilai selisih absorbansi blanko dan absorbansi sampel disubstitusikan pada persamaan kurva standar asam askorbat untuk menentukan AEAC (Ascorbic Acid Equivalent Antioxidant Capacity). Nilai yang diperoleh menunjukkan jumlah mg asam askorbat yang ekivalen dengan 1 ml sampel.
9.
Analisis Data Statistik
Perhitungan data analisis total antosianin, total asam askorbat, dan total fenol buah takokak dinyatakan dalam buah segar (mg/100 gram fresh weight) dan basis kering sampel (mg/100 gram dry basis). Kemudian, beberapa data analisis terhadap total antosianin, total asam askorbat, aktivitas Phenylalanine Ammonia Lyase (PAL), perhitungan total fenol buah takokak, dan aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak diolah secara statistik dengan uji Independent Sampels T-Test untuk mengetahui perbedaan hasil analisis antara perlakuan buah dan hancuran buah takokak. Sementara itu, data analisis total fenol ekstrak buah takokak dan perhitungan yield ekstrak buah takokak diolah secara statistik dengan uji Univariate Analysis of Variance (ANOVA) untuk mengetahui perbedaan hasil analisis akibat pengaruh perlakuan buah dan hancuran buah takokak serta pengaruh jenis pelarut ekstraksi (metanol, etil asetat, dan heksan).
18
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Pengaruh Perlakuan Terhadap Komponen Bioaktif Buah Takokak Metode penelitian yang dilakukan diawali dengan tahap pemberian perlakuan terhadap sampel segar buah takokak dengan membagi sampel menjadi dua perlakuan, yaitu perlakuan buah utuh atau tanpa penghancuran dan hancuran buah. Tujuan pemberian perlakuan untuk mengidentifikasi dan memperoleh komponen bioaktif buah takokak dengan memberikan pengaruh penghancuran pada sebagian sampelnya, sehingga dapat diketahui dampaknya dan perbedaannya terhadap kandungan komponen bioaktif dengan buah yang tidak mengalami proses penghancuran. Komponen bioaktif yang diperoleh ini salah satunya berperan sebagai antioksidan. Tahap persiapan sampel diawali dengan proses penimbangan sampel segar buah takokak yang telah dipisahkan dari tangkainya sebanyak 1-2 kg. Sampel mengalami pencucian dan penirisan untuk selanjutnya dibagi menjadi dua perlakuan. Proses penghancuran buah takokak dilakukan secara bertahap atau sedikit demi sedikit, yaitu sekitar 500 gram setiap proses penghancuran selama ± 10-15 menit tanpa penambahan air hingga keseluruhan bentuk hancuran sampel yang diperoleh relatif sama (homogen) untuk setiap kali proses penghancurannya. Sampel buah utuh dan hancuran buah takokak yang diperoleh dimasukkan ke dalam plastik HDPE (bening) ukuran 1 kg, dimana ¾ bagian plastik diisi oleh sampel. Kemudian, sampel-sampel tersebut secara bersamaan dimasukkan ke dalam freezer selama satu malam dan dikeringkan dengan alat freeze dryer pada keesokan harinya selama + 48 jam. Setiap sampel diukur pula kadar air segarnya, sehingga dapat diketahui kadar air buah segar dan hancuran buah segar takokak. Berdasarkan hasil analisis kadar air, buah takokak segar memiliki kadar air sebesar 80.94% bahan basah, sedangkan hancuran buah takokak segar memiliki kadar air sebesar 84.32% bahan basah. Perhitungan kadar air sampel segar secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 1. Menurut penelitian Rahmat (2009) dan Apriady (2010), kadar air buah takokak segar yang dianalisis sebesar 89.20% bahan basah dan 79.89% bahan basah. Hal ini menunjukkan, bahwa kandungan air pada buah dan hancuran buah segar takokak yang diperoleh relatif tinggi sebagai bahan pangan segar. Nilai kadar air kedua sampel tersebut relatif tidak berbeda jauh. Pada buah segar takokak, analisis kadar air diawali dengan proses pemotongan atau pengirisan sampel. Hal ini untuk mempermudah dan mempercepat proses pengeringan. Sementara itu, untuk hancuran buah segar takokak, analisis kadar air diperoleh dari sampel buah takokak yang telah dihancurkan. Proses pemotongan atau pengirisan dan penghancuran akan berpengaruh terhadap luas permukaan bahan yang dikeringkan. Permukaan bahan yang luas ketika pengeringan akan memudahkan bahan berhubungan dengan medium pemanasan atau udara panas dan mengurangi jarak gerak panas untuk sampai ke bahan yang dikeringkan (Muchtadi 2008). Sebagai tambahan, air bebas pada bahan segar banyak yang terikat di jaringan matriks bahan, seperti kapiler, membran, serat, dan lain-lain. Air bebas ini mudah diuapkan dan sering dimanfaatkan sebagai media pertumbuhan mikroba dan media reaksireaksi kimiawi (Winarno 1980). Sebelumnya telah dijelaskan bahwa buah takokak mengalami pengeringan terlebih dahulu dengan menggunakan alat pengering beku (freeze dryer) selama ± 48 jam. Salah satu tujuan pengeringan beku dilakukan untuk mengurangi tingkat kerusakan sampel pada senyawa metabolit sekunder, khususnya senyawa flavonoid (Sandrasari 2008). Tingkat kerusakan bahan pangan yang dikeringkan dengan cara pengeringan beku menjadi lebih minimum karena prinsipnya berupa penghilangan air melalui sublimasi yakni perubahan wujud padat (es) langsung menjadi gas (uap)
19
dengan suhu pengeringan di bawah titik beku dan tekanan vakum (di bawah tekanan triple) (Fellows 2000). Proses ini dapat menghambat dan tidak memungkinkan aktivitas enzim mendegradasi senyawa di dalam bahan pangan (Chan 2009). Selain itu, pengeringan beku (freeze-drying) memiliki efisiensi ekstraksi yang tinggi daripada pengeringan udara (air-drying) karena kristal es yang terbentuk di dalam matriks bahan sebagai hasil pengeringan beku dapat memecah struktur sel yang memungkinkan keluar dari komponen seluler dan larut baik dalam pelarut, akibatnya proses ekstraksi pun akan menjadi lebih baik. Sementara itu, pengeringan udara hanya akan menyebabkan pecahnya sel sedikit saja atau bahkan tidak pecah dan adanya pengaruh pemberian panas yang dapat menyebabkan bahan yang dikeringkan kehilangan senyawa fenolik dan asam askorbat (Asami et al. 2003). Setelah proses pengeringan beku, sampel dihancurkan dengan cara diblender kering dan diayak dengan ayakan berukuran 20 mesh untuk memperoleh bubuk takokak dengan kehalusan yang cukup tinggi dan seragam. Sampel dalam bentuk bubuk akan mempermudah kontak antara bahan dan pelarutnya, sehingga proses ekstraksi lebih optimal. Hasil warna bubuk hancuran buah dan buah takokak dapat dilihat pada Gambar 8. Warna bubuk buah takokak yang diperoleh berwarna hijau muda, sedangkan bubuk hancuran buah takokak berwarna kecoklatan. Hal ini disebabkan pigmen atau warna bahan pangan sangat sensitif terhadap perubahan kimia dan fisika selama pengolahan, seperti proses penghancuran. Peningkatan aktivitas beberapa enzim akibat proses penghancuran disebabkan sel-sel tenunan dan pigment body tempat pigmen itu berada telah pecah, sehingga pigmen keluar (Muchtadi 2008). Kemudian, pigmen tersebut menjadi rusak dan teroksidasi karena kontak dengan udara yang dikatalisasi oleh enzim, seperti enzim peroksidase (POD) dan polifenol oksidase (PPO). Enzim POD dan PPO dapat mengkatalisasi berbagai proses oksidatif pada reaksi perubahan warna dan cita rasa (Gardjito et al. 2006). Dengan demikian, secara fisik terlihat sampel hancuran buah takokak mengalami perubahan warna dari hijau muda menjadi kecoklatan.
Gambar 8. Warna bubuk hancuran buah dan buah takokak (kiri ke kanan) Bubuk buah dan hancuran buah takokak hasil pengeringan beku ditentukan kadar airnya seperti pada Lampiran 2. Berdasarkan hasil analisis, kadar air bubuk buah takokak sebesar 7.72% bahan basah dan kadar air bubuk hancuran buah takokak sebesar 8.50% bahan basah. Menurut penelitian Rahmat (2009), kadar air bubuk buah takokak yang diperoleh sebesar 4.36% bahan basah dan Apriady (2010) menyebutkan bahwa kadar air buah takokak segar yang dianalisis sebesar 13.16% bahan basah. Adanya perbedaan antara hasil kadar air bubuk buah takokak pada penelitian ini dengan penelitian sebelumnya dapat disebabkan oleh faktor kondisi keragaman buah atau sampel yang diuji, seperti sumber atau buah berasal dari pohon yang berbeda dan tingkat kematangan buah yang kemungkinan bervariasi (Tanudjaja 1999). Kemudian, suatu bahan yang kadar airnya berkisar 3-7% akan mencapai kestabilan optimum, terutama pada bahan-bahan yang mengandung lemak tak jenuh yang lebih mudah mengalami oksidasi (Winarno 1980). Oleh karena itu, kadar air yang diperoleh pada bubuk buah dan hancuran buah takokak yang diuji akan membuat bahan menjadi lebih stabil selama penyimpanan, karena tingkat perubahan bahan secara biologis dan kimiawi relatif rendah.
20
Sampel bubuk buah dan hancuran buah takokak dianalisis untuk diketahui kandungan total antosianin, total asam askorbat, dan aktivitas Phenylalanine Ammonia Lyase (PAL) termasuk kandungan proteinnya dengan metode protein Lowry. Alasan penggunaan sampel bubuk untuk beberapa analisis ini karena ingin diketahui pengaruh penghancuran terhadap komponen-komponen kimia tersebut.
1.
Kandungan Antosianin Buah Takokak
Antosianin memiliki cincin aromatik bergugus polar (hidroksil, karboksil, metoksil) dan residu glikosil yang menghasilkan molekul polar. Maka dari itu, pigmen antosianin dilarutkan dengan menggunakan pelarut polar, seperti etanol, metanol, dan air (Bridle dan Timberlake 1997). Namun biasanya proses ekstraksi pun menggunakan pelarut asam untuk mendenaturasi dan merusak membran sel atau jaringan tanaman, sehingga pigmen antosianin lebih mudah keluar dari sel. Hal ini karena, antosianin senyawa yang tidak stabil dalam suasana netral atau basa (Jackman dan Smith 1996). Cara ekstraksi antosianin secara sederhana dan sering digunakan adalah dengan maserasi, yaitu merendam bahan yang diekstrak dalam alkohol, suhu rendah, dan dengan penambahan sedikit asam seperti HCl. Berdasarkan penelitian oleh Raharja dan Dianawati (2001), bahwa ekstraksi antosianin pada daun erpa dengan menggunakan tiga jenis pelarut, yaitu aquades, etanol, dan metanol yang masing-masing mengandung HCl, maka ditemukan bahwa aquades yang mengandung HCl (HCl 5% dalam aquades) cukup asam untuk memecah dinding sel vakuola dimana pigmen antosianin berada. Namun pelarut ini tidak terlalu asam untuk membuat kerusakan pigmen. Pemilihan jenis pelarut HCl 5% dalam aquades untuk penelitian ini pun diperkuat dengan penelitian yang dilakukan oleh Kurniasih (2010), bahwa penelitian kandungan antosianin pada 24 sampel sayuran indigenous menunjukkan nilai yang relatif tinggi, khususnya pada buah takokak. Beberapa metode untuk mengetahui kandungan antosianin suatu bahan, antara lain metode dengan larutan yang memiliki nilai satu pH dan metode dengan menggunakan dua larutan dengan dua nilai pH yang berbeda. Salah satu metode dengan menggunakan satu nilai pH dalm penelitian ini, yaitu metode Lees dan Francis (1972). Total antosianin dihitung berdasarkan absorbansi ekstrak yang dilarutkan dalam etanol 95%:HCl 1.5 N (85:15) pada panjang gelombang 535 nm. Nilai serapan molar yang digunakan adalah 98.2, yaitu nilai E (1%, 1 cm, 535 nm) untuk pelarut etanol yang diasamkan. Nilai tersebut merujuk pada absorpsi campuran antosianin buah cranberry di dalam etanol asam yang diukur di dalam celah selebar 1 cm pada panjang gelombang 535 nm dengan konsentrasi 1% (w/v). Hasil nilai total antosianin buah dan hancuran buah takokak ini dihitung dalam berat segar (fresh weight) yang secara berurutan sebesar 3.42 mg/100 gram fresh weight dan 5.33 mg/100 gram fresh weight atau dalam basis keringnya (dry basis) sebesar 17.93 mg/100 gram dry basis dan 34.01 mg/100 gram dry basis. Perhitungan total antosianin takokak secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 3. Pengolahan data nilai total antosianin buah dan hancuran buah takokak menggunakan uji t-test dengan output seperti pada Lampiran 4. Hasil uji statistik menunjukkan adanya perbedaan yang nyata terhadap nilai kandungan antosianin kedua sampel dalam basis kering sampel (dry basis) seperti pada Gambar 9. Hal ini terlihat dari nilai signifikansi sampel yang dihasilkan, yaitu lebih kecil dari taraf α (0.05).
