Ph. D. ÉRTEKEZÉS
A PROLACTIN SZEREPE MYELOMA MULTIPLEXBEN
DR. GADÓ KLÁRA
SEMMELWEIS EGYETEM, DOKTORI ISKOLA BUDAPEST, 2001.
ÖSSZEFOGLALÓ Az értekezés címe: A prolactin szerepe myeloma multiplexben Szerző:
Dr. Gadó Klára
Témavezető:
Dr. Falus András
Készült:
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Budapest, 2001.
Program címe:
A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai (19).
A neuroendocrin és az immunrendszer igen bonyolult és sokoldalú közös szabályozási rendszert alkot. Ennek alapja, hogy a két rendszer sejtjein hasonló receptorok (citokin és hormon receptorok) expresszálódnak és a szabályozásukban részt vevő mediátorok (citokinek és hormonok) is közösek. A prolactin (PRL) mint növekedési faktor szerepet játszik az immunregulációban, a hemopoezisben, valamint a tumorfejlődésben. A PRL befolyásolja a normális csontvelői B sejt előalakok fejlődését és a malignus B lymphocyták proliferációját is. Mivel a myeloma multiplex (MM) a B sejtek malignus megbetegedése, munkánk során a PRL MM-ben betöltött szerepét vizsgáltuk. Igazoltuk, hogy előrehaladott klinikai stádiumban lévő MM betegek szérum PRL szintje emelkedett. A kemoterápia során remisszióba jutó betegeknél a kezdetben észlelt emelkedett szérum PRL szint csökkent, míg refrakter betegeknél továbbra is magas maradt. A szérum PRL szint adott beteg esetében ismert prognosztikus faktorok (b2mikroglobulin és interleukin-6) változását követte. MM betegek csontvelői sejtjeiben anti-humán PRL antiszérummal immunreaktivitást mutattunk ki. Kemoterápiát követően, és a kontroll mintákban a reakció negatív volt. A sejtek között legnagyobb mennyiségben a plazmasejtek tartalmaztak PRL-t. U266 humán myeloma sejtvonalon kimutattuk, hogy a sejtek intracellulárisan PRL-t tartalmaznak, melynek mennyisége etoposid hatására nő. Exogén PRL gátolja a sejtek IgE termelését, valamint proliferációját. Az etoposiddal kiváltott apoptózist kis dózisban a PRL fokozza, míg nagy dózisban gátolja. Eredményeink alapján MM betegeken a PRL tumor markerként szerepelhet, míg U266 humán myeloma sejtvonalon a PRL gátló hatása igazolható.
2
SUMMARY Title of dissertation: Role of prolactin in multiple myeloma Author:
Klára Gadó MD
Advisor:
András Falus MD
Prepared:
Semmelweis University, Postgradual School, Budapest, 2001.
Title of program:
Basics of human molecular genetics and genetical diagnosis (19).
There is a complex regulation network between the neuroendocrine and the immune system. The basis of the bidirectional regulation is the common receptors (cytokine and hormone receptors) and common mediators (cytokines and hormones) shared by the two systems. Prolactin (PRL) as a growth factor plays a role in immunoregulation, hematopoiesis and tumor genesis. PRL modulates the development of normal B cell precursors in the bone marrow as well as the proliferation of malignant B cells. Multiple myeloma (MM) is a B cell malignancy. We have studied the role of PRL in MM. Patients with advanced disease have an elevated serum PRL level. In case of patients who reached a remission after chemotherapy serum PRL level was declined, while in case of patients with refracter disease PRL concentration was increasing during the disease progression. Concentration of serum beta2-microglobulin and interleukin-6 changed parallel with that of serum PRL. Immunoreactivity with anti-human PRL antiserum has been demonstrated in bone marrow cells of patients with MM. No immunostaining could be found in case of MM patients after chemotherapy and in control patients. Plasma cells contain the largest amount of PRL among bone marrow cells. We demonstrated that cells of human myeloma cell line U266 contain intracytoplasmic PRL, which was higher after administration of etoposid. IgE production and proliferation of these cells was inhibited by exogenous PRL. Apoptosis of U266 cells induced by etoposid was increased by low doses of PRL, while it was inhibited by high doses of PRL. In case of MM patients PRL can be used as a tumor marker, while an inhibitory effect of PRL has been demonstrated on U266 myeloma cells.
3
TARTALOMJEGYZÉK
1. Bevezetés
9.
2. Célkitűzés
10.
3. Irodalmi háttér
11.
3.1 Myeloma multiplex
11.
3.1.1. A betegség klinikuma
11.
3.1.1.1. Előfordulás
11.
3.1.1.2. Klinikai tünetek, laboratóriumi eltérések
13.
3.1.1.3. Kezelés
13.
3.1.1.4. Multidrug rezisztencia
15.
3.1.1.5. Prognosztikai faktorok
16.
3.1.2. A betegség biológiája
17.
3.1.2.1. MGUS-MM átmenet
18.
3.1.2.2. Citogenetikai eltérések
18.
3.1.2.3. Növekedési faktorok szerepe
19.
3.1.2.4. Kaposi sarcoma asszociált herpesvirus (KSHV) szerepe
21.
3.1.2.5. Adhéziós molekulák, angiogenezis
22.
3.2. A prolactin szerepe az immunregulációban, a hemopoezisben és a tumor fejlődésben
24.
3.2.1. A PRL szerkezete
24.
3.2.2. A PRL-receptor szerkezete
24.
3.2.3. A jelátvitel
25.
3.2.4. A PRL termelés szabályozása
25.
3.2.5. PRL hatása az immunrendszerre
26.
3.2.5.1. A hypoprolactinaemia hatása
26.
3.2.5.2. A PRL célpontjai az immunregulációban
26.
3.2.5.3. Hyperprolactinaemia szerepe patológiás állapotokban
27.
3.2.6. A PRL szerepe a hemopoezisben
28.
3.2.7. A PRL szerepe a tumorfejlődésben
29.
3.2.7.1. Humán vizsgálatok
29.
3.2.7.2. In vitro és állatkísérletes megfigyelések
30.
3.2.7.3. A PRL tumorfejlődésben játszott komplex szerepe
31.
4
3.2.8. A PRL immunregulációban, vérképzésben, és
32.
tumorfejlődésben betöltött szerepének klinikai jelentősége
4. Módszerek
33.
4.1. A szérum PRL koncentráció vizsgálata myeloma multiplexben
33.
szenvedõ betegeken 4.1.1. Betegek
33.
4.1.2. Mintavétel
33.
4.1.3. A szérum PRL koncentráció meghatározása
35.
4.1.4. A szérum béta2-mikroglobulin koncentráció meghatározása
35.
4.1.5. A szérum interleukin-6 koncentráció meghatározása
35.
4.1.6. A szérum kortizol és TSH meghatározás
35.
4.2. Myeloma multiplexben szenvedő betegek csontvelő aspirátumából
36.
származó keneteken a sejtek PRL tartalmának vizsgálata 4.2.1. Betegek
36.
4.2.2. A csontvelő aspirátum PRL tartalmának vizsgálata
38.
4.2.2.1. Immuncitokémiai vizsgálat
38.
4.2.2.2. A csontvelői sejtek PRL tartalma és
38.
sejttípusa közötti összefüggés vizsgálata 4.3. U266 humán IgE-t termelő myeloma sejtvonalon
39.
a PRL szerepének vizsgálata
4.3.1. U266 sejtek intracelluláris PRL tartalmának vizsgálata
39.
4.3.1.1. A sejtek kezelése
39.
4.3.1.2. intracelluláris PRL tartalom mérése
39.
4.3.2. U266 sejtek IgE termelésének vizsgálata
43.
4.3.2.1. U266 sejtek kezelése PRL-nal
43.
4.3.2.2. IgE meghatározás 4.3.3. A PRL hatásának vizsgálata az U266 sejtek proliferációjára
44.
4.3.3.1. MTT módszer elve
44.
4.3.3.2. U266 sejtek kezelése PRL-nal
44.
4.3.3.3. MTT teszt
44.
4.3.4. A PRL hatásának vizsgálata U266 sejtek apoptózisára
45.
4.3.4.1. U266 sejtek előkészítése
45.
4.3.4.2. Apoptózis indukció
45.
4.3.4.3. A sejtek kezelése PRL-nal
45.
4.3.4.4. Apoptózis mérése
45.
5. Eredmények
48.
5.1. A szérum PRL koncentráció myeloma multiplexben
5
szenvedõ betegeken
48.
5.1.1. A szérum PRL koncentráció változása
48.
5.1.2. A szérum b2-M és IL-6 koncentráció változása
48.
5.1.3. Összefüggés a szérum PRL szint és az alkalmazott kezelés között 48. 5.1.4. A szérum kortizol szint változása
54.
5.2. Myeloma multiplexben szenvedő betegek csontvelő
54.
aspirátumából származó keneteken a sejtek PRL tartalma 5.3. U266 humán IgE-t termelő myeloma sejtvonalon PRL szerepe
62.
5.3.1. U266 sejtek intracelluláris PRL tartalmának vizsgálata
62.
5.3.2. A PRL hatása U266 sejtek IgE termelésére
67.
5.3.3. A PRL hatása U266 sejtek proliferációjára
70.
5.3.4. A PRL hatása U266 sejtek apoptózisára
73.
6. Megbeszélés
75.
7. Köszönetnyilvánítás
83.
8. Irodalomjegyzék
84.
9. A témához kapcsolódó saját közlemények
101.
6
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
AML
acut myeloid leukemia
b2 M
béta2-mikroglobulin
BRP
bromocriptin
CD
“cluster of differentiation” (differenciálódási antigén)
CRP
C-reaktív protein
DA
dopamin
EIA
enzim immunoassay
FACS
áramlási citometriás sejt analízis
FCS
fetal calf serum
FITC
fluorescein isothiocyanate
FGFR3
fibroblast growth factor receptor3 gén
GH
growth hormon
GM-CSF
granulocyta-makrofág kolónia-stimuláló faktor
G-CSF
granulocyta kolónia-stimuláló faktor
GVHD
graft versus host disease
HLA
humán leukocyta antigén
HP
hypophysis
HS
horse serum (lószérum)
HT
hypothalamus
ICAM-1
intercelluláris adhéziós molekula
IL
interleukin
IL-6R
interleukin-6 receptor
IGF-I
insulin-like growth factor I
IFN
interferon
IRF
interferon-regulatory factor
IRMA
immunradiometriás módszer
Ig
immunglobulin
Jak/STAT
Janus kinase/signal transducers and activators of transcription
JNK/SAPK
Jun-N-terminal kinase/stress activated protein kinase)
7
KSHV
Kaposi sarcoma asszociált herpesvirus
LAK
lymphokin-aktivált killer sejt
LDH
laktát dehidrogenáz
LFA-1
leukocyta funkcionális antigén
MAPK
mitogén aktivált protein kináz
MGUS
monoclonal gammopathy of unknown significance
MM
myeloma multiplex
MTT
3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazólium bromid
N-CAM
neural cell adhesion molecule
NK
natural killer
PCLI
plasma cell labeling index
PE
phycoerythrin
PI
propidium jodid
PRL
prolactin
PRL-R
prolactin receptor
Rb1
retinoblastoma tumor-szupresszor gén
RA
rheumatoid arthritis
RPMI
tenyésztő médium (Roswell Park Memorial Institute)
SLE
systemás lupus erythematosus
sIL-6R
szolubilis interleukin-6 receptor
TGF-b
transforming-growth factor-b
TSH
thyreoidea stimuláló hormon
VAD
vincristin, adriamycin, dexamethasone
VEGF
vascular endothelial growth factor
VLA-4
very late antigen, fibronektin receptor
8
1. BEVEZETÉS
A MM a plazmasejtek rosszindulatú megbetegedése. A kórkép kialakulásának oka, a betegség progressziójában szerepet játszó tényezők összessége még nem ismert annak ellenére, hogy sok információ áll rendelkezésre citokinek, növekedési faktorok, adhéziós molekulák, a Kaposi sarcoma-asszociált herpesvirus szerepével kapcsolatosan. Megoldatlan kérdés jelenleg a betegség gyógyítása is. Fontos tehát a patomechanizmus minél pontosabb és részletesebb megismerése, mely segítséget nyújthat új terápiás célpontok kialakításában is. A PRL fontos szerepet tölt be egyebek mellett az immunrendszer szabályozásában, a hemopoezisben és a tumorfejlődésben is. A szervezet sokféle sejtje (pl. a lymphocyták, daganat sejtek) felszínükön PRL receptort (PRL-R) expresszálnak, valamint maguk is képesek PRL termelésére. Az extrapituitaer termelődő PRL autokrin/parakrin módon fejti ki hatását, és befolyásolja a B sejtek differenciálódását, fokozza a lymphocyták és egyes tumorsejtek proliferációját, gátolja az apoptózist, az NK sejtek aktivitásának befolyásolása révén hatással van a gazdaszervezet tumor elleni védekezésére is. Többféle betegség csoporttal kapcsolatosan merült fel a PRL kóroki szerepe. Így szisztémás autoimmun betegségek (pl. szisztémás lupus erythematosus), valamint egyes tumoros megbetegedések esetében (szolid tumorok és hematológiai malignitások) találhatunk a PRL szerepére utaló vizsgálati eredményeket. AML és egyes lymphoma alcsoportokkal kapcsolatban irodalmi adatok bizonyítják a PRL növekedési faktorként betöltött szerepét a betegség patomechanizmusában. Mivel a MM a B sejtek megbetegedése, mely sejtek proliferációját normális körülmények között a PRL befolyásolja, s mivel eddig több malignus hematológiai betegség esetében található a PRL szerepére utaló adat, ésszerűnek látszik a PRL MMben betöltött szerepének vizsgálata. A szakirodalomban ilyen jellegű vizsgálatok eredményéről eddig nem számoltak be.
9
2. CÉLKITŰZÉS Munkánk során a PRL MM-ben játszott szerepét kívántuk vizsgálni. A vizsgálatok tervezésekor az alábbi kérdéseket tettük fel: 1. eltér-e az egészségesektől a MM-ben szenvedő betegek szérum PRL szintje? 2. Van-e összefüggés a betegség súlyossága és a szérum PRL szint között? 3. Van-e összefüggés a szérum PRL szint és a kezelésre mutatott válaszkészség között? 4. Van-e összefüggés a szérum PRL szint és ismert prognosztikai faktorok (béta2mikroglobulin, interleukin-6) szérum szintje között? 5. Van-e különbség egészségesek és myelomában szenvedő betegek csontvelői sejtjeinek intracelluláris PRL tartalma között? 6. Van-e összefüggés a sejtek PRL tartalma és a vizsgálatot megelőzően alkalmazott kezelés között? 7. Van-e eltérés a csontvelői sejtek PRL tartalma között? 8. Tartalmaznak-e az U266 IgE-t termelő humán myeloma sejtek PRL-t? 9. Befolyásolja-e a PRL az U266 sejtek működését? (Befolyásolja-e a sejtproliferációt, az IgE termelést, valamint az etoposiddal kiváltott apoptózist?)
10
3. IRODALMI HÁTTÉR 3.1. Myeloma multiplex A MM rosszindulatú hematológiai megbetegedés, melyet egy malignus plazmasejt klón csontvelői burjánzása jellemez (1. ábra). A WHO (2000) osztályozása szerint érett (perifériás) B-sejtes neoplasma. (A betegség kutatásának számos magyar vonatkozása van, terjedelmi okok miatt csak a Kolozsvárról származó Marschalkó Tamás nevét említjük, aki a plazmasejteket először írta le). 3.1.1. A betegség klinikuma 3.1.1.1. Előfordulás Az összes daganatos betegség 1 %-áért, a vérképzőrendszer rosszindulatú megbetegedéseinek 10 %-áért felelős. Az USA-ban incidenciája 4/100000. A betegség gyakrabban fordul elő az afrikai-amerikai népességben, mint a kaukázusiak között (1), legkisebb a gyakorisága a kínai és japán populációban. Gyakorisága a nemek között is eltérő: a férfiak és a nők aránya 3:2 (2) A diagnózis felállításának időpontjában az átlagos életkor 65 év, leggyakrabban a 70-80 éves korcsoportban fordul elő, bár az utóbbi évtizedekben az életkor korábbra tolódása figyelhető meg. A betegség kialakulásában többféle környezeti tényezőnek a szerepe felmerült, a kontrollált vizsgálatok többsége azonban nem talált összefüggést a különféle foglalkozási ártalom és környezeti tényező, valamint a betegség gyakorisága között. Kivétel az irradiatio és (kevésbé egyértelműen) a benzol hatása, melyek összefüggését a MM kialakulásával több tanulmány bizonyítja (3, 4). Jóval nagyobb jelentőségű a genetikai tényezők és a krónikus antigén stimuláció szerepe, ezt támasztja alá többek között a Gaucher kóros betegek körében nagyobb számban előforduló MM (a betegségben felhalmozódó cerebrozid krónikus antigén stimulációt jelent, mely először poliklonális, majd monoklonális Ig termelést eredményez (5).
11
1. ábra MM-ben szenvedő beteg csontvelői képe (May Grünwald Giemsa festés, 200x nagyítás).
12
3.1.1.2. Klinikai tünetek, laboratóriumi eltérések A MM diagnózisának kritériuma a csontvelőben 10 %-ot meghaladó plazmasejt arány, vagy plazmocitóma jelenléte, valamint legalább egy eltérés igazolása a következő három közül: emelkedett szérum monoklonális fehérje (M-protein) koncentráció (> 3 g/dl); emelkedett vizelet M-protein koncentráció (> 1 g/24 óra); lythicus csontlézió. Jellemző tünet a csontfájdalom, a fáradékonyság, fogyás, ismétlődő infekciók, valamint az anaemia, nephropathia, neuropathia, hyperviscositas és coagulopathia által okozott tünetek. Előfordul extramedulláris érintettség is: máj-, lép, vese- nyirokcsomóinfiltráció, megjelenhet plazmasejt leukémia formájában is. A stádium besorolás Salmon és Durie alapján a csontvelői plazmasejt arány, a hypercalcaemia, az anemia jelenléte és mértéke, a monoklonális fehérje mennyisége, a csontléziók kiterjedtsége, illetve a vesekárosodás megléte, vagy hiánya alapján történik (6). Ha klinikai tünetek nincsenek jelen, de egyébként a diagnózishoz szükséges kritériumok megállapíthatóak, "smoldering" myelomáról beszélünk. Az MGUS (monoclonal gammopathy of unknown significance) esetében a szérum M-protein koncentrációja < 3 g/dl, a csontvelőben a plazmasejtek aránya nem éri el a 10 %-ot, nincs sem anaemia, sem hypercalcaemia, és hiányoznak a klinikai tünetek is (7). A "smoldering" myeloma és az MGUS elkülönítése azért is fontos, mert ezeket az entitásokat nem szükséges kezelni, csupán a beteg megfigyelése a feladatunk (8/b).
