A mesenchymalis őssejtek terápiás alkalmazásának lehetőségei és korlátai sclerosis multiplexben
Uher Ferenc
Országos Vérellátó Szolgálat, Őssejt-biológia, Budapest
A mesenchymalis ős- vagy stroma sejtek I.
HSC MSC
A mesenchymalis ős- vagy stroma sejtek II. Agy Thymus Tüdő
Csontvelő
Szívizom Máj Hasnyálmirigy
Zsírszövet
Lép Vese Vázizom Nagy és kis erek, kapillárisok
Csontvelő
Zsírszövet
Wharton-kocsonya
Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells Plastic-adherent under standard culture conditions. Express CD105, CD90 CD73 and CD44, and lack expression of CD45, CD34, CD14 or CD11b, CD79 or CD19 and HLA-DR. Must differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondroblasts in vitro. Dominici et al.: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006;8(4):315.
CD44
Osteo
CD73
CD90
Adipo
CD45
Chondro
Mesenchymalis ős- és elődsejtek izolálása Csontvelő
Zsírszövet
2500 rpm, 20 perc
Kollagenáz, 30 perc, 37°C
600 rpm, 8 perc
Gradiens centrifugálás
Mosás
1200 rpm, 10 perc
Emésztés
Mosás
Mononukleáris sejtfrakció
SVF frakció ~1%
~0,001-0,002% További átoltások
Első átoltás és szélesztés (1:3 – 1:5)
Növekedés
Tripszin-EDTA
„MSC kultúra” (heterogén)
Konfluens stroma tenyészet
Primer kultúra (adherens sejtek)
Plaszticitásuk Vérképzést támogató stroma
MSC
CFU-F
Stro-CFU
Osteoblast Osteo-CFU Chondrocyta Chondro-CFU Adipocyta Adipo-CFU Tendocyta Idegsejt, gliasejt, b-sejt, májsejt
Nem ortodox plaszticitás
Myoblast Szívizomsejt
Ortodox plaszticitás
Csont
Alizarin vörös/Giemsa, x10
Adipocyták
Olajvörös/metilénkék, x20
Az MSC-k gyulladásgátló és immunszuppresszív aktivitása B-sejt T-sejt Apoptózis
Sejtosztódás
Fas FasL
TGF-b Kinurenin NO Sejt-sejt Szolubilis faktorok Egyéb Trp kölcsönhatások iNOS PGE2; Gyulladás TNF-a Sejtosztódás HLA-G; IDO TNFR-1 B7-H1 (PDL1) Idolamin 2,3-dioxygenáz enzim; H-faktor. IFN-g Treg LPS B7-H4 Nitrogén-monoxid; sejtek IFNg-R FasL TLR4 Galektin-1; Notch-ligandum(ok)
PGE2
MSC
IL-10, TGF-b, HGF; Regulátor T-sejtek (Treg) indukciója.
COX2
EP2/4R
PGE2
NK-sejt Sejt-sejt kölcsönhatás
EP2/4R IL-10
Dendritikus sejt
Macrophag
Granulocyta
Az MSC-k M2 (regulátor) irányú MΦ polarizációt indukálnak Klasszikus úton aktivált M
M1
MSC
MHC-II, B7, iNOS, IL-12, TNF-a, + APC, Th1 válasz
Regulátor M Alternatív úton aktivált M MHC-II, B7, iNOS, IL-12, TNF-a, IL-10, Argináz, APC, Sebgyógyulás, Regeneráció
TAM
M2
MHC-II, B7, iNOS, IL-12, TNF-a, IL-10, ++ APC, Th2 válasz, Gyulladásgátlás
Mesenchymalis őssejtterápia Az MSC-k hamar felkeltették mind a kutatók, mind a gyakorló orvosok Az MSC-k elsősorban olyan betegségek kezelése során lehetnek ígéretesek, figyelmét: amelyekben egyidejűleg van szükség regenerációra (az elpusztult sejtek/ • viszonylag hozzáférhetők (csontvelő, zsírszövet, köldökzsinór), szövetek pótlására)könnyen és a károsodott területen kialakuló gyulladás, illetve • jól szaporíthatók in vitro kultúrában , és immunválasz csökkentésére. • csak minimális mértékben immunogének (allogén transzplantáció), • multipotensek (plaszticitás), • in vivo a szöveti sérülés/gyulladás helyére vándorolnak,
• jelentős regeneratív képességgel rendelkeznek (trofikus faktorok), • gátolják az apoptózist és a fibrózist, • elősegítik új kapillárisok képződését, • mitochondriumokat és mikrovezikulumokat jutatnak a károsodott sejtekbe, • immunszuppresszív és gyulladásgátló aktivitással rendelkeznek (szolubilis faktorok és sejt-sejt kölcsönhatások).