21
Keterangan : Tanda * dan ** menunjukkan berbeda nyata (p<0.05) dengan uji t-test
Gambar 9. Total antosianin buah takokak berdasarkan dry basis Perbedaan nilai total antosianin buah dan hancuran buah karena pigmen antosianin buah berwarna lebih kehijauan dan hancuran buah takokak berwarna lebih merah kecoklatan. Pada sampel buah takokak, antosianin kurang terlarut baik dalam pelarut ekstrak karena membran sel tempat pigmen antosianin berada tidak terdenaturasi secara baik. Di samping itu, pigmen klorofil (zat hijau) buah takokak lebih mendominasi daripada pigmen antosianin. Aktivitas pembentukan antosianin pada bagian-bagian tanaman (termasuk buah) dapat terjadi secara bersamaan dengan pembentukan klorofil. Kemudian, pigmen antosianin pada hancuran buah takokak lebih terlarut baik pada pelarut ekstrak karena pada awal persiapan sampel, sampel mengalami penghancuran, sehingga membran sel tempat pigmen antosianin berada sudah terdegradasi lebih awal. Nilai total antosianin buah takokak yang diuji, baik yang dalam kondisi buah utuh atau pun hancuran buah lebih rendah daripada buah terong (Solanum melongena) sebesar 45.01 mg/100 gram fresh weight (Sadilova et al. 2006). Namun, nilai total antosianin buah takokak yang diuji pada penelitian ini masih berada atau dekat hasilnya dengan.nilai total antosianin buah takokak penelitian Kurniasih (2010), yaitu sebesar 22.09 mg/100 gram dry basis.
2.
Kandungan Asam Askorbat (Vitamin C) Buah Takokak
Analisis vitamin C dalam penelitian ini menggunakan pelarut air untuk mengekstrak dan membantu melarutkan vitamin C dari bubuk buah dan hancuran buah takokak. Hal ini disebabkan asam askorbat atau vitamin C merupakan salah satu vitamin yang tergolong larut air disamping vitamin-vitamin B kompleks (Winarno 1997). Metode yang digunakan untuk mengetahui total asam askorbat sampel menggunakan metode titrasi dengan iodium. Ekstrak sampel yang diperoleh direaksikan dengan larutan amilum (soluble starch) 1%. Larutan ini merupakan indikator perubahan warna ekstrak setelah dititrasi dengan 0.01 N iodium, menjadi warna semburat biru. Sebanyak 1 ml 0.01 N iodium setara dengan 0.88 mg asam askorbat, sehingga hasil titrasi yang diperoleh dapat dikalkulasikan menjadi seberapa banyak asam askorbat (vitamin C) dalam sampel tersebut. Perhitungan total asam askorbat dapat dilihat pada Lampiran 5. Hasil total asam askorbat (vitamin C) buah dan hancuran buah takokak dalam berat segar (fresh weight) berturut-turut sebesar 85.37 mg/100 gram fresh weight dan 60.30 mg/100 gram fresh weight, sedangkan dalam basis kering sampel (dry basis), nilai total asam askorbat buah takokak sebesar 447.91 mg/100 gram dry basis dan hancuran buah takokak sebesar 384.55 mg/100 gram dry basis. Pengujian secara statistik untuk nilai total asam askorbat (vitamin C) sampel menggunakan uji t-test dengan output seperti pada Lampiran
22
6. Nilai total asam askorbat buah takokak terlihat berbeda nyata (p<0.05) dengan nilai total asam askorbat hancuran buah takokak pada taraf signifikansi 5% setelah di uji t-test dalam dry basis (Gambar 10).
Keterangan : Tanda * dan ** menunjukkan berbeda nyata (p<0.05) dengan uji t-test
Gambar 10. Total asam askorbat (vitamin C) buah takokak berdasarkan dry basis
Nilai total asam askorbat buah takokak lebih tinggi dari hancuran buah takokak dan secara statistik berbeda nyata untuk kedua jenis sampel ini. Hal tersebut dikarenakan buah takokak tidak mengalami penghancuran (perlakuan mekanis) pada persiapan sampel. Vitamin C mudah mengalami kerusakan akibat oksidasi, panas, dan alkali, sehingga pengirisan dan penghancuran yang berlebihan dapat menyebabkan vitamin C pada bahan banyak yang hilang (Winarno 1997). Penurunan kadar vitamin C pada takokak akibat penghancuran akan membuat bahan mudah teroksidasi dan kemungkinan akan memicu pula aktivitas enzim, seperti peroksidase, asam askorbat oksidase, sitokrom oksidase, dan fenolase. Penelitian Kurniasih (2010) pun menyebutkan, bahwa kandungan asam askorbat buah takokak sebagai salah satu sampel sayuran indigenous dari ke-24 sampel yang diuji sebesar 639.98 mg/100 gram dry basis. Apabila dibandingkan dengan sayuran buah lainnya yang masih satu famili Solanaceae, total asam askorbat buah dan hancuran buah takokak yang diuji relatif masih lebih tinggi. Seperti penelitian Vasco et al. (2008) yang menyebutkan bahwa total asam askorbat dari buah naranjilla (Solanum quitoense Lam.) dan pepino (Solanum muricatum Ait.) hanya sebesar 11-13 mg/100 gram fresh weight dan 20-38 mg/100 gram fresh weight. Begitu pula dengan total asam askorbat buah terong (Solanum melongena) yang hanya mengandung 12.0 mg/100 gram fresh weight (Gopalan et al. 2007) dan 56–129 mg/100 gram dry basis (Hanson et al. 2006) serta total asam askorbat Solanum aethiopicum sebesar 71-98 mg/100 gram dry basis (Hanson et al. 2006). Total asam askorbat buah dan hancuran buah takokak ini sudah dapat mencukupi kebutuhan tubuh akan kebutuhan vitamin C setiap harinya. Kebutuhan tubuh akan vitamin C berdasarkan RDA (Recommended Dietary Allowance) atau AKG (Angka Kecukupan Gizi) untuk pria dewasa dan wanita menurut National Academy of Science (2000) adalah 75-90 mg/hari.
3.
Phenylalanine Ammonia Lyase (PAL) Buah Takokak
Phenylalanine Ammonia Lyase (PAL) (E.C. 4.1.1.5) merupakan salah satu enzim yang berperan dalam metabolisme sekunder pada tanaman. Menurut Sadasivam dan Manickam (1996), PAL berperan dalam konversi substrat asam amino aromatik L-fenilalanin menjadi asam trans-
23
sinamat. Aktivitas PAL dalam penelitian ini dinyatakan sebagai jumlah asam trans sinamat (µmol) yang terbentuk per mg protein setiap menit. Perhitungan nilai protein takokak dengan metode Lowry. Perhitungan kurva standar yang diperoleh untuk standar protein BSA tercantum pada Lampiran 7a dengan persamaan garis yang diperoleh y = 0.0034x + 0.0342 dan R² = 0.9993. Nilai kandungan protein Lowry dapat dilihat pada Lampiran 7b, dimana kandungan protein bubuk buah takokak dan bubuk hancuran buah takokak, yaitu sebanyak 48.83 µg/g sampel dan 55.97 µg/g sampel. Kemudian, kurva standar aktivitas PAL berupa asam trans sinamat tercantum pada Lampiran 7c dan perhitungan aktivitas PAL buah takokak dapat dilihat pada Lampiran 7d. Persamaan garis standar asam trans sinamat adalah y = 0.1246x - 0.2953 dan R² = 0.9984. Hasil aktivitas PAL (Gambar 11) buah dan hancuran buah takokak yang diperoleh sebesar 1.37 µmol trans cinnamic acid/mg protein/menit dan 0.76 µmol trans cinnamic acid/mg protein/menit. Hasil aktivitas PAL diuji secara statistik dengan uji t-test (Lampiran 8) dan hasilnya menunjukkan adanya perbedaan nyata antara aktivitas PAL buah takokak dengan aktivitas PAL hancuran buah takokak pada taraf signifikansi 5%, karena nilai signifikansi sampel lebih kecil dari 0.05 (p<0.05). Nilai aktivitas PAL buah takokak lebih tinggi dibandingkan aktivitas PAL hancuran buah takokak, karena proses penghancuran bahan akan membuat aktivitas PAL menjadi turun akibat protein dalam bahan mengalami denaturasi dan pada saat itu konformasi enzim tidak berada pada posisi yang sesuai untuk dapat menempel pada substratnya (Tanudjaja 1999). Aktivitas PAL dibandingkan terhadap protein bahan karena enzim PAL berfungsi untuk mengkatalisis perubahan asam amino aromatik fenilalanin menjadi asam trans sinamat. Fenilalanin yang termasuk asam amino aromatik bercincin benzena ini diidentifikasi dengan metode Lowry. Metode Lowry merupakan salah satu metode untuk mengetahui jumlah protein atau asam amino jenis aromatik, seperti tirosin, triptofan, dan fenilalanin dengan mereduksi Cu2+ menjadi Cu+. Ion Cu+ akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteau, kompleks phosphomolibdat-phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropolymolybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri (Lowry 1951). Kandungan protein bahan ini berbeda dengan aktivitas PAL yang ditunjukkan. Hal ini disebabkan, protein yang diperoleh dengan metode Lowry tidak semuanya adalah asam amino jenis fenilalanin. Namun demikian, kandungan asam amino fenilalanin buah takokak kemungkinan lebih banyak daripada asam amino fenilalanin hancuran buah takokak, sehingga aktivitas PAL buah takokak relatif lebih tinggi.
Keterangan : Tanda * dan ** menunjukkan berbeda nyata (p<0.05) dengan uji t-test
Gambar 11. Aktivitas Phenylalanine Ammonia Lyase (PAL) buah takokak
24
Penelitian terkait aktivitas PAL relatif masih terbatas, khusunya untuk famili Solanaceae. Nilai aktivitas Phenylalanine Ammonia Lyase (PAL) buah takokak termasuk rendah jika dibandingkan dengan aktivitas PAL dari buah segar seperti buah tomat yang belum diinfeksi larva sebesar 5 µmol trans sinamat/mg protein N (Brueske 1980). Kemudian, aktivitas PAL yang terdeteksi pada kulit buah segar blueberries sebesar 2.3 µmol/mg protein dan cranberries beku (frozen powder) sebesar 0-3.5 µmol/mg protein (Sapers et al. 1987). Namun, aktivitas PAL relatif lebih tinggi dibandingkan host plant Persea bombycina dengan tingkat kematangan medium sebesar 4.14 x 10-3 µmol/mg/menit dan host plant Litsea citrate sebesar 0.96 x 10-3 µmol/mg/menit seperti pada penelitian Neog et al. (2011). Beberapa faktor lain yang mempengaruhi aktivitas PAL adalah cahaya atau sinar, keragaman buah (bahan), perlakuan stress pada tanaman, dan kematangan buah. Total aktivitas PAL setiap buah akan lebih tinggi nilainya saat buah tersebut matang dibandingkan buah yang masih muda (Cheng et al. 1991). Umumnya, nilai antosianin berkaitan dengan nilai aktivitas PAL, namun kondisi tersebut tidaklah mutlak. Seperti pada penelitian buah takokak ini, nilai total antosianin buah takokak tidak berkorelasi atau tidak mempengaruhi nilai aktivitas PAL-nya. Peningkatan aktivitas PAL tidak selalu bertanggung jawab pada akumulasi antosianin pada suatu bahan. PAL hanya merupakan enzim kunci untuk menghasilkan prekursor zat warna bagi tanaman, salah satunya seperti antosianin. Pengaturan konsentrasi prekursor inilah yang kemungkinan berpengaruh terhadap jumlah antosianin yang dihasilkan. Tetapi, jika jumlah prekursor pada buah telah mencukupi, perubahan aktivitas PAL tidak berkaitan dengan akumulasi antosianin. Kondisi maksimum aktivitas PAL dan antosianin bisa berbeda. Kemudian, penemuan lainnya menemukan bahwa jenis senyawa fenol sederhana lebih erat berkorelasi dengan tingkat PAL daripada antosianin karena fenol sederhana dihasilkan pada awal biosintesis fenolik melalui jalur fenilpropanoid dengan melibatkan enzim PAL (Ju et al. 1995).
B. Kualitatif dan Kuantitatif Komponen Bioaktif Ekstrak Buah Takokak Tahap penelitian ini selanjutnya adalah tahap pengekstraksian sampel bubuk buah takokak. Tujuannya untuk memperoleh zat atau senyawa kimia (fitokimia) yang berperan sebagai metabolit sekunder dari ekstrak, sehingga dapat diketahui pula perubahan senyawa tersebut dan kadar serta aktivitas antioksidan pada hancuran buah. Tahap ekstraksi sampel bubuk takokak dengan menggunakan metode ekstraksi maserasi. Metode ini merupakan salah satu metode ekstraksi yang cukup sederhana karena dilakukan dengan cara melarutkan sampel menggunakan pelarut, perendaman selama beberapa hari, dilakukan pengadukan, dan proses penyaringan hingga diperoleh cairan (Pandiangan 2008). Pada proses ekstraksi, sampel bubuk buah dan hancuran buah takokak dilarutkan dengan pelarut organik, yaitu metanol (polar), etil asetat (semi polar), dan heksan (non polar). Penggunaan ketiga pelarut organik yang berbeda kepolarannya ini akan menentukan jenis komponen bioaktif (fitokimia) yang terekstrak dari sampel. Oleh karena itu, sampel ekstrak yang diperoleh dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif. Warna ekstrak hasil ekstraksi buah dan hancuran buah takokak dapat dilihat pada Gambar 12. Warna ekstrak bubuk buah takokak dan bubuk hancuran buah takokak yang dilarutkan dalam pelarut metanol, etil asetat, dan heksan tidak berbeda. Warna hijau yang diperoleh dari jenis ekstrak metanol dan etil asetat menunjukkan bahwa kemungkinan buah dan hancuran buah takokak mengandung senyawa klorofil (zat hijau). Sementara itu, warna kuning yang diperoleh dari jenis ekstrak heksan menunjukkan bahwa buah dan hancuran buah diduga mengandung senyawa flavonoid, karotenoid, dan antosianin.