3.1.1.3. Kezelés
A betegség mai tudásunk szerint nem gyógyítható, bár a kezelésben bekövetkező fejlődés
eredményeképpen
napjainkban
az
átlagos
túlélési
idő
jelentősen
meghosszabbodott. Ez a kemoterápia fejlődésén kívül a jobb diagnosztikus lehetőségeknek, valamint a szupportív kezelés eredményességének – infekciók, hypercalcaemia, veseelégtelenség kezelése – is köszönhető. A
melphalan
alkalmazása
(önmagában,
vagy
prednisolonnal
kombinálva)
évtizedeken keresztül a terápia “arany standard”-ját jelentette (8/a). A betegek 40-60 %-
13
a reagál a kezelésre, komplett remisszió kb. az esetek kb. 5 %-ában érhető el, a túlélési idő átlagosan 3 év. Mivel a relapszus minden esetben bekövetkezik és a kialakuló gyógyszer rezisztencia is gátat szab a további kezelésnek, az 1970-es évektől kezdve többféle kombinált kemoterápiás sémát alkalmaztak az eredmények javításának reményében (8). A leggyakrabban alkalmazott protokollok a VAD (vincristin, adriamycin, dexamethasone), valamint vincristint (V), carmustint (B), melphalant (M), cyclophosphamidot (C), prednisolont (P) különféle kombinációkban tartalmazó sémák, mint a VBMCP, MCBP, VCMP, VBAP és VCAP. Bár a különböző kombinált kemoterápiás sémák csalódást jelentettek abban az értelemben, hogy nem eredményezték a teljes túlélési idő jelentős megnövekedését
a
melphalan-prednisolon
kezeléssel
szemben,
azonban
az
eseménymentes túlélés és az életminőség javulásához vezettek. Az igazán nagy áttörést a hemopoetikus őssejt adás védelmében végzett nagydózisú citosztatikus kezelés jelentette, mely a teljes túlélési időt is megnövelte. A kezelésre a betegek 90 %-a reagál, ezek 25-70 %-a (átlagosan 50 %) komplett remisszió (9). A teljes túlélési idő 5 év körül mozog, 3 év után a betegek 70 %-a van életben. Autológ perifériás őssejtátültetés esetében először kombinált kemoterápiában részesül a beteg (pl 3 ciklus VAD). Kemoszenzitív betegség esetén ezt követi a perifériás őssejt mobilizáció (általában cyclophosphamid 4-7 g/m2 és G-CSF), majd a perifériás őssejtek gyűjtése. A beteg őssejtjeit nagy dózisú kemoterápiát (ún. kondícionáló kezelés, mely pl. 200 mg/m2 melphalan adását jelenti) követően kapja vissza. Az autotranszplantáció után a relapszus
késleltetése
céljából
interferon-a
(IFN-a)
és
thalodomid
kezelést
alkalmaznak. A módszer előnye, hogy nem alakul ki GVHD, és viszonylag alacsony a toxicitása. Hátránya viszont, hogy a relapszus mindenképpen bekövetkezik, mely egyrészt a transzplantátum myeloma sejt kontaminációjának, másrészt a graft versus myeloma hatás hiányának következménye. Az egyetlen olyan beavatkozás napjainkban, amely a gyógyulás esélyét kínálja, az allogén csontvelő átültetés. Komplett remisszió az esetek 26-78 %-ban következik be (10, 11), az Európai Csontvelő Transzplantációs Munkacsoport 162 beteg eredményét feldolgozó tanulmánya 66 % komplett remissziót, 6 év múlva 34 %-os progresszió mentes túlélést említ (12). Ez azonban csak a HLA-identikus testvérdonorral rendelkező, viszonylag fiatal betegek számára elérhető lehetőség, és jelentős toxicitással
14
jár. A beavatkozás során a nagy dózisú kemoterápiát követően egy megfelelően kiválasztott egészséges egyén őssejtjeit kapja vissza a beteg. Ezek az őssejtek nem voltak kitéve a kemoterápia károsító hatásainak, és nem tartalmaznak tumor sejteket sem. További előny, hogy a donor T-sejtek által kifejtett graft-versus-myeloma hatás hatékonyan közrejátszhat a reziduális tumorsejtek eliminációjában. Sajnos, az eljárás számos hátránnyal is rendelkezik. A transzplantációval összefüggő halálozás az eddigi vizsgálatok szerint 15-56 %, a legtöbb munkacsoport adata szerint 40 % felett mozog. (10). Az IFN-a szerepével kapcsolatosan nem egységes a szakirodalom; elsősorban az ún. “plateau fázis”-ban (kezeléssel elért remissziós időszak, melyben progresszós jelek nincsenek) alkalmazzák. Úgy tűnik, alkalmas a remisszió időtartamának növelésére (13). Manapság az un. “szekvenciális kezelés” alkalmazása került előtérbe: indukciós kemoterápia, melyet hemopoetikus őssejt adás védelemben végzett nagy-dózisú kemoterápia követ. Az irradiatio alkalmas a tumor tömeg megkisebbítésére, és fájdalomcsillapító hatással is rendelkezik. A
szupportív
eljárások
(fájdalom
csillapítás,
hyperviscositas
csökkentése
plazmapheresissel, a hypercalcaemia kezelése, erythropoetin alkalmazása), valamint a szövődmények kezelése (infekciók, veseelégtelenség) is megemlítendők. A bisphosphonatok nemcsak a csontfájdalmak csökkentésében és a csontléziók kezelésében játszanak szerepet, ma már az is ismert, hogy apoptózist indukáló hatásuk hozzájárul a betegség visszaszorításához (14, 14/a). Az angiogenezis gátló thalidomidot elsősorban refrakter betegség, illetve transzplantációt követően alkalmazzák (15). A betegség patomechanizmusának jobb megismerése új terápiás lehetőségeket vet fel: a myeloma sejtek egyik legfontosabb növekedési faktora, az interleukin-6 hatásának antagonizálása, valamint a különböző vakcinációs eljárások eredményességére vonatkozóan a jövőben kaphatunk választ (8, 16, 17).
15
3.1.1.4. Multidrug rezisztencia Refrakter
betegség
esetén
citosztatikummal
szemben
megnyilvánuló
rezisztenciáról van szó, mely jelen lehet a betegség kezdetétől fogva (primer refrakter), vagy kialakulhat a kezelés során (relabáló refracter betegség). A refrakter betegség hátterében többféle mechanizmus állhat, legnagyobb jelentőséget az MDR-1 gén (multidrug-resistance) szabályozási zavarának tulajdonítanak, melynek következtében a P-glycoprotein fokozott expressziója következik be. Ez a fehérje megakadályozza a citosztatikum sejtbe történő bejutását. Az MDR kialakulását a hosszantartó doxorubicin, etoposid és vinca alkaloid kezelés indukálhatja és a hatékony kezelés legfőbb gátját jelentheti (18). Az MDR áttörésében a P-glycoprotein gátlásának lehet szerepe. A verapamil, cyclosporin A, és a PSC-833 (Valdospar) VAD-dal történő kombinációjának hatásával kapcsolatos vizsgálatok jelenleg human II klinikai fázisban vannak (18, 19). Több vizsgálat tanúsága szerint a primer refrakter, illetve a relabáló beteg kezelésében a nagydózisú kemoterápia lehet eredményes (20).
3.1.1.5. Prognosztikai faktorok A standard melphalan-prednisolon és a kombinált kemoterápia alkalmazásával az átlagos túlélés 3 év. Az autológ őssejt átültetéssel összekapcsolt nagydózisú kemoterápia az 5 éves túlélést 52 %-ra emelte, míg az allogén csontvelő átültetés az egyetlen kuratív hatású gyógymód, azonban a beavatkozás igen magas halálozási aránnyal jár. A myelomás betegek élettartama igen tág határok között mozog, a betegek mintegy 3 %-a 10 évnél is hosszabb ideig él. Mindezek alapján igen fontos lenne, hogy a diagnózis felállításakor meg tudjuk becsülni a várható élettartamot, és a különböző kezelési módokra várható reakciót (21). Rossz prognosztikai jelnek tekinthető a magas béta2-mikroglobulin (b2M), laktát dehidrogenáz (LDH) szint, az emelkedett PCLI, a plazmablastos morfológia, citogenetikai eltérések, aneuploiditás jelenléte. A sejtciklus S fázisában (DNS szintézis fázisa) lévő sejtek arányának meghatározása szintén alkalmas a plazmasejtek
16
proliferációs aktivitásának meghatározására. 3%-nál több S fázisban lévő plazmasejt a rossz
prognózis
független
faktoraként
alkalmazható.
(22).
A
plazmasejtek
intracitoplazmatikus Ig pozitivitása érettlenebb sejttípust, rossz prognózist jelez. A szérum interleukin-6 (IL-6) és a szolubilis IL-6 receptor (sIL-6R) szintén önálló prognosztikus faktornak tekinthető. Az IL-6 változása általában párhuzamos a C-reaktív protein (CRP) változásával. A CRP a máj által termelt akut-fázis fehérje, melynek prognosztikus értékét nem minden vizsgálat eredménye támasztotta alá (23). Az angiogenezis mértéke a von Willebrand faktor immunhisztokémiai vizsgálata, vagy a mikroerek CD34 markerrel történő azonosítása révén meghatározható. Fokozott angiogenezis rossz prognózist jelöl. Tandem transzplantációt alkalmazva, a túlélés esélye jobb volt alacsony angiogenetikus aktivitás mellett, valamint az átültetést követően
a
progressziómentes
túlélés
is
hosszabbnak
bizonyult
alacsony
posztranszplantációs angiogenezis esetén (24). Újabb adatok szerint, az I. típusú kollagén emelkedett szérum szintje, a CD19+ B sejtek emelkedett, valamint a CD4+ T sejtek csökkent aránya a perifériás vérben, a magas szérum timidin kináz aktivitás, a plazmasejtek syndecan-1 (CD138) pozitivitása szintén a rossz prognózissal állhat összefüggésben. (25, 26, 27). 3.1.2. A betegség biológiája A malignus plazmasejt, vagy myeloma sejt egy jól differenciált, lassan proliferáló sejt, mely már keresztül jutott a fejlődés azon szakaszain, melyek a szomatikus hipermutációt, az antigén szelekciót és az immunglobulin nehézlánc (IgH) izotípus átkapcsolást foglalják magukba. Az a prekurzor sejt, melyet a malignitás irányába indító első genetikai inzultus ér, a nyirokcsomóban elhelyezkedő pre-B, vagy korai B sejt, melyre jellemző, hogy az antigén szelekció utáni, de még az IgH izotípus átkapcsolás előtti fejlődési stádiumban van (28). A MM kialakulása és progressziója többlépcsős folyamat eredménye, mely során a sejtek elvesztik apoptózis válaszkészségüket, kibújnak az immunellenőrzés alól, megnő életidejük, a sejtklón proliferációja, expanziója, inváziója és disszeminációja figyelhető meg. A folyamatsorban fontos szerepet játszik a tumor mikrokörnyezete is. A malignus átalakulásban és progresszióban citokinek, növekedési faktorok, adhéziós molekulák, a
17
Kaposi sarcoma asszociált herpesvirus (KSHV), az antigén-prezentáló dendritikus sejtek, valamint a T sejtek vesznek részt (29, III).
3.1.2.1. MGUS-MM átmenet A betegséget gyakran megelőzi egy premalignus állapot, a MGUS, amely a felnőtt népesség 1%-ában fordul elő. A MGUS-ban szenvedő betegek szérumában, vagy vizeletében monoklonális fehérjeszaporulat mutatható ki, de hiányoznak a MM-ra jellemző klinikai tünetek, és a csontvelőben sem mutatható ki malignus morfológiájú plazmasejt szaporulat. Az esetek 17- 25 %-ában az idő előrehaladtával a MGUS betegekben MM alakul ki, a MM betegek 58%-ának betegségét MGUS előzte meg. A MGUS-MM átalakulás mai tudásunk szerint több, egymást követő változás következménye. Felmerült a plazmasejtet érő genetikai változás, vagy vírusfertőzés szerepe, mely kóros citokin és adhéziós molekula expressziót von maga után. A citokinek közül az IL-1b-t hozzák összefüggésbe a MGUS-MM átalakulással: a csontvelői plazmasejtjek IL-1b expressziója a MGUS konverziójára, progresszióra utal (30).
3.1.2.2. Citogenetikai eltérések A frissen diagnosztizált betegek myeloma sejtjeinek 20-30 %-ában mutatható ki citogenetikai eltérés. A betegség progressziójával párhuzamosan az előfordulás növekszik (31). A leggyakrabban előforduló szerkezeti változás az IgH génszakaszának helyét érinti (14q32) (32, 33). Megfelelően érzékeny technikával az esetek többségében (74%) kimutatható az IgH switch régióját érintő strukturális eltérés. A B sejtek esetében az IgH lókusz igen erős transzkripciós aktivitással rendelkezik, és ez a transzlokáció révén hozzá közel kerülő gén diszregulációját eredményezheti. A transzlokációban részt vevő partner lókuszok közül a 11q13 a cyclin D1 kóros expresszióját, a 4p16 a fibroblast growth factor receptor3 gén (FGFR3) kóros expresszióját, a 16q23 az onkogén c-maf
18
fokozott expresszióját eredményezi. A transzlokációs töréspontok nem az onkogén közvetlen szomszédságában találhatók. Igy a következmény nem fúziós fehérje kialakulása lesz (ahogy több, haematológiai betegségben megfigyelhető), hanem az Ig gén
szabályozó
szakaszához
történő
kapcsolódás
az
onkogén
expresszió
diszregulációjához vezet. Számos egyéb genetikai eltérés is kimutatható (34). A c-myc protoonkogén a sejtproliferációban játszik szerepet. A c-myc gén átrendeződése, kóros c-myc transzkripció, és kórosan magas c-myc mRNS szint a MM betegek jelentős részében megfigyelhető (35). A ras onkogéneket érintő mutációk szintén kimutathatók. N- és K-ras gén mutáció a diagnózis idején a betegek 50 %-ában, relapszus esetén 70 %-ban detektálható (36). A p53 tumor-szupresszor gén, mely a DNS károsodás által indított sejtválasz, a sejtciklus és az apoptózis szabályozásában játszik szerepet. MM betegek esetében a p53 pontmutációját 10-16 %-ban sikerült kimutatni, jelenléte progresszív betegségre utal (37). A sejtciklus G1-S átmenetét gátló fehérjét kódoló retinoblastoma tumor-szupresszor gén (Rb1) delécióját a MM betegek 52 %-ában mutatták ki. Többségük frissen diagnosztizált beteg volt, ami arra utal, hogy az Rb1 gén deléció a MM patogenezisének korai állomása (37). Humán sejtvonalon a bcl-2 gén fokozott expresszióját igazolták. Ez a gén a 18. kromoszómán helyezkedik el, és működése az apoptózis gátlását eredményezi. Fokozott expressziója a myeloma sejtek túlélésével állhat összefüggésben. A 13q monoszómia jelentősége még nem ismert, feltehetően egy tumor szupresszor gén működésének kiesését eredményezi (37).
3.1.2.3. Növekedési faktorok szerepe Interleukin-6 (IL-6) A növekedési faktorok között az IL-6 alapvető szerepet játszik (38). Nemcsak a myeloma sejtek proliferációját fokozza, hanem túlélésüket is elősegíti az apoptózis gátlása révén (39). Osteoclast-aktiváló hatása révén hozzájárul a betegségre jellemző
19
csontléziók kialakulásához (2. ábra). Az IL-6 hatását az IL-6 receptorhoz (IL-6R) kapcsolódva fejti ki. A jelátviteli folyamatban a Jak/STAT3 (Janus kinase/signal transducers and activators of transcription), a Ras/MAPK (Ras/mitogen-activated protein kinase és a JNK/SAPK (Jun-N-terminal kinase/stress activated protein kinase) útvonalak is szerepet játszanak. A növekedést elősegítő hatását a p53 és pRb inaktivációján keresztül fejti ki. IL-6-ot termelnek maguk a myeloma sejtek is, de az autokrin hatásnál nagyobb jelentősége van a csontvelői stróma sejtek és dendritikus sejtek által termelt IL-6 parakrin hatásának (40, I). Felmerült a KSHV infekció kapcsán a virális IL-6 szerepe is a betegség progressziójában (28). Az IL-6 jelentős szerepét mutatja, hogy MM betegek szérum szintje megemelkedik, és mértéke arányos a betegség súlyosságával. Az agonista hatású sIL-6R szérum koncentrációja is emelkedett MM betegek esetében (41). In vivo monoklonális anti-IL-6 antitest, valamint in vitro IL-6 antiszenz oligonukleotid gátolja a myeloma sejtek növekedését. Az IL-6 szerepét állatmodellen is tanulmányozták. Pristane-olaj intraperitonealis injekciója révén fogékony egértörzsben IL-6 termelés és plazmocitóma kialakulása indukálható. IL-6 knockout egéren ilyen módon nem hozható létre plazmocitóma (42, II). Interleukin-1b (IL-1b) Az IL-1b jelentős osteoclast aktiváló hatással rendelkezik. A normális és MGUS betegekből származó plazmasejtekkel szemben, a MM betegek plazmasejtjei számottevő mennyiségben termelnek IL-1b-t (30). A MM sejtek által termelt IL-1b egyrészt aktiválja az osteoclast sejteket, ezzel hozzájárul a csontléziók kialakulásához. Ezen túlmenően a csontvelői strómasejtek adhéziós molekula expresszióját és parakrín IL-6 termelését fokozza, ami a MM sejtek csontvelői fixációját és proliferációját segíti elő (43). Insulin-like growth factor I (IGF-I) Humán myeloma sejteken kimutatták IGF-I receptorok jelenlétét, a MM sejtek IGF-I termelésére képesek. Az IGF-I fokozza a myeloma sejtek proliferációját, és gátolja a dexamethasone-indukálta apoptózist (44).
20
Transforming-growth factor-b (TGF-b) A TGF-b a tumor fejlődésben negatív szerepet játszik. Bár egér plazmocitóma sejtek TGF-b termelését igazolták, a sejtek rezisztensek e citokin növekedést gátló hatásával szemben, mivel nem rendelkeznek funkcionáló TGF-b receptorral (45). Interferon-a (IFN-a) Az IFN-a-ra jellemző, hogy a myeloma sejtek növekedését fokozó és gátló hatás kifejtésére is képes (46). Ezek az egymásnak ellentmondani látszó eredmények azért is figyelemre méltóak, mivel az IFN-a-t régóta alkalmazzák MM betegek fenntartó kezelésében. A nagy számban rendelkezésre álló klinikai adatok mellett, melyek az IFN-a hatékonyságát bizonyítják, egyes esetekben az IFN-a progressziót elősegítő hatásáról számoltak be. Az ellentmondást feloldani látszik, hogy míg az IFN-a egyfelől fokozza az autokrin IL-6 termelést, amely a tumor növekedést segíti elő, másfelől az IL6R expresszió gátlásával a sejtciklust szabályozó fehérjéken keresztül a növekedés gátlására képes. Pontos hatása azonban még jelenleg sem ismert. (47). 3.1.2.4. Kaposi sarcoma asszociált herpesvirus (KSHV) szerepe Feltételezhető a vírus szerepe a betegség patogenezisében. KSHV genomiális szekvenciáit sikerült kimutatni MM betegek csontvelői dendritikus sejtjeiben, valamint vérmintáiban. A diagnózis időpontjában a MM betegek 83 %-a volt pozitív. Egészséges egyedekből származó minták negatívak voltak (48). MM betegek esetében a vírusnegativitás korai stádiumot, kis tumor tömeget jelez. Az IL-8, az IL-6 és az interferonregulatory factor (IRF) virális homológjainak expressziója a vírusnak a betegség kialakulásában játszott szerepére utal (30). Az IRF termelés a fertőzött sejtek számára egy növekedési és apoptózissal szembeni előnyt jelent egy növekedést gátló molekula, a p21, cyclin D kinase inhibitor gátlása következtében. Az IL-8 termelés az angiogenezis stimulációját erősíti a VEGF (vascular endothelial growth factor) indukciója által, egyben gátolja a vírusmentes dendritikus sejtek szaporodását (49).