A mesenchymalis őssejtek klinikai alkalmazása Csont/porc betegségek
Autológ Allogén (felnőtt) Allogén (perinatális)
Szív- és érrendszeri betegségek Neurológiai betegségek GVHD/Transzplantációs tolerancia Máj Fázis III
Diabetes
Fázis II/III
Gastro-intestinalis betegségek
Fázis II
Tüdő
Autoimmun betegségek
Fázis I/II
Egyéb
Fázis I 0
10
20
30
40
Regisztrált klinikai vizsgálatok
A jelenleg folyó klinikai trial-ok általában túl kicsik (fázis I/II) és nagyon sokféle (>50) betegséget érintenek.
Az MSC-k klinikai alkalmazása – rövid távon – biztonságos; hosszú távon - ???
50
0
20
40
60
80 100
Klinikai vizsgálatok (%)
Terápiás hatékonyságuk viszont messze elmarad (fázis III) a preklinikai állatkísérletek alapján remélttől.
SM/EAE
A sclerosis multiplex 1868, Jean Martin Charrot (Salpetrière, Párizs)
A központi idegrendszer autoimmun (?) megbetegedése, amelynek következtében gyulladásos léziók (gócos demyelinisatio) jönnek létre az agy és a gerincvelőben.
Myelin-hüvely (velős hüvely) Hegszövet
Lefolyása Szekunder progresszív
(RR-SM)
(SP-SM)
Klinikai tünetek
Relapsus / remisszió
Demyelinisatio a fehérállományban
Demyelinisatio a szürkeállományban
Atrofia
Axon károsodás
Idő (évek) Váltakozó remissziók és relapsusok (RRMS) (85-90%) Progrediáló (PPMS) Krónikus (jóindulatú?) Centrális vs. perifériás (Guillain-Barré syndroma)?
A klinikai kép
Immunszuppresszív kezelés, gyulladásgátlók
Immunválasz
Gyulladás a központi idegrendszerben
Immunválasz
Neurodegeneráció
Neurodegeneráció
Gyulladás a központi idegrendszerben
EAE – experimentális autoimmun encephalomyelitis
1888, Louis Pasteur, Párizs
1933, Thomas Rivers (Rockefeller Institute, New York)
EAE – experimentális autoimmun encephalomyelitis egérben Az egér EAE 0 – egészséges állat, nincs tünet; indukciója 1 – bénult farok; során alkalmazott peptid antigének
MBP – myelin basic protein; PLP – proteolipid protein; MOG – myelin-oligodendrocyte glycoprotein.
2 – gyengülő hátsó lábak vagy 1 béna hátsó láb; 3 – mindkét hátsó láb bénult; 4 – gyengülő mellső lábak vagy 1 béna mellső láb; 5 – minden végtag bénult vagy elhalálozott Beltenyésztett állat.