25
a
b
c
d
e
f
Gambar 12. Ekstrak buah takokak pelarut heksan (a), etil asetat (b), dan metanol (c); Ekstrak hancuran buah takokak pelarut heksan (d), etil asetat (e), dan metanol (f)
1.
Kualitatif Fitokimia Ekstrak Buah Takokak
Hasil ekstraksi buah dan hancuran buah takokak dianalisis lanjut secara kualitatif dengan melihat perubahan warna setelah ekstrak ditambahkan zat-zat kimia atau perlakuan tertentu. Perubahan warna atau secara fisik ekstrak menunjukkan bahwa ekstrak mengandung komponen senyawa bioaktif tertentu. Hasil analisis kualitatif komponen bioaktif (fitokimia) ekstrak buah dan hancuran buah dari pelarut metanol, etil asetat, dan heksan secara keseluruhan tidak berbeda. Perbedaan kandungan komponen kimia terdapat pada ekstrak antar pelarut. Ekstrak buah utuh dan hancuran buah untuk jenis pelarut metanol mengandung alkaloid, flavonoid jenis flavon, tanin, dan saponin. Sementara itu, ekstrak buah utuh dan hancuran buah untuk jenis pelarut etil asetat dan heksan mengandung alkaloid, flavonoid jenis flavon, terpenoid, dan saponin. Perbandingan hasil fitokimia ekstak buah takokak dengan beberapa penelitian lainnya dapat dilihat secara lengkap pada Tabel 2. Menurut Chah et al. (2000), ekstrak metanol buah takokak yang diuji menunjukkan adanya kandungan alkaloid, flavonoid, tanin, dan saponin. Adanya kandungan komponen bioaktif ini ditunjukkan dengan adanya perubahan warna atau endapan (+). Hasil penelitian Rammohan et al. (2011) menunjukkan hasil positif adanya kandungan alkaloid, isoflavonoid, dan tanin pada ekstrak metanol buah takokak. Sementara itu, Stevanie et al. (2007) menyatakan adanya hasil positif terhadap kandungan flavonoid dan terpenoid pada sampel ekstrak n-heksan buah takokak yang diuji. Penelitian Sapkale et al. (2009) menyatakan bahwa adanya kandungan positif terhadap flavonoid, alkaloid, tanin, dan steroid pada ekstrak alkohol buah takokak (Solanum torvum Swartz.). Dengan demikian, secara umum hasil fitokimia ekstrak metanol buah dan hancuran buah takokak yang diuji masih memiliki banyak kesamaan dengan hasil fitokimia ekstrak metanol atau etanol dari sayuran buah lainnya yang masih termasuk famili Solanaceae. Perbedaannya lebih terletak pada jenis flavonoid yang teridentifikasi pada ekstrak metanol buah dan hancuran buah takokak, yaitu jenis flavon, sedangkan jenis flavonoid ekstrak metanol buah takokak pada penelitian Rammohan et al. (2011) adalah jenis isoflavonoid.
26
Tabel 2. Hasil kualitatif komponen bioaktif (fitokimia) ekstrak sayuran buah famili Solanaceae Nama Indonesia
Nama Latin
Takokak (buah dan hancuran buah)
Solanum torvum Swartz.
Takokak
Terong Terong Belanda Leunca
Pepino Terong hias
Ekstrak Metanol Etil Asetat Heksan
Solanum torvum Swartz.
Alkaloid Dragendorff Mayer + + + -
+
Wagner + + +
Flavonoid
Tanin
Terpenoid
+ (flavon) + (flavon)
+ -
+
-
+ +
+ (flavon)
-
+
-
+
Metanol
+*
+
+
Alkohol
+*
+
+
Metanol
+*
+ (isoflavonoid)
+
Steroid Saponin
+ +
Chah et al. (2000) Sapkale et al. (2009) Rammohan et al. (2011) Stevanie et al. (2007) Latha dan Kannabiran (2006) Hassan et al. (2006)
n-Heksana
+
Solanum trilobatum Linn.
Aqueous
+
+
+
Solanum gilo
Metanol
+*
+
+
+
Metanol Solanum melongena Aqueous Solanum betaceum Etanol Cav. Solanum nigrum Etanol Linn. Solanum Aqueous aethiopicum L. Solanum Aqueous macrocarpon L. Solanum Sari buah muricatum Aiton. (air) Solanum Metanol macranthum
+ +
+ +
+ +
+ +
+
Tiwari et al. (2009)
+
+
+
+
Sinaga (2009)
+
+
+
Karmakar et al. (2010)
+*
+
+*
+
Referensi
+*
+
+
+
+
+
+*
+
+
+
-
+
+*
+
+
+*
+
+
+
+
Chinedu et al. (2011) Saptarini et al. (2011) Olayemi et al. (2011)
Keterangan: (+) : (+)menunjukkan me Keterangan adanya perubahan dalam bentuk warna atau endapan; (+*) menunjukkan bahwa referensi tidak menjelaskan hasil fitokimia alkaloid dengan metode spesifik; (-) tidak menunjukkan adanya perubahan dalam bentuk warna atau endapan 27
27
Senyawa alkaloid terdapat pada ketiga pelarut, yaitu metanol, etil asetat, dan heksan. Hal ini dikarenakan senyawa alkaloid hanya dapat terlarut baik pada pelarut organik. Senyawa alkaloid merupakan senyawa organik (metabolit sekunder) terbesar diantara senyawa lainnya baik secara jumlah maupun penyebarannya (Astuti et al. 1995). Oleh karena itu, kemungkinan ditemukannya senyawa alkaloid pada ketiga ekstrak buah dan hancuran buah menjadi lebih besar. Senyawa flavonoid dan tanin merupakan senyawa fenolik yang dapat larut dalam pelarut polar karena adanya gugus hidroksi, sehingga pada ekstrak metanol, senyawa ini dapat terdeteksi. Kemudian, pada pelarut etil asetat yang bersifat semipolar juga ditemukan adanya senyawa flavonoid dan fenol, karena sifat pelarut etil asetat yang mampu mengekstrak senyawa bersifat polar dan non polar. Pada ekstrak buah dan hancuran buah pelarut heksan dapat ditemukan adanya senyawa flavonoid. Hal ini dimungkinkan, struktur senyawa flavonoid pada pelarut heksan merupakan aglikon flavonoid, yaitu flavonoid tanpa gula terikat. Contoh senyawa aglikon flavonoid, seperti isoflavon, flavonon, flavon, dan flavonol yang termetoksilasi yang cenderung lebih mudah larut dalam pelarut non polar (Markham 1988).Senyawa terpenoid, steroid, dan saponin termasuk senyawa yang dapat larut lemak, sehingga dapat terekstrak dengan pelarut non polar, seperti heksan. Saponin pun masih dapat ditemukan pada pelarut polar metanol (Cowan 1999). Setelah diketahui hasil analisis ekstrak secara kualitatif, sampel ekstrak juga dianalisis secara kuantitatif dengan menganalisis kandungan total fenolnya dalam setiap ekstrak, sehingga dapat dihitung pula nilai total fenol buah dan hancuran buah takokak.
2.
Total Fenol dan Yield Ekstrak Buah Takokak
Total fenol ekstrak diperoleh dengan mereaksikan ekstrak sampel dari masing-masing pelarut (metanol, etil asetat, dan heksan) bersama senyawa folin. Senyawa fenol dapat bereaksi dengan gugus kromofor pada fenolik dan dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 725 nm. Perhitungan total fenol ekstrak dengan membandingkan fenol pada kurva standar asam galat. Persamaan garis dari kurva standar asam galat adalah y = 0.0035x - 0.0719 dengan nilai R2 = 0.9985. Konsentrasi asam galat yang dibuat adalah 50, 100, 150, 200, dan 250 mg/L. Kurva standar asam galat dapat dilihat pada Lampiran 9a. Perhitungan total fenol ekstrak dilakukan untuk setiap jenis ekstrak. Perhitungan total fenol ekstrak buah dan hancuran buah dalam satuan mg/100 gram dapat dilihat secara lengkap pada Lampiran 9b dan 9c. Nilai rata-rata total fenol ekstrak metanol, etil asetat, dan heksan buah takokak secara berurutan adalah 99.24 mg/100 gram ekstrak, 218.62 mg/100 gram ekstrak, dan 187.31 mg/100 gram ekstrak. Sementara itu, nilai rata-rata total fenol untuk ekstrak metanol hancuran buah sebesar 72.53 mg/100 gram ekstrak, ekstrak etil asetat dan heksan hancuran buah berturut-turut sebesar 204.14 mg/100 gram ekstrak dan 203.79 mg/100 gram ekstrak. Hasil uji ANOVA total fenol ekstrak buah takokak berbeda nyata (p<0.05) pada taraf signifikansi 5% terhadap jenis pelarutnya, namun untuk perlakuan buah dan hancuran buah tidak berbeda nyata pada taraf signifikansi 5% karena nilai signifikansi sampel lebih besar (p>0.05), seperti terlihat pada Lampiran 10a. Perbedaan hasil ANOVA dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan pada Lampiran 10b. Hasil uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa total fenol ekstrak untuk jenis pelarut antara ekstrak metanol dengan ekstrak etil asetat dan heksan berbeda nyata karena berada pada subset yang berbeda. Kemudian, hasil uji ANOVA total fenol ekstrak untuk faktor interaksi perlakuan (buah dan hancuran buah) dan jenis pelarut berbeda nyata (p<0.05) pada taraf signifikansi 5%, seperti terlihat pada Lampiran 10c. Hasil perbedaan ini dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan yang dapat dilihat di Lampiran 10d. Hasil uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa total fenol ekstrak untuk perlakuan buah 28
ekstrak metanol berada pada subset yang sama dengan hancuran buah ekstrak metanol. Namun, kedua sampel tersebut berbeda subset dengan buah atau hancuran buah ekstrak etil asetat dan buah atau hancuran buah ekstrak heksan. Dengan demikian, pengaruh perlakuan berupa buah dan hancuran buah tidak menyebabkan perbedaan secara signifikan terhadap nilai total fenol ekstrak. Sementara itu, pengaruh jenis pelarut menyebabkan perbedaan yang signifikan terhadap nilai total fenol ekstrak. Nilai total fenol ekstrak untuk perlakuan (buah dan hancuran buah takokak) dan jenis pelarut dapat dilihat pada Gambar 13.
