A postmenopausalis és glükokortikoid indukálta csontvesztés genomikai hátterének vizsgálata

A postmenopausalis és glükokortikoid indukálta csontvesztés genomikai hátterének vizsgálata Doktori értekezés

Kósa János Pál Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető:

Dr. Speer Gábor egyetemi adjunktus, Ph.D.

Hivatalos bírálók:

Dr. Bálint B. László, egyetemi tanársegéd Ph.D. Dr. Várbíró Szabolcs, egyetemi tanársegéd Ph.D.

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Sasvári Mária egyetemi tanár, D.Sc. Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Korányi László főorvos, D.Sc. Dr. Kiss Csaba főorvos, Ph.D.

Budapest 2009.

TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

4

1

6

BEVEZETÉS

1.1 A CSONTSZÖVET FELÉPÍTÉSE ÉS FUNKCIÓJA 6 7 1.2 A CSONTÁTÉPÜLÉS FOLYAMATA 1.3 A CSONTANYAGCSERÉT SZABÁLYOZÓ MOLEKULÁK ÉS JELÁTVITELI RENDSZEREK 8 1.3.1 RANK/RANKL/OPG rendszer 8 1.3.2 A csont morfogenetikus protein (BMP) szignalizációs rendszer 9 1.3.3 Egyéb lokális citokinek 11 1.4 A CSONTANYAGCSERE KÓROS FOLYAMATAI, A PRIMER ILLETVE SZEKUNDER 12 CSONTVESZTÉS KIALAKULÁSÁNAK OKAI 1.4.1 Primer, postmenopausas csontvesztés 13 1.4.2 Szekunder, glükokortikoid indukálta csontvesztés 13 1.5 A CSONTVESZTÉSBEN SZEREPET JÁTSZÓ GÉNPOLIMORFIZMUSOK 16 1.5.1 Új kandidáns gének meghatározása gímszarvas-modell segítségével 17 18 1.6 A POSTMENOPAUSAS CSONTVESZTÉS IMMUNOLÓGIAI VONATKOZÁSAI 2

CÉLKITŰZÉSEK

20

3

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

21

21 3.1 VIZSGÁLATI CSOPORTOK 3.1.1 Postmenopausas és premenopausas nem osteoporotikus nők vizsgálati csoportja 21 3.1.2 Az SNP analízisek vizsgálati csoportja 22 3.2 DENZITOMETRIA ÉS A HUMÁN CSONTSZÖVET MINTÁK IZOLÁLÁSA 23 3.3 DIREKT MESSENGER RNS (MRNS) SZEPARÁLÁS CSONTSZÖVETBŐL 24 24 3.4 DNS SZEPARÁLÁS PERIFÁRIÁS VÉRBŐL 3.5 A VIZSGÁLT GÉNEK KIVÁLASZTÁSA A GÉNEXPRESSZIÓS ANALÍZISEKHEZ, KVANTITATÍV VALÓS IDEJŰ RT-PCR ÉS A VIZSGÁLATI CSOPORTOK STATISZTIKAI 25 ÖSSZEHASONLÍTÁSA 3.6 GÉNEK ÉS SNP-K KIVÁLASZTÁSA A GENOMIKAI ANALÍZISEKHEZ, GENOTIPIZÁLÁS 27 3.7 TÖBBVÁLTOZÓS TRANSZKRIPTOMIKAI ADATELEMZÉSEK 29 3.7.1 Diszkriminancia analízis (DFA) 29 3.7.2 Főkomponens analízis (PCA) 30 31 3.8 A GENOMIKAI VIZSGÁLATOKHOZ FELHASZNÁLT STATISZTIKAI MÓDSZEREK 3.8.1 Leíró statisztikai módszerek 31 3.8.2 Elemző statisztikai módszerek 31 3.9 A GLÜKOKORTIKOID INDUKÁLTA CSONTVESZTÉS VIZSGÁLATÁHOZ HASZNÁLT CSONTSEJT KULTÚRÁK, SEJT ÉLETKÉPESSÉGI TESZTEK, KEZELÉSEK 32 3.10 FLUORESZCENCIA AKTIVÁLTA ÁRAMLÁSI CITOMETRIA (FACS) ÉS PÁSZTÁZÓ LÉZERES KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA 32 3.11 TOTÁL RNS PREPARÁLÁS, MENNYISÉGI VALÓS IDEJŰ POLIMERIZÁCIÓS LÁNCREAKCIÓ ÉS AZ ADATOK STATISZTIKAI ÉRTÉKELÉSE 33 3.12 A BMP-8 FEHÉRJE W ESTERN BLOT ANALÍZISE 36 3.13 GÉNCSENDESÍTÉS, SIRNS KEZELÉS 37 4

EREDMÉNYEK

38

2

4.1

POSTMENOPAUSAS ÉS PREMENOPAUSAS NEM OSTEOPOROTIKUS NŐK CSONTSZÖVETI GÉNEXPRESSZIÓS MINTÁZATÁNAK VIZSGÁLATA EGYVÁLTOZÓS MANNWHITNEY U TESZT SEGÍTSÉGÉVEL 4.2 POSTMENOPAUSAS ÉS PREMENOPAUSAS NEM OSTEOPOROTIKUS NŐK CSONTSZÖVETI GÉNEXPRESSZIÓS MINTÁZATÁNAK VIZSGÁLATA TÖBBVÁLTOZÓS STATISZTIKAI ANALÍZISEK SEGÍTSÉGÉVEL

4.2.1 Diszkriminancia analízis (DFA) 4.2.2 Főkomponens analízis (PCA) 4.3 AZ IMMUNRENDSZER MŰKÖDÉSÉT SZABÁLYOZÓ GÉNEK EXPRESSZIÓS VÁLTOZÁSAINAK VALÓS IDEJŰ RT-PCR VIZSGÁLATA POSTMENOPAUSAS CSONTSZÖVETBEN

4.3.1 Egyváltozós Mann-Whitney U teszt alapú statisztikai elemzés 4.3.2 Többváltozós diszkriminancia analízis 4.4 ÚJ GÉNPOLIMORFIZMUSOK ÖSSZEFÜGGÉSE A POSTMENOPAUSALIS

38 40 40 42 45 45 50

52 4.4.1 A vizsgálat egyes paramétereit leíró statisztikai analízisek eredményei 52 4.4.2 Asszociációs vizsgálatok 52 4.5 A GLÜKOKORTIKOID INDUKÁLTA CSONTVESZTÉS IN VITRO VIZSGÁLATA 55 4.5.1 Sejtéletképesség mérések és FACS eredmények 55 4.5.2 A DEX hatása a génexpressziós profilra MC3T3-E1 és calvaria osteoblastokon 57 4.5.3 A BMP-8 fehérje Western blot analízise 64 4.5.4 A BMP-8 gén kifejeződésének gátlása / géncsendesítés siRNS rendszer felhasználásával 64 CSONTVESZTÉSSEL

5

MEGBESZÉLÉS

66

5.1

A MENOPAUSA HATÁSA A CSONTSZÖVET KOMPLEX GÉNEXPRESSZIÓS MINTÁZATÁRA POSTMENOPAUSALIS VS. PREMENOPAUSALIS NŐKBEN

66 5.1.1 Az immunológiai mechanizmusok szabályozásában szerepet játszó gének eltérő csontszöveti kifejeződésének azonosítása postmenopausas nőkben 69 5.2 ÚJ KANDIDÁNS GÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE A MENOPAUSAT KÖVETŐ CSONTVESZTÉSSEL 70 5.3 A GLÜKOKORTIKOID INDUKÁLTA IN VITRO GÉNEXPRESSZIÓS VÁLTOZÁSOK CSONTSEJTEKBEN

71 6

KÖVETKEZTETÉSEK

75

7

ÖSSZEFOGLALÁS

77

8

SUMMARY

79

9

IRODALOMJEGYZÉK

81

10

SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE

93

10.1 10.2 10.3

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁVAL ÖSSZEFÜGGŐ SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE TOVÁBBI SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE IDÉZHETŐ ABSZTRAKTOK

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

93 94 97 100

3

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE α-MEM

α-minimum essential medium

Akt/PKB

Akt/protein kinase B

ALPL

alkalikus foszfatáz

AP-1

activating protein-1

BGLAP

bone gamma-carboxyglutamate protein, osteocalcin

BMD

bone mineral density, csontsűrűség

BMI

body mass index

BMP

bone morphogenetic protein, csont morfogenetikus fehérje

BMPR

bone morphogenetic protein receptor

BMU

basic multicell unit

COL

kollagén

DEX

dexametazon

DFA

discriminant function analysis, diszkriminancia analízis

DMSO

dimetil-szulfoxid

ECM

extracelluláris mátrix

EGFR

epidermális növekedési faktor receptor

ER

ösztrogén receptor

ERK

extracellular signal-regulated kinase

FABP3

fatty acid binding protein 3, zsírsavkötő fehérje 3

FACS

fluoreszcencia aktiválta áramlási citometria

FGF

fibroblast növekedési faktor

FGFR1

fibroblast növekedési faktor receptor 1

FITC

fluorescein isothiocyanate

GAPDH

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

GC

glükokortikoid

GH

növekedési hormon

GR

glükokortikoid receptor

GRE

glükokortikoid response element

IGF

inzulin-szerű növekedési faktor

4

IGSF4

immunoglobulin superfamily member 4

IL

interleukin

MAF

minimal allel frequency

MAPK

mitogen-activated protein kinase

MGP

matrix gamma-carboxyglutamate protein

MMP2

mátrix metalloproteináz 2

NF-κB

nuclear factor kappa B

OPG

osteoprotegerin (TNFRSF11B)

PBS

phosphate buffered saline

PCA

principal components analysis, főkomponens analízis

PDGF

trombocitákból származó növekedési faktor

PPARγ

peroxisome proliferator-activated receptor gamma

PTH

parathormon

PTHR

parathormon receptor

PTHRP

parathormone-related protein

RANK

receptor activator of nuclear factor kappa B (TNFRSF11A)

RANKL

receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (TNFSF11)

Ras

retrovirus-associated DNA sequence

RUNX2

runt-related transcription factor

Smad

cytoplasmic proteins mothers against decapentaplegic

SNP

egypontos nukleotid polimorfizmus

SP7

osterix, sp7 transcription factor

SPARC

osteonectin

TGFβ

transzformáló növekedési faktor béta

TIMP2

tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, mátrix metalloproteinázok

szöveti inhibitora 2 TNFα

tumor necrosis faktor alfa

TNFR

tumor necrosis faktor receptor

TRIB2

tribbles homolog 2

VDR

D-vitamin receptor

VEGF

vaszkuláris endotheliális növekedési faktor

WNT

wingless jelátviteli út

5

1 BEVEZETÉS

1.1 A csontszövet felépítése és funkciója A csontszövet a gerincesekben biztosítja a mechanikai stabilitást, a szervezet vázát adja, lehetővé teszi a mozgást, védi a központi idegrendszert és a mellkasi szerveket. A vérplazma ionizált kalcium- és foszfátkoncentrációjának stabilizálásában a kalciumfelvétel és -ürítés mellett a belső kalcium- és foszfátforgalom meghatározó szerepet játszik. Megfelelő hormonális szabályozás mellett a kalciumhiány vagy kalciumvesztés esetén a vérplazma Ca2+-koncentrációja a csontszövetből pótlódik. A csont felépítésében szerepet játszó sejtek az osteoblastok a mesenchymalis sejtekből differenciálódnak és szintetizálják a csontszövet mátrixállományának makromolekuláit. A csontra jellemző kollagén típus az I. típusú kollagén (COL1). Az ún. minor kollagének (III., V., X. típusok) a COL1-rostok felszínéhez kapcsolódva a kollagénhálózat integritásában játszanak szerepet. A nem kollagén típusú mátrix elemek közé tartoznak a proteoglikán-, a glikoprotein-, és a gamma-karboxilált- fehérjecsaládok tagjai. Ezek a kisméretű mátrixmolekulák a kollagén fibrillumok közti keresztkötések és a sejt-mátrix kapcsolat kialakításáért, fenntartásáért felelősek. Ez az extracelluláris mátrix az osteoblastokkal együtt alkotja az osteoid szövetet, mely a későbbiekben kalcifikálódik (mineralizálódik), és az érett csont mátrixállományát képezi. Az osteoclastok nagyméretű, többmagvú sejtek, és a monocita-macrophag sejtfejlődési vonalhoz tartoznak. Az osteoclast különböző hidrolitikus enzimeket (pl. tartarát rezisztens savi foszfatáz, kollagenázok, mátrix metalloproteinázok) szecernál a környezetébe, ezek a mátrix proteinjeit, proteoglikánjait bontják le. Az osteoclast csontok morfogenezisében, pl. a velőüreg képzésében és a trabekuláris csontszerkezet kialakításában is részt vesz1,2.

6

1.2 A csontátépülés folyamata A felnőttkori csontélettanra a remodelling folyamata jellemző, amely a felnőtt, érett csont folyamatos átépülését jelenti. A remodelling során a csontformáció és reszorpció térben és időben szorosan kapcsoltan zajlik és egészséges szervezetben a két folyamat intenzitása megegyezik. A felnőtt szervezet tehát – ideális esetben – tartani tudja csúcscsonttömegét, miközben a folyamatos remodelling következtében a teljes vázrendszer megújul2. A remodelling folyamata a trabekuláris csontállományban (köbös és lapos csontok, csöves csontok epiphysise) intenzívebben zajlik. A remodelling soksejtű, elemi egységekben (BMU - basic multicell unit) zajlik a csontok periosteális és endocorticális felszínén. A szerves és szervetlen állomány képzése több szinten szabályozott folyamat. A csontállomány termelése és bontása végeredményben a csontsejtek, az osteoblastok, az osteoclastok és az osteocyták jól összehangolt együttműködésének köszönhető (1. ábra).

Csont bontás

Csont építés

Csont

Új Csont 1. ábra: A csontátépülés elemi egysége (Nat Rev Cancer 5 (1):21-28, 2005)

A remodelling legfontosabb eleme az osteoblast-osteoclast kapcsolat, amely a folyamat szabályozási csomópontja. Az aktív osteoblast számos olyan molekulát expresszál és épít az osteoid állományba, amelyek az osteoclastok működésének

következtében, az osteoid állomány degradálódásával felszabadulnak és a csontsejtek érését, működését közvetlenül befolyásolják.

1.3 A csontanyagcserét szabályozó molekulák és jelátviteli rendszerek

1.3.1 RANK/RANKL/OPG rendszer A RANK/RANKL/OPG rendszer kulcsfontosságú a csont élettani folyamatainak szabályozásában3. Az NF-κB receptor aktivátor molekula ligandumát (RANKL) az osteoblast-vonal sejtjei és aktivált T-sejtek is termelik4. A RANKL elősegíti az osteoclast képzést, fúziót, differenciációt, aktivációt és túlélést, ezzel is a csontreszorpció, és a csontvesztés irányába hatva. A RANKL specifikus receptorát, a RANK-ot (NF-κB receptor aktivátor molekula) stimulálja, amely korlátozott számú sejttípusban (progenitor és érett osteoclastok, myeloid-eredetű dendritikus sejtek) expresszálódik. A RANK aktiváció a c-Jun, NF-κB, Akt/PKB útvonalakat is magába foglaló intracelluláris kaszkád beindulásához vezet5,6. Az osteoprotegerin (OPG) RANKL szolubilis, a jelátvitelben szerepet nem játszó receptora, és hasonlóságot mutat a tumor nekrózis faktor receptor szupercsalád több tagjával. Az OPG az osteoclastokban és dendritikus sejtekben expresszálódó – a RANKL specifikus kötéséért felelős – RANK-kal versengve fejti ki hatását7. A RANKL/RANK/OPG rendszer együttesen, egy citokin hálózatot alkotva kulcsszerepet játszik a csontanyagcsere szabályozásában, és az osteoclastok biológiájában8,9 (2. ábra). A remodelling során kiemelt jelentősége van a szöveti RANKL/OPG hányadosnak. Amennyiben az OPG expresszió csökken, vagy a RANKL expresszió megnő, a csontbontás fokozódik, a remodelling egyensúlya a reszorpció irányába billen. Ellentétes hatású az osteoblastok OPG termelésének megnövekedése, vagy az osteoclastok RANK expressziójának csökkenése. Ezen molekulák tudományos elnevezése megváltozott. A TNF szupercsaládban való elhelyezkedésüket reprezentálandó jelenleg a következő neveken találhatjuk meg a genetikai adatbázisokban ez a három molekulát: OPG: TNFRSF11B, RANK: TNFRSF11A,

RANKL:

TNFSF11.

Hasonlóképpen

8

a

napjainkban

megjelenő

szakirodalom zöméhez, jelen dolgozatban a hagyományos, elterjedtebb neveket fogom használni a következőkben.

2. ábra: RANK/RANKL/OPG jelátviteli rendszer (Nature 423, 337-342, 2003)

1.3.2 A csont morfogenetikus protein (BMP) szignalizációs rendszer A BMP-k a transzformáló növekedési faktor β (TGFβ) polipeptid szupercsalád tagjai.

A

csont

morfogenetikus

fehérjék

számos

extraszkeletális

szövetben

expresszálódnak, de a csontszövet szempontjából legfontosabbak a BMP-2, -4, -6, és -7 molekulák. Alapvető funkcióik közé tartozik a mesenchymális sejtek differenciálása az osteoblastikus vonal irányába, elősegítve az osteoblastikus érést és működést. A BMP2 hiányos egér életképtelen, amnion/chorion defektusok miatt; míg a BMP4 null mutáció a 6,5 és 9,5 gesztációs nap között letális, a mesodermális differenciálódás hiánya miatt. A BMP6 null egerekben a sternum elégtelen csontosodása figyelhető meg10. Mind a BMP-2, mind a BMP-4 gén promotere tartalmazza az osteoblastok elköteleződését irányító tanszkripciós faktor, a RUNX2 kötőhelyét. Mindkét molekula fokozza a csontképzést stimuláló inzulinszerű növekedési faktor (IGF1) termelődését. Továbbá a BMP-2 és BMP-7 a mesenchymális őssejtekben indukálja a RUNX2 és egy másik,

9

szintén kritikus osteogén transzkripciós faktor az SP7 expresszióját11. Így az ostoblastogenesis szempontjából kulcsfontosságú szabályozó mechanizmus alakul ki12. A jelátviteli rendszerben I-es és II-es típusú BMP receptorokat (BMRPI, BMPRII) különböztetünk meg (3. ábra). A ligand kötődésekor a BMPRII heterodimert képez az I-es típusú receptorral. A BMPRII-t alkotó kináz aktiválja az I-es típusú kinázt, és elindítja a foszforilációs kaszkádot, amely hatásai a sejtmagba jutva fokozzák, vagy gátolják a célgének transzkripcióját. Az I-es és II-es receptorok a BMP aktiválás előtt homomer és heteromer komplex formában a sejtfelszínen találhatók. A BMP-k kötése a preformált heteromer receptor komplexhez a Smad útvonal aktivációjához vezet10,13. Három Smad osztályt különböztetünk meg; a receptorokhoz kötődő Smad molekulák (Smad-1/5), amelyeket a BMP-k aktiválnak, a komplex formáló Smad (Smad-4), amely a receptor Smad-okkal heterodimereket képezve a célgénhez kötődik. A harmadik csoportot az inhibitor Smadok (Smad-6/7) alkotják, amelyek a foszforiláció megakadályozásán keresztül gátolják a BMP jelátvitelt.