21
3.1.2.5. Adhéziós molekulák, angiogenezis Csontvelői angiogenezis jelenlétét igazolták MM betegeken, míg MGUS betegek esetében a jelenség nem volt megfigyelhető. Az angiogenezis mértéke arányos volt a plazmasejtek proliferációs aktivitását mutató plasma cell labeling index-szel (PCLI). Az angiogenezis igazolása az aktív betegség egyik prognosztikus faktorának tekinthető (28). A MM sejtek által termelt, angiogenesist fokozó citokin, a VEGF hozzájárul a betegség disszeminációjához. A MM kezelésében újabban alkalmazott thalidomid az angiogenezis gátlása révén fejti ki hatását. MM-ben a csontvelői plazmasejtek és a stróma sejtek is adhéziós molekulákat expresszálnak. Aktív betegségben szenvedőkön az angiogenezissel párhuzamosan LFA1 (CD11), VLA-4 (very late antigen, fibronektin receptor), ICAM-1 (intercellular adhesion molecule, CD54), és CD44 (lymphocyte homing receptor), expresszió mutatható ki (50). A malignus sejtekre jellemző a N-CAM (neural cell adhesion molecule, CD56) expresszió. Az extracelluláris mátrixhoz (pl. fibronektinhez), illetve a stróma sejtekhez történő adhézió a MM sejt számára túlélési előnyt jelent. A fibronektin adhézió gátolja a citosztatikumok által (doxorubicin, melphalan) indukált apoptózist. A fokozott adhéziós molekula expresszió a gyógyszer rezisztencia kialakulásával is összefügg. Gyógyszer rezisztens myeloma sejtvonal fokozott VLA-4 expresszióját mutatták ki. Ez arra utal, hogy in vivo a csontvelői mikrokörnyezet szerepet játszik a gyógyszer általi szelekció korai fázisában azáltal, hogy a fibronektinhez kötődött MM sejtek szelektív túlélési előnyt élveznek (51). Az adhéziós molekulák nemcsak a MM sejtek csontvelői lehorgonyzását és akkumulációját segítik elő, hanem egyszersmind komoly szerepet töltenek be a tumorsejtek véráramba jutásában és a betegség disszeminációjában (51, 52).
22
T sejt
Csontlézió
IL-4 IL-6 IL-6
Osteoclast ANGIOGENESIS
IL-6R
TNF-a, IL-1b
MYELOMA SEJT
NÖVEKEDÉS IL-6R
IL-6
IL-6 ADHÉZIÓ
APOPTÓZIS
IL-1b, GCSF, GMCSF, TGF-b
IL-6 VCAM-1 TNF-a, IL-1b
CSONVELŐI STRÓMASEJTEK
2. ábra. Citokinek és a csontvelői mikrokörnyezet hatása a myeloma sejtre Piros nyíl: serkentés; kék szaggatott nyíl: gátlás
23
3.2. A prolactin szerepe az immunregulációban, a hemopoezisben és a tumor fejlődésben A PRL neuropeptid hormon, melyről sokáig csak annyit tudtunk, hogy a hypophysis (HP) termeli, alapvető élettani funkciója a tejelválasztás szabályozása. Ma már ismert, hogy a szervezet homeosztázisának fenntartását szolgáló több, mint 300 különféle biológiai hatással rendelkezik, így például a reprodukcióban, ozmoregulációban, kalcium anyagcserében és a viselkedés szabályozásában is szerepet játszik (53). Az immunrendszer szabályozásában, a hemopoezisben és a tumor fejlődésben szintén alapvetően fontos a szerepe. PRL termelésére nemcsak a HP sejtjei képesek, hanem a szervezet igen sokféle sejtje, többek között az immunrendszer sejtjei is (54, 55). Hasonlóan, PRL-R expresszió nagyon sokféle sejt felszínén megfigyelhető (56, 57, 58). Az extrapituitaer PRL lokálisan autokrin/parakrin módon, a citokinekhez hasonlóan fejti ki hatását (59). 3.2.1. A PRL szerkezete A PRL egyetlen, 198 aminosavat tartalmazó láncból álló fehérje, molekulsúlya 23,5 kDa.
Poszttranszlációs
módosulások
következtében
különböző
molekulasúlyú
izoformák alakulnak ki, melyek receptor affinitása, biológiai hatása eltérő, az egyes izoformák aránya más lehet normális és patológiás körülmények között (60). Különbség mutatkozik az egyes sejttípusok által termelt PRL izoformák között is (61). Szerkezetét tekintve a citokin/hemopoetikus család tagjaival mutat rokonságot (62). 3.2.2. A PRL receptor szerkezete A PRL-R a citokin/hemopoetikus receptor család tagja, mely családba sorolhatók többek között az interferon receptorok, az interleukin (IL) –2, IL-3, IL-4, IL-6, granulocyta-makrofág kolónia-stimuláló faktor (GM-CSF), granulocyta kolóniastimuláló faktor (G-CSF), gp-130 (63, 64). A PRL-R-nak is többféle izoformája ismert,
24
melyek alternatív hasítás útján jönnek létre. A hosszú, közepes és rövid forma közül az utóbbi nem képes a jelátvitelre az intracellulárs domén hiánya miatt (65). 3.2.3. A jelátvitel A PRL receptorhoz történő kapcsolódása a receptor homodimerizációja után a Jak/STAT rendszer aktiválódását idézi elő, mely a sejt transzkripciós aktivitásának fokozódását eredményezi (66, 67). Az egyes sejteken a PRL más-más Stat fehérje aktiválódását indukálja. Nb2 sejteken a Stat1, Stat3 és Stat5-öt aktiválja (67). A jelátvitel a Ras, Raf/MAPK útvonalon is történhet (68). A PRL target génjei közül az interferon-regulatory factor-1 (IRF-1) az egyik legjelentősebb (57, 69). Aktiválódása T lymphocytákon például nélkülözhetetlen a sejtfejlődés, proliferáció, apoptózis szempontjából. A PRL által indukált Stat1 az IRF-1 gén promoterének pozitív, a Stat5 negatív mediátora: a két Stat faktor arányától függ tehát az IRF-gén aktivációjának fokozódása, vagy csökkenése (57, 70). A receptor stimuláció másik fontos eredménye a sejtnövekedés és differenciálódás szempontjából igen jelentős ornithine decarboxilase fokozott termelődése (71). A PRL nemcsak a sejtfelszíni receptorhoz történő kapcsolódás és jelátviteli mechanizmusok beindítása révén képes hatását kifejteni, hanem ismert az a tény is, hogy a sejtek internalizálni tudják a PRL-t. Az ilyen módon a sejtbe bejutott PRL a magba transzlokálódik (72). 3.2.4. A PRL termelés szabályozása A HP PRL termelését a hypothalamus (HT) szabályozza. A HT által termelt dopamin (DA) a PRL szekréció folyamatos gátlását idézi elő, míg más faktorok (thyreotropinreleasing hormon, vasoactiv intestinalis peptid, oxitocin, serotonin) serkentik a PRL felszabadulást. A dexamethasone szintén gátolja a PRL termelődését. Egyes citokinek is befolyásolják a PRL termelést, így az IL-1, IL-2, IL-6 stimulálják, míg az interferon-g (IFN-g), endotelin-3 gátolja a PRL termelést (53, 55, 73). Fontos megemlíteni a PRL szekréció cirkadián ritmusát. Az elválasztás csúcsa 02 óra. A nemi hormonok igen összetett hatást gyakorolnak a PRL termelésre.
25
3.2.5. A PRL hatása az immunrendszerre Az immunrendszer normális fejlődéséhez, a fiziológiás működéshez normális PRL szint szükséges. Mind a hypoprolactinaemia, mind a hyperprolactinaemia kóros állapotot eredményez (74, 75, 76, 77). 3.2.5.1. A hypoprolactinaemia hatása A PRL immunregulációban játszott szerepére és a hypoprolactinaemia hatására először Berczi és mtsai által végzett kísérletek hívták fel a figyelmet. HP-írtott patkányok immunhiányossá és anémiássá váltak, PRL-ellenes antiszérum adása az állapotot oly mértékben súlyosbította, hogy az állatok elpusztultak. Bromocriptin kezelés (BCR; DA antagonista, mely a HP PRL szintézisét gátolja) hasonló hatást eredményezett. Exogén PRL bejuttatásával a hatás felfüggeszthetőnek bizonyult. (78, 79, 80). In vitro vizsgálatok során hypoprolactinaemiás állapotban szintén a lymphocyta funkciók csökkenését igazolták, PRL-nal a funkciócsökkenés felfüggeszthető volt (81). Az immunszupresszív hatású cyclosporine, mely kompetitív módon akadályozza a PRL receptorhoz történő kapcsolódását, hatását részben PRL-függő reakciók gátlása révén fejti ki (82). 3.2.5.2. A PRL célpontjai az immunregulációban A PRL összetett hatást fejt ki az immunrendszerre (IR) (83, 84). Mind a celluláris, mind a humorális immunitást befolyásolja (85). A PRL fokozza az immunsejtek proliferációját és túlélését (86, 87). A sejtproliferációra gyakorolt hatását a sejtciklus progresszióját elősegítő géntermékek expresszióján keresztül fejti ki (67). Korai hatásként a c-myc, c-fos, b-actin, IRF-1 gén transcriptioját indukálja, majd egy későbbi fázisban az ornithin decarboxylase, a heat-shock protein 70 és a cyclin gének expresszióját fokozza (88). T, B lymphocyták, NK (natural killer) sejtek komitogénjeként szerepel (81). Túlélési faktorként antagonizálja a glukokortikoidok
26
apoptózist fokozó hatását (89). Ez az aktivitása nagymértékben hozzájárul a stresszindukálta glukokortikoid termelés immunszupresszív hatásának ellensúlyozásához (90). A PRL in vitro fokozza az IL-2, IL-4 által stimulált humán és egér lymphocyta proliferációt (86). Fokozza T sejteken az IL-2 receptor expressziót (91). T sejteken az IL-2 stimuláció fokozza a PRL sejtmagba történő transzlokációját (92), eszerint a PRL az IL-2 “második hírvivője”-ként szerepel (93). B sejteken fokozza az antitest termelést (94). Az NK sejt-mediált citotoxicitást fiziológiás koncentrációban fokozza, míg patológiásan magas dózis gátló hatást eredményez (95). A sejt-közvetített reakciókat is befolyásolja: a kontakt szenzitivitást (96) és az akut allograft kilökődést fokozza. HPírtott állatokon, vagy BCR kezelés után az akut allograft kilökődés gátlása figyelhető meg, ez a gátlás PRL adásával felfüggeszthető (97).
3.2.5.3. Hyperprolactinaemia szerepe patológiás állapotokban A kórosan magas PRL szint és az autoimmun betegségek között kapcsolat figyelhető meg (76, 98). Állatkísérletes eredmények NZB/NZW spontán SLE (szisztémás lupus erythematosus) kialakulására hajlamos egértörzset vizsgálva igazolták, hogy krónikus hyperprolactinaemia aktiválta a betegséget, fokozta az állatok mortalitását. BCR kezelést követően a PRL szint csökkent, ezzel párhuzamosan csökkent az antitest titer, és javultak a túlélési eredmények (99). Patkányokon Freund adjuvánssal előidézett arthritis (adjuváns arthritis, mely a rheumatoid arthritis állatmodelljének tekinthető) kialakulása BCR kezeléssel, vagy HPírtással meggátolható. Ez a hatás PRL adásával felfüggeszthető (100). Kísérletes allergiás enkephalomyelitis (101), vagy uveitis (102) modelleken szintén igazolták a PRL szerepét: BCR, vagy cyclosporin A (mely reverzibilis módon a PRL-Rhoz kötődik) kezelés csökkentette a betegség súlyosságát és előfordulását, míg exogén PRL a kórállapot akcelerációját idézte elő.
27
Humán vizsgálatok Az állatkísérletes eredmények mellett humán vizsgálatok is megerősítették a hyperprolactinaemia és az autoimmun betegségek kapcsolatát. Hyperprolactinaemiás betegeken nagyobb gyakorisággal mutathatók ki különféle autoantitestek (103). Humán
vizsgálatokban
igazolták az
enyhe hyperprolactinaemia kölönböző
autoimmun kórképekkel való kapcsolódását, pl. autoimmun thyreoiditis-szel, sclerosis multiplex-szel, scleroderma-val, polymyositis-szel (98). Ismert, hogy egyes autoimmun betegségek a terhesség, vagy a laktáció időszaka alatt manifesztálódnak, vagy aktiválódnak. Fertilis nők fogékonyabbak SLE –vel szemben, mint a férfiak, de ez a különbség a menopauza során eltűnik. SLE-s betegeket vizsgálva az emelkedett szérum PRL szint korrelált a betegség klinikai és laboratóriumi aktivitási jeleivel. BCR kezelés csökkentette a betegség aktivitását (103, 104, 105,). Mivel az SLE kezelésében használatos gyógyszerek egy része befolyásolja a PRL szintézist (pl. chloroquin, glukokortikoidok), a betegek kiválasztása, a vizsgálati eredmények megfelelő értékelése rendkívül fontos (98). Rheumatoid arthritisben (RA) igazolták a neuroendokrin és immunrendszer kapcsolatának
zavarát,
amely a
gyulladásos
reakciók megváltoztatása révén
hozzájárulnak a betegség kialakulásához (106, 107). A PRL szint RA-ban is korrelál a betegség súlyosságával, és az aktivitást jelző paraméterekkel. RA-ban gyakran előforduló HLA-DR4 fenotípus és prolactin gén polimorfizmus kapcsolatát is sikerült igazolni: (108). Az emelkedett szérum PRL szint forrása nem ismert. Egyaránt okozhatja a proinflammatoros citokinek HP stimulációja, valamint a perifériás lymphocyták fokozott PRL termelése (77). 3.2.6. A PRL szerepe a hemopoezisben HP-írtott patkányok anaemiássá válnak. Ha PRL-ellenes antitest adásával az extrapituitaer PRL hatását is közömbösítjük, az állatok csontvelő elégtelenség miatt elpusztulnak (59). Humán rekombináns PRL adása egérkísérletekben fokozta mind a myeloid, mind az erythroid kolónia képződést (CFU-GM, BFU). A myeloszupresszív
28
hatású azidothymidin által okozott csontvelői gátlás is kivédhető volt PRL adása révén (109). A perifériás vérsejtek és a csontvelői sejtek egy részén kimutatható PRL-R, ezek a sejtek pit-1/GHF-1-et expresszálnak (transzkripciós faktor, mely szabályozza a HP sejtek PRL és GH termelését), valamint PRL termelésére is képesek. A hemopoetikus sejtek PRL-R expressziója és PRL termelése autokrin/parakrin növekedési hurok jelenlétére utal (110). A PRL-nak jelentős szerepe van a B sejt fejlődésben. Csontvelői B sejt precursorokon PRL-R expressziót igazoltak, a PRL csontvelői sejtkultúrákon a B sejtpopuláció expansioját idézi elő (111). A hemopoetikus mikrokörnyezet jelentős mértékben eltér a HT-HP-től. Míg a HP PRL termelését a HT DA és hormonok útján szabályozza, a citokineknek e tekintetben kisebb a jelentőségük, a hemopoetikus rendszer PRL termelését elsősorban a hemopoetikus növekedési faktorok és citokinek szabályozzák. A HP által termelt PRL a vérképző rendszerben is kifejti hatását, ezzel szemben a hemopoetikus sejtek által termelt PRL-nak nincs szisztémás hatása, más faktorokkal együttműködve a hemopoetikus mikrokörnyezetre hat (112). 3.2.7. PRL szerepe a tumorfejlődésben 3.2.7.1. Humán vizsgálatok Bronchus-, emlő-, colon- és vesecarcinomában szenvedő betegek egy részében emelkedett szérum PRL szint, a tumorsejtek fokozott PRL expressziója mutatható ki (113, 114, 115, 116). Colon carcinomában szenvedő betegeken a szérum PRL szint korrelált a betegség progressziójával, a tumor resectioját követően a PRL szérum szintje csökkent, recidiva esetén ismét emelkedett. A carcinoembrionalis antigénnél hasznosabb tumor markernek találták a recidiva előrejelzése szempontjából (117). Emlőcarcinomában a PRL autokrin növekedési faktor szerepét igazolták (118). AML-ben (acut myeloid leukémia) szenvedő betegek egy részében (16/28) emelkedett szérum PRL szint, a blast sejtekben PRL termelés észlelhető (119).
29
Grobe Hodgkin és non-Hodgkin lymphomában szenvedő betegeket vizsgálva egy részüknél emelkedett szérum PRL szintet igazolt, közöttük többen rendelkeztek extranodalis manifesztációval. A remisszió során a szérum PRL szint a normális értékre csökkent (120). 3.2.7.2. In vitro és állatkísérletes megfigyelések Egyes lymphoma/leukémia típusok esetében in vitro és in vivo megfigyelések támasztják alá a PRL malignus folyamatban betöltött szerepét (121). Míg normál B lymphocyták expresszálnak ugyan PRL-R-t, de PRL termelés a sejtekben ritkán mutatható ki, malignus B sejteken a receptor expresszión túlmenően endogén PRL szintézis, és exogén PRL-ra való válaszkészség figyelhető meg (122). IM-9-P B lymphoblastoid sejtvonal biológiailag aktív PRL-t
termel (123). Az EBV-negatív
Burkitt lymphoma (sfRamos) PRL-t termel, mely e sejtek számára autokrin növekedési faktor (124). Eol-1 acut myeloid blast sejtvonal szintén biológiailag aktív PRL-t termel (125). Gaidano és munkacsoportja Burkitt lymphoma AIDS-hez kapcsolódó és endémiás formáit vizsgálva in vitro kísérletekben igazolta, hogy az IL-2 és a PRL szinergista módon hatva képes citotoxikus killer sejtek (LAK) létrehozására, mely a lymphoma sejteket elpusztítja (126). A PRL direkt tumorsejt növekedést fokozó hatása ellentétes a szervezet antitumor folyamatait elősegítő szerepével. Jurkat humán T-leukémia sejtvonalon a PRL szintén autokrin növekedési faktorként hat (127). Nb2 T sejtes lymphoma sejtvonal növekedése szintén PRL-függő (128, 1988). A sejtvonal igen érzékeny módszert nyújt a PRL biológiai aktivitásának vizsgálatára.
Ezen
a
modellen
részletesen
tanulmányozták
a
PRL-indukálta
génexpressziós folyamatokat (129). Transzformált NK sejtvonalon is sikerült PRL mRNS és fehérje expressziót kimutatni (127). Állatkísérletes modellen HP-írtást követően egyes myeloid leukémia típusok regresszióját figyelték meg (130).
30
Az endothel sejtek PRL termelésének angiogenezisre gyakorolt hatását is vizsgálták. PRL fragmentumok (16 kDa) gátolják az angiogenezist. Ezzel szemben újabb eredmények az intakt humán PRL angiogén hatását igazolták (131). 3.2.7.3. A PRL tumorfejlődésben játszott komplex szerepe A PRL összetett hatást fejt ki a tumorfejlődésre. A hatás mértéke és iránya függ a dózistól, sejttípustól, a sejt differenciálódási fokától, a mikrokörnyezetben jelenlévő egyéb faktoroktól. Ismert, hogy míg fiziológiás koncentrációban stimulálja a lymphocytákat, farmakológiás dózis gátló hatású lehet. Ennek a kettős hatásnak szerepe lehet fiziológiás körülmények között az érett lymphocyta funkció fenntartásában, hyperprolactinaemiás állapotokban (pl. stressz, terhesség) a lymphocyta funkció csökkentésében. Ha a magas PRL koncentráció gátolja a citotoxikus lymphocytákat, a malignus B sejtek által termelt PRL-nak szerepe lehet a tumor-mediált immunszupresszióban (132). A PRL direkt és indirekt módon hatva szintén egymással ellentétes folyamatokat indukálhat. Direkt módon fokozza a malignus lymphocyták növekedését, míg a citotoxikus killer sejt aktivitás fokozása a gazdaszervezet tumorellenes védekezését fokozza (121, 133). Az eltérő hatások közvetítésének egyik oka lehet a sejtek felszínén lévő PRL-R-ok egymástól eltérő izotípusa, mely befolyásolhatja a jelátviteli folyamatokat. Az IL-2 és IL-6 fokozza a PRL termelést. A PRL befolyásolja a T sejtek IL-2 expresszióját. IFN-g gátolja a PRL termelést. Az egyes citokinek kölcsönhatása az adott mikrokörnyezetben szintén bonyolult módon befolyásolja az eredő válasz irányát és nagyságát (133). A sejten belüli folyamatokat vizsgálva, bár még sok ismeretlen tényező van, a PRL alapvető hatása a sejtciklus progressziójában szerepet játszó gének expressziójának fokozása. Az egyik legfontosabb target gén a JAK/STAT jelátviteli úton keresztül aktiválódó IRF-1. Az egyes Stat faktorok (Stat1 és 5) vetélkednek koaktivációs faktorokért, az IRF-1 gén promoterén érvényesülő hatás iránya tehát függ az aktiválódó Stat faktorok arányától. Ez sejttípusonként (normál lymphocyta, Nb2 T lymphoma sejt, IM-9 lymphoblast), valamint a sejtciklus eltérő pontjain különböző lehet (57, 67, 70).