Keterangan : Huruf yang berbeda menunjukkan berbeda nyata (p<0.05) dengan uji lanjut Duncan
Gambar 13. Total fenol ekstrak buah takokak untuk perlakuan (buah dan hancuran buah) dan jenis pelarut
Perhitungan yield ekstrak dilakukan untuk mengetahui berat fenol tiap ekstrak terhadap berat kering bahan yang diekstrak. Berat fenol dalam tiap ekstrak diperoleh dari total fenol ekstrak dengan berat ekstrak dari masing-masing pelarut. Yield yang diperoleh dari ekstrak metanol, etil asetat, dan heksan buah takokak secara berturut-turut sebesar 0.0330%, 0.0067%, dan 0.0035%. Sementara itu, yield yang diperoleh dari ekstrak metanol, etil asetat, dan heksan hancuran buah takokak secara berturut-turut sebesar 0.0246%, 0.0031%, dan 0.0021%. Perhitungan yield secara lengkap dapat dilihat di Lampiran 11. Hasil uji ANOVA yield ekstrak buah takokak berbeda nyata (p<0.05) pada taraf signifikansi 5% terhadap jenis pelarutnya, namun untuk perlakuan buah dan hancuran buah tidak berbeda nyata pada taraf signifikansi 5% karena nilai signifikansi sampel lebih besar (p>0.05), seperti terlihat pada Lampiran 12a. Perbedaan hasil ANOVA dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan pada Lampiran 12b. Hasil uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa yield ekstrak untuk jenis pelarut antara ekstrak metanol dengan ekstrak etil asetat dan heksan berbeda nyata karena berada pada subset yang berbeda. Kemudian, hasil uji ANOVA yield ekstrak untuk faktor interaksi perlakuan (buah dan hancuran buah) dan jenis pelarut berbeda nyata (p<0.05) pada taraf signifikansi 5%, seperti terlihat pada Lampiran 12c. Hasil perbedaan ini dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan yang dapat dilihat di Lampiran 12d. Hasil uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa yield ekstrak untuk perlakuan buah ekstrak metanol berada pada subset yang sama dengan hancuran buah ekstrak metanol. Namun, kedua sampel tersebut berbeda subset dengan buah atau hancuran buah ekstrak etil asetat dan buah atau hancuran buah ekstrak heksan. Dengan demikian, pengaruh perlakuan berupa buah dan hancuran buah 29
tidak menyebabkan perbedaan secara signifikan terhadap nilai yield ekstrak. Sementara itu, pengaruh jenis pelarut menyebabkan perbedaan yang signifikan terhadap nilai yield ekstrak. Nilai yield ekstrak untuk perlakuan (buah dan hancuran buah takokak) dan jenis pelarut dapat dilihat pada Gambar 14. \
Keterangan : Huruf yang berbeda menunjukkan berbeda nyata (p<0.05) dengan uji lanjut Duncan
Gambar 14. Yield ekstrak buah takokak untuk perlakuan (buah dan hancuran buah) dan jenis pelarut
Hasil yield ekstrak buah takokak terbaik diperoleh dari ekstrak metanol buah dan hancuran buah takokak, sedangkan nilai total fenol ekstrak tertinggi diperoleh dari ekstrak etil asetat buah takokak sebesar 218.62 mg/100 gram ekstrak dan diikuti oleh ekstrak etil asetat hancuran buah takokak sebesar 204.14 mg/100 gram ekstrak. Hasil total fenol ekstrak dan yield ekstrak tidak berbanding lurus. Hal ini dikarenakan yield ekstrak ditentukan oleh berat akhir ekstrak yang diperoleh dari tiap jenis pelarut terhadap berat awal bubuk (bahan), dimana hasil berat akhirnya berbeda-beda. Rata-rata berat akhir ekstrak dari pelarut metanol untuk bubuk buah dan bubuk hancuran buah lebih banyak diperoleh dibandingkan dengan ekstrak dari jenis pelarut lainnya, yaitu etil asetat dan heksan. Komponen-komponen kimia pada buah dan hancuran buah relatif lebih banyak terlarut di pelarut metanol. Komponen tersebut bukan hanya komponen fenolik (-OH) atau komponen bermolekul kecil saja, akan tetapi juga komponen lainnya yang bermolekul besar dan komponen non fenolik yang kemungkinan bersifat polar. Penggunaan pelarut metanol yang bersifat polar untuk memperoleh komponen yang juga bersifat polar, seperti gula, asam amino, dan glikosida (Houghton dan Raman 1998), terpenoid, saponin, alkaloid, dan kuasinoid. Oleh karena itu, pelarut metanol dapat mengekstrak komponen atau senyawa bioaktif lebih banyak. Kemudian, pelarut heksan biasanya dapat mengekstrak senyawa non polar lainnya seperi lilin, lemak, dan minyak atsiri (Houghton dan Raman 1998) dan senyawa fenolik yang ikut terlarut atau bergabung dengan senyawa non polar, seperti terpenoid dan steroid. Pelarut etil asetat sendiri dapat mengekstrak senyawa yang bersifat polar dan juga non polar karena sifatnya yang semi polar. Total fenol ekstrak terlarut baik pada pelarut etil asetat daripada metanol karena kemungkinan senyawa fenolik pada ekstrak etil asetat lebih banyak jumlahnya ketika terukur oleh spektrofotometer. Sementara itu, ekstrak metanol yang memiliki berat akhir ekstrak lebih banyak, ternyata hanya memiliki sedikit senyawa fenolik yang terlarut atau terukur. Komponen-komponen molekul besar, seperti protein dan gula (karbohidrat) lebih banyak yang terekstrak. Seperti penelitian Adawiyah (1998) yang menyatakan bahwa pelarut etil asetat bersifat semipolar dan memiliki kelarutan yang 30
tinggi terhadap zat antimikroba biji buah atung dibandingkan dengan pelarut etanol (polar) yang hanya sedikit larut dan pelarut heksan (non polar) yang sama sekali tidak larut. Zat antimikroba ini dapat bersifat sebagai antioksidan juga karena biasanya mengandung senyawa fenol yang mampu menghambat pertumbuhan suatu mikroba. Dengan demikian, total fenol ekstrak etil asetat memiliki nilai yang tinggi karena pelarut ini memiliki dua sifat kelarutan, yaitu hidrofilik dan hidrofobik, sehingga mampu juga untuk mengekstrak senyawa yang bercincin benzena dengan gugus hidroksi. Menurut Harborne (1987), salah satu senyawa kurang polar yang mampu larut dengan baik dalam etil asetat adalah flavonon. Senyawa ini merupakan kelompok flavonoid aglikon. Hasil yield ekstrak buah takokak lebih tinggi daripada yield ekstrak hancuran buah, karena ekstrak buah takokak tidak mengalami proses penghancuran (perlakuan mekanis) di awal persiapannya. Oleh karena itu, komponen bioaktif pada ekstrak buah relatif masih lebih banyak daripada ekstrak hancuran buah. Perlakuan mekanis tersebut mengakibatkan terjadinya kerusakan integritas pada jaringan tanaman (Cheng dan Crisosto 1995). Kemudian, nilai total fenol ekstrak buah dan hancuran buah takokak yang diuji ini relatif lebih rendah jika dibandingkan dengan ekstrak buah lainnya yang masih satu famili Solanaceae seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3. Hal ini kemungkinan dapat disebabkan oleh varietas buah, kondisi keseragaman buah, proses ekstraksi (pelarut, suhu, dan metode), kondisi lingkungan (habitat) tanaman, dan sebagainya.
3.
Total Fenol Buah Takokak
Perhitungan total fenol dilakukan terhadap berat segar (fresh weight) dan basis kering (dry basis) untuk buah dan hancuran buah takokak. Perhitungan dilakukan berdasarkan nilai total fenol ekstrak metanol dan yield ekstrak metanol terhadap 100 gram berat segar buah takokak (mg/100 gram fresh weight) atau terhadap 100 gram basis kering sampel buah takokak (mg/100 gram dry basis). Perhitungan total fenol buah dan hancuran buah takokak ini dapat dilihat secara lengkap pada Lampiran 13. Nilai total fenol buah dan hancuran buah takokak bertutut-turut adalah 6.30 mg/100 gram fresh weight dan 3.86 mg/100 gram fresh weight atau 33.04 mg/100 gram dry basis dan 24.63 mg/100 gram dry basis. Uji statistik nilai total fenol buah takokak dalam dry basis dilakukan dengan uji t-test (Lampiran 14). Pada Gambar 15 dapat dilihat tidak adanya perbedaan signifikan antara total fenol buah takokak dan total fenol hancuran buah takokak pada taraf signifikansi 5% karena nilai signifikansi sampel lebih besar (p>0.05). Hal ini disebabkan sebelum proses ekstraksi, kedua sampel mengalami pengeringan beku, sehingga kemungkinan kehilangan senyawa fenol setelah pengeringan tidak signifikan. Seperti yang disampaikan oleh Sandrasari (2008), bahwa tujuan pengeringan beku dilakukan untuk mengurangi terjadinya kerusakan sampel pada senyawa metabolit sekunder, khususnya senyawa flavonoid yang termasuk salah satu senyawa fenol. Proses pengeringan beku tidak mengalami pemanasan dengan suhu tinggi, sehingga komponen volatil atau bioaktif bahan masih baik. Namun demikian, secara kuantitatif terlihat bahwa total fenol buah takokak relatif lebih tinggi daripada total fenol hancuran buah takokak karena kedua jenis sampel mengalami perbedaan perlakuan secara mekanis pada tahap persiapan sampel berupa penghancuran untuk sampel hancuran buah saat akan dikering bekukan. Dengan demikian, kandungan komponen fenol buah takokak yang tidak dihancurkan lebih banyak dan proses oksidasinya menjadi lebih lambat karena kerja enzim polifenol oksidase pun lambat.
31
Gambar 15. Total fenol buah takokak berdasarkan dry basis Hasil penelitian Rahmat (2009) menyebutkan, bahwa nilai total fenol takokak yang diperoleh sebesar 860.29 mg/100 gram dry basis dan memiliki kandungan flavonol berupa quarcetin dengan konsentrasinya sebesar 6.1 mg/100 gram dry basis dan myricetin sebesar 21.3 mg/100 gram dry basis, sehingga total flavonol atau flavonoid pada takokak sebesar 27.4 mg/100 gram dry basis. Flavonol merupakan senyawa flavonoid dan juga termasuk golongan senyawa fenol. Penelitian Apriady (2010) menyatakan, bahwa nilai total fenol buah takokak yang diuji sebanyak 790.12 mg/100 gram dry basis dan mengandung asam fenolat berupa asam klorogenat 164.76 mg/100 gram dry basis, asam kafeat 12.74 mg/100 gram dry basis, dan asam ferulat 1.60 mg/100 gram dry basis, sehingga total asam fenolat buah takokak berdasarkan perhitungan kurva standar campuran sebesar 179.11 mg/100 gram dry basis. Nilai total fenol yang diperoleh merupakan nilai yang berasal dari keseluruhan jumlah atau total senyawa fenol pada sampel yang diekstrak, bukan jenis senyawa fenol spesifik atau tertentu. Maka dari itu, nilai total fenol pada suatu sampel belum tentu mengandung flavonoid atau asam fenolat saja sebagai senyawa fenolnya. Nilai total fenol buah takokak hasil penelitian ini berbeda dengan penelitian sebelumnya, karena secara langsung Rahmat dan Apriady menganalisis sampel bubuk buah takokak tersebut untuk diketahui total fenolnya. Sementara itu, nilai total fenol buah takokak yang diperoleh pada penelitian kali ini berdasarkan hasil perhitungan total fenol ekstrak metanol dan yield ekstrak metanol buah takokak. Dengan kata lain, sampel yang digunakan untuk analisis total fenol pada penelitian ini berupa sampel ekstrak dari pelarut organik metanol, sehingga komponen fenol yang terekstrak pada penelitian ini kemungkinan lebih sedikit dan nilainya menjadi lebih rendah. Oleh karena itu, kandungan senyawa yang diperoleh dari nilai total fenol ekstrak metanol buah takokak pun kemungkinan hanya mengandung beberapa jenis senyawa fenol.
C. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah Takokak Berdasarkan nilai yield, ekstrak metanol memiliki yield tertinggi daripada ekstrak etil asetat dan heksan. Maka dari itu, sampel ekstrak metanol dipilih untuk analisis aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak ini. Selain itu, diasumsikan bahwa nilai aktivitas antioksidan yang terukur merupakan senyawa antioksidan yang sebagian besar berasal dari senyawa fenolik yang cenderung bersifat polar, sehingga larut baik pada pelarut metanol (polar). Metode yang digunakan untuk mengetahui aktivitas antioksidan suatu bahan cukup banyak, salah satunya adalah metode pengujian DPPH (1,1-diphenyl2-picrylhidrazyl). Metode DPPH merupakan metode yang murah, sederhana, dan cepat dalam mengukur aktivitas antioksidan suatu bahan pangan dengan melibatkan penggunaan radikal bebas 1,132
diphenyl-2-picrylhidrazyl (DPPH). Metode ini pun dapat digunakan untuk sampel padat atau cair dan tidak spesifik untuk komponen antioksidan tertentu, akan tetapi berlaku untuk aktivitas antioksidan seluruh sampel (Prakash et al. 2012). Maka dari itu, metode pengujian DPPH digunakan dalam penelitian ini untuk mengetahui aktivitas antioksidan pada takokak dengan menggunakan vitamin C (ascorbic acid) sebagai salah satu standar antioksidan murni atau aslinya. Aktivitas antioksidan bahan dapat dinyatakan dalam persen penghambatan (% inhibisi) radikal bebas DPPH (Sandrasari 2008, Andarwulan et al. 2010) dan dalam AEAC (Ascorbic acid Equivalen Antioxidant Capacity) (Prangdimurti et al. 2010). Perhitungan aktivitas antioksidan ekstrak takokak berdasarkan % inhibisi terdapat pada Lampiran 15. Ekstrak buah yang diuji dibuat dalam konsentrasi 200 ppm berdasarkan nilai total fenolnya. Nilai % inhibisi untuk aktivitas antioksidan ekstrak metanol buah takokak dan ekstrak metanol hancuran buah takokak masing-masing sebesar 84.18% dan 87.37%. Hasil nilai aktivitas antioksidan ekstrak takokak yang dinyatakan dengan % inhibisi pada Gambar 16a diolah secara statistik dengan uji t-test (Lampiran 16). Uji statistik t-test menujukkan bahwa % inhibisi ekstrak metanol buah takokak tidak berbeda nyata (p>0.05) dengan ekstrak metanol hancuran buah takokak pada taraf signifikansi 5%. Nilai aktivitas antioksidan ekstrak metanol buah takokak dan ekstrak metanol hancuran buah takokak dibandingkan hasilnya dengan asam askorbat dalam bentuk AEAC. Nilai AEAC diperoleh dari kurva standar asam askorbat. Kurva standar asam askorbat yang diperoleh dan hasil perhitungan AEAC dapat dilihat pada Lampiran 17 dan 18. Persamaan garis yang diperoleh dari kurva standar asam askorbat yaitu y = 1.6686x + 0.0065 dengan R² = 0.9943. Nilai AEAC ekstrak metanol buah takokak dan ekstrak metanol hancuran buah takokak sebesar 0.23 mg/ml dan 0.24 mg/ml. Aktivitas antioksidan ekstrak takokak yang dinyatakan dalam AEAC pada Gambar 16b diolah secara statistik dengan uji t-test (Lampiran 19). Uji statistik t-test menujukkan bahwa nilai AEAC ekstrak metanol buah takokak tidak berbeda nyata dengan ekstrak metanol hancuran buah takokak pada taraf signifikansi 5%, karena nilai signifikansi sampel lebih dari 0.05.