3. ábra: BMP jelátviteli hálózat (Frontiers in Bioscience 14, 1023-1067, 2009)

10

A csont morfogenetikus proteinek multifunkcionális fehérjék, az egyetlen olyan jelátviteli molekulák, melyek képesek de novo csontképzésre. Ez az egyedülálló osteoinduktív tulajdonságuk tette lehetővé terápiás felhasználásukat elsősorban ortopédiai beavatkozások során11,14 (1. táblázat). 1. táblázat: A BMP molekulák klinikai alkalmazása BMP típus

Alkalmazás Különböző ortopédiai és fogászati beavatkozások, pl: csigolyatest

Rekombináns

fúziók, discus degenerációk, csonttörések, fogászati implantációk,

humán BMP-2

avasculáris combfej elhalás (csontfelszínek „bekenése” rekombináns fehérjével, BMP-vel borított implantátumok)

Rekombináns

osteotomia, hosszú csont defektusok, nem gyógyuló törések, porc

humán BMP-7

regeneráció, csigolya fúziók (lokális alkalmazás)

1.3.3 Egyéb lokális citokinek Az osteoblastok által termelt interleukin-1 (IL-1) kettős hatású molekula. Egyfelől serkenti az osteoblastok kollagéntermelését, másfelől részben közvetlenül, részben a reszorpciót fokozó interleukin-6 (IL-6) expressziójának és hatásának erősítésével az osteoclastokat aktiválja. Az IL-6 nagyon erős reszorpciós hatású molekula, és ezt jól példázza, hogy IL-6 illetve IL-1 hiányos egerekben még ovariectomia hatására sem alakul ki csontritkulás. Az interleukin-11 (IL-11) szintén az osteoclastok működését serkenti. A tumor nekrózis faktor (TNF) mindkét sejtre serkentő hatású, tehát a teljes remodelling folyamatát fokozza.

11

1.4 A csontanyagcsere kóros folyamatai, a primer illetve szekunder csontvesztés kialakulásának okai A csontszöveti remodelling összehangoltan működik (coupling), ha a csontbontás és építés mértéke megegyezik. Az összhang felbomlásakor (uncoupling), a túlzott reszorpció következtében nem marad elegendő csontgerenda, melyre új csont rakódhat, vagy az osteoblastok nem képesek teljesen kitölteni a reszorpciós gödröket. A folyamat a csont ásványianyag-tarlamának egyre nagyobb mértékű megfogyatkozásához és végül csontritkulás kialakulásához vezethet2. A csontritkulás kialakulásának valószínűségét két tényező, az élet folyamán elért csúcs csonttömeg és a csontvesztés mértéke határozzák meg (2. táblázat). A csúcscsonttömeget elsősorban genetikai faktorok határozzák meg, ugyanakkor a serdülő- és felnőttkori táplálkozási és fizikai aktivitási szokások, valamint hormonális tényezők is befolyásolják a csontok gyarapodását15. A mozgás hiánya, a finomított élelmiszerek, a túlzottan magas zsír, fehérje és cukor tartalmú táplálékok megakadályozzák a bevitt kalcium felszívódását. A fehérjében dús táplálkozás meggátolja a csontok kalcium felvételét. A kalcium anyagcserét szabályozó hormonok, a D-vitamin hormon rendszer, a növekedési hormon (GH) és az inzulin-szerű növekedési faktorok szerepét is bizonyították a csökkent csonttömeg kialakulásában. A pajzsmirigyhormonok fiziológiásnál nagyobb koncentrációja növeli a csontok reszorpcióját és súlyosbítja a csontvesztést1,2. 2. táblázat: A csontvesztés kockázatát növelő faktorok (Lakatos, P. et al., 2001) Női nem Életkor Ázsiai vagy kaukázusi származás Alacsony BMD Alacsony BMI (< 20 kg/m2) Családban előfordult csípőtáji törés Korábbi osteoporotikus törés Korai menopausa Alacsony Ca-bevitel D-vitamin hiány Dohányzás Alkoholfogyasztás Szteroid kezelés Hosszú immobilizáció, csökkent fizikai aktivitás

1.4.1 Primer, postmenopausas csontvesztés A csontritkulás 60-70%-ban a postmenopausaban lévő nőkben alakul ki. A primer postmenopausas

formában

elsődlegesen

a

csontbontást

serkentő

citokinek

felszaporodása figyelhető meg Postmenopausalis fokozott csontvesztésben először a csigolyák élénk anyagcseréjű trabekuláris állománya változik, így a csigolyák teherbíró képessége csökken, a lemezkék elvékonyodnak, trauma nélkül ék alakúvá válhatnak, összeroppanhatnak. Ma már közismert, hogy a gyulladásos citokinek a postemenopausalis csontvesztés pathogenesisében nagyon fontos szerepet játszanak16,17. A keringő macrophagok

megnövekedett

interleukin-1

(IL-1)

termelését

és

a

plazma

megnövekedett IL-1 koncentrációját írták le ösztrogén hiányos nőkben. Az IL-1 receptor

antagonista

fehérje

képes

lassítani

a

csontvesztést

ovariectomizált

patkányokban. A csont és a csontvelő sejtjeinek interleukin-6 (IL-6) termelése ösztrogén adagolásával gátolható. Azok az egerek, amelyeknek az IL-6 génjét hatástalanították, ovariectomia után nem veszítenek csontot. A prostaglandin E2 a csont képzésének és lebontásának hatásos serkentője és termelődését az ösztrogén hiánya is serkenti. Az insulin-like growth factor I és II (IGF-I és -II) valamint kötőfehérjéik keringő mennyisége és termelődése egyaránt csökken ösztrogén hiányos állapotokban. A primer posztmenopausas csontvesztés patogenetikájánál a citokinek szerepe elsőrendű, míg később dominálni kezd a bélből történő csökkenő Ca felszívódás és a fokozódó Ca vesztés a vizelettel, amik együttesen csökkenő szérum-Ca tendenciához vezetnek. A lecsökkent szérum kálcium triggereli a PTH szekréciót, majd a secunder hyperparathyreosis tovább gyorsítja a csontvesztést a késői menopausaban2.

1.4.2 Szekunder, glükokortikoid indukálta csontvesztés A

csontvesztés

másodlagos

okok

miatt

(egyéb

endokrinológiai,

gasztroenterológiai hematológiai betegségek, vagy gyógyszerek) is kialakulhat, ekkor szekunder osteoporosisról beszélünk. A szekunder csontritkulás egyik leggyakoribb oka a gyógyszer indukálta - és ezen belül is a glükokortikoid indukálta, - csontvesztés. Mivel a glükokortikoidok alkalmazása széleskörű, rendkívül sok indikációjuk van. Napjainkban a nyugati felnőtt lakosság közel 1%-a orális glükokortikoid kezelés alatt áll, ezért számos betegséghez kapcsolódhat másodlagosan csontvesztés. Rheumatoid

13

arthritises betegekben a csípő, csigolya és alkar törések előfordulása 2-5-szörösére nő glükokortikoid terápia mellett, a szteroiddal nem kezeltekhez képest18. Asthmásoknál a csigolya, és a bordatörések előfordulása is emelkedett a hosszú távon orális glükokortikoid terápiára állított betegekben19. Mivel a glükokortikoidok csökkentik az immunrendszer működését, így a transzplantációknál nagy szerepük van a beültetett szervek kilökődésének megakadályozásában. Ezért a szervátültetett betegeknek szintén magas a kockázata az osteoporosis kialakulása szempontjából20. A

glükokortikoid

indukálta

csontvesztés

pathogenesise

komplex

és

multifaktoriális. A glükokortikoidok csontépítésre és -bontásra kifejtett hatásai egyaránt ismertek21

(4-5.

ábra).

A glükokortikoid

receptorok

(GR) megtalálhatók

a

csontsejtekben és több száz gén expresszióját szabályozzák a GC-k a receptorukkal együtt a sejtmagba traszlokálódva közvetlenül az ún. glükokortikoid response element (GRE) szekvenciákon vagy indirekt módon az AP-1 transzkripciós faktoron keresztül22. Fiziológiás koncentrációban fokozzák az osteoblastok differenciálódását, növelik kollagén szintetizáló képességüket. Szintén fiziológiás GC koncentráció szükséges az osteoclastok normális működéséhez. In vitro adatok alapján azonban a glükokortikoidok megemelkedett szuprafiziológiás koncentrációja gátolja az osteoblast proliferációt, differenciálódást, és elősegíti az osteoblast apoptosist, továbbá csökkenti az I-es típusú kollagén, osteocalcin és az inzulin-szerű növekedési faktor 1 aktivitást fokozó IGF-kötő fehérje-3, -5 expresszióját23. Hisztomorfometriai tanulmányok szerint emelkedett számú osteoclast is megfigyelhető a csökkent csontképződés mellett24. Glükokortikoidok szabályozzák számos, a csontépítésre ható lokális citokin, mint a TGFβ, az IGF a kifejeződését is25,26. A glükokortikoidok csökkentik az osteocalcin, az I-es típusú prokollagén C-terminális peptid szintjét a szérumban. A glükokortikoid indukálta csontvesztés celluláris mechanizmusa egyelőre részlegesen ismert. Hosszú glükokortikoid kezelésben részesülők vizsgálata csökkent csont-turnovert, és csökkent csontképzést igazolt. A glükokortikoid kezelés a csontmátrixban és a csontösszetételben is változást eredményezhet, ami meghatározza a csont törékenységét és a törések kockázatát21. A csontképzést illetve az érett osteoblastokat jelző marker, az osteocalcin szupresszálását kimutatták glükokortikoid terápiában27.

A

postmenopausas

csontvesztésben

a

trabekuláris

csonttérfogat

csökkenése a csontreszorpció fokozódásának eredménye lehet, ezzel ellentétben ez a

14

jelenség a glükokortikoid indukálta csontvesztés esetében a csökkent csontképzés miatt van20. Több más tényezőknek is szerepe van a glükokortikoid indukálta csontvesztés létrejöttében, ilyenek pl. a kalcium háztartás szabályozásának változása és szexhormonok. A glükokortikoid használat következtében csökken a bélben a kalcium felszívódás20 és csökken a vesében a kalcium tubularis reabszorpciója is28. A glükokortikoidok gátolják a gonadotropin szekrécióját a hypophysisből, valamint az ösztrogének és androgének szekrécióját az ovariumból és testisből. Tekintettel arra, hogy ezek a hormonok csontvédők, hiányuk felgyorsítja a glükokortikoidok által indukált csontvesztést. A glükokortikoid indukálta csontritkulás a csont és kalciumháztartásra kifejtett közvetlen és közvetett hatások összegeként jön létre (4-5. ábra).

Glükokortikoidok

Közvetlen hatások

Osteoblast proliferáció⇓ funkció⇓

Közvetett hatások

Ca2+⇓, PTH⇑ szekunder hyperparathyreosis

Osteoclast proliferáció⇑ funkció⇑

csontképzés⇓

LH, FSH, ACTH⇓ ↓ szexuálszteroidok⇓

csontbontás⇑

OSTEOPOROSIS

4. ábra: Glükokortikoid indukálta csontvesztés mechanizmusa (J Bone Miner Metab 18:350-352, 2002)

15

glükokortikoidok

↑kalcium ürítés

↓kalcium felszívás

csökkent osteoblast szám, élettartam, funkció

↓szérum kalcium ↓szérum ösztrogén és tesztoszteron

↓szérum tesztoszteron

↑PTH

↓izomtömeg/ izomerő

↑osteoclastok csontbontása

↓osteoblast csontépítés

⇓CSONTTÖMEG

5. ábra: Glükokortikoidok hatása a csonttömegre (Preventive Medicine 36:243-249, 2003)

1.5 A csontvesztésben szerepet játszó génpolimorfizmusok A kalcium metabolizmus és a csontsejtek szabályozásában részt vevő gének tanulmányozása során több mint kétszáz olyan gént azonosítottak már, amelyeknek az osteoporosis kialakulásában illetve a csonttömeg csökkenésében szerepe van. A betegség genetikai hátterében fontos tényezők a kandidáns gének egypontos nukleotid polimorfizmusai (SNP). Számos ilyen genetikai variáns összefüggését írták le a csontdenzitással és a törési rizikóval. Az SNP-k esetében a vizsgálatok egy része funkcionális SNP-ket tanulmányozott, ahol a báziscsere a gén funkciójának

16

(transzkripció, splicing stb.) megváltozását eredményezi és a kódolt mRNS illetve fehérje mennyiségében vagy minőségében kerül a genetikai hatás kifejeződésre. A vizsgálatok másik típusánál a SNP-k segítségével feltérképezték az adott gént, a betegséggel asszociált variánsokat genetikai markerként felhasználva. A kapcsoltsági viszonyok alapján a szignifikáns SNP-k kijelölik azokat a génszakaszokat, amelyeken belül megtalálható az eltérő funkcióhoz vezető variáns. A legfontosabb kandidáns géneket a 3. táblázatban foglaltuk össze. 3. táblázat: Kandidáns gének a csontvesztés patomechanizmusában. (Lazáry, Kósa et al, 2008) Gének neve liporpotein receptorkapcsolt fehérje 5 (LRP5) I. típusú kollagén (COL1) transzformáló növekedési faktor béta (TGFβ)

Funkció

SNP-k kapcsolata a csontvesztéssel

A kanonikus Wnt jelátviteli út ko-receptora. Aktivációját követően a β-katenin regulált gének transzkripciója megnő. Serkenti az osteoblast proliferációt, érést és aktivációt.

1330Val és a 667Met allélok csökkent BMD-vel járnak és növelik a törési rizikót

A csont extracelluláris mátrixának fő szerves alkotóeleme.

Az Sp1 „s” allélja polimorfizmus szignifikánsan növeli a vertebrális törési rizikót és csökkent csontdenzitást eredményez.

Az osteoblastok és az működésének szabályozása.

Számos polimorfizmusát írták le a csontritkulással összefüggésben.

osteoclastok

érésének

és

A BMP2 Ser37Ala polimorfizmusa és a BMP4 Ala152Val variánsa szignifikánsan befolyásolják a csontdenzitást. Régóta vizsgált polimorfzmusai (BsmI, ApaI, TaqI) különböző mértékben befolyásolják a csontdenzitást és a törési rizikót.

csont morfogenetikus proteinek (BMP)

A csontfejlődést és az osteoblastok érését, működését serkentő molekulák.

D-vitamin receptor (VDR)

A D3-vitamin intracelluláris receptoraként gének transzkripcióját szabályozza. Az egészséges csontturnovert serkenti, az osteoblastok és az osteoclastok működésének szabályozásával.

NF-κB receptor aktivátor ligand (RANKL), osteoprotegenin (OPG)

Az OPG a RANKL szolubilis receptoraként gátolja a citokin kapcsolódását a sejtfelszíni receptorához (RANK). A RANKL az osteoclastok aktiválásán keresztül csontreszorpciót indukál.

A RANKL promóter-haplotípusát illetve az OPG polimorfizmusait írták le a csontdenzitással összefüggésben.

ösztrogén recetor alpha (ESR1)

Az ösztrogén intracelluláris receptora. Aktivációja csontvédő hatású az osteoblastok serkentése és a gyulladási citokinek gátlása révén.

XbaI, PvuII SNP-inek és a promóter régióban található TA repeat polimorfizmusnak szerepét írták le számos vizsgálatban.

1.5.1 Új kandidáns gének meghatározása gímszarvas-modell segítségével A gímszarvas, az évenként ismétlődő agancsképzés során képes igen robosztus csontépítő tevékenységre, mely során reverzibilis, fiziológiás osteoporosis alakul ki. Az agancs növekedése egy módosult chondrális csontosodási folyamat29, mely intenzív csontépítést az állat igen rövid idő alatt (május-július) végzi. Ilyenkor a szarvas

17

kalciumban gazdag táplálékot fogyaszt, azonban az ásványi anyag szükségletet nem tudja csupán külső forrásból fedezni, így az agancs-képzéshez szükséges ásványi anyagot saját csontvázából vonja ki, melynek következtében az állatban időszakos, fiziológiás csontvesztés/csontritkulás alakul ki30. A júliustól augusztus végéig eső időszakában történik a kalcium-tartalom visszapótlása a csontvázba (6.1. ábra).

6.1. ábra: Szarvas borda csontok osteoporotikus, regenerálódó/visszapótló és stady state állapotokban. (Molecular Genetics and Genomics 2009 Mar;281(3):301-13)

A ásványianyag-tartalom visszapótlása egyedülálló az élővilágban, pontos mechanizmusát

nem

ismerjük.

Munkacsoportunk

kollaborációja

a

gödöllői

Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpontjának Genetika Intézetével azt a célt tűzte ki, hogy a szarvas agancsfejlődés és visszapótlás genetikai hátterének feltérképezése során megismert, eltérő expressziós mintázattal rendelkező gének humán ortológjait is azonosítsa postmenopausalis csontszövetben. Továbbá ezen új kandidáns gének allélikus variánsainak és a csonttömeg kapcsolatának vizsgálata.

1.6 A postmenopausas csontvesztés immunológiai vonatkozásai Mára már közismert, hogy az immunrendszer és a csontrendszer funkcionális kapcsolatban áll egymással. Sejtalkotóik a csontvelői mikrokörnyezetben interakcióba lépnek és különböző citokinek termelésén illetve jelátviteli mechanizmusokon keresztül részt vesznek egymás szabályozásában4,31. A menopausat követő nemi hormon hiány mind a csontszövet, mind az immunrendszer élettani folyamatait közvetve és közvetlenül egyaránt befolyásolja, megváltoztatva ezzel komplex kölcsönhatásukat. Az immunrendszer szinte valamennyi sejttípusán és csontsejtek felszínén is megtalálhatóak a nemi hormonok receptorai (ösztrogén, progeszteron, androgén receptorok)32,33.

