ADLN- PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA DAFTAR ISI

ADLN- PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

DAFTAR ISI Halaman Sampul Luar ..................................................................................................... i Sampul Dalam .................................................................................................. ii Halaman Prasyarat Gelar.................................................................................. iii Halaman Pengesahan ....................................................................................... iv UCAPAN TERIMA KASIH ............................................................................ v ABSTRAK ....................................................................................................... vi ABSTRACT ..................................................................................................... vii DAFTAR ISI .................................................................................................... viii DAFTAR TABEL ............................................................................................ xi DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xii DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xiii DAFTAR SINGKATAN ................................................................................. xiv BAB I PENDAHULUAN ............................................................................ 1 1.1 Latar Belakang Permasalahan ..................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ....................................................................... 5 1.3 Tujuan Penelitian ........................................................................ 5 1.3.1 Tujuan umum ..................................................................... 5 1.3.2 Tujuan khusus .................................................................... 5 1.4 Manfaat Penelitian ...................................................................... 6 1.4.1 Manfaat keilmuan .............................................................. 6 1.4.2 Manfaat praktis .................................................................. 6 BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................... 7 2.1 Geobacillus sp ............................................................................. 7 2.2 Tongkol Jagung ........................................................................... 8 2.3 Xilan dan Aktivitas Katalitik Enzim Xilanolitik......................... 9 2.4 Glikosida Hidrolase..................................................................... 11 2.5 β-Xilosidase ................................................................................ 12 2.6 CBM (Carbohydrate Binding Module) ....................................... 12 2.7 Kinetika Enzim............................................................................ 14 BAB III KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN ................................................................................... 21 3.1 Kerangka Konsep Penelitian ....................................................... 21 3.2 Hipotesis Penelitian..................................................................... 24 3.3 Skema Kerangka Konseptual Penelitian ..................................... 25 BAB IV METODE PENELITIAN .................................................................. 26 4.1 Tempat dan Waktu Penelitian ..................................................... 26 4.2 Bahan dan Alat Penelitian ........................................................... 26 4.2.1 Bahan penelitian ................................................................ 26 4.2.2 Sampel penelitian ............................................................... 26 4.2.3 Alat penelitian .................................................................... 26 4.3 Rancangan Penelitian .................................................................. 27 4.3.1 Isolasi xilan ........................................................................ 27

viii TESIS

KARAKTERISASI ENZYME .....

NI NYOMAN PURWANI


4.3.2 Karakterisasi enzim -xilosidase GbtXyl43B yang mengandung CBM .................................................... 28 4.4 Prosedur Penelitian ...................................................................... 29 4.4.1 Pembuatan reagensia dan medium ..................................... 29 4.4.1.1 Pembuatan media LB padat untuk peremajaan isolat GbtXyl43A dan GbtXyl43B .................... 29 4.4.1.2 Pembuatan media inokulum untuk tahap inokulasi isolat GbtXyl43A dan GbtXyl 43B ... 29 4.4.1.3 Pembuatan media produksi GbtXyl43A ............ 29 4.4.1.4 Pembuatan media produksi GbtXyl43B ............ 29 4.4.1.5 Pembuatan larutan NaOH 4 M .......................... 30 4.4.1.6 Pembuatan larutan buffer fosfat 50 mM pH 6 ... 30 4.4.1.7 Pembuatan larutan CH3COOH 4 M................... 30 4.4.1.8 Pembuatan larutan HCl 6 N ............................... 30 4.4.1.9 Pembuatan larutan akrilamid/bis-akrilamid....... 30 4.4.1.10 Pembuatan larutan Sodium Dodesil Sulfat (SDS) 10 % ........................................................ 31 4.4.1.11 Pembuatan buffer tris HCl 1M, pH 8,8 ............. 31 4.4.1.12 Pembuatan buffer tris HCl 1M, pH 6,8 ............. 31 4.4.1.13 Pembuatan sample buffer (SDS Reducing Buffer)....................................... 31 4.4.1.14 Pembuatan running buffer ................................. 31 4.4.1.15 Pembuatan larutan APS 10% ............................. 32 4.4.1.16 Pembuatan separating gel 12% ......................... 32 4.4.1.17 Penentuan stacking gel 5% ................................ 32 4.4.1.18 Pembuatan larutan staining ................................ 32 4.4.1.19 Pembuatan larutan destaining ............................ 32 4.4.1.20..Pembuatan larutan bromofenol biru 0,5% ........................................................... 33 4.4.1.21 Pembuatan larutan oat spelt xylan 1% ............... 33 4.4.1.22 Pembuatan larutan xilan 1 % (hasil esktraksi dari tongkol jagung) ........................... 33 4.4.1.23 Pembuatan larutan birchwood xylan 1% ........................................................... 33 4.4.1.24. Pembuatan larutan buffer untuk pemurnian protein GbtXyl43A dan GbtXyl43B......................................................... 33 4.4.1.25 Pembuatan larutan Na2CO3 0,4 M ..................... 34 4.4.1.26 Pembuatan reagen asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS) .................................. 34 4.4.1.27 Pembuatan reagen Bradford .............................. 34 4.4.1.28 Pembuatan larutan standar albumin (BSA) ................................................................ 34 4.4.1.29 Pembuatan larutan standar xilosa ...................... 34 4.4.2 Isolasi xilan dari tongkol jagung ....................................... 34 4.4.3 Peremajaan isolat .............................................................. 35