(a)
(b)
Gambar 16. Aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak berdasarkan % inhibisi (a) dan AEAC (b) Persentase inhibisi dan AEAC ekstrak metanol buah takokak tidak berbeda nyata dengan hancuran buah takokak, artinya senyawa antioksidan secara keseluruhan pada sampel mampu menghambat radikal bebas DPPH yang ditandai dengan indikator perubahan warna larutan dari ungu tua menjadi kuning terang atau tidak berwarna. Perubahan warna ini dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Hal tersebut terjadi akibat interaksi senyawa antioksidan bahan dengan elektron atau atom hidrogen pada radikal bebas DPPH, sehingga radikal bebas DPPH menjadi netral dan membentuk DPPH tereduksi (DPPH-H) (Sharma dan Bhat 2009). 33
Semakin pudar warna ungu yang dihasilkan dari larutan uji akan menunjukkan selisih nilai absorbansi yang tinggi pula, dan nilai aktivitas antioksidan sampel uji akan semakin besar. Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, bahwa penggunaan ekstrak metanol dalam uji aktivitas antioksidan buah takokak karena diasumsikan komponen bioaktif antioksidannya sebagian besar bersifat polar. Senyawa antioksidan di dalam tanaman tingkat tinggi selain senyawa protein, senyawa bernitrogen, karotenoid, dan vitamin C adalah senyawa fenolik (Larson 1988). Senyawa fenolik yang berfungsi sebagai antioksidan primer ini dalam tanaman bersifat polar, dapat berupa vitamin E, flavonoid, asam fenolat, dan senyawa fenol lainnya (Andarwulan et al. 1996). Senyawasenyawa fenolik tersebut dapat terlarut secara baik dalam pelarut polar, yaitu metanol. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Sandrasari (2008) bahwa sampel uji dikatakan memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat jika sampel mampu menghambat perkembangan radikal bebas lebih dari 80%, dikatakan sedang jika mampu menghambat sebesar 50-80%, dan dikatakan lemah jika kemampuan penghambatan kurang dari 50%. Hasil data % inhibisi ekstrak metanol buah dan hancuran buah takokak menunjukkan nilai yang tinggi, yaitu lebih dari 80%. Hal ini berarti ekstrak metanol buah dan hancuran buah takokak mempunyai aktivitas antioksidan yang sangat kuat dan dapat dijadikan sebagai sumber antioksidan alami. Proses penghancuran pada sampel menujukkan tidak adanya perbedaan secara signifikan dalam nilai aktivitas antioksidan buah takokak, sebab diduga senyawa-senyawa antioksidan, seperti senyawa fenol pada bahan tetap aktif sebagai antioksidan. Akan tetapi, secara kuantitas, jumlah senyawa-senyawa antioksidan pada ekstrak metanol buah dan hancuran buah tetap berbeda. Senyawa fenol merupakan senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus hidroksil (-OH) yang menempel pada cincin aromatik (benzena). Benzena merupakan cincin aromatik yang dibentuk oleh enam buah atom karbon yang terikat secara semi rangkap (terkonjugasi). Struktur benzena terdiri atas ikatan kovalen tunggal (σ) dan ikatan kovalen rangkap dua (π). Ikatan kovalen rangkap dua pada benzena membuat ikatan tersebut tidak selalu berada pada tempat yang sama akibat adanya pergerakan elektron (delokalisasi). Delokalisasi elektron menyebabkan senyawa aromatik mempertahankan kearomatisannya dengan mengalami reaksi substitusi (penggantian atom), seperti senyawa fenol yang merupakan substitusi benzena dengan gugus –OH. Senyawa fenol yang aktif sebagai antioksidan dikarenakan atom hidrogen yang terdapat pada gugus –OH fenol mengalami ikatan hidrogen. Ikatan hidrogen lebih lemah daripada ikatan kovalen, sehingga ikatan hidrogen lebih mudah lepas. Secara umum, senyawa fenolik merupakan asam lemah, namun lebih asam daripada alkohol alifatis (Andarwulan et al. 2012). Dengan demikian, aktivitas antioksidan suatu bahan tidak selalu ditentukan oleh total fenol. Namun, kemungkinan ditentukan oleh kemampuan gugus hidroksil (-OH) pada senyawa fenol untuk melepaskan elektron atau atom hidrogen (radikal fenol) dan berikatan dengan radikal bebas lainnya, sehingga menjadi stabil akibat adanya delokalisasi elektron tidak berpasangan ke bagian cincin aromatik. Faktor-faktor yang mempengaruhi keefektifan antioksidan terhadap kecepatan atau tingkat otoksidasi, antara lain struktur antioksidan, kondisi oksidasi, dan sampel yang teroksidasi (Andarwulan et al. 1996). Kemudian, perubahan kandungan vitamin C pada buah (vegetable fruit) kurang memberikan pengaruh yang berbeda nyata tehadap aktivitas antioksidannya dibandingkan dengan sayur berdaun hijau, seperti bayam. Kestabilan asam askorbat pada buah dan produk turunannya diakibatkan keberadaan senyawa askorbat dan fenolik pada kompartemen intraseluller, dimana vitamin C akan dilokalisasi dalam vakuola, atau sitosol, atau kloroplas yang tidak dilindungi oleh senyawa fenolik. Sementara itu, senyawa fenolik seperti flavonoid hampir dilokalisasi pada vakuola dengan pH lingkungan yang rendah dan hampir menempati semua sel. 34
Beberapa hasil analisis terkait senyawa dan aktivitas antioksidan buah dan ekstrak buah takokak (Solanum torvum Swartz.) dapat dibandingkan dengan beberapa jenis sayuran buah lainnya yang masih dalam satu famili Solanaceae (terung-terungan). Berikut hasil beberapa rekapitulasi nilai total fenol, total antosianin, dan total asam askorbat sayuran buah dari famili Solanaceae yang dapat dilihat pada Tabel 3.
35
Tabel 3. Rekapitulasi nilai total fenol, total antosianin, dan total asam askorbat sayuran buah dari famili Solanaceae Total Fenol Nama Indonesia
Nama Latin
Fresh Weight (mg/100g)
Dry Basis (mg/100g)
Takokak (buah)
Solanum torvum Swartz.
6.30*
33.04*
Takokak (hancuran buah)
Solanum torvum Swartz.
3.86*
24.63*
Takokak
Solanum torvum Swartz.
Total Antosianin Ekstrak (mg/100g) Metanol: 99.24 Etil asetat: 218.62 Heksan: 187.31 Metanol: 72.53 Etil asetat: 204.14 Heksan: 203.79
Fresh Weight (mg/100g)
Dry Basis Ekstrak (mg/100g) (mg/100g)
Total Asam Askorbat Fresh Weight (mg/100g)
Referensi
Dry Basis Ekstrak (mg/100g) (mg/100g)
3.42
17.93
85.37
447.91
5.33
34.01
60.30
384.55
a
860.28 , 790.12b
71-98
Hanson et al. (2006)
b
22.09c
Solanum aethiopicum Solanum quitoense Lam.
639.98c
Rahmat (2009) Apriady (2010) c Kurniasih (2010)
a
Vasco et al. (2008) 91
11-13
36
36
Tabel 3. (Lanjutan)
Nama Indonesia
Total Fenol Nama Latin
Pepino
Solanum muricatum Ait..
Fresh Weight (mg/100g)
Dry Basis (mg/100g)
Total Antosianin Ekstrak (mg/100g)
Fresh Weight (mg/100g)
Dry Basis Ekstrak (mg/100g) (mg/100g)
56
Total Asam Askorbat Fresh Weight (mg/100g)
Referensi Dry Basis Ekstrak (mg/100g) (mg/100g) Vasco et al. (2008)
20-38 c
Terong
Solanum melongena
Metanol : 739.361116.13c
Leunca
Solanum nigrum L.
Metanol: 573
Terong Belanda
Solanum betaceum Cav.
Jelly : 2511 Peeling: 1369
45.01d
12e
56 – 129f
8.43
Akanitapichat et al. (2010); d Sadilova et al. (2006) e Gopalan et al. (2007) f Hanson et al. (2006); Veeru et al. (2009) Hurtado et al. (2009)
Keterangan : *dihitung berdasarkan total fenol ekstrak metanol dan yield ekstrak metanol
37
37
V.
SIMPULAN DAN SARAN
A. SIMPULAN Buah takokak sebagai salah satu jenis sayuran indigenous Indonesia memiliki banyak potensi sebagai bahan pangan karena salah satu fungsinya sebagai antioksidan. Hal ini disebabkan buah takokak mengandung komponen bioaktif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa analisis kualitatif fitokimia ekstrak buah dan hancuran buah takokak untuk jenis pelarut metanol mengandung alkaloid, fenol, flavonoid jenis flavon, tanin, dan saponin. Sementara itu, ekstrak buah utuh dan hancuran buah untuk jenis pelarut etil asetat dan heksan mengandung alkaloid, flavonoid jenis flavon, terpenoid, dan saponin. Secara umum, proses penghancuran dapat mempengaruhi nilai total fenol buah dan ekstrak buah, yield ekstrak buah, total antosianin buah, total asam askorbat buah, aktivitas Phenylalanine Ammonia Lyase (PAL) buah, dan aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak. Hal ini dapat ditunjukkan dengan hasil statistik, baik itu dengan uji t-test maupun uji ANOVA, dimana buah takokak yang mengalami proses penghancuran memiliki nilai yang berbeda nyata dengan buah takokak yang tidak dihancurkan pada taraf signifikansi 5%. Walaupun demikian, beberapa parameter uji terkait komponen bioaktif antioksidan buah takokak ada yang tidak berbeda nyata pada taraf signifikansi 5% dengan adanya pengaruh proses penghancuran, seperti pada nilai total fenol buah takokak dry basis dan aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak. Dengan demikian, keberadaan senyawa fenolik pada buah takokak yang diuji ini dapat dipengaruhi oleh aktivitas PAL, namun tidak dipengaruhi oleh total antosianinnya. Selain itu, aktivitas antioksidan ekstrak buah dan hancuran buah yang tidak berbeda nyata secara statistik menunjukkan bahwa proses penghancuran tidak terlalu mempengaruhi keberadaan senyawa fenolik yang berfungsi sebagai antioksidan, seperti antosianin. Hal ini dikarenakan, aktivitas antioksidan ekstrak tidak selalu ditentukan dari nilai total fenolnya, akan tetapi dipengaruhi pula oleh kemampuan gugus –OH untuk mendonorkan atom H dan berikatan secara cepat dengan radikal bebas. Aktivitas antioksidan ekstrak pun sedikit dapat dipengaruhi oleh senyawa asam askorbat (vitamin C).
B. SARAN Buah takokak sebagai salah satu jenis sayuran indigenous Indonesia yang kaya akan antioksidan masih perlu dilakukan pengujian lanjut terkait kandungan metabolit primer dan sekundernya. Terkait pengujian metabolit sekunder yang dilakukan perlu juga untuk memperhatikan faktor eksternal bahan, seperti kondisi tanaman, umur, musim, dan sebagainya. Hal ini untuk mengetahui tingkat perbedaan atau perubahan nilai antioksidan akibat faktor-faktor eksternalnya, sehingga dapat dikaitkan dengan pengaruhnya terhadap faktor internal bahan. Selain itu, proses ekstraksi bahan lainnya berupa metode dan jenis pelarut perlu dilakukan untuk mendapatkan proses ekstraksi terbaik dan metode pemisahan komponen bioaktif buah takokak bisa dapat dikarakterisasi lebih lengkap dan spesifik, misalnya dengan kromatografi kertas atau kromatografi lapis tipis (KLT).