18

Postmenopausas korban szignifikánsan fokozódik a gyulladásos citokinek (interleukin-1, interleukin-6, tumor necrosis faktor) expressziója, amely az aktivált T limfocitákon serkenti a RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa B ligand) kifejeződését és ezáltal a csontbontó osteoclastok érését, aktivitását34. A megemelkedett gyulladásos citokin produkció további következménye, hogy az osteoclastokkal közös hemopoetikus őssejtekből származó granulociták és monociták szám is nő postmenopausalis nőkben35. Számos egyéb citokin szintézise is változik ösztrogéndeficiens állapotban, pl.: az interleukin-7 és interleukin-2 szekréciója egyformán erősödik, amely a T és B sejt vonalak proliferációját serkenti és fokozott csontvesztéshez vezet33. Emellett az általános immunszuppresszáns és csontvédő transzformáló növekedési faktor β (TGFβ) mennyisége csökken34. A citokin mintázat eltéréseinek okán a CD4+/Th limfociták számának redukciója, míg ezzel ellentétben a korai pre-B sejtek expanziója következik be36. Postmenopausaban magasabb az interferon gamma (IFNγ) szintje, amely kulcsfontosságú szerepet játszik az aktivált TNF termelő T sejtek arányának és élettartamának kiterjedésében. A folyamat további eredménye az antigén prezentációs rendszer aktivitásának emelkedése, a dendritikus sejtek és makrofágok funkciójának növekedése, valamint az MHCII molekula expressziójának indukálása34,37.

19

2 CÉLKITŰZÉSEK I. A postmenopausas csontvesztés transzkripciós és genomikai szintű molekuláris genetikai vizsgálata I/a. Postmenopausas nőkből izolált csontszövet minták komplex génexpressziós profil meghatározása Célunk a csontanyagcserében és a csont homeosztázisában nélkülözhetetlen szerepet játszó, előre leválogatott közel 150 kandidáns gén menopausat követő csontszöveti mRNS expressziós mintázatának vizsgálata ABI 7500 kvantitatív valósidejű RT-PCR rendszerben TaqMan Assay felhasználásával. I/b. Postmenopausas nőkből izolált csontszövet minták immunológailag releváns génexpressziós profiljának meghatározása Különböző immunológiai mechanizmusok szabályozásában szerepet játszó gének eltérő csontszöveti kifejeződésének azonosítása postmenopausas nőkben, osteoimmunológiai megközelítésben. I/c. Postmenopausas nők egypontos nukleotid polimorfizmusainak vizsgálata Célunk

új

kandidáns

gének

egypontos

nukleotid

polimorfizmusainak

feltérképezése 353 magyar postmenopausalis nő genetikai mintájában. Annak vizsgálata, hogy a szarvas modellben azonosított és a humán mintákon validált, a csontritkulás pathomechanizmusában potenciális szereppel bíró gének allélikus variánsainak van-e hatása a csontdenzitásra és a törési rizikóra.

II. A glükokortikoid indukálta csontvesztés in vitro génexpressziós hatásai osteoblast sejteken Egy ismert glükokortikoid analóg, a dexametazon a csont fejlődésében, életképességében szerepet játszó gének expressziójára kifejtett hatásának vizsgálta immortalizált egér csontsejtvonal (MC3T3-E1) és egér calvariából izolált osteoblastok felhasználásával. A feltételezhetően szerepet játszó gének további vizsgálata fehérjeszinten és géncsendesítési (gén knock-down, siRNA) kísérletekben.

20

3 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1 Vizsgálati csoportok 3.1.1 Postmenopausas és premenopausas nem osteoporotikus nők vizsgálati csoportja A postmenopausas nem osteoporotikus csoportban (POST csoport) 10 csontmintát

elemeztünk,

osteoporotikus

csoport

míg (PRE

a

kontrollként

csoport)

7

nő

használt

premenopausas

csontmintáját

tartalmazta.

nem A

postmenopausalis nők életkorának medián értéke 55.00 év (tartomány: 47-57). A kontroll premenopausalis nők életkorának medián értéke 52.00 év (tartomány: 50-57). A vizsgált személyek klinikai és labordiagnosztika paramétereit a 4. táblázatban tüntettük fel. Nem találtunk szignifikáns különbségeket a vizsgált POST és PRE csoportok átlag életkorában, csont-ásványianyag tartalmában, dohányzását illetően, bevitt kalcium mennyiségében, alkohol és kávé fogyasztásában, fizikai aktivitásában, illetve nem részesültek semmilyen biológiai terápiában. Azonban erőteljes szignifikáns eltéréseket észleltünk a szérum ösztradiol szintekben (p = 0,0006) és a csontanyagcsere markereinek koncentrációiban, azaz; osteocalcin (p = 0,002) és beta-crosslaps (p = 0,01) értékek esetében a két vizsgálati csoport alkotó nők tekintetében. 4. táblázat: A vizsgálatba bevont postmenopausas és permenopausas nem osteoporotikus nők klinikai és biokémiai adatai.

Kor (év) T-score L1-L4 (SD) Z-score L1-L4 (SD) BMD L1-L4 (g/cm2) T-score teljes femur (SD) Z-score teljes femur (SD) BMD teljes femur (g/cm2) Súly (kg) Magasság (cm) BMI (kg/m2)

Medián (Tartomány) POST PRE nem osteoporotikus nem osteoporotikus (n = 10) (n = 7)

p értékek*

55,00 (47 - 57) -0,6 (-1,5 - 3,9) 0,5 (-1,3 - 3,5) 1,113 (1,025 - 1,652) 0,05 (-1,5 - 1,8) 0,7 (-1,0 - 3,3) 1,052 (0,760 - 1,221) 72,50 (65 - 82) 162,00 (150 - 165) 28,29 (24,77 - 32,03)

0,13 0,47 0,81 0,23 0,74 0,42 0,54 0,06 0,36 0,07

21

52,00 (50 - 57) 0,2 (-0,9 - 1,7) 0,0 (-1,1 - 2,0) 1,298 (1,073 - 1,380) 0,0 (-1,0 - 0,8) 0,4 (-0,7 - 0,9) 0,952 (0,788 - 1,208) 65,00 (58 - 88) 160,00 (151 - 164) 26,03 (22,14 - 38,59)

Sys. vérnyomás (Hgmm) Dia. vérnyomás (Hgmm) Pulzus (/perc) Ösztradiol (pg/ml) Beta-CrossLaps (pg/ml) Osteocalcin (ng/ml) PTH (pg/ml) TSH (µIU/l)

Medián (Tartomány) POST PRE nem osteoporotikus nem osteoporotikus (n = 10) (n = 7)

p értékek*

130,00 (110 - 140) 80,00 (70 - 90) 68,00 (60 - 76) 9,55 (5,0 - 24,3) 335,00 (166,00 - 626,00) 17,15 (12,43 - 29,96) 26,50 (19,00 - 55,00) 1,35 (0,40 - 6,50)

0,07 0,74 0,89 0,0006 0,01 0,002 0,54 0,81

120,00 (110 - 130) 80,00 (80 - 80) 68,00 (64 - 72) 67,10 (47,2 - 245,1) 218,20 (149,00 - 295,00) 11,94 (7,99 - 15,21) 32,40 (15,00 - 51,00) 2,02 (0,64 - 4,22)

*: A valószínűségi adatok (p értékek) a jobb oldali oszlopban a két mintacsoport Mann-Whitney U teszt alapú összehasonlításának eredményei.

3.1.2 Az SNP analízisek vizsgálati csoportja A polimorfizmus vizsgálatokhoz 353 magyar, független mintaválasztásból származó postmenopausalis stádiumú nő vérmintáját gyűjtöttük össze (5. táblázat). A kiválasztott nőkön a Semmelweis Egyetem I. sz. Belgyógyászati Klinikáján csontsűrűség mérés történt kettős energiájú röntgensugár - abszorpciometria (DEXA) segítségével. A BMD értékeket a lumbalis gerinc (L2-L4) és a teljes femur vonatkozásában Lunar Prodigy DXA készülékkel (GE Medical Systems, Diegem, Belgium), a radiust tekintve Norland pDEXA denzitométerrel (CooperSurgical Inc, Trumbull, CT, USA) határoztuk meg. A vizsgálatból kizártuk azokat a résztvevőket, akiknél endokrinológiai vagy egyéb krónikus betegségek gyanúja merült fel, illetve akik hormonpótló terápiában vagy egyéb olyan gyógyszeres kezelésben részesültek, amely befolyásolhatja a csontanyagcserét. Továbbá, nem kerültek bevonásra azok a személyek, akik szérum ALPL, TSH, PTH, 25-OH D-vitamin szintjében a normálértékektől eltérés volt tapasztalható.

22

5. táblázat: A vizsgálatba bevont nők klinikai, denzitometriás és életmódbeli jellemzői. Változók Életkor (év) Menopausalis kor (év) Testmagasság (cm) Testsúly (kg) Testtömeg index (kg/m2) Dohányzás (%) Alkoholfogyasztás (%) Kalcium bevitel (mg/nap) BMD lumbális csigolya (g/cm2) BMD teljes csípő (g/cm2) BMD csukló (g/cm2) A vizsgálati populációban diagnosztizált osteoporosisos betegek (%)

átlag ± szórás (tartomány) 61.6 ± 7.9* 13.5 (1-42) 158.1 (139-176) 68.9 ± 12.1* 27.6 ± 4.5* 45 (12.5%) 16 (4.44%) 642 (350-2000) 0.887 ± 0.176* 0.785 ± 0.168* 0.689 ± 0.161* 198 (55%)

*: A változó eloszlása a Kolmogorov-Smirnov teszt alapján (p>0,05) nem tér el a normál eloszlástól.

3.2 Denzitometria és a humán csontszövet minták izolálása Csontsűrűség mérés a teljes femuron és a lumbális csigolyákon (L1-L4) kettős energiájú röntgensugár - abszorpciometria (DEXA) (DPX-L, Lunar Corp. Madison, WI, USA) segítségével történt, néhány nappal az operációt megelőzően. A csontminták a diagnosztizált III. stádiumú primer osteoarthritist gyógyító műtétet

szolgáló

csípőizületi

totál

endoprotézis

beépítésekor

leforgácsolódott

csontszövet darabok összegyűjtéséből származtak. A primer osteoarthritis minősítése az Amerikai Ortopédsebészeti Társaság (AAOS) ajánlásával a Kellgren-Lawrence-féle rendszer alapján történt38. A betegség a combfejben a mintavételi helyként is szolgáló spongiózus csontállományt nem érintette. Továbbá, radiológiai vizsgálatokkal alátámasztva az arthrosis mértékében nem volt különbség kimutatható a két vizsgálati csoport között. A gyűjtést követően a friss mintákat azonnal alaposan megtisztítottuk a csontvelőtől, illetve egyéb vérszennyeződésektől PBS felhasználásával, majd folyékony nitrogénben tároltuk. A vizsgálat a Semmelweis Egyetem Tudományos és Kutatásetikai Bizottsága által jóváhagyva készült (SOTE-TUKEB 6392-1/2004-1018EKU, SOTETUKEB 33/2008). Minden betegtől – részletes felvilágosítás után – írásos beleegyező nyilatkozatot is kértünk.

23

3.3 Direkt messenger RNS (mRNS) szeparálás csontszövetből A humán csontmintákat (átlagosan 500 mg) folyékony nitrogén alatt elporítottuk Freezer-mill 6750 készülék segítségével (SPEX Certiprep Inc., NJ, USA). Az RNS izolálást Dynabeads Oligo (dt)25 kit (Dynal Biotech ASA, Oslo, Norvégia) felhasználásával végeztük. Az elporított mintához 5 ml lysis/binding puffer adtunk és centrifugáltuk 9000 rpm-el, 15 percig szobahőmérsékleten. A szeparálódott, nukleinsavakat tartalmazó középső réteget 1 ml oligo-dt-vel borított paramagnetikus partikulumokat tartalmazó oldathoz adtuk. Ezután az mRNS-t 2 µl DN-áz I. enzimmel (Promega, Madison, WI, USA) kezeltük 20 percig, 37ºC-on 80 U RN-asin RN-áz inhibitor (Promega) jelenlétében. Az mRNS tisztítását a NucleoSpin RNA Clean-up kit (Macherey-Nagel, Düren, German) kit-ben található puffer szett segítségével a gyártó előírása szerint végeztük. A tisztított mRNS eluálásához 40 µl RN-áz mentes vizet használtunk. A tiszta mRNS minőségét és mennyiségét NanoDrop spektrofotométerrel (Nanodrop Technologies, Montchanin, DE, USA) ellenőriztük 260 / 280 nm hullámhossztartományon. 15 µl humán mRNS-t cDNS-re fordítunk át reverz transzkripció (RT-PCR) során, melyhez 200 U SuperScriptIII RN-áz H reverz transzkriptázt (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, USA), 125 ng random primert (Promega), és 40 U RNaseOUT Ribonukleáz inhibitort (Invitrogen Life Technologies) használtunk 30 µl végtérfogatban.

3.4 DNS szeparálás perifériás vérből A polimorfizmus meghatározásokhoz összegyűjtött 353 résztvevő EDTA-s vérmintájából genomiális DNS-t izoláltunk High Pure PCR Template Purification kit (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germany) felhasználásával gyártó előírásainak megfelelő protokoll szerint. A tisztított DNS minőségét és mennyiségét NanoDrop spektrofotométerrel (Nanodrop Technologies, Montchanin, DE, USA) határoztuk meg. Minden mintát 10 ng/µl DNS végkoncentrációra higítottunk.

24

3.5 A vizsgált gének kiválasztása a génexpressziós analízisekhez, kvantitatív valós idejű RT-PCR és a vizsgálati csoportok statisztikai összehasonlítása Kvantitatív valós idejű RT-PCR módszer alkalmazásával olyan kandidáns géneket vizsgáltunk melyek eltérő génexpressziós aktivitása szerepet játszhat a menopausat követően megváltozott csontszöveti anyagcsere-folyamatok kialakulásában. Előzetes genetikai útvonal analízisek, irodalmi adatok és online adatbázisok (www.pubmed.com, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/OMIM) alapján kiválasztottunk 147 gént a transzkripciós vizsgálatokhoz (6. táblázat). Ezen a gének egy része a TGFβ / BMP jelátviteli útvonalat alkotják, mások a WNT szignál transzdukciós útvonalhoz tartoznak. Továbbá találunk olyan géneket is, amelyek extracelluláris mátrix molekulákat,

extracelluláris

mátrix

bontó

enzimeket,

növekedési

faktorokat,

sejtadhéziós molekulákat, valamint transzkripciós faktorokat kódolnak. Néhány gén kifejeződése az ösztrogén szabályozása alatt áll, illetve génpolimorfizmusaik és a csont ásványianyag-tartalom között összefüggés található. Több gént lehetséges szerepére a szarvason végzett előzetes genetikai analízisek világítottak rá. További néhány gén az alapvető immunológiai mechanizmusok szabályozásában vesz részt. A PCR mérésekhez 2 kontroll gént használtunk (GAPDH, ACTB). 6. táblázat: A postmenopausas humán csontszövet expressziós vizsgálatához összegyűjtött 147 gén listája. ABI Assay ID

Gén szimbólumok

ABI Assay ID

Gén szimbólumok

ABI Assay ID

Gén szimbólumok

Hs00356261_m1 Hs99999903_m1 Hs00153836_m1 Hs00155658_m1 Hs00609608_m1 Hs00758162_m1 Hs00167549_m1 Hs00743063_s1 Hs00155794_m1 Hs00171168_m1 Hs00155939_m1 Hs01587813_g1 Hs00156076_m1 Hs00196183_m1 Hs00154192_m1 Hs00609638_m1 Hs00370078_m1 Hs01629138_s1 Hs00236942_m1

ACP5 ACTB ACVR1 ACVR2 ALOX15 ALPL ANXA1 ANXA2 APOD APOE ATP2A2 BGLAP BGN BMP1 BMP2 BMP3 BMP4 BMP8A BMP8B

Hs00266491_m1 Hs00171962_m1 Hs00154830_m1 Hs00153181_m1 Hs00193306_m1 Hs00186772_m1 Hs00361415_m1 Hs00174860_m1 Hs00230957_m1 Hs00269758_m1 Hs00609791_m1 Hs00181225_m1 Hs00234969_m1 Hs00265254_m1 Hs00266645_m1 Hs00234404_m1 Hs00277509_m1 Hs99999905_m1 Hs00740413_g1

DCN DSPP DUSP9 EGF EGFR EIF3S4 ENO1 / MBP1 ESR1 ESR2 FABP3 FABP4 FASLG FCGR2A FGF1 FGF2 FKBP2 FN1 GAPDH HLA-A

Hs00179899_m1 Hs00233987_m1 Hs00233992_m1 Hs00234422_m1 Hs00233972_m1 Hs00234579_m1 Hs00427183_m1 Hs00751239_s1 Hs00231653_m1 Hs00212076_m1 Hs00273458_m1 Hs00231692_m1 Hs00212206_m1 Hs00428481_m1 Hs00196708_m1 Hs00195432_m1 Hs00183425_m1 Hs00232219_m1 Hs00232068_m1

MGP MMP10 MMP13 MMP2 MMP8 MMP9 MSX1 MSX2 NFKB1 NLK OSTF1 RUNX2 SCARA3 SERF2 SFRS7 SMAD1 SMAD2 SMAD3 SMAD4

25

ABI Assay ID

Gén szimbólumok

ABI Assay ID

Gén szimbólumok

Hs00831730_s1 Hs00176148_m1 Hs00381122_m1 Hs00163811_m1 Hs00383718_m1 Hs00173436_m1 Hs02621496_s1 Hs00169627_m1 Hs00374176_m1 Hs00175478_m1 Hs00199349_m1 Hs00176484_m1 Hs00166657_m1 Hs00266273_m1 Hs00189184_m1 Hs00385388_m1 Hs00266332_m1 Hs00164004_m1 Hs00164099_m1 Hs00156568_m1 Hs00164103_m1 Hs00164150_m1 Hs00609088_m1 Hs00169768_m1 Hs00164310_m1 Hs00156680_m1 Hs00171266_m1 Hs00236884_m1 Hs00170025_m1 Hs00166156_m1

BMPR1A BMPR2 C1QA C3 C5AR1 CASR CD14 CD36 CD40 CD80 CD86 CKB COL10A1 COL11A1 COL12A1 COL14A1 COL15A1 COL1A1 COL1A2 COL2A1 COL3A1 COL4A4 COL5A1 COL5A2 COL7A1 COL9A1 CSF2 CSF3 CTNNB1 CTSK