Peptid
egértörzs
Encephalitogénszekvencia
Az EAE mesenchymalis őssejtterápiája Klinikai „score”
n=7
5 4
MSC
3
(2x106
sejt/állat ip)
2 1
● ● ● ● ● ● ●
0 1 2
● ●
7
● ● ● ●
10
●
●
● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●
●
●
15
20
25
● ●
● ●●
30
Idő (napok) MOG35-55 + CFA + Pertussis toxin
Pertussis toxin
A mesenchymalis őssejtek hatása a lépsejt populációk megoszlására EAE-ben CD45R (B220)
CD4 % pozitív sejt 20
% pozitív sejt
CD11b % pozitív sejt
60 20
10
50 10 40
20
CD8 30
10
14. 22. Nap Kontroll EAE EAE + MSC
Gr-1
20
20
10
10
14. 22. Nap
14. 22. Nap
A mesenchymalis őssejtek gátolják az antigén-bemutatást és a T-sejtek osztódását a lépben felvétel (cpm/kultúra)
3H-thymidin
EAE APC
Kontroll APC
EAE + MSC APC
16000
12000
8000
4000
Kontroll T sejt: EAE T sejt: EAE + MSC T sejt: MOG peptid:
+ -
+ - - - - + + - - - - + + + - + - +
+ -
+ - - + + - - + - +
+ -
+ +
+ -
+ - - - - + + - - - - + + + - + - +
A mesenchymalis őssejtek gátolják a CD4+ T lymphocyták felszaporodását a gerincvelőben 17. nap
8,34 %
12,36 % 8,97 x106
5,44
8,13 %
11,37 % 10,20 x106
6,36
x106
6,52 %
3,14 %
5,52 %
3,85 %
Fluoreszcencia intenzitás
Fluoreszcencia intenzitás
Kontroll
EAE + MSC
x106
Relatív sejtszám
Relatív sejtszám
EAE
EAE + MSC
Relatív sejtszám
EAE
22. nap
2,07 % 4,67 x106
Fluoreszcencia intenzitás
A mesenchymalis őssejtek gátolják a demyelinizációt EAE
H&E festés (a nyilak a gyulladásos gócokat jelölik)
Demyelinizáció (Luxol Fast Blue jelölés)
EAE + MSC
Kontroll
ÖSSZEFOGLALÁS A mesenchymalis őssejtek hatása az EAE progressziójára kettős: Perifériás
Centrális
(a lépben):
(a gerincvelőben):
• mérséklik a gyulladáskeltő (CD11b és Gr-1 pozitív; monocyta/MΦ és granulocyta) sejtek beáramlását;
• gátolják a CD4 pozitív T-sejtek beáramlását és/vagy osztódását;
• gátolják a CD45R (B220) pozitív B- és a CD8 pozitív T-sejtek arányának csökkenését;
• mérséklik a demyelinizációt és/vagy segítik a remyelinizációt;
• csökkentik a gyulladást ???
• gátolják az antigén-bemutatást és a MOG35-55-specifikus T lymphocyták proliferációját; Hegyi Beáta; Országos Vérellátó Szolgálat, Őssejt-biológia
• MSC – mikroglia kölcsönhatás in vitro! Madarász Emília és Környei Zsuzsanna; MTA-KOKI, Idegi Sejt- és Fejlődésbiológia Kutatócsoport Kovács Krisztina és Ferenczi Szilamér; MTA-KOKI, Molekuláris Neuroendokrinológia Kutatócsoport
Consensus Report of the International MSCT Study Group • The rationale for MSC transplantation in MS • MSC transplantation: preliminary clinical experience in MS • New perspective for the exploitation of MSC in MS: an international consensus • Study design Inclusion criteria Exclusion criteria • Mesenchymal stem cell product • Study protocol • Treatment outcomes
Multiple Sclerosis 16(4): 503–510. (2010)