38
DAFTAR PUSTAKA Adawiyah RA. 1998. Kajian pengembangan metode ekstraksi komponen antimikroba biji buah atung (Parinarium glaberimum Hassk) [tesis]. Bogor: Program Studi Ilmu Pangan, Program Pasca Sarjana., Institut Pertanian Bogor. Agrawal DA, Bajpei SP, Patil AA, dan Bavaskar RS. 2010. Solanum torvum Sw.-A phytopharmacological review. Der Pharmacia Lettre 2(4): 403-407. Akanitapichat P, Phraibung K, Nuchklang K, dan Prompitakkul S. 2010. Antioxidant and hepatoprotective activities of five eggplant varieties. Food and Chemical Toxicology 48: 3017– 3021. Andarwulan N, Wijaya CH, dan Cahyono DT. 1996. Aktivitas antioksidan dari daun sirih (Piper betle L.). Buletin Teknologi dan Industri Pangan 7(1): 29-37. Andarwulan N, Batari R, Sandrasari DA, Bolling B, dan Wijaya H. 2010. Flavonoid content and antioxidant activity of vegetables from Indonesia. Food Chemistry 121: 1231-1235. Andarwulan N dan Faradilla RHF. 2012. Senyawa Fenolik pada Beberapa Sayuran Indigenous dari Indonesia. South East Asian Food and Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Astuti Y. 2005. Isolasi, identifikasi dan uji toksisitas senyawa aktif fraksi metilen klorida dari tanaman purwoceng (Pimpinella alpina Molk) [tesis]. Semarang: Jurusan Kimia FMIPA Universitas Diponegoro. AOAC. 1984. Official Methods of Analysis of The Association of Official Analytical Chemist. AOAC Int. Washington. Apriady RA. 2010. Identifikasi senyawa asam fenolat pada sayuran indigenous Indonesia [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Asami DK, Hong YJ, Barrett DM, dan Mitchell AE. 2003. Comparison of the total phenolic and ascorbic acid content of freeze dried and air dried marionberry, strawberry, and corn grown using conventional, organic, and, sustainable agricultural practices. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51: 1237-1241. Batubara I, Mitsunaga T, dan Ohashi H. 2009. Screening antiacne potency of Indonesian medicinal plants: antibacterial, lipase inhibition, and antioxidant activities. Journal of Wood Science 55(3): 230-235. Bridle P dan Timberlake CF. 1997. Anthocyanin as natural food colours–selected aspects. Food Chemistry 58 (1 –2): 103 – 109. Brueske CH. 1980. Phenylalanine ammonia lyase activity in tomato roots infected and resistant to the root-knot nematode, Meloidogyne incognita. Physiological Plant Pathology 16: 409-414. Camm L dan Towers GHN. 1973. Review article phenylalanine ammonia lyase. Phytochemistry 12: 961-973. Chah KF, Muko KN, dan Oboegbulem SI. 2000. Antimicrobial activity of methanolic extract of Solanum torvum fruit. Fitoterapia 71: 187-189. Chan EWC, Lim YY, Wong SK., Lim KK., Tan SP, Lianto FS, dan Yong MY. 2009. Effect of different drying methods on the antioxidant properties of leaves and tea of ginger species. Food Chemistry 113: 166–172. Cheng GW dan Breen PJ. 1991. Activity of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and concentrations of anthocyanins and phenolics in developing strawberry fruit. Journal American Society Horticultural Science 116(5): 865-869. 39
Cheng GW dan Crisosto CG. 1995. Browning potential, phenolic composition, and polyphenoloxidase activity of buffer extracts of peach and nectarine skin tissue. Journal American Society Horticultural Science 120(5): 835-838. Chinedu SN, Olasumbo AC, Eboji OK, Emiloju OC, Arinola OK, dan Dania DI. 2011. Proximate and phytochemical analyses of Solanum aethiopicum L. and Solanum macrocarpon L. fruits. Research Journal of Chemical Sciences. 1(3): 63-71. Cowan MM. 1999. Plant product as antimicrobial agents. Journal of Microbiology Reviews 12(4): 564-582. Crozier A, Jaganath IB dan Clifford MN. 2006. Phenols, polyphenols, and tannins: An Overview. Di dalam: Crozier A, Clifford MN, Ashihara H. Plant Secondary Metabolites: Occurance, Structure and Role in the Human Diet. Blackwell Publishing Ltd, Victoria. Dewick PM. 2009. Medicinal Natural Product: A Biosynthetic Approach 3rd Edition. University of Nottingham, UK. Direja HE. 2007. Kajian Aktivitas Antimikroba Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa L.) Terhadap Bakteri Patogen dan Perusak Pangan [skripsi]. Bogor: Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Elbe JHV dan Schwarts SJ. 1996. Colorants. Di dalam: O.R. Fennema. (ed.). Food Chemistry Third Edition. Marcel Dekker Inc.: New York. Fellows PJ. 2000. Food Processing Technology: Principles and Practice Second Edition. Woodhead Publishing Limited and CRC Press LLC: New York Washington DC. Gardjito M, Adnan M, dan Tranggono. 2006. Etilen luka, aktivitas enzim peroksidase, polifenol oksidase, dan fenil alanin liase pada irisan mesokarp labu kuning. Majalah Ilmu dan teknologi Pertanian 14(1): 14-23. Gopalan C, Rama Sastri BV, dan Balasubramanian S. 2007. Nutritive Value of Indian Foods: National Institute of Nutrition (NIN). Di dalam: Anonim. Series of crop Specific Biology Documents: Biology of Brinjal. Ministry of Environment and Forests, Departement of Biotechnology: India. Gordon MH. 1990. The mechanism of antioxidant action in vitro. Di dalam: Hudson, B.J.F. (ed.). Food Antioxidant. El Sevier App. Sci.: London. Harborne JB. 1987. Metode Pitokimia. Penterjemah: Kosasih Patmawinata dan Iwang Soediro. Edisi kedua. Penerbit ITB, Bandung. Harborne JB. 1996. Metode Fitokimia. Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Terjemahan. K. Padmawinata dan I. Soediro. Penerbit ITB, Bandung. Hanson PM, Yanga Ray-Yu, Tsoua SCS, Ledesmaa D, Englea L, dan Leeb Tung-Ching. 2006. Diversity in eggplant (Solanum melongena) for superoxide scavenging activity, total phenolics, and ascorbic acid. Journal of Food Composition and Analysis 19: 594–600. Hassan HS, Haruna AK, Hassan AS, Agunu A, dan Musa KY. 2006. Phytochemical and antispasmodic studies of the fruit of Solanum gilo. Nigerian Journal of Natural Products and Medicine. 10: 45-46. Higuchi T. 1990. Lignin biochemistry: Biosyntesis and biodegradation. Wood Sci Technol 24: 23-63. Ho CT. 1992. Phenolic compound in food. Di dalam: Huang, MT, CT Ho, dan CY Lee (eds.). Phenolic Compound in Food and Their Effects on Health II. American Chemical Society: Washington DC. Houghton PJ dan Raman A. 1998. Laboratotry Handbook for the Fractionation of Natural Extracts. Chapman and Hall, London. 40
39
Hurtado NH, Morales AL, Gonzalez-Miret ML, Escudero-Gilete ML, dan Heredia FJ. 2009. Colour, pH stability and antioxidant activity of anthocyanin rutinosides isolated from tamarillo fruit (Solanum betaceum Cav.). Food Chemistry 117:88-93. Jackman RL dan Smith JL. 1996. Anthocyanins and betalains. Di dalam: Hendry GAP dan Houghton JD. (eds.). Natural Food Colorants, Second Edition. Chapman and Hall: London. Jacobs MB. 1951. The Chemical Analysis of Foods and Food Products, 2nd ed. D. Van Nostrand Company, Inc., New York. Ju Zhi-Guo, Yuan’ Yong-Bing, Lieu Cheng-Lian, dan Xin Shi-Hai. 1995. Relationships among phenylalanine ammonia-lyase activity, simple phenol concentrations and anthocyanin accumulation in apple. Scientia Horticulturae 61:215-226. Kalt W, Forney CF, Martin A, dan Prior RL. 1999. Antioxidant capacity, vitamin C, phenolics, and anthocyanins after fresh storage of small fruits. Journal of Agriculture and Food Chemistry 47: 4638-4644. Karmakar UK, Tarafder UK, Sadhu SK, Biswas NN, dan Shil MC. 2010. Biological investigations of dried fruit of Solanum nigrum Linn. Journal of Pharmacological Science 3(1): 38-45. Kumalaningsih S. 2006. Antioksidan Alami Penangkap Radikal Bebas: Sumber, Manfaat, Cara Penyediaan dan Pengolahan.Trubus Agrisarana, Surabaya. Kurniasih D. 2010. Kajian kandungan senyawa karotenoid, antosianin, dan asam askorbat pada sayuran indigenous Jawa Barat [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Larson RA. 1988. The Antioxidants of Higher Plants. Phytochemical. 27: 969. Latha PS dan Kannabiran K. 2006. Antimicrobial activity and phytochemicals of Solanum trilobatum Linn. African Journal of Biotechnology 5(23): 2402-2404. Lees DH dan Francis FJ. 1972. Analysis of anthocyanin. Di dalam: Markakis P. Anthocyanins as Food Colors. (ed.). Academic Press: New York. Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL dan Randall RJ. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry 193: 265-275. Markakis P. 1982. Anthocyanins as food additives. Di dalam: Markakis P. (ed.). Anthocyanins as Food Colors. Academic Press: New York. Markham KR. 1988. The avonoids, advances in research since 1980. Chapman and Hall, London. Molyneux P. 2004. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin Journal of Scince Technology 26(2) : 211-219. Muchtadi TR. 2008. Teknologi Proses Pengolahan Pangan. PAU Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor. Naidu AS. 2000. Natural Food Antimicrobial Systems. CRC Press, New York. National Academy of Science. 2000. Dietary reference intakes for vitamin C, vitamin E, selenium, and carotenoids. www.nap.edu. [4 April 2012] Neog K, Unni B, dan Ahmed G. 2011. Studies on the influence of host plants and effect of chemical stimulants on the feeding behavior in the muga silkworm, Antheraea assamensis. Journal of Insect Science 11(133):1-16. Olayemi JO, Essien EE, Ajaiyeoba EO, dan Ekundayo O. 2011. Phytochemical and antimicrobial properties of Solanum macranthum Dunal. African Journal of Biotechnology 11(21): 49344937. Pandiangan M. 2008. Stabilitas antimikroba ekstrak temulawak (Curcuma xanthoriza Roxb.) terhadap mikroba patogen. Media Unika 73(4):365-373.
39
Prakash A, Rigelhof F, dan Miller. Antioxidant activity. Medalion Laboratories. Analytical Progress. Website. www.medallionlabs.com. [16 Maret 2012]. Prangdimurti E, Koswara S, dan Hartoyo A. 2010. Penuntun Praktikum Evaluasi Biologis Komponen Pangan. Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut 41 Pertanian Bogor: Bogor. Pratt DE. 1992. Natural antioxidant from plant material. Di dalam: Huang MT, CT Ho dan CY Lee. (eds.). Phenolic Compound in Food and Their Effects on Health II. American Chemistry Society: Washington DC. Rammohan M, Pandu raj, dan Reddy CS. 2011. Comparative diuretic activity of seed and fruit wall extract of Solanum torvum. Hygeia Journal for Drugs and Medicines 3(1): 50-53. Rahmat H. 2009. Identifikasi senyawa flavonoid pada sayuran indigenous Jawa Barat. [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Raharja S dan Dianawati E. 2001. Mempelajari ekstraksi antosianin dari daun erpa (Aerva sp.) dengan pelarut yang diasamkan. Jurnal Teknologi Industri Pertanian 11(2): 29-52. Sadasivam S dan Manickam A. 1996. Biochemical Methods. New Age International Publishers, New Delhi. Sadilova E, Stintzing FC, dan Carle R. 2006. Anthocyanins, colour, and antioxidant properties of eggplant (Solanum melongena L.) and violet pepper (Capsicum annuum L.). Z. Naturforsch. 61c:527-535 Safaryani N, Haryanti S, dan Hastuti ED. 2007. Pengaruh suhu dan lama penyimpanan terhadap enurunan kadar vitamin C Brokoli (Brassica oleracea L). Buletin Anatomi dan Fisiologi Vol. XV, No.2. Laboratorium Biologi Struktur dan Fungsi Tumbuhan Jurusan Biologi FMIPA, UNDIP. Sandrasari DA. 2008. Kapasitas antioksidan dan hubungannya dengan nilai total fenol ekstrak sayuran indigenous [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Sapers GM, Matulaitis RM, dan Beck JA. 1987. Detection of phenylalanine ammonia lyase in the skin of blueberry and cranberry fruits. Journal of Food Science 52(1): 155-158. Sapkale GN, Patil SM, Patil MB, dan Shaikh Gazi. 2009. Diuretic activity of fruit Solanum torvum (Swartz.). International Journal of Chemical Sciences 7(4): 2801-2805. Saptarini NM, Suryasaputra D, dan Saepulhak AM. 2011. Analisis rasio proteksi antiulser sari buah pepino (Solanum muricatum Aiton) menggunakan mencit sebagai model hewan coba. Majalah Obat Tradisional 16(2): 75-80. Sharma OP dan Bhat TK. 2009. DPPH antioxidant assay revisited. Food Chemistry 113: 1202-1205. Shetty K, Curtis OF, Levin RE, Witkowsky R, dan Ang W. 1995. Prevention of vitrification associated with in vitro shoot culture of oregano (Origanum vulgare) by Pseudomonas spp. Journal Plant Physiology. 147: 447-451. Sinaga ILH. 2009. Skrining fitokimia dan uji aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol buah terong belanda (Solanum betaceum Cav.) [skripsi]. Medan: Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara. Sirait N. 2009. Terong cepoka (Solanum torvum) herba yang berkhasiat sebagai obat. Warta Penelitian dan Pengembangan Tanaman Industri 15(1):10-12. Somantri IH. 2006. Pentingnya melestarikan sayuran indigenous (Indijenes). Di dalam: Soetiarso TA. Sayuran Indigenous Alternatif Sumber Pangan Bernilai Gizi Pangan. Iptek Hortikultura: Jakarta. Stevanie, Fidrianny I, dan Elfahmi. 2007. Telaah Kandungan Kimia Ekstrak n-Heksana Buah Takokak (Solanum torvum Swartz.) [skripsi]. Sekolah Farmasi ITB, Bandung. Suradikusumah, E. 1989. Kimia Tumbuhan. PAU Ilmu Hayat Institut Pertanian Bogor, Bogor. 39 42
Tang C. 1991. Phenolic Compound in food. Di dalam: Chi-Tang, Chang Y, Lee, dan Mou-Tuan Huang. (eds.). Phenolic Compound in Food and Their Effects on Health. American Chemical Society: Washington DC Tanudjaja I. 1999. Aktivitas enzim β-glukosidase, Phenylalaninee ammonia lyase (PAL), dan peroksidase dalam hubungannya dengan pembentukan komponen volatilvanilla (Vanilla planifolia Andrew) selama proses curing [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Tiwari A, Jadon RS, Tiwari P, dan Nayak S. 2009. Phytochemical investigations of crown of Solanum melongena fruit. International Journal of Phytomedicine 1: 9-11. Vasco C, Ruales J, Kamal-Eldin A. 2008. Total phenolic compounds and antioxidant capacities of major fruits from Ecuador. Food Chemistry 111: 816–823. Veeru P, Kishor MP, dan Meenakshi M. 2009. Screening of medicinal plant extracts for antioxidant activity. Journal of Medicinal Plants Research 3(8): 608-612. Velioglu Y S, Mazza G, Gao, L, dan Oomah B D. 1998. Antioxidant activity and total phenolics in selected fruits, vegetables, and grain products. Journal of Agricultural Food and Chemistry 46: 4113–4117. Waterborg JH. 2002. The lowry method for protein. Di dalam: Wolker JM (ed.). The Protein Protocols Handry basisook. 2nd Ed. Humana Press: New Jersey Inc. 7-9. Wijaya SI, Widjanarko BS, dan Susanto. 2001. Ekstraksi dan karakterisasi pigmen dari kulit buah rambutan (Nephelium lappaceum) var. Binjai. BIOSAIN. Universitas Brawijaya, Malang 1(2). Winarno FG. 1980. Kimia Pangan. Pusbangtepa Teknologi Hasil Pertanian Fatemeta IPB. Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. PT Gramedia, Jakarta. Winkel BSJ. 2006. The biosynthesis of flavonoid. Di dalam: Grotewold E. The sciencw of Flavonoids. Springer: USA 71-95. Yuanyuan LU, Jianguang L, Xuefeng H dan Lingyi K. 2009. Four steroidal glycosides from Solanum torvum and their cytotoxic activities. Steroids 74: 95–101. Zucker M. 1972. Light and enzymes. Annual Review Plant Physiology 23: 133.