Hs00734212_m1 Hs00164932_m1 Hs00174143_m1 Hs00153126_m1 Hs00181385_m1 Hs00204937_m1 Hs00174086_m1 Hs00168405_m1 Hs00233688_m1 Hs00174106_m1 Hs00174092_m1 Hs00174097_m1 Hs00158057_m1 Hs00173950_m1 Hs00166237_m1 Hs00174131_m1 Hs00174202_m1 Hs00233682_m1 Hs00174103_m1 Hs00171410_m1 Hs00170103_m1 Hs00235006_m1 Hs00158127_m1 Hs00355885_m1 Hs00174217_m1 Hs00164957_m1 Hs00241497_m1 Hs00183100_m1 Hs00391006_m1 Hs00182031_m1

HLA-DRB1, DRB3 ICAM1 IFNG IGF1 IGF1R IGSF4 IL10 IL12A IL12B IL15 IL-1A IL-1B IL-1RAP IL2RG IL4RA IL-6 IL7 IL7RA IL8 INHA INHBA ITGA1 ITGA2 ITGAM ITGAX ITGB2 KITLG KL LPR4 LRP5

ABI Assay ID

Gén szimbólumok

Hs00228830_m1 Hs00268388_s1 Hs00165814_m1 Hs00541729_m1 Hs00234160_m1 Hs00167093_m1 Hs00181036_m1 Hs00171257_m1 Hs00234244_m1 Hs00234245_m1 Hs00610319_m1 Hs00234253_m1 Hs00234278_m1 Hs00152939_m1 Hs00363670_m1 Hs00864161_g1 Hs00233648_m1 Hs00174128_m1 Hs00200178_m1 Hs00243519_m1 Hs00171068_m1 Hs00222224_m1 Hs00361186_m1 Hs02379973_s1 Hs00174239_m1 Hs00172113_m1 Hs00173626_m1 Hs00183662_m1

SOST SOX4 SOX9 SP7 SPARC SPP1 TCF7L2 TGFB1 TGFB2 TGFB3 TGFBR1 TGFBR2 TIMP2 TLR4 TMSB10 TMSB4X TNC TNF TNFAIP6 TNFSF11 TNFRSF11 TRIB2 TWIST1 TWIST2 VCAM1 VDR VEGF WIF1

A kvantitatív real-time PCR-hez előre megtervezett és validált gén-specifikus TaqMan próba alapú génexpressziós Assayt használtunk az Applied Biosystemstől (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), ahol minden gén-specifikus TaqMan szett tartalmazott egy 5’ irányú és egy 3’ irányú primert, valamint fluoreszcens jelölő molekulákkal ellátott próbát. A PCR reakció 20 µl végtérfogatban zajlott, amely tartalma volt 1 µl cDNS, 10 µl TaqMan 2x Universal PCR Master Mix NoAmpErase UNG (Applied Biosystems), 1 µl validált gén specifikus TaqMan próba 20x (Applied Biosystems) és 8 µl víz. A kiválasztott 147 gén amplifikálásához ABI Prism 7500 valós idejű PCR (Applied Biosystems) rendszert használtunk. Minden gént 3-3 párhuzamos méréssel vizsgáltunk 96 lyukú lemezeken a következő protokoll szerint: első lépésként 10 perc denaturálás 95ºC-on, majd 70 cikluson keresztül 15 másodperc denaturálás 95ºC-on, 1 perc szintézis 60ºC-on. Általános „house-keeping” géneket (GAPDH, ACTB) alkalmaztunk belső kontrollként. A további statisztikai analízisek során a

26

GAPDH szinteket használtuk a normalizált értékek megadásához, mert irodalmi adatok utalnak arra, hogy osteoblast sejtekben az ösztrogén befolyásolja az ACTB gén kifejeződését39. A relatív kvantifikáció kiértékelése az összegyűjtött adatokból (küszöb ciklus számok, Ct) 7500 System SDS software 1.3 (Applied Biosystems) felhasználásával készült. A gén-specifikus mRNS relatív mennyiségét (RQ) a gyártó előírása szerint (Applied Biosystems) az átlag ∆Ct értékekből (cél gén Ct értéke endogén kontroll gén Ct értéke) számítottuk mind a 147 gén esetén (6.2. ábra). A génexpressziós arányokat a postmenopausas és premenopausas nem osteoporotikus csoportokat alkotó személyek RQ értékeiből kalkuláltuk (RQ POST / RQ PRE).

6.2. ábra: ABI Prism 7500 valós idejű PCR amplifikációs görbék egy PCR lemezen.

Az adatok analíziséhez Windows SPSS 13.0.1 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) programot használtunk. A statisztikai analízist egyparaméteres Mann-Whitney U teszt segítségével végeztük. Statisztikailag szignifikánsnak tekintettük azt, ahol a valószínűségi adatok: p ≤ 0,05 értket mutattak.

3.6 Gének és SNP-k kiválasztása a genomikai analízisekhez, genotipizálás Az SNP analízisekhez öt olyan, humán csontszövetben expresszálódó gént (ALPL, MMP2, TIMP2, FGFR1, FABP3) választottunk, amelyek meghatározó szerepet tölthetnek be a csontanyagcserében (7. táblázat). Az NCBI dbSNP adatbázis

27

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP) segítségével optimális GC aránnyal (40-65%) rendelkező 21 SNP-t szelektáltunk a következő kritériumok szerint: a) az automatizált nagy teljesítményű genotipizáló módszer (GenomeLab SNPstream Genotyping System) követelménye, hogy a polimorf allélok esetén C/T vagy A/G nukleotid csere történhet; b) a ritkább allél előfordulási gyakorisága (MAF) > 5%; c) a kaukázusi populációban már validáltak; d) a polimorfizmusok elsősorban a gének funkcionális szakaszaiban (promoter, exon, 3’-UTR vég) forduljanak elő. Az „in silico” kapcsoltsági adatok alapján a genotipizált SNP-k 29%, 80%, 64%, 41% illetve 55%-os mértékben reprezentálják az ALPL, FABP3, FGFR1, MMP2 és TIMP2 gének (és upstream illetve downstream nem kódoló régióik) összes allelikus variánsát r2>0.8 valószínűséggel. 7. táblázat: A genotipizált egypontos nukleotid polimorfizmusok (SNP) leíró statisztikai elemzései. SNP SNP Sikerességi HW azonosítási Allélok SNP pozíciók ráta (%)* p értékek lokalizációk számok G/A chr1:21607931 intron 97.4 0.509 rs871132 ALPL G/A chr1:21612135 intron 100 0.822 rs1256341 alkalikus foszfatáz chr1:21640041 exon(263Y/H) 100 0.086 rs3738099 G/A C/T chr1:31513758 intron 99.1 1.0 rs951545 FABP3 zsírsav-kötő fehérje 3 rs10914367 G/A chr1:31515299 promoter 100 0.716 C/T chr8:38388671 3’ UTR 99.1 0.646 rs13317 G/A chr8:38400815 intron 97.4 0.942 rs3925 FGFR1 chr8:38401451 intron 100 1.0 rs2280846 G/A fibroblast növekedési G/A chr8:38441503 intron 98 0.506 rs6996321 faktor receptor 1 chr8:38446444 promoter 99.1 0.362 rs7825208 G/A chr8:38449100 promoter 100 0.921 rs12677355 C/T G/A chr16:54069038 promoter 100 0.701 rs243866 MMP2 mátrix chr16:54074268 intron 97.7 0.747 rs1030868 C/T metalloproteináz 2 C/T chr16:54081499 intron 99.7 0.919 rs243847 chr17:74364423 intron 99.7 1.0 rs1384364 C/T G/A chr17:74370134 intron 98.8 0.697 rs931227 TIMP2 chr17:74373700 intron 100 0.063 rs9894295 G/A mátrix chr17:74380209 intron 99.7 0.720 rs9900972 G/A metalloproteinázok chr17:74386781 intron 99.7 0.656 rs4796812 C/T szöveti inhibitora 2 100 1.0 chr17:74393298 intron rs4789939 G/A chr17:74441474 promoter 98.8 0.064 rs8066116 C/T *: A sikerességi ráta a genotípusok százalékát jelöli. A HW p-érték a Hardy-Weinberg equilibrium GÉNEK

megállapítására alkalmazott χ2-teszt szignifikancia szintje.

A robosztus genotipizálás a Semmelweis Egyetem SNP Core Facility keretein belül a nagy áteresztőképességű GenomeLab SNPstream Genotyping System (Beckman

28

MAF 0.116 0.305 0.113 0.119 0.166 0.212 0.204 0.082 0.322 0.137 0.350 0.262 0.390 0.317 0.195 0.173 0.122 0.184 0.058 0.133 0.119

Coulter, Fullerton, CA, USA) rendszerben történt. Az automatizált genotipizáló rendszer multiplex polimeráz láncreakcióval (PCR) kapcsolt fluoreszcens jelölésen alapuló, array-rendszerű egybázisos primer extenzió elvén működik40. A genotipizálás lépései a következők voltak: 1) Multiplex PCR a kiválasztott SNP-régiók amplifikálására. 2) Tisztítás (a feleslegben maradt primerek és dNTP emésztése exonukleáz I és shrimp ALPL speciális keverékével). 3) Allél-specifikus, fluoreszcens egy-bázisú primer extenzió. 4) Az extenziós primerek 5’-ragadós végének segítségével a termékeket az ún. SNPware Tag Array plate-hez hibridizáltuk. 5) Az array leolvasása két-színű floreszcens detektálással, a SNPstream Imager szoftverrel. 6) Adatelemzés és genotípus meghatározás a SNPstream szoftverrel. Minden, a multiplex genotipzáláshoz szükséges PCR primert és extenziós primert a Beckman Coulter webalapú primer tervező alkalmazásával (Autoprimer.com, http://www.autoprimer.com) terveztünk. A genotipizáló munkafolyamat Biomek FX Dual Arm system (Beckman Coulter) pipettázó robotok segítségével 384-lyukú plateken zajlott.

3.7 Többváltozós transzkriptomikai adatelemzések

3.7.1 Diszkriminancia analízis (DFA) A diszkriminancia elemzés (Discriminant Function Analysis) segítségével egyes eleve megadott géncsoportok közötti elválások maximalizálhatók. Az elemzés eredményei a kanonikus értékek, amelyek koordinátaként használhatók a térbeli ábrázolás során. Két mintacsoport esetén nem rajzolható fel koordinátarendszer, de a csoportok elválása a kanonikus változók alapján így is felmérhető. Ha a megfigyelések random mintavételezésből származnak, és teljesül a többváltozós normalitás feltétele is, akkor a betegcsoportok elválásának szignifikanciája is értékelhető. Ha ezek a feltételek nem teljesülnek, a betegcsoportok szeparálódásának mértéke akkor is informatív az adatok szerkezetére vonatkozóan. A DFA igen értékes információt szolgáltat arról, hogy a vizsgálati csoportok egymástól való elkülönülését mely gének magyarázzák elsősorban. A módszer problémája azonban, hogy a változók (gének) száma nem haladhatja meg a vizsgált betegek számát. A kritérium alapján a géneket részhalmazokra osztottuk, és az egyes génszettek diszkriminációs erejét külön-külön vizsgáltuk. Így

29

számos géncsoportot definiáltunk különböző osztályozási feltételek alapján. A klasszifikáció szempontjai elsősorban a következők voltak: a Mann-Whitney U teszt eredményi, a gének különböző regulációs útvonalakban (TGFβ, BMP, MAPK, WNT) betöltött szerepe, illetve biológiai funkcióik, lásd bővebben az eredmények c. fejezetben. A számításokat a SYN-TAX 2000 programcsomag felhasználásával készítettük41.

3.7.2 Főkomponens analízis (PCA) A főkomponens analízis (Principal Components Analysis) egy standard technika, amely széles körben alkalmazható az orvosbiológiai kutatásokban, különösen microarray és egyéb génexpressziós adattömegek statisztikai kiértékelésében42-44. A módszer összegzi a multivariációs adatrendszereket néhány fontos, egymástól független és az eredeti adatstruktúrát jól tükröző dimenzióba, mely dimenziókat komponenseknek nevezünk45,46. Minden komponens az összvariancia egy töredéke. A kvantitatív RTPCR adatok feldolgozása során standardizált PCA metodikát használtunk, vagyis minden változót egyforma súllyal szerepeltettünk az elemzésben. Az eredmények grafikus ábrázolása ordinációs diagramon, illetve kettős szórásdiagramon (biplot) történt. A biplot diagramon a vizsgálati személyeket (objektumok) pontokként, míg a géneket (változók) nyilakként egyszerre tüntettük fel. Az objektumok koordinátáit az eigenvektorokból kapjuk meg, ugyanakkor a gének koordinátáit a változók komponensekkel való korrelációjából számolt értékei adják. Ez az ábrázolásmód megengedi a beteg vs. kontoll mintacsoportok és a gének kórfolyamati jelentőségének egyidejű értékelését. Az egy csoportba tartozó személyek konvex sokszögekbe zárhatók, amely vizualizációs technika alkalmazása egyértelműbbé teszi a csoportok elkülönülését a diagramon45. A PCA szelektálja azokat a géneket, amelyek a leginkább felelőssé tehetők a beteg és kontroll csoportok közötti különbségekért. Scree diagram segítségével döntöttük el, hogy egy komponens valóban hasznos információkat foglal magában vagy az csupán véletlenszerű eltérés az adatokban47. Így meghatároztuk azt a töréspontot, ahol az eigenértékek nagyon lassan csökkenni kezdenek. A számításokat a SYN-TAX 2000 programcsomag felhasználásával készítettük41.

30

3.8 A genomikai vizsgálatokhoz felhasznált statisztikai módszerek

3.8.1 Leíró statisztikai módszerek Az adatbázisban a hiányzó genotípusokat a „10-legközlebbi szomszéd módszer” (10-nearest neighbor method) segítségével determináltuk a genotipizálási hibákból eredő fals eredmények elkerülése érdekben48. A „Haploview 3.0” (Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA, USA) szoftver segítségével végeztük a genotipizálás leíró elemzését (7. táblázat). A SNP-k közti kapcsoltsági viszonyt (LD) szintén a „Haploview” szoftverrel határoztuk meg. A vizsgálati populációt klinikai és denzitometriás adatok alapján jellemeztük (5. táblázat). A csontdenzitás (BMD) értékre szignifikáns kovariánsokat regressziós analízis segítségével szűrtük ki.

3.8.2 Elemző statisztikai módszerek A humán genetikai asszociációs vizsgálatokat a „PedGenie” szoftver felhasználásával végeztük49. A statisztikai szoftver ANOVA-val ekvivalens elemzést végez három genetikai modellben (additív, domináns, recesszív). Az alkalmazás „Quantitativ” és „OddsRatio” opcióját alkalmaztuk vizsgálatunkban és empirikus pértéket generáltunk 10.000 Monte-Carlo permutációs próba futtatásával. Statisztikailag szignifikánsnak a permutált p-érték 0,05-nél kisebb értékét tekintettük. Az individuális SNP-analízis statisztikai erejét (power of the study) a Quanto szoftver 1.1 verziójával számoltuk ki (University of Southern California, Los Angeles, CA, USA). A genetikai eredményekből haplotípus analízist is végeztünk az R-statisztikai környezetbe épülő „haplo.stats” szoftver felhasználásával. Csúszó-ablak analízis segítségével konstruáltuk a 2, 3 és 4 SNP-ből álló haplotípusokat az egyes géneken belül, majd score-statisztika alkalmazásával határoztuk meg az egyes haplotípusok és a fenotípusok kapcsolatát. A score-statisztika permuált p-értéket számít a globális összefüggés és az egyes haplotípusok szerepének jellemzésére. A haplotípusok egyedi hatását regressziós modellben a szoftverbe épített „haplo.glm” funkcióval határoztuk meg. A regressziós analíziseket az SPSS 15.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, USA) statisztikai szoftverkörnyezetben végeztük.

31

3.9 A glükokortikoid indukálta csontvesztés vizsgálatához használt csontsejt kultúrák, sejt életképességi tesztek, kezelések MC3T3-E1 sejtvonalat az ATCC-től (Rockville,MD, USA) szereztük be és αMEM sejttenyésztő médiumban tartottuk fenn, amit kiegészítettünk 2 mM L-glutamin, 5% FBS és 1% antibiotikum oldattal (Sigma, St. Louis, MO, USA), 37 °C-on, párásított atmoszférában (85% RH) 5% CO2 mellett. A sejttenyésztő médiumot hetente kétszer cseréltük. Az egér MC3T3-E1 preosteoblast sejtek spontán immortalizálódott calvaria sejtekből alakultak ki, melyek széles skáláját fejezik ki különböző osteoblast markereknek (BSP-, BGLAP- PTH-, PTHrP-receptor). Az összes kísérletet a sejtek 815. passzálása között végeztük el. Jelen tanulmányban felhasznált konfluens MC3T3-E1 sejteket differenciált osteoblastoknak tekintettük mivel az osteocalcin (késői osteoblast differenciációs marker) jól mérhetően kifejeződött bennük (saját RT-PCR eredmények, adatokat nem közlünk). Normál egér calvaria osteoblastokat újszülött egér calvariaból izoláltunk, egy előzetesesen publikált, jól karakterizált technika segítségével50. A sejttenyésztő kondíciók megegyeztek az MC3T3-E1 sejtvonal esetében leírtakkal. A dexametazont (DEX) a Sigmától (St. Louis, MO, USA) szereztük be. A DEXt dimethyl sulfoxide-ban (DMSO) oldottuk fel 10 mM koncentrációban, és -20°C-on tároltuk a felhasználásig. A kísérletek előtt a DEX-t felhígítottuk steril sejttenyésztő médiumban és azonnal felhasználtuk a jelzett koncentrációban. Az összes egyéb vegyszert minimum analitikai minőségben használtuk fel. Sejt életképességet a magas érzékenységű CellTiter-Glo assay (Promega, Madison, WI, USA) segítségével mértük, ez a homogén esszé luciferázt használ fel az intracelluláris ATP mérésére.