31
Nb2 sejteket vizsgálva a bcl-2 és bax megváltozott expressziójának tulajdonítanak szerepet a sejtciklus progresszióban (134). Reed munkcsoportja az apoptózis szabályozó bcl-2 gén expressziójának fokozódását mutatta ki PRL hatására (135), míg mások nem tudták igazolni a bcl-2 szerepét (89). Szintén Nb2 sejteken dexamethasone-indukálta apoptózist a PRL gátolta. A dexamethasone egy eddig ismeretlen kaszpáz aktivációja által a mitochondriális transzmembrán potenciál megváltoztatásán keresztül fejti ki apoptotikus hatását. A PRL ezt a hatást akadályozza meg (89). 3.2.8. A PRL immunregulációban, vérképzésben, és tumorfejlődésben betöltött szerepének klinikai jelentősége A PRL ezen hatásait terápiás szempontból is megközelíthetjük. Autoimmun kórképekben a PRL aktiválja, súlyosbítja a betegséget. SLE-ben, RAban már történtek próbálkozások a PRL szintet csökkentő BCR kezeléssel, egyes vizsgálatok szerint a kezelés csökkentette a betegség aktivitását (103, 104, 105,), míg más munkacsoportok nem tudták megerősíteni ezeket az eredményeket (136). Új terápiás megközelítést jelenthet PRL alkalmazása irradiatio, vagy kemoterápia következtében kialakult csontvelőelégtelenség esetében (109, 112). Krónikus GVHDben (graft versus host disease) szenvedő betegeken emelkedett PRL szintet mutattak ki. BCR alkalmazása csökkentheti a GVHD-s betegek cyclosporine igényét, amely a toxikus ártalmak kivédését segítheti (137). Hasonlóan, vesetranszplantációt követően, az akut graft kilökődés megelőzése céljából alkalmazott cyclosporine dózisa csökkenthető egyidejű BCR adással (82). Többféle malignus sejt PRL termelését, illetve PRL-R expresszióját igazolták. A PRL egyes malignomák esetében autokrin/parakrin növekedési faktor szerepet tölt be. Másrészt, a PRL képes a gazdaszervezet tumorellenes folyamatainak aktiválására (LAK sejtek aktivációja). A tumorkeletkezésben fontos szerepet játszó angiogenezisre is hat. Mindezek
arra
utalnak,
hogy
a
daganatos
betegségek
keletkezésében
és
progressziójában a PRL olyan összetett szerepet tölt be, hogy jelenleg nehezen jósolható meg, hogy adott esetben hatásának fokozásától, vagy gátlásától várható-e kedvező eredmény. Mindazonáltal ismereteink elmélyülése ezen a területen a gyógyításban közvetlenül felhasználható eredményekkel szolgálhat.
32
4. MÓDSZEREK 4.1. A szérum PRL koncentráció vizsgálata MM-ben szenvedõ betegeken 4.1.1. Betegek A vizsgálatban 56 MM-ás beteg és 40 kontroll személy vett részt. A résztvevõk felvilágosítást követően beleegyezésüket adták a vizsgálatban való közremûködéshez. A klinikai stádium meghatározást Salmon és Durie alapján végeztük (6). A betegek legfontosabb paramétereit az I. táblázatban foglaltuk össze. A kontroll csoportot egészséges önkéntesek, illetve rosszindulatú és immunológiai betegségben nem szenvedõ egyének alkották. 4.1.2. Mintavétel 3 egymást követõ napon 8 órakor 10 ml heparinizált perifériás vért vettünk. A betegek megfelelõen hidrált állapotban voltak a vérvétel idõpontjában. A vérvételt megelõzõ napon a betegek nem vettek be olyan gyógyszert, mely befolyásolja a hypophysis PRL termelését (pl. opiátok). Az emelkedett TSH értékkel rendelkezõ betegeket a vizsgálatból kizártuk. A szérum mintákat a mérés elvégzéséig - 20 oC-on tároltuk.
33
I. táblázat A betegek jellemző paraméterei MM betegek Szám
56
Kontroll személyek 40
Kor
24-86 év, átlag: 60.3
22-74 év, átlag: 57.3
Nem
32 nő, 24 férfi
20 nő, 20 férfi
Klinikai stádium
I/A: 13
egészséges önkéntesek
(Salmon és Durie)
II/A: 17
és rosszindulatú
III/A: 14
vagy immunbetegségben
III/B: 12
nem szenvedők
Monoklonális Ig típusa
IgG k: 26 IgG l: 12 IgA k: 5 IgA l: 7 IgD l: 1 k: 3
l: 2
4.1.3. A szérum PRL koncentráció meghatározása A szérum PRL koncentrációt mikropartikuláris enzim-immunassay (MEIA, Abbott AxSYM system, Abbott Laboratories, U.S.A.) módszerrel mértük. A módszer minimális érzékenysége 0.6 ng/ml. Férfiak esetében a szérum PRL normál értéktartománya 5.0-12.0 ng/ml, nõknél 5.0-18.0 ng/ml van. Az intra-assay variációs koefficiens 8.3 ng/ml-nél 2.8%, 20.5 ng/ml-nél 3.19%, 42.3 ng/ml-nél 3.74%. Az interassay variációs koefficiens a fentebb említett koncentrációknál rendre 1.1%, 1.09% és 1.0%. Meghatároztuk a három egymást követõ napon történt mintavétel mérési eredményeinek átlagát.
34
4.1.4. A szérum béta2-mikroglobulin koncentráció meghatározása A b2-M koncentrációt fluoroimmunassay segítségével határoztuk meg (Delfia System, Wallac Oy, Turku, Finland). A módszer érzékenysége 0.15 mg/L. A normál érték 60 évnél fiatalabb egyének esetében < 2.0 mg/L, míg 65 évnél idõsebbek esetén > 2.6 mg/L. 4.1.5. A szérum interleukin-6 koncentráció meghatározása A szérum IL-6 koncentrációt immunradiometriás módszerrel határoztuk meg (IRMA, Biosource Europe S.A., Nivelles, Belgium). A módszer érzékenysége 6 pg/ml. A normál értéktartomány 0-31 pg/ml. 4.1.6. Szérum kortizol és TSH meghatározás 10 emelkedett szérum PRL szinttel rendelkezõ beteg esetében meghatároztuk a szérum kortizol koncentrációt fluoroimmunassay módszer segítségével (Delfia System, Wallac Oy, Turku, Finland). A szérum TSH-t mikropartikuláris enzim immunassay módszerrel mértük (MEIA, Abbott AxSYM system, Abbott Laboratories, U.S.A.). A statisztikai elemzést ANOVA variancia analízist követõen Duncan-teszttel végeztük.
4.2. MM-ben szenvedő betegek csontvelő aspirátumából származó keneteken a sejtek PRL tartalmának vizsgálata 4.2.1. Betegek Felvilágosítást követõ beleegyezés után 17 MM-ben szenvedõ (9 férfi, 8 nõ, átlagéletkor 63,4 év) és 5 kontroll személytõl (1 férfi, 4 nõ, átlagéletkor 49,4 év) sternum pukció útján csontvelõt aspiráltunk. A klinikai stádiumot Salmon és Durie alapján határoztuk meg (6). 4 beteg kapott 6 hónapon belül kemoterápiás kezelést,
35
míg 13 beteg vagy nem részesült a vizsgálatot megelõzõen kemoterápiás kezelésben, vagy csak 6 hónapnál régebben. A kemoterápia ICOMP protokoll szerint történt (idarubicin, cyclophosphamid, oncovin, methylprednisolon). Egy beteg esetében a vizsgálatot elvégeztük a kezelés megkezdése elõtt, majd megismételtük 3 hónapos kezelési periódust követõen. 11 beteg csontvelõi plazmasejt aránya meghaladta a 30 %-ot, 6 esetben ez az arány 30 % alatt volt. A klinikai stádiummal, a monoklonális Ig típusával, a megelõzõen alkalmazott kezeléssel kapcsolatos adatokat a II. táblázatban foglaltuk össze. Kontroll minták: 5 beteg csontvelõ aspirátumát tekintettük kontrollnak. Ezek a betegek nem szenvedtek rosszindulatú betegségben, a csontvelõ vizsgálatára hematológiai betegség gyanúja miatt került sor, mely a későbbiek során nem igazolódott.
36
II. táblázat A betegek fontosabb klinikai adatai Beteg
Kor
Klinikai
(év)
stádium
Sz. T.
71
III./A
B. M.
54
S. G.
Ig típusa
Plazmasejt
Kezelés 6 hó-
Immuncitoké
arány (%)
napon belül
miai reakció
IgG
73
Igen
Neg.
III./B
IgA
80
Nem
Poz.
50
III./B
IgA
70
Igen
Neg.
M. L.
39
II./A
IgG
25
Nem
Poz.
Cs. J.
57
II./A
IgA
70
Nem
Poz.
S. P.
56
III./A
IgG
64
Nem
Poz.
N. G.
72
III./B
IgA
9
Nem
Poz.
Sz. S.
59
III./A
IgG
80
Nem
Poz.
S. A.
90
II./A
IgG
10
Nem
Poz.
N. L.
80
III./B
IgG
10
Nem
Poz.
O. I.
56
II./A
IgG
5
Igen
Neg.
L. A.
56
III./B
IgG
100
Nem
Poz.
K. E.
76
III./A
IgG
25
Nem
Poz.
B. L.
48
III./A
IgA
90
Nem
Poz.
V. L.
69
II./A
IgG
61
Nem
Poz.
U. F.
78
III./A
IgG
15
Nem
Poz.
Sz. A.
60
III./B
IgA
90
Igen
Neg.
37
4.2.2. A csontvelő aspirátum PRL tartalmának vizsgálata Az aspirált csontvelőből keneteket készítettünk, melyeket B5 fixálóval 10 percig fixáltunk. (A fixáló összetétele: 90 ml desztillált vízben 6g HgCl2-t és 1,25 g natrium acetátot oldottunk, az oldathoz közvetlenül a felhasználás előtt 10 ml 37 %os formaldehidet kevertünk.) A keneteket a felhasználásig szobahőmérsékleten fiziológiás sóoldatban tároltuk. 4.2.2.1. Immuncitokémiai vizsgálat Léránt és Nagy módszerét alkalmaztuk (138). Röviden, a keneteket 1 percig sorrendben a következő oldatokkal kezeltük: 95% etanol, H2O, Lugol oldat (1 g jód, 2 g nátrium jodid 100 ml H2O), H2O, nátrium tioszulfát (2 g/100 ml H2O). Ezt követően a keneteket 5 percig 3.0% H2O2-dal, 10 percig 1% normál kecske szérummal,
és
24
órán
keresztül
szobahőmérsékleten
anti-humán-PRL
antiszérummal (1:2000 higítás) kezeltük. Az immuncitokémiai procedúrát ABC módszerrel végeztük (Vector labs, Burlingame, CA) az ABC kit leírása szerint. Szubsztrátként diaminobenzidine-t (Sigma) használtunk (koncentráció: 50 mg/100 ml, Tris pufferben oldva, 0.15 M, pH 7.6). A rendszer kontrolljaként a keneteket anti-humán PRL antiszérum helyett normál humán szérummal kezeltük. Az immuncitokémiai reakció után a keneteket hematoxilinnel festettük és lefedtük. 4.2.3. A csontvelői sejtek PRL tartalma és sejttípusa közötti összefüggés vizsgálata 5 MM beteg sternum punkció útján nyert csontvelő aspirátumát elemeztük. A csontvelő aspirátumot áramlási citometriás vizsgálat segítségével analizáltuk. Összehasonlítottuk az egyes sejtpopulációk (granulocyták, lymphocyták, plazmasejtek) PRL tartalmát. A leukocyta szubpopulációkat méret és granuláltság alapján, (forward scatter / side scatter dot plot) különítettük el. A plazmasejtek azonosítása céljából CD45 illetve CD56/CD38/CD19 sejtfelszíni jelölést alkalmaztunk. A malignus plazmasejteket a CD19-/CD45-/CD38+/CD56+ immunfenotipus alapján definiáltuk A
sejtfelszíni jelöléseket teljes csontvelői mintából végeztük, előzetes sejtszeparálás nélkül. A vizsgálatokhoz CD45 PerCP, illetve CD56 FITC, CD38 Pe és CD19 PerCP Becton Dickinson gyártmányú fluoreszcens festékkel konjugált monoklonális antitesteket használtunk (3. ábra). Az antitestekkel történt inkubáció után a vörösvértesteket Becton Dickinson FACS Lysing oldattal feloldottuk. Az aspecifikus jelölődés elkülönítésére festetlen mintákat és izotipus kontroll antitesttel jelölt mintákat vizsgáltunk meg. A sejtek PRL tartalmát 4%-os paraformaldehid fixálást és 0.1%-os saponin permeabilizálást követően, indirekt fluoreszcens jelölés alklamazásával vizsgáltuk. A permeabilizált sejteket nyúlban termelt anti-prolactin antitesttel, majd FITC-tal jelzett anti-nyúl immunglobulinnal inkubáltuk. Az inkubációs időt követően a be nem kötődött ellenanyagokat 0.1%-os saponin oldattal mostuk ki. Mérés előtt a sejteket 2%-os paraformaldehid oldatban fixáltuk. Az aspecifikus jelölődés elkülönítésére festetlen és csak szekunder antitest jelölést végeztünk. A méréseket Becton Dickinson FACSCalibur áramlási citométeren végeztük. A méréshez és az analízishez a CellQuest 3.1 software-t használtuk.
4.3. U266 humán IgE-t termelő myeloma sejtvonalon PRL szerepének vizsgálata 4.3.1. U266 sejtek intracelluláris PRL tartalmának vizsgálata 4.3.1.1. A sejtek kezelése A sejteket 0,5 %, vagy 10 % foetalis borjúsavót (FCS), illetve 10 % lószérumot (HS) tartalmazó RPMI oldatban inkubáltuk 37 °C-on, 5 % CO2-ot tartalmzó termosztátban. 48 órát követően meghatároztuk a sejtek PRL tartalmát. 4.3.1.2. A PRL tartalom mérése A sejtek PRL tartalmának vizsgálatára 4%-os paraformaldehid fixálást követően, 0.1%os saponin permeabilizálást végeztünk. A permeabilizált sejteket indirekt jelölési módszerrel, nyúlban termelt anti-PRL antitesttel majd FITC-tal jelzett anti-nyúl
39
immunglobulinnal inkubáltuk. Az inkubációs időt követően a be nem kötődött ellenanyagokat 0.1%-os saponin oldattal mostuk ki. Mérés előtt a sejteket 2%-os paraformaldehid oldatban fixáltuk. Az aspecifikus jelölődés elkülönítésére festetlen és csak szekunder antitest jelölést végeztünk. A méréseket Becton Dickinson FACSCalibur áramlási citométeren végeztük. A méréshez és az analízishez a CellQuest 3.1 software-t használtuk (4. ábra).
40
3. ábra Myeloma multiplexben szenvedő betegek csontvelői sejtjeinek intracitoplazmatikus PRL
tartalmának
vizsgálata
áramlási
citometriás
módszer
segítségével.
A
granulocytákat, lymphocytákat és plazmasejteket méret és granuláltság alapján különítettük
el.
A
plazmasejtek
azonosítása
immunfenotipus alapján történt.
41
a
CD19-/CD45-/CD38+/CD56+
4. ábra U266 sejtvonal intracellularis prolactin tartalmának vizsgálata indirekt flow cytometriás jelöléssel: A bal oldali ábrán a sejtek méret (FSC -Height) és granuláltság (SSC-Height) szerinti eloszlása látható. A homogén populáció kijelölésével (kapuzás) definiáltuk azokat az élő sejteket, amelyek intracellularis prolactin tartalmát kívántuk megvizsgálni. A "kapuzással" az összetapadt sejteket és a sejttörmeléket kirekesztettük az analízisből. A jobb oldali ábrán a prolactin ellenes antitest jelölés hisztogramja látható, a festés technikai kontrolljával szemben. A secunder antitest kontrollhoz képest detektált eltolódás az anti-PRL antitest specifikus bekötődését jelzi. A görbe egységessége arra utal, hogy a vizsgált sejtvonal sejtjei valamennyien tartalmazzák intracellularisan a prolactint, azaz homogén a sejtpopuláció az intracellularis PRL tartalomra nézve.
42
4.3.2. U266 sejtek IgE termelésének vizsgálata 4.3.2.1. U266 sejtek kezelése PRL-nal A sejteket 10 % FCS-t tartalmazó RPMI tápoldatban tenyésztettük. A kísérlet megkezdése előtt a sejteket éjszakán keresztül szérum mentes RPMI médiumban szinkronizáltuk. A sejtszuszpenziót 96 lyukú mikrolemezre helyeztük, 1 x 105 sejt/200 ml/lyuk mennyiségben. A PRL-t 0,01 M natrium hydrocarbonáttal oldottuk, majd a további higításokat RPMI médiummal végeztük. A PRL kezelést 2,5, 125, 500 ng/ml végkoncentrációjú oldatokkal végeztük. A kontroll csoport esetében a sejteket a PRL oldásához használt oldószerrel kezeltük. A minták egy részénél a PRL-nal egyidejűleg 10-6 M végkoncentrációjú etoposid (Vepesid inj., BristolMyers Squibb) oldattal is kezeltük a sejteket. A sejteket 48 órán keresztül 37 °C-on 5 % CO2-ot tartalmazó termosztátban tartottuk. 48 óra inkubációt követően a lemezeket centrifugáltuk (2000 g, 5 perc), majd 140 ml felülószót leszívtunk, melyet a felhasználásig –70 °C-on tároltunk.
4.3.2.2. IgE meghatározás Totál IgE meghatározást végeztünk immunradiometriás módszerrel (IRMA, 2122, Immunotech, Coulter Co). A módszer érzékenysége 0,05 kIU/l (0,12 ng/ml). Az intra-assay variációs koefficiens 7,5 kIU/l koncentrációnál 4,3%, 40,5 kIU/l-nél 0,74%, míg 89,9 kIU/l-nél 1,4%. Az inter-assay variációs koefficiens a fenti koncentrációknál rendre 6,1%, 2,6%, 4,2%. Egy PRL koncentrációt két párhuzamossal vizsgáltunk, az IgE mérést duplikátumban végeztük. Pozitív kontrollként etoposidot használtunk. A statisztikai elemzést két mintás t-próbával végeztük.