ix TESIS


NI NYOMAN PURWANI


4.4.3.1…Peremajaan isolat E.coli BL21 [ GbtXyl43A/GbtXyl43B .................................... 35 4.4.3.2 T Pembuatan inokulum ......................................... 35 4.4.4 Produksi[yekstrak kasar enzim rekombinan ....................... 36 4.4.4.1 Tp Produksi ekstrak kasar GbtXyl43A ye dan GbtXyl32B .................................................. 36 p protein dan analisa protein .............................. 36 4.4.5 Pemurnian 4.4.5.1 ea Pemurnian protein GbtXy43A dan GbtXyl43B......................................................... 36 4.4.5.2 a Analisis hasil pemurnian dengan q SDS-PAGE ........................................................ 37 u 4.4.5.3 Uji aktivitas enzim dengan metode qo DNS ................................................................... 38 4.4.5.4 ut Penentuan kadar protein ................................... 38 4.4.6 Analisis oexilan dari tongkol jagung dan produk t hidrolisisnya...................................................................... 39 4.4.7 Penentuan ef parameter kinetika enzim ................................ 39 BAB V HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN r 5.1 Isolasi Xilan dari fo Tongkol Jagung ............................................... 40 5.2 Produksi GbtXyl43A dan GbtXyl43B Rekombinan.................... 42 rm 5.3 Pemurnian Protein GbtXyl43A dan GbtXyl43B o Rekombinan ............................................................................... 44 m t 5.4 Uji Aktivitas GbtXyl43A dan GbtXyl43B terhadap Berbagai Substrat h Alami ............................................................ 48 5.5 Analisis Produkte Hidrolisis GbtXyl43B terhadap Substrat Xilan hdari Tongkol Jagung............................................ 51 5.6 Analisis Profil eKinetika GtXyl43B Rekombinan ........................ 56 d BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN o 6.1 Kesimpulan ................................................................................. 60 dc 6.2 Saran ............................................................................................ 60 ou DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 61 c m LAMPIRAN ue m n et n to r o rt h te h es

TESIS

u sm um x m a m r KARAKTERISASI ENZYME ay r

.....

NI NYOMAN PURWANI


DAFTAR TABEL No.

Judul Tabel

Halaman

Tabel 2.1 Kandungan xilan beberapa limbah pertanian ................................. 9 Tabel 5.1 Pemurnian protein GbtXyl43A dan GbtXyl43B rekombinan.......... 47 Tabel 5.2 Aktivitas GbtXyl43B rekombinan terhadap berbagai substrat alami 51 Tabel 5.3 Luas area standar dan produk hidrolisis substrat oat spelt xylan dan xilan dari tongkol jagung ................................................................. 55