3.10 Fluoreszcencia aktiválta áramlási citometria (FACS) és pásztázó lézeres konfokális mikroszkópia MC3T3-E1 sejteket 100 mm-es TC petri-csészékre szélesztettük éjjelen át. A sejteket ezután DEX-al kezeltük 2, 6 és 24 órán keresztül. A sejteket 0,25% trypsinEDTA-val (Sigma, St. Louis, MO, USA) arattuk, majd 3x mostuk PBS-ben. A már le nem tapadt, lebegő sejteket is összegyűjtöttük a médium enyhe centrifugálásával. A sejteket kétszer mostuk annexin-kötő pufferben, ami 140 mM NaCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCl2 (pH 7,4) tartalmazott. A sejtéletképesség meghatározásához FACS

32

segítségével a sejteket 100 µl annexin-kötő pufferben szuszpendáltuk fel (2,5 µl annexin V-FITC, 115 µg/ml, Sigma, 0,25 µg propidium iodide, PI), majd 15 percen keresztül szobahőmérsékleten, sötét helyen inkubáltuk. A mérés előtt 400 µl annexin-kötő puffert adtunk a sejtekhez. A sejteket forward scatter eljárással analizáltuk, az annexin V-FITC jelölést 530+/-15 nm-en mértük az FL-1 csatornán, míg a PI festődést 675+/-25 nm-en az FL-3 csatornán. Az analízist FACS Calibur áramlási citométeren (Beckton Dickinson, Mansfield, MA, USA) végeztük el, az adatok kiértékelését a CellQuest szoftverrel (Beckton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA) végeztük el. A pásztázó lézeres konfokális mikroszkópos vizsgálatokat Olympus FluoView 500 rendszeren végeztük el.

3.11 Totál RNS preparálás, mennyiségi valós idejű polimerizációs láncreakció és az adatok statisztikai értékelése A 100 mm TC sejttenyésztő lemezekről totál RNS-t izoláltunk spin-column módszerű eljárással, High Pure Total RNA Isolation System (Roche, Indianapolis, IN, USA) segítségével. Mennyiségét és tisztaságát 260/280 nm-en való méréssel határoztuk meg NanoDrop spectrofotometerrel (Nanodrop Technologies, Montchanin, DE, USA). Az RNS-ek integritását ethidium-bromide festett agarózgélen vizsgáltuk meg. Mintánként ötszáz nanogramm totál RNS-t fordítottunk át MMLV reverse transcriptase enzim felhasználásával, a gyártó (Promega, Madison, WI, USA) előírásainak megfelelően, 20 µl térfogatban. Két mikroliter cDNS-t amplifikáltunk valósidejű PCRrel 1x TaqMan universal PCR mastermix (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) segítségével. Az amplifikációkhoz 110 génspecifikus, Taqman próba alapú, előzetesen validált és legyártott Taqman Gene Expression Assay-t (Applied Biosystems) használtunk (8. táblázat) a következő protokollal: 10 perc denaturáció 95 °C-on, majd 45 ciklus 15 mp denaturálás 95 °C-on, 1 perc annealing és lánchosszabbítás 60 °C-on. Az RNS felvitel normalizálására GAPDH-t használtunk housekeeping génként. Minden PCR reakciót legalább három független kísérletben megismételtünk. Minden mintát triplikátunként vizsgáltunk az ABI Prism 7500 real-time PCR rendszeren (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A relatív mennyiségi meghatározásokat 7500 System SDS software 1.3 (Applied Biosystems) segítségével készítettük el.

33

8. táblázat: A glükokortikoid indukálta csontvesztés expressziós vizsgálatához kiválogatott 110 gén Gén szimbólumok Ahsg Alpl Ambn Anxa5 Bgn Bmp1 Bmp2 Bmp3 Bmp4 Bmp5 Bmp6 Bmp7 Bmp8 Bmpr1a Bmpr1b Bmpr2 Calcr Cd36 Cdh11 Col10a1 Col11a1 Col12a1 Col14a1 Col15a1 Col18a1 Col19a1 Col1a1 Col1a2 Col2a1 Col3a1 Col4a1 Col4a2 Col4a3 Col4a4 Col4a5 Col4a6 Col5a1 Col6a1 Col6a2 Col7a1 Col8a1 Col9a1 Col9a3 Comp

Gén nevek Alpha-2-HS-glycoprotein Alkaline phosphatase, liver/bone/kidney Ameloblastin Annexin A5 Biglycan Bone morphogenetic protein 1 Bone morphogenetic protein 2 Bone morphogenetic protein 3 Bone morphogenetic protein 4 Bone morphogenetic protein 5 Bone morphogenetic protein 6 Bone morphogenetic protein 7 Bone morphogenetic protein 8 Bone morphogenetic protein receptor, type 1A Bone morphogenetic protein receptor, type 1B Bone morphogenic protein receptor, type II Calcitonin receptor CD36 antigen Cadherin 11 Collagen, type X, alpha 1 Collagen, type XI, alpha 1 Collagen, type XII, alpha 1 Collagen, type XIV, alpha 1 Collagen, type XV Collagen, type XVIII, alpha 1 Collagen, type XIX, alpha 1 Collagen, type I, alpha 1 Collagen, type I, alpha 2 Collagen, type II, alpha 1 Collagen, type III, alpha 1 Collagen, type IV, alpha 1 Collagen, type IV, alpha 2 Collagen, type IV, alpha 3 Collagen, type IV, alpha 4 Collagen, type IV, alpha 5 Collagen, type IV, alpha 6 Collagen, type V, alpha 1 Collagen, type VI, alpha 1 Collagen, type VI, alpha 2 Collagen, type VII, alpha 1 Collagen, type VIII, alpha 1 Collagen, type IX, alpha 1 Collagen, type IX, alpha 3 Cartilage oligomeric matrix protein

34

ABI Assay azonosítási számok Mm00442674_m1 Mm00475834_m1 Mm00477485_m1 Mm00477537_m1 Mm00455918_m1 Mm00802225_m1 Mm01340178_m1 Mm00557790_m1 Mm00432087_m1 Mm00432091_m1 Mm01332882_m1 Mm00432101_m1 Mm00432109_m1 Mm00477650_m1 Mm03023971_m1 Mm03023976_m1 Mm00432271_m1 Mm01135198_m1 Mm00515462_m1 Mm00487041_m1 Mm00483387_m1 Mm00491889_m1 Mm01195380_m1 Mm00456551_m1 Mm00487131_m1 Mm00483576_m1 Mm00801666_g1 Mm01165187_m1 Mm01309565_m1 Mm00802331_m1 Mm01210125_m1 Mm01216767_m1 Mm01269205_m1 Mm00801552_m1 Mm00801606_m1 Mm01332287_m1 Mm01332581_m1 Mm00487160_m1 Mm00521578_m1 Mm00483818_m1 Mm01344185_m1 Mm00483834_m1 Mm00658509_m1 Mm00489490_m1

Gén szimbólumok Csf2 Csf3 Ctsk Dcn Dmp1 Dspp Egf Enam Fgf1 Fgf2 Fgf3 Fgfr1 Fgfr2 Fgfr3 Flt1 Fn1 Gapdh Gdf10 Ibsp Icam1 Igf1 Igf1r Itga2 Itga2b Itga3 Itgam Itgav Itgb1 Mgp Mmp10 Mmp13 Mmp2 Mmp8 Mmp9 Msx1 Nfkb1 Pdgfa Runx2 Scarb1 Serpinh1 Smad1 Smad2 Smad3 Smad4 Smad5 Smad6 Smad7 Smad9 Sost

Gén nevek Colony stimulating factor 2 Colony stimulating factor 3 (granulocyte) Cathepsin K Decorin Dentin matrix protein 1 Dentin sialophosphoprotein Epidermal growth factor Enamelin Fibroblast growth factor 1 Fibroblast growth factor 2 Fibroblast growth factor 3 Fibroblast growth factor receptor 1 Fibroblast growth factor receptor 2 Fibroblast growth factor receptor 3 FMS-like tyrosine kinase 1 Fibronectin 1 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Growth differentiation factor 10 Integrin binding sialoprotein Intercellular adhesion molecule 1 Insulin-like growth factor 1 Insulin-like growth factor I receptor Integrin alpha 2 Integrin alpha 2b Integrin alpha 3 Integrin alpha M Integrin alpha V Integrin beta 1 Matrix Gla protein Matrix metallopeptidase 10 Matrix metallopeptidase 13 Matrix metallopeptidase 2 Matrix metallopeptidase 8 Matrix metallopeptidase 9 Homeobox, msh-like 1 Nuclear factor of kappa light chain gene Platelet derived growth factor, alpha Runt related transcription factor 2 Scavenger receptor class B, member 1 Serine (or cysteine) peptidase inhibitor MAD homolog 1 (Drosophila) MAD homolog 2 (Drosophila) MAD homolog 3 (Drosophila) MAD homolog 4 (Drosophila) MAD homolog 5 (Drosophila) MAD homolog 6 (Drosophila) MAD homolog 7 (Drosophila) MAD homolog 9 (Drosophila) Sclerostin

35

ABI Assay azonosítási számok Mm99999059_m1 Mm00438334_m1 Mm00484036_m1 Mm00514535_m1 Mm00803831_m1 Mm00515666_m1 Mm00438696_m1 Mm00516922_m1 Mm01258325_m1 Mm01285715_m1 Mm00433290_m1 Mm00438923_m1 Mm01269938_m1 Mm00433294_m1 Mm00438971_m1 Mm00692666_m1 Mm99999915_g1 Mm00521349_m1 Mm00492555_m1 Mm00516023_m1 Mm00439560_m1 Mm00802831_m1 Mm00434371_m1 Mm00439768_m1 Mm00442890_m1 Mm01271260_m1 Mm00434506_m1 Mm01253227_m1 Mm00485009_m1 Mm00444630_m1 Mm01168713_m1 Mm00439498_m1 Mm00772335_m1 Mm00600163_m1 Mm00440330_m1 Mm00476379_m1 Mm01205760_m1 Mm00501580_m1 Mm00450234_m1 Mm00438056_m1 Mm00484723_m1 Mm01262399_m1 Mm00489637_m1 Mm03023996_m1 Mm01341688_gH Mm01171378_m1 Mm03023958_m1 Mm00649885_m1 Mm00470479_m1

Gén szimbólumok Sox9 Sparc Spp1 Tfip11 Tgfb1 Tgfb2 Tgfb3 Tgfbr1 Tgfbr2 Tnf Tuft1 Twist1 Twist2 Vcam1 Vdr Vegfa Vegfb Vegfc

Gén nevek SRY-box containing gene 9 Secreted acidic cysteine rich glycoprotein Secreted phosphoprotein 1 Tuftelin interacting protein 11 Transforming growth factor, beta 1 Transforming growth factor, beta 2 Transforming growth factor, beta 3 Transforming growth factor, beta receptor I Transforming growth factor, beta receptor II Tumor necrosis factor Tuftelin 1 Twist gene homolog 1 (Drosophila) Twist homolog 2 (Drosophila) Vascular cell adhesion molecule 1 Vitamin D receptor Vascular endothelial growth factor A Vascular endothelial growth factor B Vascular endothelial growth factor C

ABI Assay azonosítási számok Mm00448840_m1 Mm00486332_m1 Mm00436767_m1 Mm00450654_m1 Mm01178820_m1 Mm01321739_m1 Mm01307950_m1 Mm03024015_m1 Mm03024091_m1 Mm99999068_m1 Mm00449139_m1 Mm00442036_m1 Mm00492147_m1 Mm00449197_m1 Mm00437297_m1 Mm00437306_m1 Mm00442102_m1 Mm01202432_m1

Az adatokat SPSS for Windows, release 13.0.1 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) programcsomaggal végeztük el. A végső adatokat mindig legalább három független mérés eredményeképpen jelenítettük meg. Az eredményeket, amelyek átlag ± standard hibaként (SD) jelennek meg, unpaired Student’s t-teszttel értékeltük ki. Statisztikailag szignifikánsnak tekintettük a 0,05 alatti p értékkel bíró eredményeket.

3.12 A BMP-8 fehérje Western blot analízise Teljes sejtkivonatokat RIPA pufferben készítettük el (1% NP-40, 0,5% Nadeoxycholate, 0,1% SDS és proteázgátló koktél; Sigma, St. Louis, MO, USA). A lizátumokat 21G fecskendőn nyomtuk át, majd az oldhatatlan anyagoktól hűtött asztali centrifugálással szabadultunk meg. Fehérje koncentrációt Bradford esszével határoztuk meg. 100 µg teljes fehérje kivonatot oldottunk fel Laemmli pufferben lágy redukáló kondíció mellett, majd öt perc forralás után 15% illetve 10% SDS-PAGE géleken választottuk el a BMP-8 illetve a beta-actin esetében. Az elválasztott fehérjéket nitrocellulóz membránra transzferáltuk (120 mA, éjszakán át). A membránokat 1% BSA-val blokkoltuk majd az elsődleges antitestekkel inkubáltuk (1 µg/ml anti-BMP-8 vagy 0,2 µg/ml anti-actin, TBST, 4 °C, o/n). Az anti-BMP-8 antitestet az R&D

36

Systems-től (Mineapolis, MN, USA), az anti-b-actin-t a Santa Cruz Biotechnology-től (Santa Cruz, CA, USA) szereztük be. A nem kötött elsődleges antitestek eltávolítása után a membránokat biotinilált kecske-ellenes antitesttel (1:80.000, Sigma, St. Louis, MO, USA) inkubáltuk 45 percen keresztül szobahőmérsékleten. A membránokat streptavidin-HRP konjugátummal kezeltük TBST pufferben 15 percen keresztül szobahőmérsékleten. A fehérje csíkokat ECL-plus Western blotting detection rendszerrel (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden) mutattuk ki. A chemilumineszcens detektálást FluorChem 8900 (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA) készüléken végeztük.

3.13 Géncsendesítés, siRNS kezelés 30 - 50%-os konfluens MC3T3-E1 sejteket siRNS duplexekkel kezeltünk Ambion Silencer siRNA Kit (Applied Biosystems) felhasználásával. Három különböző BMP-8 gén specifikus siRNS-t alkalmaztunk az Applied Biosystems-től (ref. kódok: Ambion siRNA 159881, 159880, 60441). A sejteket 20 nM koncentrációjú BMP-8a, GAPDH specifikus, vagy negatív kontroll siRNS-ekkel transzfektáltuk siPORT NeoFX transzfekciós rendszerben. Az optimális kezelés érdekében a felesleges siRNA duplexek és a transzfektáló rendszer komponenseinek kimosását a gyártók előírása szerint csökkentett szérum tartalmú médiummal (Gibco Opti-MEM I., Invitrogen, CA, USA) végeztük. 24 óra elteltével a csökkentett szérum tartalmú médiumot normál α-MEM sejttenyésztő médiumra cseréltük. A BMP-8 specifikus géncsendesítés 48 órát vett igénybe a 24 órás DEX kezelést követően. Az mRNS szinteket mennyiségi valósidejű RT-PCR rendszerben mértük, az előzőekben részletezett RNS izolálási és valósidejű RT-PCR protokollonak megfelelően.

37

4 EREDMÉNYEK 4.1 Postmenopausas és premenopausas nem osteoporotikus nők csontszöveti génexpressziós mintázatának vizsgálata egyváltozós Mann-Whitney U teszt segítségével A 9. táblázatban foglaltuk össze a szignifikánsan eltérő kifejeződést mutató gének expressziós változására vonatkozó adatait (RQ POST / RQ PRE) 17 nem osteoporotikus nő csontszövetében. A táblázatban szereplő géneket funkcionális osztályozást követően tüntettük fel. Hét kollagén molekula (COL2A1, COL3A1, COL5A1, COL5A2, COL9A1, COL12A1, COL15A1), három nem-kollagén típusú extracelluláris mátrix (ECM) molekula (MGP, BGLAP, FN1) és két szerves mátrix bontó enzim (MMP13, BMP1) génkifejeződési mintázata szignifikánsan nagyobb volt a postmenopausalis stádiumú nem osteoporotikus csontban. Postmenopausas nőkben a közös TGFB/BMP jelátviteli hálózatba tarozó öt gén (BMPR1A, TGFB2, TGFB3, TGFBR2, SMAD4) nagyobb transzkripciós aktivitását észleltük. Ugyanebben a csoportban két nélkülözhetetlen osteoblast specifikus transzkripciós faktor (RUNX2, SP7) és újabb kettő, amely a Wingless útvonalban (TCF7L2) illetve a porcsejtek érésében (SOX9) játszik szerepet, megnövekedett génexpressziós szintet mutatott. Két MAPK (mitogén aktivált protein kináz) kaszkád által szabályozott növekedési faktor génje (PDGFA, FGFR1), valamint két osteoclast stimuláló faktor (TNFSF11/RANKL, IL6) és egy, a differenciálódott osteoblastokat jelző molekula (ALPL) génátíródása is felerősödött a postmenopausas csoportban. Az IGSF4 és a TRIB2 gének kifejeződését elsőként detektáltuk nem osteoporotikus humán csontszövetben. Azt találtuk, hogy ezek a gének nagymértékben expresszálódnak a postmenopausas csoportban. Az ENO1/MBP1 esetén szignifikánsan csökkent géntranszkripciós szintet figyeltünk meg. 9. táblázat: Szignifikánsan megváltozott expressziót mutató 29 gén kvantitatív valósidejű RT-RCR adatainak összefoglalása.