43
4.3.3. PRL hatásának vizsgálata az U266 sejtek proliferációjára 4.3.3.1. Az MTT módszer elve A sejtproliferációt 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difeniltetrazólium bromid (MTT) teszt segítségével határoztuk meg (138/b). A mószer azon alapul, hogy az élő sejtek aktív mitochondriális dehidrogenáz enzimei a festéket oldhatatlan formazánná alakítja. Míg az oldható festék sárga, a formazán lila színű. Az elpusztult sejtek mitochondriuma nem veszi fel a festéket, így a formazánná alakult oldhatatlan, lila festék mennyisége (a színes oldat optikai denzitása) arányos az élő sejtek számával. 4.3.3.2. A sejtek kezelése PRL-nal A sejteket szérummentes közegben éjszakán át szinkronizáltuk. A proliferációs teszt során a sejtek 0,5 % FCS tartalmú RPMI tápoldatban voltak. A sejteket 96 lyukú lemezen 1 x 104/lyuk koncentrációban, 200 ml/lyuk térfogatban helyeztük el. A PRL oldását a fentebb leírt módon végeztük, 2,5, 25, 500 ng/ml végkoncentrációjú PRL oldatokkal kezeltünk. Kezelésenként 5-5 párhuzamos mintával dolgoztunk. A kontroll mintákat a PRL oldat készítéséhez használt oldószerrel kezeltük. A lemezeket 24, illetve 48 órán keresztül 37 °C-on, 5 % CO2ot tartalmazó termosztátban helyeztük el. Pozitív kontrollként melphalant (Alkeran inj., Wellcome) használtunk. A kísérletet 0,5 % FCS helyett 10 % lószérumot tartalmazó médiummal is elvégeztük. 4.3.3.3. MTT teszt 24, illetve 48 órán keresztül történt inkubáció után 50 ml/lyuk 5 mg/ml töménységű MTT oldatot (Sigma) adtunk a sejtekhez, mellyel 4 órán keresztül inkubáltunk (37 °C-on, 5 % CO2-ot tartalmzó termosztátban), majd a lemezeket centrifugáltuk (2000 g, 5 perc). A felülúszót eltávolítottuk, és a sejteket 100 ml/lyuk DMSO-val (dimetil-sulfoxid) kezeltük (30 perc). EIA leolvasóval, (Multiscan MS) 620 és 540 nm-en mértük az optikai denzitást (OD). A statisztikai elemzéshez két mintás t-próbát használtunk.
44
4.3.4. A PRL hatásának vizsgálata U266 sejtek apoptózisára 4.3.4.1. A sejtek előkészítése A sejteket szérum mentes RPMI tápoldatban éjszakán keresztül szinkronizáltuk, majd 10 % FCS tartalmú RPMI médiumban helyeztük el 1 x 105/lyuk/200 ml mennyiségben 96 lyukú mikrolemezen. 4.3.4.2. Apoptózis indukció Az apoptózis kiváltása céljából a sejteket 10-6 M etopoziddal kezeltük 48 órán keresztül. A sejteket 37 °C-on, 5 % CO2-ot tartalmazó termosztátban helyeztük el. 4.3.4.3. A sejtek kezelése PRL-nal A PRL-t 0,01 M-os natrium hidrokarbonátban oldottuk, a további higításokat RPMI médiummal készítettük. 0,025-500 ng/ml koncentráció tartományban vizsgáltuk a PRL hatását. Egy adott koncentráció hatását 3 párhuzamos mintán vizsgáltuk. A PRL kezelést közvetlenül az etoposid adása előtt végeztük. 4.3.4.4. Apoptózis mérése Az apoptózis méréséhez áramlási citometriás módszert használtunk, mely során propidium jodid (PI) festéssel DNS fragmentációt detektáltunk (5. és 6. ábra). 48 óra inkubációt követően a sejteket (1x105) centrifugáltuk (2000 ford/perc, 5 perc), a felülúszót eltávolítottuk. A sejteket 1 ml –20 °C 70%-os etanolban reszuszpendáltuk, majd 30 percig szobahőmérsékleten, 24 órán keresztül -20°C-on inkubáltuk. Centrifugálást követően (1000 ford/perc, 1 perc) a felülúszót eltávolítottuk, és az üledéket 500 ml 100 mg/ml RN-áz (SIGMA, R5503, törzsoldat: 10 mg/ml desztillált vízben
oldva,
1
ml-es
sejtszuszpenzióhoz
100x
higítás)
végkoncentrációjú
citromsav/Na2HPO4 pufferben reszuszpendáltuk. Szobahőmérsékleten 20 percen keresztül történő inkubáció után PI-dal festettünk: 10 mg/ml végkoncentrációban mértük
45
hozzá a puffer oldathoz (200 mM Na2HPO4-et, 200 mM citromsavat tartalmaz, pH = 7,8). A statisztikai elemzést két mintás t-próbával végeztük.
5. ábra 2,5 ng/ml PRL hatása U266 sejtvonal apoptosisára. A felső ábrán a sejtek méret (FSC -Height) és granuláltság (SSC-Height) szerinti eloszlása látható. Kapuzással definiáltuk azokat a sejteket, amelyek DNS tartalma alapján az apoptotikus populációt meghatároztuk. Az alsó ábrán a DNS tartalom propidium jodiddal (PI) történt jelölésével detektált hisztogram látható. A logaritmikus ábrázolási mód lehetővé tette a sejtciklus G0-G2/M fázisában levő sejtek és az apoptotikus DNS fragmensek egyidejű detektálását. (Kék: kontroll, zöld: 10-6M etoposid, piros: 10-6M etoposid és 2,5 ng/ml PRL együttes alkalmazása).
46
6. ábra 250ng/ml prolactin hatása U266 sejtvonal apoptosisára. A felső ábrán a sejtek méret (FSC -Height) és granuláltság (SSC-Height) szerinti eloszlása látható. Kapuzással definiáltuk azokat a sejteket, amelyek DNS tartalma alapján az apoptotikus populációt meghatároztuk. Az alsó ábrán a DNS tartalom propidium jodiddal (PI) történt jelölésével detektált hisztogram látható. A logaritmikus ábrázolási mód lehetővé tette a sejtciklus G0-G2/M fázisában levő sejtek és az apoptotikus DNS fragmensek egyidejű detektálását. (Kék: kontroll, zöld: 10-6M etoposid, piros: 10-6M etoposid és 2,5 ng/ml PRL együttes alkalmazása).
47
5. EREDMÉNYEK 5.1. Szérum PRL koncentráció MM-ben szenvedõ betegeken 5.1.1. A szérum PRL koncentráció változása I. klinikai stádiumban lévő betegek, valamint II. stádiumban lévő nőbetegek szérum PRL értéke normális volt. II. stádiumban lévő férfi betegek esetében magasabb szérum PRL szintet mértünk, de az eltérés nem volt szignifikáns. III. klinikai stádiumban lévő betegeink esetében (mindkét nemet tekintve) a szérum PRL koncentráció szignifikáns mértékben magasabb volt, mint a kontroll csoport esetében (7/a és 7/b. ábra). 5.1.2. A szérum b2-M és IL-6 koncentráció változása Vizsgáltuk a szérum b2-M és IL-6 koncentrációt is. Mind a szérum b2-M, mind az IL-6 koncentráció emelkedett a betegség progressziója során (8. és 9. ábra). A b2-M és IL-6 koncentráció emelkedése a PRL koncentráció emelkedésével párhuzamos volt. A betegek monoklonális Ig típusa és a szérum PRL érték megoszlása között összefüggést nem találtunk. 5.1.3. Összefüggés a szérum PRL szint és az alkalmazott kezelés között 11 beteg esetében a kemoterápia időszaka során több alkalommal is meghatároztuk a szérum PRL koncentrációt. Azon betegek esetében, akik kemoszenzitívek voltak, és a kezelés során parciális remissziót tudtunk elérni (2 beteg), a szérum PRL szint csökkenését tapasztaltuk (10. ábra). A kemoterápiára refrakter, progresszív lefolyást mutató betegek esetében ezzel szemben a szérum PRL koncentráció fokozatosan emelkedett a betegség előrehaladása során (11. ábra). A szérum b2-M és IL-6 koncentráció párhuzamosan változott a szérum PRL szinttel.
48
Szérum prolactin koncentráció (ng/ml)
A 70 p<0.01
60 50 40 30 20 10 0
Klinikai stádium
n=7
n=8
n=13
n=20
I.
II.
III.
Kontroll
Szérum prolactin koncentráció (ng/ml)
B 70 p<0.001
60 50 40 30 20 10 0
Klinikai stádium
n=5
n=6
n=11
n=20
I.
II.
III.
Kontroll
7. ábra Myeloma multiplexben szenvedő, különböző klinikai stádiumban lévő betegek szérum PRL koncentrációja (átlag
+
SE). A. nőbetegek; normál érték: 5,0-18,0 ng/ml. B. Férfi
betegek; normál érték: 5,0-12,0 ng/ml. III. stádiumban mindkét nemnél a kontrollhoz képest szignifikánsan magasabb szérum PRL koncentrációt mértünk. Statisztikai elemzés: variancia analízist követően (ANOVA), Duncan-teszt.
49
25 20 15 (mg/l)
Szérum ß2-microglobulin koncentráció
A
10 5 0
Klinikai stádium
n=5
n=8
n=8
n=5
I.
II.
III.
Kontroll
25 p=0.05 20 15 (mg/l)
Szérum ß2-microglobulin koncentráció
B
10 5 0
Klinikai stádium
n=4
n=5
n=10
n=7
I.
II.
III.
Kontroll
8. ábra Myeloma multiplexben szenvedő, különböző klinikai stádiumban lévő betegek szérum béta2-mikroglobulin koncentrációja (átlag
+
SE). A. nők B: férfiak. Normál érték a 60
évesnél fiatalabbak esetében 2,0 mg/L alatt, 65 évnél idősebb betegek esetében 2,6 mg/L felett. III. stádiumban emelkedett szérum béta2-mikroglobulin koncentrációjót detektáltunk. Statisztikai elemzés: variancia analízist követően (ANOVA), Duncanteszt.
50
A Szérum IL-6 koncentráció (pg/ml)
40 35
p<0.01
30 25 20 15 10 5 0
Klinikai stádium
n=7
n=9
n=12
n=5
I.
II.
III.
Kontroll
B Szérum IL-6 koncentráció (pg/ml)
40 35 30 25 20 15 10 5 0
Klinikai stádium
n=5
n=6
n=9
n=9
I.
II.
III.
Kontroll
9. ábra Myeloma multiplexben szenvedő, különböző klinikai stádiumban lévő betegek szérum interleukin-6 koncentrációja (átlag + SE). A. nők; B. férfiak. Normál érték: 0-31 pg/ml. II. és III. stádiumban emelkedett szérum IL-6 koncentrációt észleltünk, statisztikailag jelentős eltérést III stádiumú nőbetegek esetén mutattunk ki. Statisztikai elemzés: variancia analízist követően (ANOVA), Duncan-teszt.
51
kemoterápia 40
100 80 60 40 20 0
20 0
4
8
12
idõ (hónap)
30
15 szérum PRL szérum ß2 M
20 10 0
10 5
0
2
4
6
8
10
12
idõ (hónap)
Szérum ß 2 M koncentráció (mg/l)
Csontvelõi plazma sejt arány (%)
Szérum PRL koncentráció (ng/ml)
diagnózis ideje
0
10. ábra Myeloma multiplexben szenvedő kemoszenzitív beteg szérum PRL koncentrációjának változása a kemoterápia során. A diagnózis időpontjában a beteg (50 éves férfi, monoklonális Ig típusa: IgG k) III/A klinikai stádiumban volt. Egy éven keresztül kombinált
kemoterápiában
részesült
(idarubicin,
cyclophosphamide,
oncovine,
methylprednisolone), mely során parciális remissziót ért el. A kezelés kezdetén észlelt emelkedett szérum PRL koncentráció a kemoterápia végére a normális szintre csökkent (fekete vonal). A szérum béta2-mikroglobulin koncentrációja a PRL szinttel párhuzamosan csökkent (szaggatott vonal), csakúgy, mint a csontvelői plazmasejtek aránya.
52
kemoterápia 40
100 80 60 40 20 0
20 0
3
6
idõ (hónap)
30
15 szérum PRL szérum ß2 M
20 10 0
10 5
0
3
6
idõ (hónap)
Szérum ß 2 M koncentráció (mg/l)
Csontvelõi plazma sejt arány (%)
Szérum PRL koncentráció (ng/ml)
diagnózis ideje
0
11. ábra Szérum PRL koncentráció változása primer kemorezisztens betegségben szenvedő myelomás beteg esetében. A diagnózis felállításának időpontjában a beteg III/A klinikai stádiumban volt (50 éves férfibeteg, monoklonális Ig típusa: IgA l). A kemoterápia ellenére
(kombinált
kemoterápia:
idarubicin,
cyclophosphamide,
oncovine,
methylprednisolone, 6 hónapon keresztül), a betegsége progrediált. A szérum PRL koncentráció emelkedett volt a diagnózis felállításának időpontjában, majd a kezelés időtartama alatt további emelkedést észleltünk (fekete vonal). A szérum béta2mikroglobulin koncentrációja a PRL szinttel párhuzamosan emelkedett (szaggatott vonal). A csontvelői plazmasejt arány ismételt vizsgálata a kezelés során szintén refrakter betegségre utalt.
53
5.1.4. Szérum kortizol szint változása 10 beteg esetében, akiknél a szérum PRL koncentrációt emelkedettnek találtuk, meghatároztuk a szérum kortizol koncentrációt is. Minden esetben normál értéket tapasztaltunk. 5.2. MM-ben szenvedő betegek csontvelő aspirátumából származó keneteken a sejtek PRL tartalma 13 olyan beteg mintáját vizsgáltuk, akik nem részesültek kemoterápiás kezelésben a vizsgálatot megelőző hat hónapon belül. Mindegyik esetben pozitív reakciót észleltünk az intracelluláris PRL immunreakció vizsgálata során (12. ábra). A 13 beteg közül 4 beteg II. klinikai stádiumban, míg 9 beteg III. stádiumban volt. 9 beteg szérumából IgG, 4 beteg esetében IgA monoklonális Ig volt kimutatható. 6 esetben a csontvelői plazmasejt arány 30 %-ot meghaladta, míg 7 betegnél ez az arány 30 %-nál kisebb volt. 4 betegünk esetében, akik a vizsgálatot megelőző 6 hónapon belül kemoterápiás kezelésben részesültek, a csontvelői sejtekben intracelluláris PRL immunreakciót nem sikerült kimutatni (13. ábra). Egy beteg II., három beteg III. klinikai stádiumban volt. A monoklonális Ig 2 beteg esetébe IgG, két betegnél IgA típusú volt. Három beteg csontvelői plazmasejt aránya 30 % feletti, míg egy beteg esetében 30 % alatti volt. Egy beteg esetében került sor ismételt vizsgálatra: először a kezelés megkezdése előtt, majd három hónapos kemoterápiát követően vizsgáltuk a csontvelői sejtek PRL tartalmát. A kezelés előtt észlelt pozitív PRL immunreakció a három hónapos kezelést követően negatívvá vált. Ezzel párhuzamosan a beteg klinikai állapota is javult (14/a és 14/b ábra). Az 5 kontroll beteg, akik malignus vérképzőszervi betegségben nem szenvedtek negatív PRL festődési reakciót mutattak (15. ábra). A hematoxilin magfestést követő morfológiai vizsgálat alapján a plazmasejtek jelentős arányban tartalmaztak PRL-t, de PRL festődést más csontvelői sejt is mutatott (16. ábra).
54
Áramlási citometriás módszerrel vizsgálva a különböző csontvelői sejtek PRL tartalmát, a plazmasejtek a granulocytáknál és a lymphocytáknál több PRL-t tartalmaztak (17. ábra).
55
12. ábra. Pozitív immuncitokémiai reakció (barna festődés) csontvelő aspirátumból származó sejteken anti-humán PRL antiszérum felhasználásával. A MM-ben szenvedő beteg (III/A klinikai stádium, csontvelői plazmasejt arány 63%, monoklonális Ig típusa IgG k) kemoterápiás kezelésben nem részesült a mintavételt megelőzően. (80x nagyítás).
56
13. ábra Anti-humán PRL antiszérummal negatívan festődő csontvelői sejtek. A minta olyan MM-ben szenvedő betegből származott (III/B klinikai stádium, csontvelői plazmasejt arány 73%, monoklonális Ig típusa IgA l), aki kemoterápiás kezelés alatt állt (ICOMP protokoll szerint: idarubicin, cyclophosphamid, oncovin, methylprednisolon).
57
A.
B.
14. ábra A. Anti-humán PRL antiszérummal pozitív immuncitokémiai reakció (barna festődés) MM-ben szenvedő beteg (III/A klinikai stádium, csontvelői plazmasejt arány 100%, monoklonális Ig típusa IgA l) csontvelői sejtjein a diagnózis felállításakor. B. Ugyananattól a betegtől származó csontvelői minta három hónapon át tartó kemoterápia után. PRL immunreaktivitás nem mutatható ki. (80x nagyítás).
58
15. ábra Kontroll
személy
csontvelői
sejtjein
anti-humán
PRL-nal
negatív
immuncitokémiai reakció. A mintavételre malignus haematológiai betegség gyanúja miatt került sor, mely nem igazolódott. (30x nagyítás).
59
16. ábra Anti-humán PRL antiszérummal pozitívan festődő plazmasejtek MM beteg csontvelői mintájában (barna színreakció). (200x nagyítás).
60
17. ábra Csontvelői sejtek intracellularis prolactin tartalmának vizsgálata indirekt áramlási citometriás jelöléssel. A felső ábrán a sejtek méret (FSC -Height) és granuláltság (SSC-Height) szerinti eloszlása látható. A homogén populációk kijelölésével (kapuzás) definiáltuk azokat az élő sejteket, amelyek intracellularis PRL tartalmát kívántuk megvizsgálni. A "kapuzással" az összetapadt sejteket és a sejttörmeléket kirekesztettük az analízisből. Méret és granuláltság alapján elkülönítettük egymástól a lymphocytákat, a granulocytákat és a plazmasejteket. A kapuzás adekvátságát sejtfelszíni markerek vizsgálatával igazoltuk (az eredményeket ezen az ábrán nem mutatjuk be). Az alsó ábrán a lymphocyta, a granulocyta és a hízósejt populációk intracelluláris PRL tartalmának hisztogramjai láthatók. A plazmasejtekből származó hisztogram (piros) eltolódása arra utal, hogy a plazmasejtek prolactin tartalma a legmagasabb a három detektált sejtpopuláció közül.
61
5.3. A PRL szerepe U266 humán IgE-t termelő myeloma sejtvonalon 5.3.1. U266 sejtek intracelluláris PRL tartalma Anti-humán PRL antiszérum felhasználásával U266 sejteken pozitív immunreakciót észleltünk (18. ábra). Melphalannal kezelve a sejteket az intracelluláris PRL tartalom növekedését tapasztaltuk (19. ábra). Cyclosporin kezelés (mely irodalmi adatok szerint gátolja a PRL-nak receptorához történő kapcsolódását, azonban más támadásponton is hat) csökkentette az U266 sejtek intracelluláris PRL tartalmát (20. ábra). Az intracelluláris PRL tartalom nem változott jelentős mértékben, ha a vizsgálatot szérum mentes médiumban végeztük (21. ábra). Ebből arra következtettünk, hogy a sejten belüli PRL nem elsősorban környezetből történő PRL felvétel eredménye.
62
A:
B:
18. ábra Anti-humán PRL antiszérummal pozitív reakciót mutató U266 sejtek. (250x nagyítás). A. kontroll. B. 10-5 M melphalan. A melphalan kezelés jelentős mértékben fokozta az intracelluláris PRL tartalmat.
63
Geometriai átlag csatornaszám
***
400 350 300 250 200 150 100 50 0 kontroll
MP
19. ábra Melphalan (MP) kezelés (10-5 M) statisztikailag jelentős mértékben fokozza az U266 sejtek intracelluláris PRL tartalmát. (Átlag + SE; statisztikai elemzés két mintás t-próba, *** p< 0,001.)