Mark S. Freedman, MSc, MD, FAAN, FRCPC, Professor of Medicine (Neurology), University of Ottawa, The Ottawa Hospital, Ottawa, Canada Antonio Uccelli, MD, Head – MS Clinic & Neuroimmunology Unit, Department of Neurosciences, Ophthalmology and Genetics, University of Genoa, Genoa, Italy Amit Bar-Or, MD, FRCPC, Associate Professor, Francesco Frassoni, MD, Director, Stem Cell and Cell Therapy Centre, Ospedale San Martino, Genova, Italy Jacques Galipeau, MD, FRCPC, Associate Professor of Medicine and Oncology, Sir Mortimer B Davis Jewish General Hospital & Lady Davis Institute for Medical Research, McGill University, Montreal, QC, Canada Dimitrios Karussis, MD, PhD, Professor, Head of MS Center Hadassah, Hadassah Hebrew University, Ein Karem, Jerusalem, Israel Katarina LeBlanc, MD, PhD, Professor, Karolinska Institutet, Division of Clinical Immunology and Transfusion Medicine, Stockholm, Sweden Neil Scolding, FRCP, PhD, Professor, University of Bristol Institute of Clinical Neurosciences, Department of Neurology, Frenchay Hospital, Bristol, UK Aikaterini Gkioka, PhD, Professor of Medical School of University of Athens, Director of Hellenic Cord Blood Bank by Medical Foundation of Academy of Athens, University of Athens, Athens, Greece Harold L. Atkins, MD, FRCPC, Medical Director, Regenerative Medicine, Ottawa Health Research Institute, Ottawa, Canada Claude C.A. Bernard, DES, MSc, PhD, DSc, Professor and Associate Director, Monash Immunology and Stem Cell Laboratories, Monash University, Clayton/Melbourne, Victoria, Australia Marjorie Bowman, RN, BScN, MS/BMT Research Coordinator, The Ottawa Hospital, Ottawa, Canada Siddharthan Chandran, PhD, MRCP, MRC, Anne McLaren Laboratory for Regenerative Medicine & Cambridge Centre for Brain Repair, Dept of Clinical Neurosciences, University of Cambridge, Cambridge, UK Jeffrey Cohen, MD, Professor of Neurology, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine, Cleveland, OH, USA Klimentini Karageorgiou, MD, PhD, Director of Neurology Department, Athens General Hospital, Athens, Greece Hillard Lazarus, MD, University Hospital/Case Medical Center, Cleveland, OH, USA Heather MacLean, MD, FRCP(C), Assistant Professor, University of Ottawa, Ottawa Hospital MS Clinic, Ottawa, ON Canada Pedro Marın Fernandez, MD, Senior Consultant, Hemotherapy and Hemostasis Service, Hospital Clinic Barcelona, Barcelona, Spain Gianvito Martino, MD, Director Division of Neuroscience/San Raffaele Hospital, Milan, Italy Paul W O’Connor, MD, FRCPC, MSc, Director, MS Clinic and MS Research, St. Michael’s Hospital, University of Toronto, Toronto, Canada Tomas Olsson, MD, PhD, Professor, Dept. of Clinical Neuroscience, Karolinska Institutet, Neuroimmunology Unit, Stockholm, Sweden Andreas Papasavvas, PhD, Professor of Medical School of Athens, Hellenic Cord Blood Bank by Medical Foundation of Academy of Athens, Athens, Greece Stefano Pluchino, MD, Division of Neuroscience/San Raffaele Hospital, Milan, Italy Albert Saiz, MD, PhD, Head of MS Unit, Hospital Clinic, Barcelona, Spain Sven Schippling, MD, Institute of Neuroimmunology and Clinical MS Research, Hamburg, Germany Mike Scott, PhD, FRCPath, Cambridge University Hospitals, Stem Cell Laboratory, Department of Haematology, Cambridge, UK Shimon Slavin, MD, Professor of Medicine, Scientific & Medical Director, The International Center for Cell Therapy & Cancer Immunotherapy (CTCI), Tel Aviv, Israel Ada Vaknin, MD, PhD, MS Center Hadassah, Hadassah Hebrew University, Ein Karem, Jerusalem, Israel Pablo Villoslada, MD, Director Neuroimmunology Group, Institut Biomedical Research August Pi Sunyer (IDIBAPS) Hospital Clinic, Barcelona, Spain
10 mm
Köszönöm a figyelmet!
1 mm