38

Transzkripciós faktorok

TGFB/BMP útvonal

ECM komponensek és bontó enzimek

ABI Assay IDa

Egyéb

Növekedési faktorok

Gén szimbólumokb

Gén nevekb

Expressziós arányokc

p értékekd

Tulajdonság, funkcióe

Hs00156568_m1

COL2A1

Collagen type II alpha 1

8,07

0,02

Extracelluláris mátrix alkotó szerkezeti fehérje

Hs00164103_m1

COL3A1

Collagen type III alpha 1

5,62

0,02

Extracelluláris mátrix alkotó szerkezeti fehérje

Hs00609088_m1

COL5A1

Collagen type V alpha 1

9,60

0,03

Extracelluláris mátrix alkotó szerkezeti fehérje

Hs00169768_m1

COL5A2

Collagen type V alpha 2

4,82

0,02

Extracelluláris mátrix alkotó szerkezeti fehérje

Hs00156680_m1

COL9A1

Collagen type IX alpha 1

5,63

0,04

Extracelluláris mátrix alkotó szerkezeti fehérje

Hs00189184_m1

COL12A1

Collagen type XII alpha 1

5,30

0,02

Sejtadhéziós molekula, extracelluláris szerkezeti fehérje

Hs00266332_m1

COL15A1

Collagen type XV alpha 1

6,59

0,01

Sejtadhéziós molekula, extracelluláris szerkezeti fehérje

Hs00179899_m1

MGP

Matrix gamma-carboxyglutamate (gla) protein

3,28

0,02

Calmodulin szerű fehérje, extracelluláris mátrix szerkezeti fehérje

Hs01587813_g1

BGLAP

Bone gamma-carboxyglutamate (gla) protein, osteocalcin

5,52

0,01

Kalcium-kötő fehérje, extracelluláris mátrix szerkezeti fehérje

Hs00277509_m1

FN1

Fibronectin 1

4,02

0,01

Extracelluláris mátrix-kötő szerkezeti fehérje, endocitózis

Hs00233992_m1

MMP13

Matrix metalloproteinase 13 (collagenase 3)

3,70

0,02

Metalloproteáz, ECM bontás

Hs00196183_m1

BMP1

Bone morphogenetic protein 1

3,12

0,04

TGF-beta szupercsalád tagja, metalloproteáz

Hs00831730_s1

BMPR1A

Bone morphogenetic protein receptor type IA

6,16

0,01

TGF-beta Szerin/Threonin protein kináz receptor

Hs00234244_m1

TGFB2

Transforming growth factor beta 2

3,42

0,04

Jelátviteli molekula, TGF-beta szupercsalád tagja

Hs00234245_m1

TGFB3

Transforming growth factor beta 3

3,70

0,002

Jelátviteli molekula, TGF-beta szupercsalád tagja

Hs00234253_m1

TGFBR2

Transforming growth factor beta receptor II

3,26

0,03

TGF-beta Szerin/Threonin protein kináz receptor

Hs00232068_m1

SMAD4

SMAD, mothers against DPP homolog 4 (Drosophila)

2,59

0,002

Transzkripciós faktor, intracelluláris jelátviteli fehérje

Hs00361415_m1

ENO1 / MBP1

Enolase 1 / C-myc promoter-binding protein

0,53

0,005

Liáz, dehidratáz (glikolízis) / c-myc gén transzkripciós inhihitora

Hs00231692_m1

RUNX2

Runt-related transcription factor 2

2,76

0,01

Transzkripciós faktor, csontvázfejlődés, TGFB/BMP útvnonal

Hs00165814_m1

SOX9

SRY (sex determining region Y)-box 9

9,35

0,04

HMG-box transzkripciós faktor

Hs00541729_m1

SP7

Sp7 transcription factor (osterix)

5,65

0,04

Cink-ujj transzkripciós faktor, osteoblastgenezis

Hs00181036_m1

TCF7L2

Transcription factor 7-like 2 (T-cell specific)

3,02

0,01

HMG-box transzkripciós faktor, WNT szignaling

Hs00234994_m1

PDGFA

Platelet-derived growth factor alpha polypeptide

2,81

0,04

Növekedési faktor

Hs00241111_m1

FGFR1

Fibroblast growth factor receptor 1

3,85

0,005

Tirozin protein kináz receptor

Hs00243519_m1

TNFSF11

Tumor necrosis factor (ligand) superfamily member 11 (RANKL)

21,57

0,01

Citokin, osteoclast fejlődés, aktiváció

Hs00758162_m1

ALPL

Alkaline phosphatase, liver/bone/kidney

2,48

0,02

Foszfatáz enzim, csontvázfejlődés, osteoblast differenciáció

Hs00174131_m1

IL6

Interleukin 6 (interferon beta 2)

7,28

0,02

Gyulladásos citokin, osteoclast aktiváció, érés

Hs00204937_m1

IGSF4

Immunoglobulin superfamily member 4

3,94

0,02

Receptor, biológia szerepe még nem tisztázott

Hs00222224_m1

TRIB2

Tribbles homolog 2 (Drosophila)

2,10

0,02

Protein kináz, MAPK útvonal

39

a

, Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assay azonosítási számok.

b

, A humán gének általánosan elfogadott illetve használt nevei és szimbólumai a “Gene Cards” alapján

(www.genecards.org). c

, Expressziós arányok (RQ POST / RQ PRE).

d,

Mann-Whitney U teszt valószínűségi értékei.

A géneket funkcióik és a csontanyagcserében betöltött fiziológiás szerepük szerint csoportosítva tüntettük fel.

4.2 Postmenopausas és premenopausas nem osteoporotikus nők csontszöveti génexpressziós mintázatának vizsgálata többváltozós statisztikai analízisek segítségével

4.2.1 Diszkriminancia analízis (DFA) Diszkriminancia premenopausas

adatelemzést

csoportot

alkalmaztunk,

multidimenzionális

térben

hogy

a

postmenopausas

elkülönítsük

a

és

csontszöveti

génexpressziós adataik alapján, illetve meghatározzuk azokat a géncsoportokat, amelyek a legnagyobb diszkriminációs képességgel rendelkeznek. Kilenc génhalmazt válogattunk a többváltozós statisztikai analízishez (7. ábra). Az organikus ECM molekulákat (12 gén) és a közös TGFB/BMP útvonal elemeit (5 gén) tartalmazó két csoport szignifikánsan eltérően kifejeződő géneket tartalmazott (p ≤ 0,05); ezeket a Mann-Whitney teszt eredményei alapján válogattuk. Számos csoportot a különböző jelátviteli útvonalak kategorizálásával alakítottunk ki, mint a kanonikus TGFB/activin/nodal útvonal (12 gén)51, BMP kaszkád (9 gén)13, WNT jelátviteli hálózat (6 gén)52-54, növekedési faktorok, melyek MAPK típusú jeltovábbítás során szabályozódnak (9 gén), illetve olyan gének csoportjait, melyek az ösztrogén-receptor alfa (ER-alfa) (13 gén)55-66 vagy az ösztrogén-receptor béta (ER-béta) (16 gén)57,59,61,62,64,67-69 ellenőrzése alatt állnak. A megmaradt csoport hét, a zsíranyagcserében érintett gént tartalmazott. Az ER-béta által szabályozott gének csoportja rendelkezett a legnagyobb megkülönböztető erővel, amely egyértelműen szétválasztotta a post- és premenopausas csoportokat. Az ECM fehérjéket kódoló gének csoportja és a TGFB/activin/nodal szabályozási útvonalhoz kapcsolódó gének szintén erős korrelációt mutattak a kanonikus változóval és a vizsgált nem osteoporotikus nők két csoportjának határozott szétválasztását tették lehetővé. A növekedési faktorok és a BMP kaszkád génjei gyengébb elkülönítő erővel bírtak (7. ábra). 40

POST PRE

BMP útvonal

WNT útvonal

TGFB/activin/nodal útvonal

Növekedési faktorok/MAPK útvonal

Lipid anyagcsere

ER-béta jelátvitel

ER-alfa jelátvitel

TGFB/BMP útvonal (p ≤ 0.05)

ECM (p ≤ 0.05) -12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

6

Gének neve

Korr. KV

TGFB/BMP útvonal (p <= 0.05) Gének Korr. neve KV

BGLAP

0.720

TGFB3

0.981 MMP9

0.250 COL7A1

MGP

0.624

TGFB2

0.723 IGF1

0.079 VEGF

COL15A1

0.520

SMAD4

0.711 VEGF

-0.042 BMP4

-0.154 ALOX15

FN1

0.482

TGFBR2

0.702 BMP4

-0.162 TNF

-0.175 LRP5

0.222 FGF2

COL2A1

0.476

BMPR1A

0.678 TGFB1

-0.188 TGFB1

-0.179 FABP3

-0.183 NFKB1

-0.376

MMP13

0.452

CTNNB1

-0.192 COL11A1

-0.309 APOE

-0.377 EGFR

COL12A1

0.412

BMP2

-0.384 TWIST1

-0.371 CD36

-0.472 PDGFA

COL5A1

0.408

OPG

-0.385 SPP1

-0.412

FGF1

COL3A1

0.381

- MMP13

-0.459 BMP3

-0.426

FGFR1

COL5A2

0.339

PDGFA

-0.461 PDGFA

-0.439

TGFB1

0.186

COL9A1

0.276

TGFB2

-0.545 SOX9

-0.448

INHA

0.136

BMP1

0.238

RUNX2

-0.631 FGF1

-0.480

SMAD3

TGFB3

-0.740 TGFBR2

-0.504

ECM (p <= 0.05)

ER-alfa jelátvitel Gének neve

Korr. KV

ER-béta jelátvitel Gének neve

Korr. KV

Lipid anyagcsere Gének neve

Korr. KV

0.041 FABP4 -0.040 APOD

ALPL

-0.513

TGFB2

-0.525

RUNX2

-0.601

Növekedési faktorok/ MAPK Gének Korr. neve KV

4

TGFB/activin/nodal útvonal Korr. KV

Gének neve

8

10

12

WNT útvonal Gének neve

14

16

BMP útvonal

Korr. KV

Gének neve

Korr. KV

0.384 IGF1

0.082

TGFB3

0.731

TCF7L2

0.878

SMAD4

0.717

0.296 VEGF

-0.044

SMAD4

0.638

LRP4

0.615

BMPR1A

0.570

-0.132

TGFB2

0.536

NLK

0.591

BMP3

-0.303

TGFBR2

0.523

WIF1

0.502

BMP2

0.425

TGFBR1

0.383

CTNNB1

0.252

BMPR2

0.292

-0.424

INHBA

0.375

LRP5

0.219

BMP4

0.179

-0.480

ACVR1

0.363

SMAD1

0.160

-0.523

ACVR2

0.281

BMP8A

0.082

-0.621

SMAD2

0.237

BMP8B

-0.437

0.275 IGF1R

0.481

-0.044

7. ábra: Tíz postmenopausas nem osteoporotikus (POST, fekete rombusz) és hét premenopausalis nem osteoporotikus (PRE, üres rombusz) nő csontszöveti génexpressziós mintázatának diszkriminancia analízise.

A legtökéletesebb szétválás az ER-béta által szabályozott gének esetén állapítható meg. Szintén nagyon éles különbség tapasztalható három géncsoport, az ECM (p ≤ 0,05), TGFB/activin/nodal útvonal és növekedési faktorok/MAPK útvonal esetén is. A kilenc halmazt meghatározó humán gének ”Gene Cards” (www.genecards.org) által elfogadott neveit illetve szimbólumait a korrelációs értékekkel együtt (korreláció a kanonikus 41

változóval, KV) a 7. ábra alatti táblázatban foglaltuk össze.

4.2.2 Főkomponens analízis (PCA) A standardizált PCA első két komponense 32% illetve 20%-át képviselte a teljes variációnak. A további komponenseket (11%-tól kezdődően) kizártuk az értékelésből, mert a scree teszt eredményei alapján ezek csak a véletlenszerű változásokért felelősek (8. ábra). A premenopausas nők - a PRE01 és PRE03 kivételével - mérsékelt génexpressziós aktivitással jellemezhetők, ezért egy relatív kompakt csoportot képeznek az 1-es és 2-es komponensek mentén negatív irányban. A postmenopausas személyek az origó körül, illetve ettől pozitív irányban helyezkednek el a menopausat követő fokozott csontszöveti génműködés következtében (8. ábra). Az 1-es főkomponens mentén a POST05, míg a 2-es főkomponens mentén a POST07 személy elkülönül a postmenopausas csoporttól az erősen emelkedett transzkripciós aktivitása alapján. Emellett a POST06 és POST11 személyek csökkent génexpressziós értékeket mutatnak és a premenopausas minták közé keverednek.

Component 2

15 14 POST07 13 12 11 10 9 8 7 POST01 6 5 POST04 PRE01 4 3 POST02 POST08 POST03 2 1 POST10 0 POST11 -1PRE05 POST06 -2 PRE06 PRE02 -3 PRE07 PRE04 -4 -5 -6 -7 PRE03 -8 -9 -10 -11 -12 -13 -14 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8

Component 1

POST05

10

12

14

16

8. ábra: A PCA diagramon a 17 vizsgált nő pozíciója látható a két főkomponens mentén.

A csontszöveti komplex génexpressziós mintázat alapján a postmenopausalis és 42

premenopausalis fenotípusok elkülönülnek egymástól. A nagyon hasonló transzkripciós aktivitással rendelkező premenopausas nők (fehér PRE) egy diszkrét csoportot képezve elválnak a postmenopausas (fekete POST) nőket magában foglaló halmaztól.

A biplot diagramon a személyek és a gének pozícióját egyszerre tüntettük fel, ahol a gének felé mutató nyilak iránya és hossza a génexpresszió mértékével arányos (9. ábra). Megmutatja, hogy a szignifikánsan (p ≤ 0,05) megváltozott expressziós mintázattal rendelkező géneken kívül mely géneknek lehet még fontos szerepe a csontszövet postmenopausalis és premenopausalis állapotainak éles elkülönítésében. Az extracelluláris mátrix elemei: COL3A1, COL5A1, COL5A2, COL9A1, COL12A1, COL15A1, BGLAP, FN1, MMP13 és további 20 gén (elsősorban a TGFB/BMP jelátviteli útvonal elemei, pl.: BMPR1A, BMPR2, BMP1, BMP2, ACVR1, ACVR2) felelősek a POST07, POST04, POST01, és kisebb mértékben a POST08 személyek elválásáért. Amíg a TGFB2, TGFBR2, RUNX2, SP7, ALPL, SMAD4, COL2A1 és számos egyéb gén (nem kollagén típusú mátrix molekulák, pl.: MGP, SPARC, SPP1, BGN) elhatárolják a POST03 és POST10 személyeket. A lipid metabolizmusban érintett gének (APOE, LRP5, FABP4, FABP3) valamint az ösztrogén receptorok (ESR1, ESR2) mutatnak a POST05, PRE03 nők irányába és a legjobban leírják a pozíciójukat. Az OSTF1, MMP8, ENO1, ICAM1, TMSB4X, CD36 gének kifejeződése pedig negatívan korrelál a kollagén molekulákat kódoló gének átíródásával.

43

15

COL1A2 COL5A2 COL5A1 COL11A1 COL3A1 POST07 COL14A1 BMPR1A COL12A1 ACVR2 ACVR1 CKB BMPR2 MMP13 TNC ALOX15 ATP2A2 BMP2 BMP1 BGLAP FN1 COL15A1 COL1A1

14 13 12 11 10 9 8

TWIST2 COL10A1 SOX9 TGFB3 TNFSF11 TWIST1 POST01 CTSK COL7A1 COL9A1 ANXA2 ITGA1 TGFBR1

7 6

Component 2

5

POST04

TNFRSF11 RUNX2 MGP LPR4 TGFB2 PRE01 SPARC KL SP7 CTNNB1 3 TNFAIP6 IL-6 SOX4 APOD TGFBR2 IGSF4 POST03 POST02POST08 IL-1RAP SMAD4 TCF7L2 2 MMP2 SMAD2 COL2A1 MSX2 1 BMP8A BMP3 INHBA TIMP2 FGF1 SPP1 POST10 NLK 0 POST11 ACP5 FGFR1 COL4A4 ALPL -1 PRE05 BGN PDGFA POST06 ITGA2 INHA CD36 -2 PRE06 EGFR BMP4 PRE07 PRE02 -3 FABP4 IL-1B DCN NFKB1 BMP8B -4 PRE04 LRP5 TRIB2 MSX1 WIF1 FGF2 APOE -5 SMAD3 ESR2 SMAD1 POST05 ICAM1 TMSB4X TGFB1 -6 SOST VDR IGF1 EIF3S4 VEGF -7 ESR1 TNF FKBP2 PRE03 OSTF1 -8 IGF1R FABP3 SFRS7 TMSB10 ENO1 -9 ANXA1 VCAM1 MMP9 SERF2

4

-10 -11 -12

MMP8

-13 -14 -8

-6

-4

-2

0

2

4

Component 1

6

8

10

12

14

16

9. ábra: A PCA biplot ábra a vizsgált személyek és a gének pozícióját egyszerre jeleníti meg.

A premenopausas csontminták alacsonyabb génaktivitással jellemezhetők szinte minden analizált gén tekintetében. Kivételt képeznek a CD36, OSTF1, MMP8, ENO1 és ICAM1 gének, amelyek fokozott expressziót mutatnak a premenopausas állapot irányában. A postmenopausas stádiumban lévő csontszövet különböző mértékben emelkedett transzkripciós profillal rendelkezik. Számos kollagén molekulát kódoló gén (COL1A2, COL5A1, COL5A2, COL11A1, COL12A1, COL14A1) a 2-es főkomponens mentén, illetve néhány növekedési faktor génje (TGFB2, TGFBR2, PDGFA, FGFR1, EGFR) az 1-es főkomponens mentén mutat jelentős génátíródási aktivitást.

44

4.3 Az immunrendszer működését szabályozó gének expressziós változásainak valós idejű RT-PCR vizsgálata postmenopausas csontszövetben

4.3.1 Egyváltozós Mann-Whitney U teszt alapú statisztikai elemzés Az 10. ábrán mutatjuk be a szignifikánsan eltérő kifejeződést mutató 9 gén expressziós változására vonatkozó adatait (RQ POST / RQ PRE) 17 nem osteoporotikus nő csontszövetében. Hat, különböző immunológiai mechanizmusok szabályozásában szerepet játszó gén ötszörös illetve annál nagyobb mértékben megnövekedett expressziós mintázattal rendelkezik a postmenopausas csontban. A transzkripció fokozódásának mértéke a postmenopausas csontban a premenopausas nem osteoporotikus csontszövethez viszonyítva a C3 esetén 5,15-szoros, a CD86 esetén 5,91-szoros, az IL-10 esetén 6,97-szoros, az IL-6 esetén 6,43-szoros a TGFB3 esetén 3,34-szoros, a TNFSF11 esetén pedig 18,49-szoros volt (10. ábra). Három gén kifejeződése csökkent postmenopausalis állapotban. A represszió mértéke a CD14 esetén 18,32-szoros, a HLA-A esetén 8,69-szoros, végül az ITGAM esetén pedig 5,63-szoros volt. 1000,00

POST PRE

GAPDH-hoz viszonyított relatív génexpresszió

100,00 10,00 1,00 0,10 0,01

FS F1 1

FB 3

TN

TG

AM

IT G

IL -6

0 IL -1

LA -A

86

H

CD

14 CD

C 3

0,00

10. ábra: Szignifikánsan megváltozott expressziós mintázatot mutató 9 gén mRNS-ének relatív mennyisége 10 postmenopausalis (fekete oszlop) vs. 7 premenopausalis stádiumú nem osteoporotikus (szürke oszlop) nő csontszövetében log skálán feltüntetve.

45

Az irodalmi adatok alapján válogatott, immunológiailag releváns génekből álló listát és ezek kvantitatív valósidejű RT-PCR adatait - a nem szignifikáns változásokkal együtt illetve a menopausat követő hormonális változások génaktivitásra gyakorolt hatásait a 10. táblázat foglalja össze. 10. táblázat: Immunológiailag releváns gének kvantitatív valós idejű RT-PCR vizsgálatának

eredményei.