xi TESIS


NI NYOMAN PURWANI


DAFTAR GAMBAR Nomor

Judul Gambar

Halaman

Gambar 2.1 Tongkol jagung (Zea Mays L) ................................................... 7 Gambar 2.2 Struktur xilan dan lokasi penyerangan enzim xilanolitik ........ 11 Gambar 2.3 Struktur CBM tipe A, B, dan C dari sumber berbeda ............... 14 Gambar 2.4 Perubahan konsentrasi substrat, enzim dan produk selama waktu reaksi ........................................................................... 15 Gambar 2.5 Penentuan pada berbagai variasi konsentrasi substrat ............... 16 Gambar 2.6 Plot Lineweaver-Burk .............................................................. 19 Gambar 3.1 Analisis filogenetik CBM dari GbtXyl43B dan kaitannya dengan urutan asam amino dari famili CBM ......................................................... 23 Gambar 3.2 Skema kerangka konseptual penelitian ................................... 25 Gambar 4.1 Diagram alir penelitian ............................................................ 27 Gambar 4.2 Diagram alir penelitian lanjutan .............................................. 28 Gambar 5.1. Ilustrasi pengolahan limbah lignoselulosa dalam pemisahan lignin, selulosa dan hemiselulosa ........................................... 40 Gambar 5.2 Serbuk halus xilan A dan xilan B .............................................. 42 Gambar 5.3 Mekanisme induksi IPTG.......................................................... 43 Gambar 5.4 Interaksi antara protein His-tag dengan resin Ni-NTA ............. 45 Gambar 5.5 Struktur senyawa imidazol dan histidin .................................... 45 Gambar 5.6 Elektroforegram protein GbtXyl43A dan GbtXyl43B rekombinan ............................................................................... 47 Gambar 5. 7 Lokasi gen Gbtxyl43B dan gen lainnya dalam pTP510 ........... 48 Gambar 5.8 Model struktur 3 dimensi CBM dari GbtXyl43B ..................... 49 Gambar 5.9 Persamaan reaksi DNS .............................................................. 50 Gambar 5.10 Kromatogram standar HPLC ..................................................... 52 Gambar 5.11 Kromatogram HPLC produk hidrolisis oat spelt xylan + xilosa (1%) + arabinosa (1%) ............................................................. 53 Gambar 5.12 Kromatogram HPLC produk hidrolisis xilan A + xilosa (1%) + arabinosa (1%) ...................................................................... 53 Gambar 5.13 Kromatogram HPLC produk hidrolisis xilan B + xilosa (1%) + arabinosa (1%) ...................................................................... 53 Gambar 5.14 Kromatogram HPLC hasil hidrolisis hemiselulosa B ............... 54 Gambar 5.15 Kurva hubungan waktu inkubasi pada berbagai konsentrasi substrat dengan konsentrasi xilosa ......................................... 57 Gambar 5.16 Kurva Lineweaver Burk untuk kinetika GbtXyl43B ................ 59

xii TESIS


NI NYOMAN PURWANI


DAFTAR LAMPIRAN No.

Judul Lampiran

Halaman

Lampiran 1. Kurva standar xilosa Lampiran 2. Kurva standar protein Lmapiran 3. Data penentuan aktivitas, dan kadar protein GbtXyl43A dan GbtXyl43B rekombinan Lampiran 4. Penentuan tingkat kemurnian protein GbtXyl43A dan GbtXyl43B rekombinan Lampiran 5. Data aktivitas spesifik GbtXyl43B rekombinan pada berbagai substrat alami Lampiran 6. Kromatogram standar HPLC dan kontrol substrat Lampiran 7. Tabel luas area standar dan produk hidrolisis substrat oat spelt xylan dan xilan dari tongkol jagung Lampiran 8. Grafik hubungan konsentrasi xilosa dengan waktu inkubasi Lampiran 9. Penentuan nilai KM, Vmax, Kcat dan Kcat/KM

xiii TESIS


NI NYOMAN PURWANI


DAFTAR SINGKATAN APS

: Ammonium Persulfat

HPLC

: High Performance Liquid Chromatography

DNS

: Asam 3,5-dinitrosalisilat

CBM

: Carbohydrate Binding Module

CM

: Catalytic Module

CBB

: Comassie Brilian Blue

SDS

: Sodium Dodesil Sulfat

BSA

: Bovine Serum Albumin

TEMED

: N,N,N’N-Tetramethylenetilenediamine

IPTG

: Isopropyl-thio-β-D-thiogalactopyranosida

Ni-NTA

: Ni-Nitriloacetic acid

xiv TESIS


NI NYOMAN PURWANI

ADLN- PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA DAFTAR ISI

Recommend Documents