64
Geometriai átlag csatornaszám 300.00 250.00 200.00 150.00 100.00 50.00 0.00 kontroll
CS
20. ábra Cyclosporin hatása az U266 sejtek intracelluláris PRL tartalmára. 10-6 M cyclosporin (CS) kezelés csökkentette a sejtek PRL tartalmát.
65
Geometriai átlag csatornaszám
300.00
200.00
100.00
0.00 0.5%FCS
10%FCS
10%HS
SMM
21. ábra Intracelluláris PRL tartalom vizsgálata. A sejteket különböző médiumban inkubáltuk: FCS (fetal calf serum), HS (lószérum), SMM (szérum mentes médium). A médiumok PRL tartalma nem befolyásolta statisztikailag jelentős mértékben a sejtek PRL tartalmát (Átlag + SE).
66
5.3.2. A PRL hatása U266 sejtek IgE termelésére 2,5 ng/ml, 125 ng/ml, 500 ng/ml koncentrációkban vizsgáltuk a PRL IgE termelésre gyakorolt hatását. A sejteket 48 órán keresztül inkubáltuk PRL-nal, és a felülúszó IgE koncentrációját mértük. Az eredményeket 1x105 sejtre vonatkoztattuk, és a kontroll csoport (PRL-nal nem kezelt) százalékában fejeztük ki. A PRL 2,5 ng/ml koncentrációban a kontroll csoporthoz képest 59,3 %-kal gátolta az IgE termelést. 125 ng/ml koncentrációban 18 %-os, míg 500 ng/ml koncentráció 16,6 %-os gátlást eredményezett (22. ábra). Összehasonlítottuk a PRL és az etoposid U266 sejtek proliferációjára gyakorolt hatását. Az etoposid 10-6M koncentrációban alkalmazva a PRL 2,5 ng/ml koncentrációjához hasonló mértékben gátolta a sejtproliferációt. A két szer együttes adása nem eredményezett nagyobb gátló effektust (23. ábra).
67
120
*
100
**
Hatás (%)
80
***
60 40 20 0
Kontroll
P2,5
P125
P500
22. ábra PRL hatása U266 sejtek IgE termelésére. A PRL (P) 2,5-500 ng/ml koncentráció tartományban szignifikáns mértékben gátolta a sejtek IgE termelését. (Átlag + SE; a statisztikai elemzést két mintás t-próbával végeztük. * = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001 a kontroll csoporthoz hasonlítva.)
68
700 600 500
IgE KU/ul
***
400
***
***
P2,5
E+P2,5
300 200 100 0
Kontroll
E 10-6
23. ábra PRL és etoposid hatása U266 sejtek IgE termelésére. 10-6 M koncentrációjú etoposid oldattal kezelve a sejteket 2,5 ng/ml koncentrációjú PRL oldat gátló hatásához hasonló mértékű eredményt észleltünk. A két anyag együttes alkalmazása nem fokozta jelentős mértékben a gátló hatást. (Átlag
+
SE; a statisztikai elemzést
két mintás t-próbával végeztük, *** = p < 0,001 a kontroll csoporthoz hasonlítva).
69
5.3.3. A PRL hatása U266 sejtek proliferációjára A sejteket 24, illetve 48 órán keresztül inkubáltuk PRL különböző koncentrációival (2,5 ng/ml, 25 ng/ml, 500 ng/ml). A sejtproliferációt MTT-teszttel mértük (a festéket az élő sejtek mitochondriuma veszi fel és alakítja át, a színintenzitás, arányos az élő sejtek számával). A PRL 2,5 ng/ml koncentrációban 12,5% és 15,6%-kal, 25 ng/ml koncentrációban 13,4% és 17%-kal gátolta 24 és 48 óra múlva a sejtproliferációt. 500 ng/ml koncentrációban a PRL nem befolyásolta szignifikáns mértékben a sejtproliferációt (24. ábra). Mivel a médiumban lévő borjúsavó tartalmaz PRL-t, ezért a kísérletet lószérumot tartalmazó médiummal is elvégeztük, melynek PRL tartalma a borjúsavó 10 %-a), de a sejtek proliferációjához szükséges egyéb faktorokat hasonló koncentrációban tartalmazza. Ilyen közegben vizsgálva a proliferációt hasonló eredményeket kaptunk (25 ábra).
70
0.35
K 2,5 ng/ml 25 ng/ml
0.3
500 ng/ml
*
*
OD
0.25
*
*
0.2
0.15
0.1
24 óra
48 óra
24. ábra A sejteket 24 és 48 órán keresztül inkubáltuk PRL-nal. 2,5 és 25 ng/ml koncentrációban alkalmazva szignifikáns mértékben gátolta az U266 sejtek proliferációját. 500 ng/ml koncentráció statisztikailag nem eredményezett jelentős hatást. Átlag + SE; * = p < 0,05 a kontroll csoporthoz hasonlítva. Statisztikai elemzés: 2 mintás t-próba.
71
0,4 0,35
OD
0,3
***
***
P2,5
M
0,25 0,2 0,15 0,1 K
25. ábra A tápoldatban 0,5 % borjúsavó helyett 10 % lószérumot alkalmaztunk, így a sejtek növekedéséhez szükséges faktorok megfelelő koncentrációban álltak rendelkezésre, anélkül, hogy a környezet PRL koncentrációja befolyásolhatta volna eredményeinket. A PRL ebben a közegben is statisztikailag jelentős mértékben gátolta a sejtek proliferációját. 48 órás inkubációt követően 2,5 ng/ml PRL (P2,5) 10-5M melphalan (M) hatásához hasonló mértékben gátolta a sejtek proliferációját. (Átlag
+
SE; statisztikai elemzés két mintás t-próbával; *** = p < 0,001 a kontroll
csoporthoz hasonlítva).
72
5.3.4. A PRL hatása U266 sejtek apoptózisára 10-6M etoposiddal 48 órán keresztül inkubáltuk a sejteket, mely 16-20 %-os apoptózist eredményezett. PRL egyidejű adása 2,5 ng/ml koncentrációban 61,9%kal, 25 ng/ml koncentrációban 55,9%-kal fokozta az U266 sejtek etoposiddal kiváltott apoptózisát. Ezzel szemben, 125-500 ng/ml közötti dózis tartomány 30,135,9 %-os apoptózis gátlást eredményezett. A PRL etoposid nélkül nem befolyásolta az U266 sejtek apoptózisát (26. és 27. ábra, ld. még 5. és 6. ábrát is).
2 0 ,0 0 1 8 ,0 0
Apoptózis (%)
1 6 ,0 0
* p <0,05
1 4 ,0 0
*
1 2 ,0 0 1 0 ,0 0
*
*
E +P 2 5 0
E +P 5 0 0
8 ,0 0 6 ,0 0 4 ,0 0 2 ,0 0 0 ,0 0 K
P 500 n g/m l
E
E +P 1 2 5
26. ábra. PRL hatása az etoposiddal kiváltott apoptózisra U266 sejteken. Apoptózis indukció:10-6M etoposiddal 48 órán keresztül inkubáltuk a sejteket. Az apoptózist a DNS fragmentáció mértéke alapján, áramlási citometriás módszerrel mértük. 500 ng/ml koncentrációban a PRL önmagában nem befolyásolta az apoptózist. Az etoposiddal kiváltott apoptózist 125, 250, 500 ng/ml koncentrációban szignifikáns módon gátolta. (Átlag
+
SE; * = p < 0,05 az etoposiddal kezelt csoporthoz képest.
Statisztikai elemzés: két mintás t-próba).
73
200 hatás (%)
**
180
*
160
* p<0,05
140
** p<0,005
120 100 80
*
*
*
125
250
500
60 40 20 0 E
0.025
0.25
2,5
25
50
27. ábra PRL hatása az etoposiddal kiváltott apoptózisra U266 sejteken. Apoptózis indukció: 10-6M etoposiddal 48 órán keresztül inkubáltuk a sejteket. Az apoptózist a DNS fragmentáció mértéke alapján, áramlási citometriás módszerrel mértük. 100 %-nak tekintettük az így előidézett apoptózist. A PRL 2,5 és 25 ng/ml koncentrációban fokozta, míg 125-500 ng/ml koncentrációban gátolta az etopsiddal előidézett apotózist. (Átlag
+
SE; * = p < 0,05; ** = p < 0,005; az etoposiddal kezelt
csoporthoz képest. Statisztikai elemzés: két mintás t-próba).
74
6. MEGBESZÉLÉS
Munkánk során a PRL MM-ben betöltött szerepét vizsgáltuk. Kérdés feltevésünk időszerűségét indokolta, hogy a MM patomechanizmusa nem tisztázott, gyógyítása napjainkban sem megoldott. Többféle malignus folyamatban (emlő, colon carcinoma, egyes lymphoma típusok) kiterjedten vizsgálták a PRL szerepét (113, 114, 115, 116, 120, 121), és bizonyítást nyert, hogy jelentős szerepet játszik a tumoros folyamatokban. Autokrin/parakrin növekedési faktorként fokozza a tumorsejtek proliferációját (127), gátolja a glukokortikoidokkal kiváltott apoptózist (89). A tumorsejtekre gyakorolt direkt hatások mellett, indirekt módon is befolyásolja a tumor növekedést: pl. az NK sejtek aktivitásának fokozása révén elősegíti a gazdaszervezet tumor-ellenes védekezését (121, 133). Az angiogenezis befolyásolása egy másik lehetséges támadáspont a PRL tumorfejlődésre gyakorolt hatásában (131). A csontvelői B sejt precursorok fejlődését fokozza (111). 56 MM beteg szérum PRL szintjét vizsgáltuk. A nők és férfiak eredményeit külön értékeltük, hiszen a normál érték eltér a két nem esetében. Mivel a szérum PRL koncentrációt nagyon sok tényező befolyásolja, különös gondot fordítottunk a vérvétel körülményeire (jól hidrált beteg, azonos időpontban történő vérvétel, PRL szekréciót befolyásoló gyógyszerek tilalma, három alkalommal ismételt vizsgálat átlagának figyelembe vétele). Mivel a TSH is befolyásolja a PRL szekréciót, a vizsgálatból kizártuk a kóros TSH értékkel rendelkező betegeket. Eredményeink azt igazolták, hogy III. stádiumban lévő betegeink esetében mindkét nemet tekintve emelkedett a szérum PRL koncentráció (V). Korábbi stádiumban lévő betegek vizsgálata nem mutatott szignifikáns eltérést a kontroll csoporthoz
képest.
Mivel
hyperprolactinaemiás
beteg
a
PRL
esetében
szekréciót
stressz
meghatároztuk
a
is
indukálja,
szérum
10
kortizol
koncentrációját is. Minden esetben normál értéket kaptunk, ez arra utal, hogy MM betegek szérum PRL koncentrációjának növekedése nem stressz ingerre adott válasz következménye.
75
Vizsgáltuk egy adott beteg esetében a betegség lefolyása során a szérum PRL szint változását. 11 betegnél 3 havonta ismételtük a szérum PRL koncentráció meghatározását. Megállapítottuk, hogy a betegség progressziója során a szérum PRL szint emelkedik, míg azoknál a betegeknél, akik a kemoterápia hatására remisszióba kerültek, a szérum PRL szint csökkenése volt igazolható. Mivel a szérum b2-M és IL-6 koncentráció mértéke bizonyítottan korrelál a betegség súlyosságával, vizsgáltuk az összefüggést a két ismert prognosztikus faktor és a PRL között. Eredményeink szerint a szérum PRL koncentráció párhuzamosan változik a szérum b2-M és IL-6 koncentrációval. Mindezen eredmények a szérum PRL koncentráció és a betegség súlyossága közötti összefüggést bizonyítják. Nem találtunk összefüggést a szérum PRL koncentráció és a monoklonális Ig típusa között. Csontvelő
aspirátum
sejtjeinek
intracelluláris
PRL
tartalmát
vizsgálva
kimutattuk, hogy MM betegek csontvelői sejtjei tartalmaznak PRL-t, míg a kontroll mintákban PRL-t nem tudtunk detektálni. Nem tudtunk PRL-t kimutatni azon MM betegek csontvelői sejtjeiben sem, akik a vizsgálatot megelőző 6 hónapon belül kemoterápiás kezelésben részesültek (IV). Ez a megfigyelés a kemoterápiát követő szérum PRL szint csökkenéssel együtt, a PRL és a kezelés közötti kapcsolatot bizonyítja. Felvetődik a lehetősége annak, hogy a kezelés hatékonyságát valamely, a PRL-nal öszefüggő paraméter változásával kövessük. A PRL-t tartalmazó csontvelői sejttípus azonosítása morfológiai vizsgálattal (melyet az immuncitokémiai procedúrát követően hematoxilin magfestéssel, fénymikroszkópos vizsgálattal végeztünk) csak igen durva megközelítést tett lehetővé. Azt állapítottuk meg, hogy sokféle sejttípus tartalmaz PRL-t, ezek között igen nagy arányban szerepelnek a plazmasejtek. A pontosabb megközelítés érdekében a sejtfelszíni markerek áramlási citometriás analízisét is elvégeztük. A plazmasejtek azonosítása a CD19 és CD45 negativitás, valamint a CD38 és CD56 sejtfelszíni antigén expressziója alapján történt. Egyidejűleg intracitoplazmatikus PRL jelölést is végeztünk. 5 beteg esetében került sor a csontvelői minta FACS
76
vizsgálatára, mely során a legnagyobb intracelluláris PRL tartalmat a plazmasejt kapún belül detektáltuk. Eredményeink
arra
utalnak,
hogy
a
PRL
szerepet
játszik
a
MM
patomechanizmusában. Előrehaladott betegségben szenvedőkön magasabb szérum PRL szint mérhető, a kezeletlen betegek csontvelői sejtjei – elsősorban a plazmasejtek – PRL-t tartalmaznak. Ezek az eredmények megerősítik más daganatos betegségekkel kapcsolatos korábbi megfigyeléseket, melyek tumoros betegek emelkedett szérum PRL szintjét, illetve a tumorsejtek PRL termelését igazolták. Az eddig elvégzett vizsgálatok azonban nem adnak magyarázatot arra, hogy a szérum
PRL
szint
emelkedés
oka,
vagy
következménye
a
betegség
súlyosbodásának. Ismert, hogy az IL-6 fokozza a HP PRL szekrécióját (139, 140). Elképzelhető, hogy a betegség progressziója során kialakuló szérum IL-6 koncentráció emelkedés a HP PRL szekréciójának fokozódása révén váltja ki a szérum PRL szint növekedését. Irodalmi adatok a tumor sejtek PRL termelését is alátámasztják (119, 127). Így, egy másik lehetőség, hogy a malignus folyamat előrehaladása során, a myeloma sejtek fokozott PRL termelése okozza a szérum PRL szint növekedését, és kemoterápiát követően ezért nem tudtunk inracelluláris PRL festődést kimutatni a csontvelői sejtekben. A glukokortikoidok gátolják a HP sejtek PRL termelését (53), elképzelhető, hogy ez más sejttípus esetében is igaz. Mivel az alkalmazott kemoterápiás protokoll tartalmazott glukokortikoidot, ez magyarázatul szolgálhat arra, hogy a kezelést követően a csontvelői sejtekben PRL-t nem tudtunk kimutatni. Mindazonáltal, kísérleteink nem bizonyítják, hogy az intracellulárisan detektált PRL-t a tumor sejtek maguk termelik, mivel ismert, hogy a környezetben jelen lévő PRL-t a sejtek képesek receptoriális mechanizmus nélkül is internalizálni (72). A jelenség pontosabb megismerésének céljából IgE-t termelő humán myeloma sejtvonalon (U266) is vizsgáltuk a PRL szerepét. A sejtekben intracelluláris PRL jelenlétét igazoltuk. Az alkalmazott tápoldat maga is tartalmazott PRL-t (10 % FCS-t tartalamzó RPMI), bár igen alacsony koncentrációban (kb. 0,4 ng/ml; Tóth E. Béla, szóbeli közlés). Ezért elvégeztük a vizsgálatot szérum-mentes médiummal is. Az intracelluláris PRL tartalom nem
77
változott jelentős mértékben. A cyclosporine kompetitív módon akadályozza a PRL receptorához történő kapcsolódását (71, 82, 141). Cyclosporine előkezelést követően az intracelluláris PRL tartalom csökkenését tapasztaltuk. Mivel azonban találhatunk irodalmi hivatkozást, mely szerint a cyclosporine nem csak receptor szinten befolyásolja a PRL hatását, (142, 143), valamint a szérum mentes környezetben is kimutatható intracelluláris PRL tartalom arra utal, hogy a sejtek, bár környezetükből is felvehetik, de feltehetően termelik is a PRL-t. Az U266 sejtek PRL termelésének egyértelmű bizonyítékát a PRL mRNS jelenlétének kimutatása jelentené, ennek vizsgálatát a későbbiekben tervezzük. Melphalan kezelés fokozta az U266 sejtek PRL tartalmát. Hasonló adatot a szakirodalomban nem találtunk. A jelenség magyarázatát nem tudjuk, elképzelhető, hogy a citosztatikumok hatására a sejtek G0/G1, illetve G2 fázisban történő megrekedése miatt hosszabb idő áll rendelkezésükre a PRL szintézishez. Humán vizsgálataink során a citosztatikus kezelést követően csontvelői sejtekben nem tudtunk intracelluláris PRL immunreakciót kimutatni. Elképzelhető, hogy humán csontvelőt vizsgálva, az összetettebb rendszerben más támadásponton érvényesülő hatást detektáltunk. Eredményeink szerint a PRL gátolja az U266 sejtek proliferációját. Különböző dózisok hatását vizsgálva (2,5-500 ng/ml) szignifikáns hatást 2,5-25 ng/ml PRL koncentráció eredményezett, míg 500 ng/ml nem okozott statisztikalilag jelentős változást. A vizsgálati rendszerben alkalmazott tápoldat 0,5 % FCS-t tartalmazott, mely kb. 0,04 ng/ml PRL tartalomnak felel meg, így azt gondoljuk, hogy ez nem befolyásolta érdemben a vizsgálatot. Mivel azonban íly módon a tápoldat egyéb, növekedéshez szükséges összetevője is szuboptimális koncentrációban lehetett jelen, ezért a vizsgálatot lószérumot tartalmazó médiummal is megismételtük, melynek PRL tartalma alacsony, de az FCS-hez hasonló mennyiségben tartalmaz más, fontos növekedési faktorokat. Ebben a vizsgálati közegben is hasonló eredményeket kaptunk. Ezek az eredmények nemcsak azért jelentenek új információt, mivel eddig humán myeloma sejtvonalon nem vizsgálták a PRL hatását, hanem azért is, mert a jelenleg rendelkezésre álló eredmények a PRL normális és tumoros sejtek proliferációját fokozó hatásról számolnak be (86, 87, 124, 127.). Nem vizsgáltuk, s így nem tudunk választ adni arra a felmerülő
78
lehetőségre, hogy vajon a PRL ezen a sejtvonalon más jelátviteli útvonalat aktivál, illetve más gének expresszióját indukálja-e, mint azokon a sejteken, ahol a sejtproliferációt fokozó hatása érvényesül. Az IgE termelés az U266 sejtek jellegzetes tulajdonsága. Vizsgálataink azt bizonyították, hogy a PRL jelentős mértékben gátolja e sejtek IgE termelését. A legkifejezettebb gátló hatást 2,5 ng/ml koncentrációban fejtette ki, a farmakológiás dózisok (125 és 500 ng/ml) kisebb mértékben, de szintén szignifikáns módon gátoltak. A PRL U266 sejtek IgE termelését gátló hatása az irodalmi adatok alapján szintén újszerű, és meglepő, mivel korábban egészséges lymphocytákon a PRL immunglobulin termelését fokozó hatásáról számoltak be (94), SLE-s betegeken a hyperprolactinaemia az autoantitest titerrel arányosnak mutatkozott (104). Malignus plazmasejtek immunglobulin termelését eddig nem vizsgálták. Az etoposid szintén gátolta az U266 sejtek IgE termelését és proliferációját is. Elképzelhető, hogy gátló hatását (legalábbis részben) a sejtek intracelluláris PRL tartalmának növelése révén fejtik ki. U266 sejteken etoposiddal apoptózist indukáltunk. (Dexamethasone-nal [10-4-106
M] és pamidronáttal [10-4–10-6M] nem sikerült apoptózist kiváltani ezen a
sejtvonalon). Az etoposid topoizomeráz gátló citosztatikum, mely a DNS szintézist gátló hatását a sejtciklus S, illetve G2 fázisában fejti ki. A PRL irodalmi adatok szerint az apoptózist azáltal gátolja, hogy elősegíti a sejtek G0/G1 fázisból a sejtciklus S fázisába történő átjutását (129). Vizsgálati rendszerünkben az etoposid 10-6 M koncentrációban 18-20 %-os apoptózist eredményezett. 2,5 és 25 ng/ml koncentrációban a PRL szignifikáns mértékben fokozta az etopoziddal kiváltott apoptózist, míg 125-500 mg/ml koncentráció gátolta azt. A magasabb PRL koncentrációk hyperprolactinaemianak megfelelő dózis tartományt jelentenek, ez megfelel azoknak az irodalmi adatoknak mely a malignus sejteken igazolták a PRL apoptózist gátló hatását, és egybecseng azokkal a megfigyelésekkel, hogy bizonyos tumoros folyamatokban (pl. egyes lymphoma típusok) hyperprolactinaemia figyelhető meg (120). Az is ismert, hogy a PRL hatása nem csak a célsejt típusától, hanem sok egyéb paraméter (pl. a sejten expresszálódó PRL-R izotípus) mellett a PRL koncentrációjától is függ (53).