46

ABI Assay IDa Hs00153836_m1

Gén szimbólumokb Gén nevekb activin A receptor type I ACVR1

Expressziós arányokc 3.81

p értékekd 0.07

Hs00155658_m1

ACVR2

activin A receptor type II

2.19

0.41

Hs00381122_m1

C1QA

0.25

0.38

E2 kezelést követően megnő a C1q tartalmú immunkomplexek plazma szintje.

C3

complement component 1, q subcomponent, A chain complement component 3

Hs00163811_m1

5.15

0.03

A humán C3 gén ösztrogén-érzékeny szekvenciát (ERE) tartalmaz. HRT hatására postmenopausas nőkben fokozódik a C3 szérum szintje.

Hs00383718_m1

C5AR1

complement component 5a receptor 1

0.99

0.83

Hs02621496_s1

CD14

CD14 molecule

0.05

0.003

Hs00374176_m1

CD40

2.27

0.06

Hs00175478_m1

CD80

0.70

0.87

Kifejeződését az E2 pozitívan szabályozza.

Hs00199349_m1

CD86

5.91

0.02

Kifejeződését az E2 pozitívan szabályozza.

Hs00174860_m1

ESR1

CD40 molecule, TNF receptor superfamily member 5 CD80 molecule, B-lymphocyte activation antigen B7-1 CD86 molecule, B-lymphocyte activation antigen B7-2 estrogen receptor 1 (ER alpha)

Expressziója E2 kezelés hatására fokozódik, azonban az LPS indukálta sejtaktivációt az E2 negatívan szabályozza. E2 és P nagymértékben fokozza a sejtfelszíni kostimulátor CD40 expresszióját DC-n.

0.89

0.66

mRNS expressziója, száma és aktivitása is csökken postmenopausas nők monocitáin és csontszövetében. Intracelluláris koncentrációját az E2 növeli.

Hs00230957_m1

ESR2

estrogen receptor 2 (ER beta)

3.02

0.23

Hs00181225_m1

FASLG

1.56

0.59

Hs00234969_m1

FCGR2A

0.99

0.74

Hs00740413_g1

HLA-A

Fas ligand, CD95 ligand (TNF superfamily, member 6) Fc fragment of IgG, low affinity IIa, receptor (CD32) major histocompatibility complex, class I, A

0.12

0.02

Hs00734212_m1

0.83

0.91

Hs00164932_m1

HLA-DRB1, - major histocompatibility complex, class II, DR beta 1, DR beta 3 DRB3 intercellular adhesion molecule 1 (CD54) ICAM1

0.23

0.91

Hs00174143_m1

IFNG

interferon, gamma

10.05

0.55

Hs00153126_m1

IGF1

insulin-like growth factor 1 (somatomedin C)

0.79

0.23

Hs00171410_m1

INHA

inhibin alpha

1.43

0.33

Hs00170103_m1

Postmenopauzális és női nemi hormon hatások

Promótere ösztrogén-érzékeny szekvenciát (ERE) tartalmaz. E2 hatására génkifejeződése erősödik.

E2, P, activin A és inhibin A hatására egyaránt fokozódik az MHCII molekula kifejeződése DCn. OVX egerekben magas expressziós rátát mutat. HRT alkalmazásával szérum szintje csökken postmenopausas nőkben. P hatására a sejtfelszínen alul-expresszálódik. A menopausat követő HRT kezelés után szérum koncentrációja csökken. Termelődését perifériás mononukleáris sejtekben az FSH és az LH indukálja. Produkcióját az inhibin A szuppresszálja, amelyet az activin A képes visszafordítani. A keringésben lévő mennyiségét az E2 növeli.

INHBA

inhibin beta A

1.49

0.28

Hs00174086_m1

IL-10

interleukin 10

6.97

0.04

Hs00168405_m1

IL-12A

0.03

0.91

Hs00233688_m1

IL-12B

interleukin 12A (natural killer cell stimulatory factor 1) interleukin 12B (natural killer cell stimulatory factor 2)

Intracelluláris szintjét a P emeli. Postmenopausas állapotban szekretált mennyisége kompenzatórikusan megemelkedik, amely HRT kezelést követően csökken. Kifejeződését az activin A negatívan szabályozza. Szekréciója E2 hatására erősödik. P azonban down-regulálja az IL-12 expressziót.

ND

-

Szekréciója E2 hatására erősödik. P azonban down-regulálja az IL-12 expressziót.

47

ABI Assay IDa Hs00174106_m1

Gén szimbólumokb Gén nevekb interleukin 15 IL-15

Expressziós arányokc ND

p értékekd -

Hs00174092_m1

IL-1A

interleukin 1, alpha

ND

-

Hs00174097_m1

IL-1B

interleukin 1, beta

2.26

0.91

Hs00158057_m1

IL-1RAP

interleukin 1 receptor accessory protein

1.62

0.38

Postmenopauzális és női nemi hormon hatások

Fokozott postmenopausas szintje E2 kezelés határára csillapodik. Előalakjából történő képződését az activin A gátolja és antagonizálja az IL-1B inflammatórikus hatását.

Hs00173950_m1

IL-2RG

interleukin 2 receptor, gamma

0.56

0.19

Hs00166237_m1

IL-4RA

interleukin 4 receptor alpha chain

0.89

0.33

Hs00174131_m1

IL-6

interleukin 6 (interferon, beta 2)

6.43

0.04

Szérum koncentrációja postmenopausaban emelkedett értéket mutat, amely HRT-t követően csökken. Biológiai aktivitását az activin A csökkenti, azonban az expresszióját képes fokozni.

Hs00174202_m1

IL-7

interleukin 7

0.36

0.59

mRNS expresszióját az OVX növeli.

Hs00233682_m1

IL-7RA

interleukin 7 receptor alpha chain

1.05

0.33

Hs00174103_m1

IL-8

1.37

0.83

Hs00235006_m1

ITGA1

2.71

0.10

Hs00158127_m1

ITGA2

0.86

0.96

Hs00355885_m1

ITGAM

0.18

0.05

Hs00174217_m1

ITGAX

0.82

0.83

Hs00164957_m1

ITGB2

interleukin 8, chemokine (C-X-C motif) ligand 8 integrin, alpha 1 (CD49A, alpha 1 subunit of VLA-1 receptor) integrin, alpha 2 (CD49B, alpha 2 subunit of VLA-2 receptor) integrin, alpha M (CD11b, complement component 3 receptor 3 subunit) integrin, alpha X (CD11c, complement component 3 receptor 4 subunit) integrin, beta 2 (CD18, complement component 3 receptor 3 and 4 subunit) c-kit ligand, stem cell factor

0.30

0.28

Hs00241497_m1

KITLG

Hs00231653_m1

NFKB1

Hs00212206_m1

Transzkripcióját az activin A és a P is serkenti.

2.10

0.19

1.81

0.13

SCARA3

nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1 (p105) scavenger receptor class A, member 3

2.16

0.07

Hs00171257_m1 Hs00234244_m1

TGFB1 TGFB2

transforming growth factor, beta 1 transforming growth factor, beta 2

1.28 3.01

0.91 0.06

Hs00234245_m1

TGFB3

transforming growth factor, beta 3

3.34

Hs00152939_m1 Hs00174128_m1

TLR4 TNF

toll-like receptor 4 tumor necrosis factor (TNF superfamily, member 2) tumor necrosis factor, alpha-induced protein 6

1.88 1.20

0.006 0.23 0.33

2.22

0.14

tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11b (osteoprotegerin) tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 11 (RANKL)

2.56

0.13

Postmenopausas állapotban szérum szintje emelkedik.

18.49

0.03

E2 hiányos állapotokban felül-expresszólódik. Génátiródása azonban E2 kezelésre downregulálódik.

Hs00200178_m1

TNFAIP6

Hs00171068_m1

TNFRSF11B

Hs00243519_m1

TNFSF11

48

P hatására expressziója visszaszorul. E2 szuprafiziológiás koncentrációban fokozza az aktivitását. OVX egerekben a csontvelői sejtek mRNS mennyisége alacsony. TGFB promóter tartalmaz ösztrogén-érzékeny egységet. Csontvelői és szérum szintje is emelkedik E2 hatására, amely indukálja a TGFB szitézisét. Az E2 gátolja a TLR4 közvetített jelátvitelt. Expresszióját a P up-regulálja. Plazma szintje postmenopausas nőkben magas, E2 adagolást követően lecsökken. Szekrécióját az activin A és az FSH szignifikánsan növeli.

ABI Assay IDa Hs00174239_m1 a

Gén szimbólumokb Gén nevekb vascular cell adhesion molecule 1 VCAM1

Expressziós arányokc 0.80

p értékekd 0.28

Postmenopauzális és női nemi hormon hatások HRT alkalmazásával szérum szintje csökken postmenopausas nőkben. E2 hatására felszíni expressziója gyengül.

, A real time RT-PCR reakciók során használt génspecifikus TaqMan alapú expressziós kitek gyári azonosítási számai.

b

, A gének általánosan elfogadott és használt szimbólumai illetve nevei a standard ”GeneCards” elnevezések alapján (www.genecards.org).

c

, Relatív génexpressziós arányok postmenopausas vs. premenopausas nem osteoporotikus csontszövetben.

(ND: a PCR reakció során jelet nem detektáltunk). d

, Mann-Witney U teszt szignifikancia értékei.

e,

A menopausat követő hormonális változások hatása a táblázatban felsorolt gének és géntermékek funkciójára irodalmi adatok alapján.

Dőlt betűvel szedve jelöltük azon géneket, amelyek esetén az expressziós változás mértéke szignifikáns különbséget mutatott (p ≤ 0.05). A táblázatban használt rövidítések: E2: 17béta-ösztradiol, P: progeszteron, FSH: tüszőserkentő hormon, OVX: ovariectomia, HRT: hormonpótló terápia, LPS: lipopoliszacharid, DC: dendritikus sejt

49

4.3.2 Többváltozós diszkriminancia analízis Diszkriminancia elemzést alkalmaztunk a postmenopausalis és premenopausalis nem osteoporotikus csontszöveti transzkriptomikai mintázatok elkülönítésére, illetve, hogy meghatározzuk mely géncsoportok rendelkeznek a legnagyobb diszkriminációs képességgel. Hat génhalmazt válogattunk le a többváltozós statisztikai analízishez, amelyek lefedik mind az adaptív, mind a természetes immnunrendszer funkcióit (11. ábra). A T és B sejtek aktivációját eredményező immunológiai mechanizmusokhoz 14 illetve 9 gént soroltunk70,71, az antigén preneztációs valamint kostimulációs folyamatokat 13 gén képviseli, a fagocitózist 9 génnel, a gyulladási folyamatokat 7 génnel, míg a komplementrendszer működését 10 génnel jellemeztük72-74. A legerőteljesebb diszkriminációs hatás a T-limfociták működésében, és annak szabályozásában szerepet játszó gének esetén volt azonosítható, mely génhalmaz élesen elválasztotta a POST és PRE csoportokat. Emellett a veleszületett immunitásban (antigén bemutatás és fagocitózis) kulcsfontosságú szerepet betöltő gének expressziós mintázata is megváltozik a postmenopausalis csontban, mely a két csoport határozott elkülönülését teszi lehetővé (11. ábra).

50

- POST - PRE

9 7 5 3 1 -1 -3 -5 -7 -9 -11 -13

T sejt aktiváció Gén CD86 TNFSF11 IL-10 CD40 IFNG IL-6

Korr. KV. 0.579 0.564 0.519 0.442 0.334 0.288

B sejt aktiváció Gén

IL-1B

0.226

CD86 IL-10 CD40 IFNG IL-6 TGFB1 HLADRB1

TGFB1 TNF HLADRB1 CD80 IL-7 IL-12A HLA-A

0.139 0.138

CD80 IL-7

-0.062 -0.127 -0.306 -0.326 -0.664

Korr. KV. 0.638 0.572 0.487 0.368 0.317 0.154 -0.069 -0.140 -0.337

Gyulladási reakció Gén ICAM1 IL-12A IL-8 TNF IL-1B IL-6 IFNG

Komplementrendszer

Korr. KV. 0.570 0.453 -0.104 -0.192 -0.315 -0.401 -0.465

Gén C3 IFNG IL-6 IL-1B TNF C5R1

Korr. KV. 0.529 0.364 0.330 0.254 0.154 -0.003

Fagocitózis Gén TLR4 SCARA3 FCGR2A ITGAX VCAM1 ICAM1

Korr. KV. 0.469 0.344 -0.010 -0.118 -0.129 -0.474

ITGAX

-0.114

ITGAM

-0.515

C1QA ITGAM

-0.453 -0.500

ITGB2 CD14

-0.544 -0.614

ITGB2

-0.528

Antigén prezentáció Gén CD86 TNFSF11 CD40 IFNG TNFRSF11 IL-6

Korr. KV. 0.585 0.569 0.446 0.337 0.330 0.291

IL-1B HLADRB1 VCAM1

-0.063 -0.113

0.229

CD80 IL-12A ICAM1 HLA-A

-0.128 -0.329 -0.414 -0.670

11. ábra: Tíz postmenopausalis (POST, fekete vonal) és hét premenopausalis nem osteoporotikus (PRE, fehér vonal) és nő csontszöveti génexpressziós mintázatának diszkriminancia analízise.

A legtökéletesebb szétválás a T sejt függő immunológiai válaszreakciókat kódoló gének esetén állapítható meg. Szintén egyértelmű különbségtétel tapasztalható két - a veleszületett immunfolyamatok közé sorolható - géncsoport; antigén prezentáció, kostimuláció és fagocitózis vizsgálatán alapulva. A hat halmazt meghatározó humán gének ”Gene Cards” (www.genecards.org) által elfogadott neveit illetve szimbólumait a korrelációs értékekkel együtt (korreláció a kanonikus változóval, KV) a 11. ábra alatti táblázatban foglaltuk össze.

51

4.4 Új génpolimorfizmusok összefüggése a postmenopausalis csontvesztéssel

4.4.1 A vizsgálat egyes paramétereit leíró statisztikai analízisek eredményei A SNPstream képességű genotipizálási módszer technikai pontossága 100%-os volt vizsgálatunkban, azaz a párhuzamosan genotipizált minták eredményeiben nem volt eltérés. A végső adatbázisunk tehát 21 SNP genotípsuát és 353 személy adatait tartalmazta. Ebben az adatbázisban összesen 54 genotípus hiányzott, amelyeket statisztikai módszerrel pótoltunk. Az életkor, a menopausalis kor és a body mass index (BMI) bizonyultak a csontdenzitásra szignifikáns „környezeti” faktornak. A nonvertebrális törési rizikót az életkor, a BMI és a BMD-k befolyásolták szignifikánsan.

4.4.2 Asszociációs vizsgálatok Jelen vizsgálatunkban csak azokat a statisztikailag szignifikáns összefüggéseket fogadtuk el és értelmeztük, ahol a vizsgálat statisztikai ereje 80%-ot meghaladónak bizonyult. A lumbalis BMD-re (mean±SD = 0,887±0,176 g/cm2) vonatkoztatva, MAF = 0,322, p<0,05 a 353 fős mintában 83%-os erősséggel detektálható 0,055 g/cm2-es domináns genetikai hatás. A femur BMD-t (mean±S.D. = 0,785±0,168 g/cm2) tekintve, 82%-os erősséggel tudtunk 0,157 g/cm2-es recesszív genetikai hatást kimutatni MAF = 0,166 esetén. A törési rizikó esetén, a vizsgálati populáció mérete (76 eset – 277 kontoll) 86%-os statisztikai erőt biztosított 2,06-os esélyhányados (O.R.) kimutatására, MAF = 0,184 esetén, domináns modellben. Az FGFR1-ben található rs6996321 SNP szignifikáns kapcsolatot mutatott a lumbalis BMD-vel (a mean BMD±S.E.M. 0,858±0,013; 0,912±0,015 és 0,916±0,029 a G/G, A/G és A/A genotípusok esetén).

A korrigált BMD értékek szignifikáns

különbséget mutattak a domináns genetikai modellben (a korrigált BMD különbségek -0,031±0,011 és 0,031±0,011 g/cm2 voltak a G/G és a A/G+A/A csoportok esetén, p=0,002) (12. ábra). A FABP3-ban található rs10914367 polimorfizmus homozigóta recesszív genotípusa szignifikánsan magasabb BMD-t eredményezett a teljes femur

52

tekintetében (a mean BMD±S.E.M. 0,783±0,009; 0,776±0,028 és 0,945±0,029 volt a G/G, A/G és A/A genotípusokban, míg a korrigált BMD különbségek a recesszív modellben -0,004±0,008 és 0,143±0,037 voltak a G/G+A/G és az A/A csoportokban, p=0,028) (12. ábra). rs6996321 (p=0,002)

Korrigált lumbális BMD

0.050

0.025

0.000

-0.025

-0.050

G/G n=166

A/G + A/A n=187

rs10914367 (p=0,028)

Korigált femur BMD

0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 -0.05 G/G + A/G n=342

A/A n=11

12. ábra: Egyedi SNP-k összefüggése a csontdenzitással.

A „haplo.stats” program segítségével azonosítottunk egy 4 lókuszból (rs13317, rs3925, rs2280846 és rs6996321) felépülő haplotípust az FGFR1 génben, amely szignifikánsan összefüggött a lumbális BMD-vel (a globális összefüggés permutált pértéke 0,007 volt) A gyakori TCGG haplotípus a szignifikánsan alacsonyabb, míg egy ritkább (CTGA) haplotípus a szignifikánsan magasabb BMD prediktorának bizonyult (11. táblázat). Mivel a haplotípust felépítő egyik SNP (rs6996321) önállóan is szignifikáns kapcsolatot mutatott a lumbális csontdenzitással, ezért további elemzéseket

53

végeztünk a haplotípusvizsgálat mélyebb rétegeinek feltárása érdekében. Log-likelihood (valószínűséghányados) analízissel az rs6996321 hatása konstansnak bizonyult az egyes haplotípusokban. Az rs6996321 hatása nem különbözött szignifikáns mértékben a TCG(Ht1-Ht2) és a CTG- (Ht4-Ht3) struktúrákat összehasonlítva (Khi2=2,38, df=2, p>0,25). Szintén összehasonlítottuk a két különböző rs6996321 allél (aláhúzva) hatását az átfedő haplotípusokban, amelyek nem mutattak szignifikáns különbséget a Ht1 (TCGG) és a Ht2 (TCGA) (Khi2=1,48, df=2, p>0,25) illetve a Ht4 (CTGG) és Ht3 (CTGA) (Khi2=5,6, df=2, p>0,05) összevetésekben. A fenti tesztek segítségével bizonyítottuk, hogy az elemzett FGFR1 haplotípus a lumbális BMD önálló genetikai prediktora és a szignifikáns összefüggés nem az rs6996321 egyedi hatását tükrözi. 11. táblázat: Az FGFR1 haplotípus összefüggése a lumbális csontdenzitással Score teszt

GLM modell

p-érték*

Koeficiens±SE

p-érték#

- 2,934

0,003

- 0,032±0,016

0,042

0,206

1,062

0,309

0,023±0,017

0,167

CTGA

0,107

2,595

0,012

0,069±0,022

0,002

Ht4

CTGG

0,083

- 1,121

0,269

- 0,016±0,028

0,568

Ht5

TCAG

0,078

0,964

0,346

0,034±0,026

0,189

Haplotípusok

Szekvenciák

Frekvenciák

Ht1

TCGG

0,506

Ht2

TCGA

Ht3

Hap-Score

Az 5%-nál gyakoribb haplotípusok és a korrigált lumbális BMD-re gyakorolt egyedi hatásuk láthatók a táblázatban, a globális összefüggést jellemző permutált p-érték 0,007 volt. *A score teszt p-értékeit 10000 permutációs próba eredményezte. #A GLM-modelben szereplő p-értékek a regressziós változókra vonatkozó t-statisztika szignifikanciáját jelölik. A haplotípusok egyedi hatását a regressziós koeficiensek demonstrálják.