39 43
LAMPIRAN
39
Lampiran 1. Kadar air buah takokak segar Sampel Takokak Segar
Ulangan
1
2 Buah 3
Duplo
W cawan kosong (g)
W sampel (g)
Wcawan+sampel kering (g)
KA (%bb)
1
3.1930
2.0989
3.5903
81.07
2
3.1440
2.0279
3.5189
81.51
1
3.2479
2.0975
3.5929
83.55
2
4.9346
2.0085
5.3339
80.12
1
5.2094
2.0084
5.6310
79.01
2
5.3144
2.0040
5.7077
80.37
Rata-rata
80.94
Std.Dev
1.54
RSD
1.91
80.94+1.54
1 2 Hancuran Buah 3
1
5.2157
2.0625
5.5651
83.06
2
4.9410
2.0534
5.2841
83.29
1
5.3160
2.0020
5.5963
86.00
2
4.9377
2.0074
5.2262
85.63
1
5.2121
2.0291
5.5319
84.24
2
4.9356
2.0263
5.2660
83.69
Rata-rata
84.32
1.23
84.32+1.23
1.46
45
Lampiran 2. Kadar air bubuk buah takokak kering beku
Sampel Bubuk Takokak
Ulangan
Duplo
W cawan kosong (g)
W sampel (g)
Wcawan+sampel kering (g)
1
5.2091
1.0006
6.1438
2
5.3124
1.0000
6.2398
1
4.9142
1.0002
5.8335
2
4.6012
1.0039
5.5198
1
Buah
KA (%BB)
Std.Dev
RSD
6.65 7.26 8.11
0.98 12. 68
2
Rata-rata
8.89 7.72 7.72±0.98
1
4.3164
1.0003
5.2542
6.28
2
4.5038
1.0004
5.4437
6.09
1
4.3899
1.0197
5.3198
10.78
2
4.3374
1.0186
5.2643
10.86
Rata-rata
8.50
1
Hancuran Buah
2. 68
2
31.51
8.50±2. 68
46
Lampiran 3. Total antosianin buah takokak Fresh Weight
Sampel Bubuk Takokak
Ulangan
Duplo
Wsampel (g)
Absorbansi (A)
[] (mg/100 g sampel)
Std. Dev
Dry Basis
RSD
[] (mg/100 g sampel)
1
1.0017
0.140
2.94
15.42
2
1.0017
0.221
4.64
24.34
1
1.0087
0.139
2.90
Std. Dev
RSD
1
Buah Takokak
0.82
2
15.20
4.33
24.16 2
1.0087
0.153
24.16
3.19
16.74
3.42
17.93
3.42+0.82
17.93+4.33
1
1.0038
0.321
5.58
35.58
2
1.0038
0.322
5.60
35.69
1
1.0191
0.308
5.27
1
Hancuran Buah Takokak
2
0.34
33.63 6.31
2
1.0191
0.285
6.31
4.88
31.12
5.33
34.01
5.33+0.34
2.15
34.01+2.15
47
Lampiran 4. T-Test antosianin dry basis buah takokak T-Test
Group Statistics Sampel Antosianin
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Buah
4
17.9267
4.33130
2.16565
Hancuran Buah
4
34.0065
2.14616
1.07308
Independent Samples Test Levene's Test for Equality of
t-test for Equality of Means
Variances
95% Confidence Interval of the L a m p Antosianin i r a n
F
Sig.
t
df
Sig. (2-
Mean
Std. Error
tailed)
Difference
Difference
Difference Lower
Upper
Equal variances assumed Equal variances not assumed
1.633
.249
-6.653
6
-6.653 4.389
.001
-16.07976
2.41693
-21.99376
-10.16575
.002
-16.07976
2.41693
-22.56185
-9.59766
48
Lampiran 5. Total asam askorbat buah takokak Fresh Weight
Sampel Bubuk Takokak
Ulangan
Dry Basis
W Sampel (g)
Titer (ml)
[ ] Vitamin C (mg/100 g sampel)
1
5.0005
0.22
79.96
419.51
2
5.0005
0.26
94.49
495.780
1
5.0050
0.24
87.15
Duplo
Std. Dev
RSD
[ ] Vitamin C (mg/100 g sampel)
Std. Dev
RSD
1
Buah
6.972
2
457.23
36.577
8.166 2
5.0050
0.22
8.166
79.89
419.13
85.37
447.91
85.37+6.972
447.91+36.577
1
5.0012
0.20
60.30
384.54
2
5.0012
0.20
60.30
384.54
1
5.0010
0.20
60.30
1
Hancuran Buah
0.001
2
384.55
0.009 0.002
0.002 2
5.0010
0.20
60.30
384.55
60.30
384.55
60.30+0.001
384.55+0.009
49
Lampiran 6. T-Test vitamin C dry basis buah takokak T-Test
Group Statistics Sampel
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Buah
4
4.4791E2
36.57669
18.28835
Hancuran Buah
4
3.8455E2
.00888
.00444
Vitamin_C
Independent Samples Test Levene's Test for Equality
t-test for Equality of Means
of Variances
95% Confidence Interval F
Vitamin_C
Equal variances assumed
Equal variances not assumed
13.197
Sig.
.011
t
3.465
df
6
3.465 3.000
Sig. (2-
Mean
Std. Error
tailed)
Difference
Difference
of the Difference Lower
Upper
.013
63.36586
18.28835
18.61588
108.11583
.040
63.36586
18.28835
5.16418
121.56754
50
Lampiran 7a. Standar protein BSA
Konsentrasi (µg/L)
Absorbansi (A)
30
0.140
40
0.176
50
0.201
100
0.366
200
0.720
51
Lampiran 7b. Total protein buah takokak (metode Lowry)
Sampel Bubuk Takokak
Ulangan
Duplo
Bobot Sampel (Wt) (g)
Absorbansi (A)
[] Protein (µg/g sampel)
1
0.1090
0.275
64.98
2
0.1090
0.283
67.13
1
0.1008
0.145
32.33
2
0.1008
0.140
30.87
Std. Dev
RSD
1
Bubuk Buah
19.92
2
40.80 48.83 48.83±19.92
1
0.1045
0.260
63.55
2
0.1045
0.267
65.52
1
0.1007
0.199
48.13
2
0.1007
0.194
46.67
1
Bubuk Hancuran Buah
2
9.94 17.76
55.97 55.97±9.94
52
Lampiran 7c. Standar trans-cinamic acid Konsentrasi (mg/L)
Absorbansi (A)
5
0.374
10
0.888
15
1.574
20
2.197
25
2.834
53
Lampiran 7d. Aktivitas Phenylalanin Ammonia Lyase (PAL) buah takokak
Sampel Bubuk Takokak
Ulangan
Duplo
Bobot Timbang (Wt) (g)
Absorbansi sampel bubuk (As)
Absorbansi kontrol (Ak)
[] Transcinnamic acid sampel (A) (mg/L)
1
0.1022
1.271
0.586
12.57
[] Transcinnamic acid kontrol (B) (mg/L)
(A-B)
Molaritas trans cinnamic acid (µmol)
7.07
5.50
0.3711
1
Buah
Ratarata protein (mg)
Aktivitas PAL (µmol transcinnamic acid/mg protein sampel/min)
Std. Dev
RSD
1.24 0.0050
2
0.1022
1.277
0.586
12.62
7.07
5.54
0.3743
1
0.1005
1.212
0.410
12.10
5.66
6.44
0.4344
2
1.25 1.48 0.0049
2
0.1005
1.231
0.410
12.25
5.66
6.59
0.4447
0.14 10.53
1.51 Ratarata
1.37 1.37±0.14
1
0.1009
0.827
0.265
9.01
4.50
4.51
0.3044
1
Hancuran Buah
0.90 0.0056
2
0.1009
0.812
0.265
8.89
4.50
4.39
0.2963
1
0.1006
0.824
0.422
8.98
5.76
3.23
0.2178
2
0.87 0.64 0.0056
2
0.1006
0.821
0.422
8.96
5.76
3.20
0.2161
0.64 Ratarata
0.76 0.76±0.14
0.14 18.50
54
Lampiran 8. T-Test aktivitas PAL buah takokak T-Test Group Statistics
Aktivitas_PAL
Sampel
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Buah
4
1.3689
.14412
.07206
Hancuran Buah
4
.7643
.14139
.07069
Independent Samples Test Levene's Test for
t-test for Equality of Means
Equality of Variances
95% Confidence Interval of F
Sig.
T
df
Sig. (2-
Mean
Std. Error
tailed)
Difference
Difference
the Difference Lower
Upper
Aktivitas_PAL Equal variances assumed Equal variances not assumed
.049
.832
5.989
6
5.989 5.998
.001
.60455
.10095
.35754
.85155
.001
.60455
.10095
.35752
.85158
55
Lampiran 9a. Standar asam galat Absorbansi (A)
Konsentrasi (mg/L) Ulangan 1
Ulangan 2
Rata-rata
50
0.130
0.104
0.117
100
0.266
0.266
0.266
150
0.451
0.459
0.455
200
0.662
0.624
0.643
250
0.822
0.804
0.813
56
Lampiran 9b. Total fenol ekstrak buah takokak
Sampel Ekstrak Buah Takokak
Ulangan
1 Metanol
2
Wtimbang awal ekstrak (mg)
Duplo
Absorbansi (A)
201.70 201.70 130.60 130.60
1 2 1 2
0.387 0.198 0.266 0.260
[ ] (mg/L)
Bobot Fenol Ekstrak (mg)
Total Fenol Ekstrak (mg/g)
Total Fenol Ekstrak (mg/100g)
131.11 77.11 96.54 94.83
0.26 0.15 0.12 0.12
1.30 0.76 0.96 0.94
130.01 76.46 96.10 94.39
Rata-rata
99.24
Std. Dev
22.35
RSD
22.52
99.24+22.35
1 Etil Asetat
2
200.60 200.60 129.90 129.90
1 2 1 2
0.682 0.571 0.782 0.741
215.40 183.69 243.97 232.26
0.43 0.37 0.32 0.30
2.15 1.83 2.44 2.32
214.80 183.10 244.20 232.44
Rata-rata
218.62
26.56
12.15
218.62+26.56
1 Heksan
2
197.40 197.40 129.90 129.90
1 2 1 2
0.608 0.594 0.602 0.512
194.26 190.26 192.54 166.83
0.39 0.38 0.25 0.22
1.97 1.93 1.93 1.67
196.82 192.76 192.69 166.96
Rata-rata
187.31 187.31+13.70
13.70
7.32
57
Lampiran 9c. Total fenol ekstrak hancuran buah takokak
Sampel Ekstrak Hancuran Buah Takokak
Ulangan
1 Metanol
2
Wsampel ekstrak (mg)
Duplo
Absorbansi (A)
120.60 120.60 105.50 105.50
1 2 1 2
0.212 0.198 0.224 0.219
[ ] (mg/L)
Bobot Fenol Ekstrak (mg)
Total Fenol Ekstrak (mg/g)
Total Fenol Ekstrak (mg/100g)
81.11 77.11 84.54 83.11
0.08 0.08 0.08 0.08
0.67 0.64 0.80 0.79
67.26 63.94 80.14 78.78
Rata-rata
72.53
Std. Dev
8.13
RSD
11.21
72.53+8.13
1 Etil Asetat
2
105.80 105.80 108.50 108.50
1 2 1 2
0.684 0.713 0.700 0.677
215.97 224.26 220.54 213.97
0.22 0.22 0.22 0.21
2.04 2.12 2.03 1.97
204.13 211.96 203.26 197.20
Rata-rata
204.14
6.06
2.97
204.14+6.06
1 Heksan
2
82.80 82.80 80.60 80.60
1 2 1 2
0.449 0.387 0.641 0.561
148.83 131.11 203.68 180.83
0.15 0.13 0.20 0.18
1.79 1.58 2.52 2.24
179.74 158.35 252.71 224.35
Rata-rata
203.79 203.79+42.66
42.66
20.93
58
Lampiran 10a. Hasil uji ANOVA total fenol ekstrak buah takokak Univariate Analysis of Variance
Descriptive Statistics Dependent Variable:Total_Fenol
Between-Subjects Factors Value Label Perlakuan
Jenis_Pelarut
N
1 Buah
12
2 Hancuran buah
12
Perlakuan
Jenis_Pelarut
Buah
Metanol
Std. Deviation
N
99.2414
22.35198
4
Etil asetat
2.1862E2
26.56538
4
1 Metanol
8
Heksan
1.8731E2
13.70275
4
2 Etil asetat
8
Total
1.6839E2
56.27020
12
3 Heksan
8
72.5295
8.13338
4
Etil asetat
2.0414E2
6.05563
4
Heksan
2.0379E2
42.65795
4
Total
1.6015E2
68.64672
12
85.8855
21.12665
8
Etil asetat
2.1138E2
19.44400
8
Heksan
1.9555E2
30.62631
8
Total
1.6427E2
61.52863
24
Hancuran buah
Levene's Test of Equality of Error Variancesa Dependent Variable:Total_Fenol F
Mean
df1 4.587
df2 5
Total
Sig. 18
.007
Tests the null hypothesis that the error variance of the dependent variable is equal across groups. a. Design: Intercept + Perlakuan + Jenis_Pelarut + Perlakuan * Jenis_Pelarut
Metanol
Metanol
59
Lampiran 10a. (Lanjutan) Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:Total_Fenol Type III Sum of Source
Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Corrected Model
77125.912a
5
15425.182
27.914
.000
Intercept
647646.603
1
647646.603
1.172E3
.000
406.997
1
406.997
.737
.402
74736.139
2
37368.070
67.622
.000
Perlakuan * Jenis_Pelarut
1982.775
2
991.388
1.794
.195
Error
9946.856
18
552.603
Total
734719.371
24
87072.768
23
Perlakuan Jenis_Pelarut
Corrected Total
a. R Squared = ,886 (Adjusted R Squared = ,854)
60
Lampiran 10b. Hasil uji lanjut Duncan total fenol ekstrak buah takokak untuk jenis pelarut Post Hoc Tests Jenis_Pelarut Homogeneous Subsets
Total_Fenol Duncan Subset Jenis_Pelarut
N
1
2
Metanol
8
Heksan
8
1.9555E2
Etil asetat
8
2.1138E2
Sig.