79
Hypoprolactinaemia az immunválasz és a hemopoezis gátlását eredményezi (78). Mindazonáltal nem találtunk irodalmi hivatkozást a PRL apoptózist fokozó hatásával kapcsolatosan. Teoretikusan elképzelhető, hogy a PRL, azáltal, hogy elősegíti a sejtek S fázisba kerülését, több sejten teszi lehetővé az etoposid apoptózist kiváltó hatásának kialakulását. Erre utal az is, hogy PRL önmagában nem befolyásolja az apoptózist. A myeloma sejtvonalak nagyon jelentősen különböznek egymástól többek között a növekedésükhöz szükséges faktorok tekintetében is. Ezért fontos lenne a vizsgálatokat más sejtvonalon is elvégezni. Eredményeinket összefoglalva: MM betegeken elsőként vizsgáltuk a PRL szerepét. Megállapítottuk, hogy a szérum PRL szint emelkedik a betegség progressziója során, csökken a remisszióba jutó betegeknél. Ennek alapján a PRL-nak a MM progressziójában játszott szerepére következtetünk. Megfigyelésünk gyakorlati jelentőséggel is rendelkezik: a szérum PRL koncentrációt tumor markerként használhatjuk, meghatározása segítségünkre
lehet
a
beteg
állapotának
felmérésében,
a
szükséges
terápia
kiválasztásában. A szérum PRL szint csökkentése új terápiás célpont lehet MM-ben. Az U266 humán myeloma sejtvonalat választva, in vitro modell segítségével kívántunk további ismereteket szerezni a PRL myelomában játszott szerepével kapcsolatosan. Eredményeink alapvetően új információt szolgáltattak, mivel bizonyítottuk, hogy ezen a myeloma sejtvonalon a PRL a tumorsejt proliferációt és IgE termelést csökkenti, fiziológiás dózistartományban az apoptózist fokozza, míg nagy dózisban gátolja azt. A MM kezelésében is használatos melphalan fokozza az U266 sejtek PRL tartalmát, elképzelhető, hogy a citosztatikum proliferáció-gátló hatását a PRL termelés befolyásolása útján fejti ki. Ezen eredményeknek nemcsak azért tulajdonítunk jelentőséget, mert elsőként vizsgáltuk myeloma sejtvonalon a PRL hatását, hanem azért is, mert az irodalmi adatok az eddig vizsgált tumoros sejtvonalakon és normális sejteken a PRL sejtproliferációt
fokozó
hatásáról
számoltak
be.
U266
sejtvonalon
végzett
kísérleteinknek ezért elsősorban elméleti jelentősége van: rávilágít egyrészt arra, hogy
80
az élő szervezet bonyolult kölcsönhatásai miatt nemcsak a hatás mértéke, de iránya is eltérhet attól, amit egyszerűbb struktúrákon (pl. sejtkultúra) figyelhetünk meg. Másrészt, a sejtvonalak sok szempontból (növekedési faktor dependencia, receptor expresszió, stb.) különböznek egymástól. Fontosnak tartanánk a PRL-R izotípusok, az IL-6 szerepének, valamint az egyes myeloma sejtvonalakon, illetve MM betegeken a PRL által indukált jelátvitel és génexpresszió vizsgálatát. Az így nyert eredmények segítségével
a
PRL
patomechanizmusához
tumoros juthatunk
folyamatokban
közelebb,
eredmények terápiás hasznosításához is.
81
amely
játszott
lehetőséget
szerepének teremtene
az
ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA
A célkitűzések során feltett kérdésekre az alábbi válaszok adhatók, melyekkel összefoglaljuk munkánk során elért új eredményeinket: 1. Előrehaladott stádiumban lévő MM-ben szenvedő betegek szérum PRL szintje emelkedett. 2. Összefüggést igazoltunk a betegség súlyossága és a szérum PRL szint között: súlyos betegség mellett emelkedett a szérum PRL koncentráció. 3. Összefüggést igazoltunk a szérum PRL szint változása és a kezelésre adott válasz között: progresszív betegség esetén a szérum PRL szint is emelkedett, míg remisszióban csökkent. 4. A szérum PRL szint és ismert prognosztikai faktorok (béta2-mikroglobulin, interleukin-6) szérum szintje párhuzamosan változott. 5. Malignus betegségben nem szenvedők és myelomás betegek csontvelői sejtjeinek intracelluláris PRL tartalma között különbség igazolható: kezeletlen betegek csontvelői sejtjei tartalmaztak PRL-t, míg a kontroll betegek esetében nem tudtunk PRL tartalmat kimutatni. (Etikai okokból egészséges egyének csontvelői mintáit nem vizsgáltuk). 6. Kemoterápiát követően a csontvelői sejtekben intracelluláris PRL-t nem tudtunk kimutatni. 7. A csontvelői sejtek között legnagyobb mennyiségben a plazmasejtek tartalmaznak PRL-t. 8. Az U266 sejtek tartalmaznak PRL-t. 9. Melphalan fokozza az U266 sejtek intracelluláris PRL tartalmát. 10. A PRL gátolja az U266 IgE-t termelő humán myeloma sejtek sejtproliferációját, az IgE termelést, valamint dózisfüggően befolyásolja az etoposiddal kiváltott apoptózist.
82
7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretném köszönetemet kifejezni első főnökömnek, Petőcz Lujzának, aki az EGIS Gyógyszergyár
Farmakológiai
Osztályának
vezetőjeként
megtanított
a
precíz
kutatómunkára. Gigler Gábornak, akinek segítségére az EGIS-ben végzett közös munkát követően is mindig számíthattam. Az EGIS-ben töltött nyolc esztendő után, a következő hét év során a HIETE I. Belklinikáján dolgoztam, és büszke vagyok arra, hogy a “Jákó Klinika” munkatársa lehettem. Szeretnék köszönetet mondani Domján Gyulának, aki klinikussá, belgyógyásszá nevelt, aki meghatározó szerept töltött be orvosi szemléletem kialakulásában, és aki kezdettől fogva támogatott munkámban. Köszönöm jelenlegi főnökömnek Pálóczi Katalinnak, hogy Osztályára kerülvén, lehetővé tette munkám folytatását és befejezését, köszönöm a kézirat bírálatában nyújtott értékes segítségét. Falus András volt csaknem 20 évvel ezelőtt tudományos diákköri munkám során is a témavezetőm, és jelen munkát is az ő szakmai irányítása mellett végeztem. Gondolkodásmódja kezdettől fogva igen mély benyomást tett rám, és nagy szerepe volt abban, hogy az immunológia szakterületét választottam. Köszönöm, hogy miközben mindig arra bíztatott, hogy klinikus legyek, lehetőséget teremtett számomra a tudományos tevékenység folytatására. Köszönöm Nagy György és Tóth E. Béla igen értékes segítségét, melyet munkámmal kapcsolatosan mind elméleti, mind gyakorlati területen nyújtottak. Köszönettel tartozom Rimanóczi Évának, Pállinger Évának, Hasitz Ágnesnek, Nagyné Farkas Krisztinának, valamint Hegyesi Hargittának, Lázár Molnár Eszternek, Darvas Zsuzsának, Kovács Péternek, Kiss Antóniának, Mészáros Máriának munkám során nyújtott értékes segítségükért. A kézirat formába öntéséért Benczúr Miklósnak tartozom köszönettel.
83
8. IRODALOMJEGYZÉK 1. Brown LM, Linet MS, Greenberg RS, Silverman DT, Hayes RB, Swanson GM, Schwartz AG, Schoenberg JB, Pottern LM, Fraumeni JF. Multiple myeloma and family history of cancer among blacks and whites in the U.S. Cancer 85:2385-90, 1999. 2. Bergsagel D. The incidence and epidemiology of plasma cell neoplasms.Stem Cells 13 Suppl 2:1-9, 1995. 3. Gilbert ES, Omohundro E, Buchanan JA. Mortality of workers at the Hanford site: 1945-1986. Health Phys 64:577-590, 1993. 4. Aksoy M, Erdem S, Dincol G. Some etiologic factors in the ethiology of multiple myeloma. A study in 7 patients. Acta Haematol 71:116-120, 1984. 5. Shoenfeld Y, Gallant LA, Shaklai M. Gaucher’s disease with chronic stimulation of the immune system. Arch Pathol Lab Med 106:388-391, 1982. 6. Durie BGM, Salmon SE. A clinical staging system for multiple myeloma: correlation of measured myeloma cell mass with presenting clinical features, response to treatment, and survival. Cancer 36:842-54, 1975. 7. Jákó J. Gammopathiák, 1991, Budapest. 8. Demeter J. Myeloma multiplex. 197-200. Non-Hodgkin lymphoma, szerk. Pálóczi K, Kelényi G. Springer, 1998. 8/a. Alexanian R, Bergsagel DE, Migliore PJ, et al. Melphalan therapy for plasma cell myeloma. Blood 31:1-9, 1968. 8/b. Anderson KC, Hamblin TJ, Traynor A. Management of multiple myeloma. Semin Hematol 36 (Suppl. 3.):3-8, 1999. 9. Harousseau JL. High-dose therapy in multiple myeloma. Fifth Congress of the European Haematology Association Birmingham, UK, 25-28 June 2000. 10. Marit G, Facon T, Louet JP, et al. Allogeneic stem cell transplantation in multiple myeloma. A report of the Societe Francaise de Greffe de Moelle (abstract). Blood 90 (Suppl. 1.):226a, 1997. 11. Barlogie B Jagannath, S, Vesole D, et al. Autologous and allogeneic transplantation for multiple myeloma. Semin Hematol 32:31-44, 1995.
84
12. Björkstrand BB, Ljungman P, Svensson H, et al. Allogeneic bone marrow transplantation versus autologous stem cell transplantation in multiple myeloma: a retrospective case-matched study from the European Group for Blood and Marrow Transplantation. Blood 88:4711-8, 1996 13. Ludwig H, Cohen AM, Polliak A, et al. Interferon-alpha for induction and maintenance in multiple myeloma: results of two multicenter randomized trials and summary of other studies. Ann Oncol 6:467-76, 1995. 14. Raje N, Anderson KC. Introduction: the evolving role of bisphosphonate therapy in multiple myeloma. Blood 96:381-3, 2000. 14/a. Endo Y, Shibazaki M, Yamaguchi K, Nakamura M, Kosugi H. Inhibition of inflammatory
actions
of
aminobisphosphonates
by
dichloromethylene
bisphosphonate, a non-aminobisphosphonate. Br J Pharmacol 126:903-10, 1999. 15. Alexanian R, Weber D. Thalidomide for resistant and relapsing myeloma. Semin Hematol 37 (Suppl. 3.):22-25, 2000. 16. Anderson K. Advances in the biology of multiple myeloma: therapeutic applications. Semin Oncol 26(5 Suppl 13):10-22, 1999. 17. Maloney DG, Donovan K, Hamblin TJ. Antibody therapy for treatment of multiple myeloma. Semin Hematol 36(Suppl.3):30-34, 1999. 18. Sonneveld P. Drug resistance in multiple myeloma. Pathol Biol (Paris) 47:182-187, 1999. 19. Sonneveld P. Multidrug resistance in haematological malignancies. J Int Med 247:521-534, 2000. 20. Dimoupolos MA, Hester J, Huh Y, et al. Intensive chemotherapy with blood progenitor transplantation for primary resistant myeloma. Br J Haematol 87:730-4, 1994. 21. Rajkumar SV, Fonseca R, Witzig TE, Gertz MA, Greipp PR. Bone marrow angiogenesis in patients achieving complete response after stem cell transplantation for multiple myeloma.Leukemia 13:469-72, 1999. 22. San Miguel JF, Garcia-Sanz R, Gonzalez M et al: A new staining system for multiple myeloma based on the number of S-phase plasma cells. Blood 85:448, 1995.
85
23. Greipp PR, Leong T, Bennett JM, Gaillard JP, Klein B, Stewart JA, Oken MM, Kay NE, VanNess B, Kyle RA. Plasmablastic morphology--an independent prognostic factor with clinical and laboratory correlates: Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) myeloma trial E9486 report by the ECOG Myeloma Laboratory Group. Blood 91:2501-7, 1998. 24. Rajkumar SV, Leong T, Roche PC, Fonseca R, Dispenzieri A, Lacy MQ, Lust JA, Witzig TE, Kyle RA, Gertz MA, Greipp PR. Prognostic value of bone marrow angiogenesis in multiple myeloma Clin Cancer Res 6:3111-6, 2000. 25. Kay NE, Leong T, Kyle RA, Greipp P, Billadeau D, Van Ness B, Bone N, Oken MM. Circulating blood B cells in multiple myeloma: analysis and relationship to circulating clonal cells and clinical parameters in a cohort of patients entered on the Eastern Cooperative Oncology Group phase III E9486 clinical trial. Blood 90:340-5, 1997. 26. Fonseca R, Trendle MC, Leong T, Kyle RA, Oken MM, Kay NE, Van Ness B, Greipp PR. Prognostic value of serum markers of bone metabolism in untreated multiple myeloma patients. Br J Haematol 109:24-9, 2000. 27. Seidel C, Sundan A, Hjorth M, Turesson I, Dahl IM, Abildgaard N, Waage A, Borset M. Serum syndecan-1: a new independent prognostic marker in multiple myeloma. Blood 95:388-92, 2000. 28. Shain KH, Landowski TH, Dalton WS. The tumor microenvironment as a determinant of cancer cell survival: a possible mechanism for de novo drug resistance Curr Opin Oncol 12:557-63, 2000. 29. Hallek M, Bergsagel PL, Anderson KC. Multiple myeloma: Increasing Evidence for a Multistep Transformation Process. Blood 91:3-21, 1998. 30. Anderson KC, Lust JA. Role of cytokines in multiple myeloma. Semin. Hematol. 36(Suppl3):14-20, 1999. 31. Johnveaux P, Berger R: Chromosome studies in plasma cell leukemia and multiple myeloma in transformation. Genes Chromosomes Cancer 4:321-325, 1992. 32. Bergsagel PL, Nardini E, Brents L, Chesi M, Kuehl WM. IgH translocations in multiple myeloma: a nearly universal event that rarely involves c-myc. Curr Top Microbiol Immunol 224:283-7, 1997.
86
33. Drach J, Kaufmann H, Urbauer E, Schreiber S, Ackermann J, Huber H. The biology of multiple myeloma. J Cancer Res Clin Oncol 126:441-7, 2000. 34. Fonseca R, Coignet LJ, Dewald GW. Cytogenetic abnormalities in multiple myeloma. Hematol Oncol Clin North Am 13:1169-80, 1999. 35. Kastrinakis NG, Gorgoulis VG, Foukas PG, Dimopoulos MA, Kittas C. Molecular aspects of multiple myeloma Ann Oncol 11:1217-28, 2000. 36. Berenson JR, Bergsagel PL, Munshi N. Initiation and maintenance of multiple myeloma. Semin Hematol 36(1 Suppl 3):9-13, 1999. 37. Varterasian ML. Advances in the biology and treatment of multiple myeloma. Curr Opin in Oncol 11:3-8, 1999. 38. Klein B, Zhang XG, Lu ZY, Bataille R. Interleukin-6 in Human Multiple Myeloma. Blood 85:863-872, 1995. 39. Barille S, Bataille R, Amiot M. The role of interleukin-6 and interleukin6/interleukin-6 receptor-a complex in the pathogenesis of multiple myeloma. Eur Cytokine Netw 11:546-551, 2000. 40. Caligaris-Cappio F, Bergui L, Gregoretti MG, Gaidano G, Gaboli M, Schena M, Zallone AZ, Marchisio PC. Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma. Blood 77: 2688-2693, 1991. 41. Smith SR, Morgan L. Soluble IL-6R in plasma cell dyscrasias. Leuk Lymphoma 26:489-95, 1997. 42. Dedera DA, Urashima M, Chauhan D, LeBrun DP, Bronson RT, Anderson KC. Interleukin-6 is required for pristane-induced plasma cell hyperplasia in mice. Br J Haematol 94:53-61, 1996. 43. Lust JA, Donovan KA. The role of interleukin-1 beta in the pathogenesis of multiple myeloma. Hematol Oncol Clin North Am 13:1117-25, 1999. 44. Ge NL, Rudikoff S. Insulin-like growth factor I is a dual effector of multiple myeloma cell growth. Blood 96:2856-2861, 2000. 45. Amoroso SR, Huang N, Roberts AB, Potter M, Letterio JJ. Consistant loss of functional transforming growth factor beta receptor expression in murine plasmacytomas. Proc Natl Acad Sci USA 95:189-94, 1998. 46. Shustik C. Interferon in the Treatment of Multiple Myeloma. Cancer Control 5:226234, 1998.
87
47. Grander D. How does interferon-alpha exert its antitumour activity in multiple myeloma? Acta Oncol 39:801-5, 2000. 48. Vescio RA, Berenson JR. The role of human herpesvirus-8, (HHV-8), in multiple myeloma pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 1999;246:403-8. 49. Sjak-Shie NN, Vescio RA, Berenson JR. The role of human herpesvirus-8 in the pathogenesis of multiple myeloma. Hematol Oncol Clin North Am 13:1159-67, 1999. 50. Teoh G, Anderson KC. Interaction of tumor and host cells with adhesion and extracellular matrix molecules in the development of multiple myeloma. Hematol Oncol Clin North Am 11:27-42, 1997. 51. Damiano JS, Dalton WS. Integrin-mediated drug resistance in multiple myeloma. Leuk Lymphoma 38:71-81, 2000. 52. Damiano JS, Cress AE, Hazlehurst LA, Shtil AA, Dalton WS. Cell adhesion mediated drug resistance (CAM-DR): role of integrins and resistance to apoptosis in human myeloma cell lines. Blood 93:1658-67, 1999. 53. Freeman ME, Kanyicska B, Lerant A, Nagy G. Prolactin: structure, function, and regulation of secretion. Physiol Rev 80:1523-63, 2000. 54. Gala RR, Shevach EM. Evidence for the release of a prolactin-like substance by mouse lymphocytes and macrophages. Proc Soc Exp Biol Med 205:12-9, 1994. 55. Weigent DA, Blalock JE. Production of peptide hormones and neurotransmitters by the immune system. J.E. Blalock(ed): Neuroimmunoendocrinology, 3rd rev.ed. Chem. Immunol. Basel, Karger. 69:1-30, 1997. 56. Gala, RR, Shevach, EM. Identification by analytical flow cytometry of prolactin receptors on immuncompetent cell populations in the mouse. Endocrinology 133:1617-1623, 1993. 57. Yu-Lee, L. Molecular Actions of prolactin in the immune system. Proc. Soc. Exp. Biol. Med 215: 35-52, 1997. 58. Bole-Feysot C, Goffin V, Edery M, Binart N, Kelly PA. Prolactin (PRL) and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout Endocr Rev 19:225-68, 1998. 59. Gala, R.R. 1991. Prolactin and growth hormone in the regulation of the immune system. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 198: 513-527.
88
60. Sinha
YN. Structural variants of prolactin:occurence and physiological
significance. Endocrin Rev 16:354-369, 1995. 61. Montgomery DW, Shen GK, Ulrich ED, Steiner LL, Parrish PR, Zukoski CF. Human thymocytes express a prolactin-like messenger ribonucleic acid and synthesize bioactive prolactin-like proteins. Endocrinology 131:3019-3026, 1992. 62. Horseman ND, Yu-Lee LY. Transcriptional regulation by the helix bundle peptide hormones: growth hormone, prolactin, and hematopoietic cytokines. Endocrin Rev 15:627-649, 1994. 63. Bazan JF. Haemopoietic receptors and helical cytokines. Immunol Today 11:350354, 1990. 64. Kelly PA, Djiane J, Postel-Vinay M-C, Edery M. The prolactin/growth hormon receptor family. Endocr. Rev 12:235-251, 1991. 65. O’Neal KD, Yu-Lee L-Y. Differential signal transduction of the short, Nb2, and long prolactin receptors. J Biol Chem 269:26076-26082, 1994. 66. Ziemiecki A, Harpur AG, Wilks AF. JAK protein tyrosine kinases: their role in cytokine signalling. Trend Cell Biol 4:207-212, 1994. 67. Yu-Lee LY, Luo G, Moutoussamy S, Finidori J. Prolactin and growth hormone signal transduction in lymphopoietic cells. Cell Mol Life Sci 54:1067-1075, 1998. 68. Piccoletti R, Maroni P, Bendinelli P, Bernelli-Zazzera A. Rapid stimulation of mitogen-activated protein kinase of rat liver by prolactin. Biochem J 303:429-433, 1994. 69. Clevenger CV, Freier DO, Kline JB. Prolactin receptor signal transduction in cells of the immune system. J Endocrinol 157:187-97, 1998. 70. Heinzel T, Lavinsky RM, Mullen T-M, Soderstrom M, Laherty CD, Torchia J et al. A complex containing N-CoR, mSin3 and histone deacetylase mediates transcriptional repression. Nature 387:43-55, 1997. 71. Russell DH, Kibler R, Matrisian DF et al. Prolactin receptors on human T and B lymphocytes: antagonism of prolactin binding by cyclosporine. J Immunol 134:3027, 1985. 72. Clevenger CV, Rycyzyn MA. Translocation and action of polypeptide hormones within the nucleus. Relevance to lactogenic transduction. Adv Exp Med Biol 480:77-84, 2000.
89
73. Neill JD. Prolactin: its secretion and control. In: Handbook of Physiology. Endocrinology. The Pituitary Gland and Its Neuroendocrine Control. Washington, DC: Am Physiol Soc sect. 7, vol. IV, 469-488, 1974. 74. Weigent DA. Immunoregulatory properties of growth hormone and prolactin. Pharmacol Ther 69:237-257, 1996. 75. Berczi, I. Pituitary hormones and immune function. Acta Paediatr. Suppl. 423: 7075, 1997. 76. Velkeniers B, Dogusan Z, Naessens F, Hooghe R, Hooghe-Peters EL. Prolactin, growth hormone and the immune system in humans. Cell Mol Life Sci 54:11021108, 1998. 77. Chikanza IC. Prolactin and neuroimmunomodulation: in vitro and in vivo observations. Ann NY Acad Sci 876:119-30, 1999. 78. Berczi, I., E. Nagy, K. Kovacs, E. Horvath. Regulation of humoral immunity in rats by pituitary hormones. Acta Endocrinol 98: 506-513, 1981. 79. Nagy, E., I. Berczi, H.G. Friesen. Regulation of immunity in rats by lactogenic and growth hormones. Acta Endocrinol 102: 351-357, 1983. 80. Kelly KW, Brief S, Westly HJ, et al. GH3 pituitary adenoma cells can reverse thymic aging in rats. Immunology 83:5663, 1986. 81. Bernton, EW, Meltzer, MS, Holiday JW. Suppression of macrophage activation and T lymphocyte function in hypothalamic mice. Science 239:401-404, 1988. 82. Wilner
ML,
Ettenger
RB,
Koyle
MA,
Rosenthal
JT.
The
effect
of
hypoprolactinemia alone and in combination with cyclosporine on allograft rejection. Transplantation 49:264-267, 1990. 83. Murphy WJ, Rui H, Longo DL. Minireview: effects of growth hormone and prolactin immune development and function. Life Sci 57:1-14, 1995. 84. Matera, L. Action of pituitary and lymphocyte prolactin. Neuroimmunomodulation 4:171-180, 1997. 85. Nira, B. J., J.L. Mershon, D.L. Allen, R.W. Steinmetz. Extrapituitary prolactin: distribution, regulation, functions, and clinical aspects. Endocrine Rev 17: 639-669, 1996. 86. Hartmann, D.P., J.W. Holaday, E.W. BerntonInhibition of lymphocyte proliferation by antibodies to prolactin. FASEB. 3:2194-2202, . 1989.
90
87. Sabharwal, P., R. Glaser, W. Lafuse, S. Varma, Q. Liu, S. Arkins, R. Kooijman, L. Kutz, K.W. Kelley, W.B. Malarkey. Prolactin synthesized and secreted by human peripheral
blood
mononuclear
cells:
An
autocrine
growth
factor
for
lymphoproliferation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 7713-7716, 1992. 88. Ben-Jonathan N, mershon JL, Allen DL, Steinmetz RW. Extrapituitary prolactin: distribution, regulation, functions, and clinical aspects.Endocrine Rev 17: 639-69, 1996. 89. Weimann E, Baixeras E, Zamzami N, Kelly P. Prolactin blocks glucocorticoid induced cell death by inhibiting the disruption of the mitochondrial membrane. Leuk Res 23:751-762, 1999. 90. Evans-Storms RB, Cidlowski JA. Regulation of apoptosis by steroid hormones. J Steroid Biochem and Mol Biol 53:1-6, 1995. 91. Mukherjee P, Masrto AM, Hymer WC. Prolactin induction of interleukin-2 receptors on rat splenic lymphocytes. Endocrinology 126:88-94, 1990. 92. Clevenger CV, Russell DH, Appasamy PM, Prystowsky MB. Regulation of interleukin-2-driven T-lymphocyte proliferation by prolactin. Proc Natl Acad Sci USA 87:6460-6464, 1990. 93. Prytowsky MB, Clevenger CV. Prolactin as a second mesenger for interleukin 2. Immunomethods 1994;5:49-55. 94. Lahat N, Miller A, Shtiller R, Touby E. Differential effects of prolactin upon activation and differentiation of human B lymphocytes. J Neuroimmunol 47:35-40, 1993. 95. Cesano, A., E. Oberholtzer, M. Contarini, M. Geuna, G. Bellone, L. Matera. Independent and synergistic effect of interleukin-2 and prolactin on development of T- and NK-derived LAK effectors. Immunopharmacology 28:67-75, 1994. 96. Nagy E, Berczi I. Prolactin and contact sensitivity. Allergy 36:429-431, 1981. 97. Hiestand PC, Mekler P, Nordmann R, Grieder A, Permmongkol C. Prolactin as a modulator of lymphocyte responsiveness provides a possible mechanism of action for cyclosporine. Proc Natl Acad Sci U S A 83:2599-603, 1986. 98. Neidhart M. Prolactin in autoimmune diseases. Proc Soc Exp Biol Med 217:408-19, 1998.
91
99. McMurray R, Keisler D, Izui S, Walker SE. Hyperprolactinemia in male NZB/NZW (B/W) F1 mice: accelerated autoimmune disease with normal circulating testosterone. Clin Immunol Immunopathol 71:338-43, 1994. 100.
Berczi I, Nagy E, Asa SL, Kovacs K. The influence of pituitary hormones on
adjuvant arthritis. Arthritis Rheum 27:682-8, 1984. 101.
Riskind PN, Massacesi L, Doolittle TH, Hauser SL. The role of prolactin in
autoimmune demyelination: suppression of experimental allergic encephalomyelitis by bromocriptine. Ann Neurol 29:542-7, 1991. 102.
Palestine AG, Nussenblatt RB, Gelato M. Therapy for human autoimmune
uveitis with low-dose cyclosporine plus bromocriptine. Transplant Proc 20(3 Suppl 4):131-5, 1988. 103.
Jara LJ, Gomez-Sanchez C, Silveira LH, Martinez-Osuna P, Vasey FB, Espinoza
LR. Hyperprolactinemia in systemic lupus erythematosus: association with disease activity. Am J Med Sci 303:222-6, 1992. 104.
Walker SE, McMurray RW, Houri JM, Allen SH, Keisler D, Sharp GC,
Schlechte JA. Effects of prolactin in stimulating disease activity in systemic lupus erythematosus. Ann N Y Acad Sci 840:762-72, 1998. 105.
Alvarez-Nemegyei J, Cobarrubias-Cobos A, Escalante-Triay F, Sosa-Munoz J,
Miranda JM, Jara LJ. Bromocriptine in systemic lupus erythematosus: a doubleblind, randomized, placebo-controlled study. Lupus 7:414-9, 1998. 106.
Chikanza IC, Petrou P, Chrousos G, Kingsley G, Panayi GS. Excessive and
dysregulated secretion of prolactin in rheumatoid arthritis: immunopathogenetic and therapeutic implications. Br J Rheumatol 32:445-8, 1993. 107.
Neidhart M, Gay RE, Gay S. Prolactin and prolactin-like polypeptides in
rheumatoid arthritis. Biomed Pharmacother 53(5-6):218-22, 1999. 108.
Brennan P, Hajeer A, Ong KR, Worthington J, John S, Thomson W, Silman A,
Ollier B. Allelic markers close to prolactin are associated with HLA-DRB1 susceptibility alleles among women with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 40:1383-6, 1997. 109.
Woody MA, Welniak LA, Sun R, Tian ZG, Henry M, Richards S, Raziuddin A,
Lomgo DL, Murphy WJ. Prolactin exerts hematopoietic grotwh-promoting effects
92
in vivo and partially counteracts myelosuppression by azidothymidine. Exp Hematol 27:800-6, 1999. 110.
Delhase M, Vergani P, Malur A, Hooghe-Peters EL, Hooghe RJ. The
transcription factor Pit-1/GHF-1 is expressed in hemopoietic and lymphoid tissues. Eur J Immunol. 1993, 23:951-5. 111.
Morales P, Carretero MV, Geronimo H, Copin SG, Gaspar ML, Marcos MA,
Martin-Perez J. Influence of prolactin on the differentiation of mouse B-lymphoid precursors. Cell Growth Differ 10:583-90, 1999. 112.
Hooghe R, Delhase M, Vergani P, Malur A, Hooghe-Peters EL. Growth
hormone and prolactin are paracrine growth and differentiation factors in the haemopoietic system. Immunol Today 14:212-4, 1993. 113.
Ozarda AT. Prolactin-secreting tumors. J Surg Oncol 22:9, 1983.
114.
Reynolds, C., K.T. Montone, C.M. Powell, J.E. Tomaszewski, C.V. Clevenger.
Expression of prolactin and its receptor in human breast carcinoma. Endocrinology 138: 5555-5560, 1997. 115.
Ilan, Y., O. Sibirsky, N. Livni, O. Gofrit, V. Barack, E. Goldin. Plasma and
tumor prolactin in colorectal cancer patients. Dig. Dis. Sci 40:2010-2015, 1995. 116.
Stanisic TH, Donovan J. Prolactin secreting renal cell carcinoma. J Urol 136:85,
1986. 117.
Bhatavdekar JM, Patel DD, Giri DD, Karelia NH, Vora HH, Ghosh N, Shah NG,
Trivedi SN, Balar DB. Comparison of plasma prolactin and CEA in monitoring patients with adenocarcinoma of colon and rectum. Br J Cancer 66:977-80, 1992. 118.
Ginsburg E, Vonderhaar BK. Prolactin synthesis and secretion by human breast
cancer cells. Cancer Res 55:2591-2595, 1995. 119.
Hatfill SJ, Kirby R, Hanley M, Rybicki E, Boehm L. Hyperprolactinemia in
acute myeloid leukemia and indication of ectopic expression of human prolactin in blast cells of a patient of subtype M4. Leuk Res 14:57-62, 1990. 120.
Grobe N, Ruhle H, Eckelmann G. Hyperprolactinemia in malignant lymphomas.
Dtsch Med Wochenschr 115:1825-0827, 1990. 121.
Matera L, Geuna M, Pastore C, Buttiglieri S, Gaidano G, Savarino A, Marengo
S, Vonderhaar. Expression of prolactin and prolactin receptors by non-Hodgkin's lymphoma cells. Int J Cancer 85:124-30, 2000.
93
122.
Pellegrini I, Lebrun JJ, Ali S, Kelly PA. Expression of prolactin and its receptor
in human lymphoid cells. Mol Endocrinol 6:1023-31, 1992. 123.
DiMattia, G.E., B. Gellersen, H.G. Bohnet, H.G. Friesen. A human B-
lymphoblastoid cell line produces prolactin. Endocrinology 122: 2508-2517, 1988. 124.
Baglia LA, Cruz D, Shaw JE. An Epstein-Barr virus-negative Burkitt lymphoma
cell line (sfRamos) secretes a prolactin-like protein during continuous growth in serum-free medium. Endocrinology 128:2266-72, 1991. 125.
Kooijman R, Gerlo S, Coppens A, Hooghe-Peters EL. Myeloid leukemic cells
express and secrete bioactive pituitary-sized 23 kDa prolactin. J Neuroimmunol 110:252-258, 2000. 126.
Gaidano G, Contarini M, Pastore C, Saglio G, Matera L. AIDS-related Burkitt's-
type lymphomas are a target for lymphokine-activated killers induced by interleukin-2 and prolactin. Proc Soc Exp Biol Med 213:196-205, 1996. 127.
Matera L, Cutufia M, Geuna M, Contarini M, Buttiglieri S, Galin S, Fazzari A,
Cavaliere C. Prolactin is an autocrine growth factor for the Jurkat human Tleukemic cell line. Neuroimmunol 79:12-2, 1997. 128.
Davis JA, Linzer DI. Autocrine stimulation of Nb2 cell proliferation by secreted,
but not intracellular, prolactin. Mol Endocrinol 2:740-6, 1988. 129.
Bole-Feysot C, Perret E, Roustan P, Bouchard B, Kelly PA. Analysis of
prolactin-modulated gene expression profiles during the Nb2 cell cycle using differential screening techniques. Genome Biol. 1:RESEARCH0008, 2000. 130.
Huggings CB, Ueda N. Regression of myelocytic leukemia in rats after
hypophysectomy. Proc Natl Acad Sci USA 81:598-601, 1984. 131.
Clapp C, Lopez-Gomez FJ, Nava G, Corbacho A, Torner L, Macotela Y, Duenas
Z, Ochoa A, Noris G, Acosta E, Garay E, Martinez de la Escalera G. Expression of prolactin mRNA and of prolactin-like proteins in endothelial cells: evidence for autocrine effects. J Endocrinol 158:137-44, 1998. 132.
Gerli R, Rambotti P, Nicoletti I, Orlandi S, Migliorati G, Riccardi C. Reduced
number of natural killer cells in patients with pathological hyperprolactinemia. Clin Exp Immunol 64:399-406, 1986.
94
133.
Hooghe R, Merchav S, Gaidano G, Naessens F, Matera L. A role for growth
hormone and prolactin in leukaemia and lymphoma? Cell Mol Life Sci 54:1095101, 1998. 134.
Leff MA, Buckley DJ, Krumenacker JS, Reed JC, Miyashita T, Buckley AR.
Rapid modulation of the apoptosis regulatory genes, bcl-2 and bax by prolactin in rat Nb2 lymphoma cells. Endocrinology 137:5456-62, 1996. 135.
Reed JC. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death . J Cell Biol 124:1-
6, 1995. 136.
Huang CM, Chou CT. Hyperprolactinemia in systemic lupus erythematosus.
Chung Hua I Hsueh Tsa Chih (Taipei) 59;37-41, 1997. 137.
Hinterberger-Fischer M, Kier P, Spona J, Sebesta C, Tiefengraber E,
Habertheuer KH, Ruckser R, Schmid A, Kalhs P, Lechner K, et al. Prolactin: a possible mediator of graft-versus-host disease following allogeneic bone marrow transplantation in humans. Bone Marrow Transplant 14:403-6, 1994. 138.
Léránt, A.A., Gy. Nagy. Analysis of autocrine and paracrine interactions in the
pituitary gland by the reverse hemolytic plaque assay. Neuroprotocols: A companion to methods in neurosciences 5: 198-208, 1994. 138/b. Lichtenstein A, Gera J, Andrews J, Berenson J, Ware CF. Inhibitors of ADPribose polymerase decrease the resistance of HER2/neuexpressing cancer cells to the cytotoxic effects of TNF. J Immunol 146:2052-2059, 1991. 139.
Spangelo BL, Judd AM, Isakson PC, MacLeod RM. Interleukin-6 stimulates
anterior pituitary hormone release in vitro. Endocrinology 125:575-577, 1989. 140.
Ray D, Melmed S. Pituitary cytokine and growth factor expression and action.
Endocrine Rev 18: 206-228, 1997. 141.
Matera L, Muccioli G, Cesano A, Bellussi G, Genazzani E. Prolactin receptors
on large granular lymphocytes: dual regulation by cyclosporin A. Brain Behav Immun 2:1-10, 1988. 142.
Varma S, Ebner KE. The effect of cyclosporine A on the growth and prolactin
binding to rat lymphoma cells. Biochem Biophys Res Commun 156:233-9, 1988. 143.
Matera L. Endocrine, paracrine and autocrine actions of prolactin on immune
cells. Life Sci 59:599-614, 1996.
95
9. A témához kapcsolódó saját közlemények I. Klara Gadó, Gyula Domján, Hargitta Hegyesi, András Falus.. Role of interleukin-6 in the pathogenesis of multiple myeloma. Cell Biology International 24:195-209, 2000,. II. Klara Gadó, Santiago Silva, Katalin Pálóczi, Gyula Domján and Andras Falus. Mouse plasmacytoma: Experimental model of human multiple myeloma. Haematologica 86:227-36, 2001. III. Gadó Klára, Gopcsa László, Pálóczi Katalin, Domján Gyula. Myeloma multiplex kezelése. Magyar Onkológia 1: 2001; IV. K. Gadó, Gy.M. Nagy, A. Hasitz, E. Rimanóczi, Gy. Domján. Evidence for prolactin immunoreactivity in the bone marrow of untreated multiple myeloma patients. Közlésre elfogadva: Neuroimmunomodulation V. Klára Gadó, Éva Rimanóczi, Ágnes Hasitz, Gábor Gigler, Béla E. Tóth, György M. Nagy, Katalin Pálóczi,Gyula Domján. Elevated levels of serum prolactin in patients with advanced multiple myeloma. Közlésre benyújtva: J Clin End Metab
96