85.8855
1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = 552,603.
.195
61
Lampiran 10c. Hasil uji ANOVA total fenol ekstrak buah takokak untuk faktor interaksi perlakuan dan jenis pelarut
ANOVA Total_Fenol Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Between Groups
77125.912
5
15425.182
27.914
.000
Within Groups
9946.856
18
552.603
Total
87072.768
23
62
Lampiran 10d. Hasil uji lanjut Duncan total fenol ekstrak buah takokak untuk faktor interaksi perlakuan dan jenis pelarut Post Hoc Tests Homogeneous Subsets
Total_Fenol Duncan Subset for alpha = 0.05 Interaksi
N 1
Hancuran Metanol
2
4
72.5295
Buah Metanol
4
99.2414
Buah Heksan
4
187.3067
4
203.7900
4
204.1423
4
218.6218
Hancuran Heksan Hancuran Etil asetat Buah Etil asetat Sig.
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
.125
.099
63
Lampiran 11. Yield ekstrak buah takokak
Sampel Takokak
Pelarut
Metanol
Ekstrak Buah
Etil asetat
Heksan
Metanol
Ekstrak Hancuran Buah
Etil asetat
Heksan
Wakhir ekstrak (g)
Rata-rata Total Fenol Ekstrak (mg/g)
Kadar air kering beku (%)
Wbahan kering (g)
Ulangan
Wsampel kering beku (g)
1
10.0084
2.5354
1.03
7.72
9.2352
0.0026
0.0283
2
10.0048
3.6592
0.95
7.72
9.2319
0.0035
0.0377
Rata-rata
0.0330
Wfenol ekstrak (g)
Yield(%)
1
10.0057
0.2441
1.99
7.72
9.2327
0.0005
0.0053
2
10.0049
0.3148
2.38
7.72
9.2320
0.0008
0.0081
Rata-rata
0.0067
1
10.0023
0.1974
1.95
7.72
9.2296
0.0004
0.0042
2
10.0056
0.1413
1.80
7.72
9.2326
0.0002
0.0028
Rata-rata
0.0035
1
10.0084
2.5958
0.66
8.50
9.1576
0.0017
0.0186
2
10.0063
3.5353
0.79
8.50
9.1556
0.0028
0.0307
Rata-rata
0.0246
1
10.004
0.1058
2.08
8.50
9.1535
0.0002
0.0024
2
10.003
0.1732
2.00
8.50
9.1526
0.0003
0.0038
Rata-rata
0.0031
1
10.0071
0.0828
1.69
8.50
9.1564
0.0001
0.0015
2
10.0048
0.1029
2.38
8.50
9.1543
0.0002
0.0027
Rata-rata
0.0021
64
Lampiran 11. (Lanjutan) Perhitungan nilai yield ekstrak : Yield (%) =
Berat fenolik ekstrak (g)
x 100%
Berat kering bahan yang diekstrak (g) =
Rata-rata total fenol ekstrak (mg/g) x Berat akhir ekstrak (g) x 100% Berat kering bahan yang diekstrak (g)
Contoh : Yield (%) =
(1.03mg/g x 2.5354 g) x 10-3 -2
(10.0084 - (10.0084 x (7.72 x 10 ))
x 100%
=
0.0026 g x 100 = 0.0283% 9.2352 g
65
Lampiran 12a. Hasil uji ANOVA yield ekstrak buah takokak Descriptive Statistics
Univariate Analysis of Variance Dependent Variable:Yield Between-Subjects Factors Value Label Perlakuan
1
Buah
2
Hancuran
N
1
Metanol
4
2
Etil asetat
4
3
Heksan
4
.
df2 5
.033042
.0066528
2
Etil asetat
.006692
.0020261
2
Heksan
.003459
.0009997
2
Total
.014397
.0148504
6
Metanol
.024634
.0085448
2
Etil asetat
.003096
.0009788
2
Heksan
.002105
.0008148
2
Total
.009945
.0120241
6
Metanol
.028838
.0079156
4
Etil asetat
.004894
.0024488
4
Heksan
.002782
.0010796
4
Total
.012171
.0130907
12
Total
Sig. 6
.
Tests the null hypothesis that the error variance of the dependent variable is equal across groups. a. Design: Intercept + Perlakuan + Jenis_Pelarut + Perlakuan * Jenis_Pelarut
Metanol
Hancuran buah
Dependent Variable:Yield df1
Buah
6
Levene's Test of Equality of Error Variancesa
F
Jenis_Pelarut
6
buah Jenis_Pelarut
Perlakuan
Mean
Std. Deviation
N
66
Lampiran 12a. (Lanjutan) Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:Yield Type III Sum of Source
Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Corrected Model
.002a
5
.000
17.042
.002
Intercept
.002
1
.002
86.015
.000
5.947E-5
1
5.947E-5
2.878
.141
.002
2
.001
40.539
.000
2.598E-5
2
1.299E-5
.629
.565
Error
.000
6
2.067E-5
Total
.004
12
Corrected Total
.002
11
Perlakuan Jenis_Pelarut Perlakuan * Jenis_Pelarut
a. R Squared = ,934 (Adjusted R Squared = ,879)
67
Lampiran 12b. Hasil uji lanjut Duncan yield ekstrak buah takokak untuk jenis pelarut Post Hoc Tests Jenis_Pelarut Homogeneous Subsets
Yield Duncan Subset Jenis_Pelarut
N
1
2
Heksan
4
.002782
Etil asetat
4
.004894
Metanol
4
Sig.
.028838 .535
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = 2,07E-005.
1.000
68
Lampiran 12c. Hasil uji ANOVA yield ekstrak buah takokak untuk faktor interaksi perlakuan dan jenis pelarut
ANOVA Yield Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Between Groups
.002
5
.000
17.042
.002
Within Groups
.000
6
2.067E-5
Total
.002
11
69
Lampiran 12d. Hasil uji lanjut Duncan yield ekstrak buah takokak untuk faktor interaksi perlakuan dan jenis pelarut
Post Hoc Tests Homogeneous Subsets
Yield Duncan Subset for alpha = 0.05 Interaksi
N 1
2
Hancuran Heksan
2
.002105
Hancuran Etil asetat
2
.003096
Buah Heksan
2
.003459
Buah Etil asetat
2
.006692
Hancuran Metanol
2
.024634
Buah Metanol
2
.033042
Sig. Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
.371
.114
70
Lampiran 13. Total fenol buah takokak (berdasarkan yield ekstrak tertinggi, yaitu ekstrak metanol) Fresh Weight Sampel Takokak
Ulangan
1
Wsampel kering beku (g)
Kadar air kering beku (%)
10.0084
Yield ekstrak metanol (%)
Wakhir ekstrak (g)
0.0283
2.5354
Dry Basis
Absorbansi (A)
[] (mg/L)
Total fenol ekstrak metanol (mg/g)
1
0.387
131.11
1.30
6.80
35.69
2
0.198
77.11
0.76
4.00
20.99
1
0.266
96.54
0.96
7.26
Duplo
[] (mg fenolik/ 100 g sampel)
Std. Dev
RSD
[] (mg fenolik/ 100 g sampel)
Std. Dev
RSD
7.72 Buah
2
10.0048
0.0377
10.0084
0.0186
38.08
8.10
24.51 2
1
1.54
3.6592 0.260
24.51
94.83
0.94
7.13
37.41
Ratarata
0.99
6.30
33.04
6.30+1.54
33.04+8.10
1
0.212
81.11
0.67
2.99
19.06
2
0.198
77.11
0.64
2.84
18.12
1
0.224
84.54
0.80
4.85
2.5958
8.50 Hancuran Buah
2
10.0063
0.0307
30.94
1.10
6.99
28.38
3.5353 2
0.219
28.38
83.11
0.79
4.77
30.41
Ratarata
0.72
3.86
24.63
3.86+1.10
24.63+6.99
71
Lampiran 13. (Lanjutan) Perhitungan total fenol takokak ditentukan dari nilai yield ekstrak tertinggi untuk buah dan hancuran buah takokak. Yield ekstrak buah dan hancuran buah takokak diperoleh dari ekstrak metanol.
Perhitungan total fenol takokak : Total fenol (mg/100 g fw) =
Berat fenolik ekstrak (mg)
x 100
=
Total fenol ekstrak metanol (mg/g) x Berat akhir ekstrak metanol (g) x 100%
Berat bahan segar (g) Berat bahan segar =
Berat bahan kering (g) = Kadar bahan kering
Total fenol (mg/100 g fw) =
Berat bahan segar (g)
9.2352 g
= 9.2352 g = 48.4524 g
(100%-80.94%)
1.30mg/g x 2.5354 g
x 100
0.1906 = 6.80 mg/100 g fw
48.4524 g
Total fenol (mg/100 g db) =
Berat fenolik ekstrak (mg)
x 100
=
Total fenol ekstrak metanol (mg/g) x Berat akhir ekstrak metanol (g) x 100%
Berat bahan kering (g) Total fenol (mg/100 g db) =
1.30mg/g x 2.5354 g 9.2352 g
Berat bahan kering (g) x 100
= 35.69 mg/100 g db
72
Lmpiran 14. Hasil T-Test total fenol dry basis buah takokak T-Test
Group Statistics
Total_Fenol
Sampel
N
Mean
Std. Deviation Std. Error Mean
Buah
4
33.0418
5.43199
2.71599
Hancuran Buah
4
24.6336
6.97676
3.48838
Independent Samples Test Levene's Test for
t-test for Equality of Means
Equality of Variances
95% Confidence Interval of the F
Total_Fenol
Sig.
t
df
Sig. (2-
Mean
Std. Error
tailed)
Difference
Difference
Difference Lower
Upper
Equal variances
3.261E15
.000
1.902
6
.106
8.40824
4.42102
-2.40961
19.22608
.109
8.40824
4.42102
-2.56922
19.38569
assumed Equal variances not assumed
1.902 5.660
73
Lampiran 15. Aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak berdasarkan % inhibisi
Sampel Ekstrak Metanol
Ulangan
Duplo
Wtimbang ekstrak (g)
Volume larutan (ml)
0.1937
1
Absorbansi blanko
1 1 2
Absorbansi sampel
% inhibisi
0.105
77.71
0.086
81.74
0.053
88.75
0.054
88.54
Rata-rata
84.18
Std. Dev
RSD
0.471 1 Buah
2
0.2099
5.41
1
6.42
2
84.18±5.41
1 1
0.3049
0.082
82.59
0.06
87.26
0.048
89.81
0.048
89.81
Rata-rata
87.37
1
2 0.471 Hancuran Buah
1 2
0.2517 2
3.40
1
3.90
87.37±3.40
74
Lampiran 16. T-Test DPPH ekstrak buah takokak berdasarkan % inhibisi T-Test
Group Statistics
Sampel Kapasitas_Antioksidan
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Buah
4
84.1826
5.40603
2.70301
Hancuran Buah
4
87.3673
3.40366
1.70183
Independent Samples Test Levene's Test for
t-test for Equality of Means
Equality of Variances
95% Confidence Interval F
Kapasitas_Antioksidan
Sig.
t
df
Sig. (2-
Mean
Std. Error
tailed)
Difference
Difference
of the Difference Lower
Upper
Equal variances assumed Equal variances not assumed
2.560
.161
-.997
6
-.997 5.055
.357
-3.18471
3.19414
-11.00048
4.63105
.364
-3.18471
3.19414
-11.36850
4.99907
75
Lampiran 17. Standar asam askorbat Konsentrasi (mg/ml) 0 0.05 0.0625 0.125 0.25
Absorbansi (A)
A blanko-A standar
0.471
0
0.374
0.097
0.371
0.100
0.238
0.233
0.055
0.416
76
Lampiran 18. Aktivitas antioksidan ekstrak buah takokak berdasarkan AEAC
Sampel Ekstrak Metanol
Ulangan
Duplo
Wtimbang ekstrak (g)
Volume larutan (ml)
Absorbansi blanko
0.105
1 1
Absorbansi sampel
0.1937
1
2
0.086 0.471
1 Buah
2
0.053 0.2099
1
2
0.054 Rata-rata
AEAC (mg/ml)
Std. Dev
RSD
0.22 0.23 0.25
0.02 6.53
0.25 0.23 0.23±0.02
1 1
0.082 0.3049
1
2
0.06 0.471
1 Hancuran Buah
2
0.048 0.2517
2
1 0.048 Rata-rata
0.23 0.24 0.25 0.25 0.24 0.24±0.01
0.01 3.96
77
Lampiran 19. T-Test DPPH ekstrak buah takokak berdasarkan AEAC
T-Test
Group Statistics Sampel AEAC
N
Mean
Std. Deviation
Std. Error Mean
Buah
4
.233729
.0152597
.0076299
Hancuran Buah
4
.242718
.0096076
.0048038
Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances
t-test for Equality of Means 95% Confidence Interval of the
F AEAC
Equal variances assumed Equal variances not assumed
Sig. 2.560
t .161
df
Sig. (2-tailed)
Mean
Std. Error
Difference
Difference
Difference Lower
Upper
-.997
6
.357
-.0089896
.0090162
-.0310513
.0130722
-.997
5.055
.364
-.0089896
.0090162
-.0320901
.0141110
78