54

4.5 A glükokortikoid indukálta csontvesztés in vitro vizsgálata 4.5.1 Sejtéletképesség mérések és FACS eredmények Az osteoblastokat különböző koncentrációjú DEX mellett tenyésztettük 16 órán keresztül. A sejtéletképességet lumineszcens, ATP mérésen alapuló módszerrel meghatározva 1,1 ± 0,8 nM EC50 értéket kaptunk MC3T3-E1 és 3,7 ± 2,3 nM calvaria osteoblast sejtek esetében (13. ábra). Ezekben a 16 órás kísérletekben a teljes sejthalál 13-15% volt a kezeletlen kontroll sejtek százalékában kifejezve, de ez az arány szignifikánsan emelkedett az ennél hosszabb idejű DEX kezelések esetében. 16 14

Sejthalál (%)

12 10 8 6 4 2 0 0,001

0,01

0,1

1

10

100

1000

10000

Dexametha sone koncentráció (nM)

13. ábra: Sejtéletképesség meghatározása lumineszcens, ATP alapú módszerrel. Az EC50 érték 1,1±0,8nM és 3,7±2,3nM volt DEX kezelés hatására MC3T3-E1 (■) és calvaria sejtek (□) esetében. A sejteket 96-lyukú sejttenyésztő lemezeken kezeltük különböző koncentrációjú DEX-al 16 órán keresztül. A sejthalált a kezelten kontroll százalékában kifejeztük ki.

Annak eldöntésére, hogy ezek a hatások vajon apoptotikus vagy nekrotikus hatások, fluoreszcencia aktivált áramlási citometrikus (FACS) méréseket alkalmaztunk. Annexin-V-FITC és propidium jodine (PI) festést alkalmaztunk FACS analízisben a sejthalál azonosítására és mennyiségi meghatározására különböző DEX kezelések esetében. Az annexin-V kötődése a sejtmembrán phosphatidyl-serinjeihez korai és karaterisztikus kimutatása az apoptózisnak. A DEX hatását a sejtek életképességére a 14. ábrán ábrázoltuk. Az elhalt sejtek átlaga a kezeletlen kultúrákban 2,7% volt. A DEX

55

koncentrációfüggő (P < 0,01) sejthalált idézett elő, 6,5%, 13,2% és 14,5% sejthalált okozva 5 nM, 1 µM and 10 µM koncentrációban. A konfokális mikroszkópos vizsgálatok is az osteoblast sejtek DEX hatására bekövetkező korai illetve késői apoptotikus folyamatait mutatják (15. ábra).

14. ábra: DEX indukálta sejthalál áramlási citometria analízise MC3T3-E1 sejtvonalon. A kvadránsok: bal-alsó= festetlen sejtek; jobb-alsó= annexin-V kötő sejtek; jobb-felső= annexin-V és PI festett sejtek; bal-felső= PI jelölt sejtek. Kontroll (bal oldali panel) és 1µM DEX kezelt (6 órás kezelés, jobb oldali panel) sejteket mutatunk be.

a,

b,

56

15. ábra: Konfokális lézer-scanning mikroszkópos felvételek: a, Az apoptózis korai fázisában lévő sejtek lefűződő apoptotokis vezikulumokkal a sejtmembrán phosphatidylserin komponenseinek annexin-VFITC kötődése alapján. b, Késői apoptotikus sejtek, amelyek esetén a sejt- és a sejtmagmembrán már kevésbé intakt, ezért a PI képes sejtbe diffundálni és a magi nukleáris állomány megfesteni.

4.5.2 A DEX hatása a génexpressziós profilra MC3T3-E1 és calvaria osteoblastokon A DEX transzkripció moduláló hatását egymással párhuzamosan növesztett, DEX kezelésben részesült és kezeletlen sejtkultúrák eredményeinek összehasonlításával vizsgáltuk. Az osteoblast sejteken kialakuló relatív gén expressziós változásokat 0,1 µM DEX hatására állapítottuk meg, a kezeletlen kontroll sejtek génexpressziós profilját használva kontrolként. A 110 vizsgált gén közül az MC3T3-E1 sejteken 5, míg calvaria sejteken 6 mutatott szignifikánsan megváltozott kifejeződést. Ezek közül 5 gén azonos volt a két osteoblast típus esetében, de találtunk egy génterméket a calvaria sejteken, amit nem sikerült detektálni az immortalizált sejtvonalon. Az izolált calvaria osteoblastok esetében a valósidejű RT-PCR vizsgálatok 6 esetben mutattak idő és koncentrációfüggő változást. A 12. táblázatban mutatjuk be 0,1 µM DEX hatását a génexpresszió profilra. A fokozott expressziót mutató gének a következők voltak: csont morfogenetikus fehérje-4 (BMP-4), és -8 (BMP-8), prokollagén IX alpha 1 (COL9A1) és mátrix metalloproteináz 2 (MMP2), a csökkent expressziót mutató pedig a prokollagén II alpha 1 (COL2A1) és a MAD homolog 3 (Smad3) voltak. Nagymértékben hasonló mintázatot azonosítottunk az MC3T3-E1 sejtek esetében is. Az egyetlen kivétel a prokollagén IX alpha 1 (COL9A1) volt, melynek expresszióját nem sikerült az immortalizált sejtekben kimutatnunk. 12. táblázat: Hat, calvaria sejteken szignifikáns génexpresszió változást mutató gén

0,1 µM/16 óra DEX kezelés hatására. Gén szimbólum BMP-4 BMP-8 COL2A1 COL9A1 MMP2 Smad3

Calvaria osteoblast Átlag SD P érték 1,39 0,11 0,03 14,72 2,42 0,00 0,55 0,12 0,04 1,71 0,19 0,01 1,42 0,15 0,04 0,43 0,05 0,03

57

MC3T3-E1 sejtvonal Átlag SD P érték 1,95 0,14 0,02 51,46 3,84 0,00 0,66 0,11 0,02 n/a n/a n/a 2,16 0,19 0,01 0,36 0,01 0,00

A mennyiségi valósidejű RT-PCR eredményeket a kezelten kontroll sejtek eredményeire normalizáltuk és arányként jelenítettük meg.

Kísérleteinkben két nagyságrendbeli emelkedést tapasztaltunk a BMP-8 mRNS esetében 16 órás DEX kezelés eredményeképpen. A DEX mindkét osteoblast típusú sejt esetében idő és koncentrációfüggő BMP-8 kifejeződés változást indukált. 16 órás DEX kezelés MC3T3-E1 sejteken 10,1x, 51,4x, 77,5x és 73,5x emelkedést idézett elő 0,01 µM, 0,1 µM, 1,0 µM és 10 µM

koncentráció esetében (BMP-8 expresszió, vs.

kezeletlen kontroll). Az összes vizsgált DEX koncentráció esetében időfüggő változást is tapasztaltunk. A DEX hatása magasabb volt az MC3T3-E1 sejteken összehasonlítva az izolált sejtekkel (77,5x vs. 16,8x, 1 µM DEX, 24 óra, P < 0,001). A DEX BMP-8 mRNS kifejeződésre gyakorolt hatását különböző periódusok és koncentráció után ábrázoltuk a 16. ábrán. a, 60

mRNS kifejeződés (a.u.)

50

40 Calvaria

30

MC3T3-E1

20

10

0 UTC

30m

1h

3h

b,

58

5h

24h

90 80

mRNS kifejeződés (a.u.)

70 60 50

Calvaria

40

MC3T3-E1

30 20 10 0 UTC

1e-8M 1e-7M 1e-6M 1e-5M 1e-4M

16. ábra: BMP-8 mRNS relatív expressziója osteoblast sejteken. Az a panelen az időfüggő BMP-8 expresszió változásokat láthatunk (0,1 µM DEX). A b panelen a koncentráció BMP-8 expresszió változásokat láthatunk (16 óra). A BMP-8 relatív expressziókat GAPDH kifejeződésre normalizáltuk majd önkényes skálán ábrázoltuk (a.u.). Az eredmények a kezelten kontroll sejtek eredményeire (UTC) normalizáltak és átlag ± SD formátumúak. A szignifikancia értékeket az adott minta és az UTC között számoltuk (*: P < 0,05, **: P < 0,01).

mRNS expresszió (a.u.)

2,5

2,0

1,5

Calvaria MC3T3

1,0

0,5

0,0 UTC

30m

1h

3h

59

5h

24h

7,0

mRNS expresszió (a.u.)

6,0 5,0 4,0

Calvaria MC3T3

3,0 2,0 1,0 0,0 UTC

1e-8M 1e-7M 1e-6M 1e-5M 1e-4M

17. ábra: Bmp4 BMP-4 mRNS relatív expressziója osteoblast sejteken. Az a panelen az időfüggő BMP-4 expresszió változásokat láthatunk (0,1 µM DEX). A b panelen a koncentráció függvényében láthatóak a BMP-4 expresszió változások (16 óra). A BMP-4 relatív expressziókat is a GAPDH kifejeződésre normalizáltuk majd önkényes skálán ábrázoltuk (a.u.). Az eredmények a kezelten kontroll sejtek eredményeire (UTC) normalizáltak és átlag ± SD formátumúak.

60

mRNS expresszió (a.u.)

2,5

2,0

1,5

Calvaria MC3T3

1,0

0,5

0,0 UTC

30m

1h

3h

5h

24h

mRNS expresszió (a.u.)

2,5

2,0

1,5

Calvaria MC3T3

1,0

0,5

0,0 UTC 1e-8M 1e-7M 1e-6M 1e-5M 1e-4M

18. ábra: MMP2 mRNS relatív expressziója oszteoblaszt sejteken. Az a panelen az idő függvényében (0,1 µM DEX), a b panelen a koncentráció függvényében láthatók az MMP2 expresszió változások (16 óra). Az MMP2 relatív expressziókat GAPDH kifejeződésre nomalizáltuk majd önkényes skálán ábrázoltuk (a.u.). Az eredmények a kezelten kontroll sejtek eredményeire (UTC) normalizáltak és átlag ± SD formátumúak.

61

1,6

mRNS expresszió (a.u.)

1,4 1,2 1,0 Calvaria

0,8

MC3T3

0,6 0,4 0,2 0,0 UTC

30m

1h

3h

5h

24h

1,2

mRNS expresszió (a.u.)

1,0 0,8 Calvaria

0,6

MC3T3

0,4 0,2 0,0 UTC

1e-8M 1e-7M 1e-6M 1e-5M 1e-4M

19. ábra: Smad3 mRNS relatív expressziója oszteoblaszt sejteken. Az a panelen az időfüggő Smad3 expresszió változásokat láthatunk (0,1 µM DEX). A b panelen a koncentrációfüggő Smad3 expresszió változásokat láthatunk (16 óra). A Smad3 relatív expressziókat GAPDH kifejeződésre normalizáltuk majd önkényes skálán ábrázoltuk (a.u.). Az eredmények a kezelten kontroll sejtek eredményeire (UTC) normalizáltak és átlag ± SD formátumúak.

62

1,2

mRNS expresszió (a.u.)

1,0 0,8 Calvaria

0,6

MC3T3

0,4 0,2 0,0 UTC

30m

1h

3h

5h

24h

1,2

mRNS expresszió (a.u.)

1,0 0,8 Calvaria

0,6

MC3T3

0,4 0,2 0,0 UTC

1e-8M 1e-7M 1e-6M 1e-5M 1e-4M

20. ábra: Col2a1 mRNS relatív expressziója oszteoblaszt sejteken. Az a panelen az idő függő Col2a1 expresszió változásokat láthatunk (0,1 µM DEX). A b panelen a koncentráció Col2a1 expresszió változásokat láthatunk (16 óra). A BMP-8 relatív expressziókat GAPDH kifejeződésre normalizáltuk majd önkényes skálán ábrázoltuk (a.u.). Az eredmények a kezelten kontroll sejtek eredményeire (UTC) normalizáltak és átlag ± SD formátumúak.

63

4.5.3 A BMP-8 fehérje Western blot analízise A DEX hatását a BMP-8 kifejeződésre mindkét típusú osteoblast sejten megvizsgáltuk. A DEX erőteljesen stimulálta a BMP-8 fehérje szintézisét. A blottokon egy 16 kDa nagyságú specifikus sávot detektáltuk, amelyet a BMP-8 fehérje monomer formájaként azonosítottunk. 2 napos 10 µM DEX inkubáció után szignifikáns (11szeres) BMP-8 fehérjekoncentráció emelkedést tapasztaltunk (21. ábra).

21. ábra: A DEX stimulálja a BMP-8 fehérje kifejeződését MC3T3-E1 sejteken (Western-blot). A 140 aminosav hosszúságú BMP-8 monomer fehérje molekulasúlya 15,8 kDa. A denzitometrikus értékelés eredménye 1, 3 és 11 volt a kontrol, 1 µM és 10 µM DEX kezelt sejtek esetében.

4.5.4 A BMP-8 gén kifejeződésének gátlása / géncsendesítés siRNS rendszer felhasználásával Kimutattuk a BMP-8 specifikus mRNS 9,7-szeres csökkenését 24 órás 1 nM DEX kezelést követően siRNS módszerrel (22. ábra). Ez a 89%-os BMP-8 specifikus géncsendesítés szignifikánsan növelte az MC3T3-E1 sejtek pusztulását a kontrollhoz képest. A 24 órás DEX kezelés hatására bekövetkező sejthalál 6,9%, 10,8% és 21,9%ról 11,0%, 32,6% és 38.7%-ra növekedett 1, 10, 100 nM DEX jelenlétében a géncsendesítés eredményeként.

64

*

50

* Cell death (%)

40 negative control siRNA

30

Bmp-8 siRNA 20 10 0 1

10

100

DEX concentration (nM)

22. ábra: BMP-8 gén specifikus géncsendesítése fokozza a DEX indukálta sejthalált MC3T3-E1 sejteken. A különdöző DEX koncentrációk mellett előkezelt sejteket BMP-8 specifikus (■) és negatív kontroll (□) siRNS-ekkel transzfektáltuk 20 nM koncentrációban / 48 órát. (*: P < 0,05)

65

5 MEGBESZÉLÉS 5.1 A menopausa hatása a csontszövet komplex génexpressziós mintázatára postmenopausalis vs. premenopausalis nőkben Munkánk során elsőként vizsgáltuk humán post- illetve premenopausas nőkből származó csontszövetek multigénes transzkripciós profilját és mutattunk ki szignifikáns expressziós különbségeket a két állapot között. A vizsgálatainkkal nyert génexpressziós adatok lehetővé tették a postmenopausalis és premenopausalis csontszöveti fenotípus elkülönítését.

A csontszövet-specifikus gének (pl. BGLAP, ALPL, IL6, RANKL)

kifejeződésének ösztrogén hiányában tapasztalt eltéréseire vonatkozó ismeretek mindezidáig főleg ovariectomizált állatmodelleken és sejtkultúrákon végzett vizsgálatok eredményein alapultak75-77. Tanulmányunkban e gének jelentőségét humán csontszövet mintákon validáltuk és meghatároztunk olyan markánsan megváltozott génexpressziós mintázatokat, amelyek a menopausat követően végbemenő és a csontanyagcserét nagyban befolyásoló változásokkal kapcsolatban eddig ismeretlenek voltak (9. és 10. táblázat). Kimutattuk két új, a csontanyagcsere folyamatok vonatkozásában eddig nem ismert gén (TRIB2, IGSF4) túlzott kifejeződését postmenopausas nem osteoporotikus nőkben. A humán TRIB molekulák szelektíven szabályozzák a gyulladásos jelátviteli mechanizmusokat a MAPKK (mitogénaktivált protein kináz kináz) interakciókon keresztül.

Rendelkeznek

’scaffold’-szerű

szignaloszómák térbeli szerveződését

78,79

funkcióval

és

irányítják

a

MAPK

. A TRIB2 gén átíródását a hierarchikus

MAPK kaszkád tagjai (ERK1,2)80 és a pro-inflammatórikus mediátorok (IL-1B)79 egyaránt modulálják. Feltételezzük, hogy az általunk észlelt túlzott TRIB2 expresszió okozhatja a MAPK rendszeren keresztül megvalósuló fokozott csontszöveti gyulladásos reakciókat a postmenopausalis korban. Az IGSF4 egy immunglobulin-szerű intracelluláris adhéziós molekula, amely 2+

Ca -tól független sejt-sejt kölcsönhatásokat közvetít. Az aktin filamentumokhoz asszociációja révén a citoszkeletális jeltovábbításban és a sejtinvázió szabályozásban

66

vesz részt81. Lin és munkatársai82 az IGSF4 gént az ösztrogén-receptor alfa célpontjaként írták le emlőtumor sejtekben. Az IGSF4 gén túlzott termelése erősödő csontsejt adhéziót és migrációt eredményezhet postmenopausas nőkben. Az egyik nélkülözhetetlen osteoblast-specifikus transzkripciós faktor, a RUNX2 (Cbfa1) kifejeződésének mértéke határozottan nagyobb volt a nem osteoporosisos csontszövetben a menopausat követően. A RUNX2 központi szerepet tölt be a csont homeosztázisában83, jelenléte szükséges a közös mesenchymális őssejtek osteoblast irányba

történő

elköteleződéséhez84.

Emellett

számos,

az

osteoblastokra

és

osteoclastokra jellemző gén (BGLAP, ALPL, RANKL, MMP13) működését irányítja85,86, amelyek szintén szignifikánsan megnövekedett expressziós szintet mutattak az általunk vizsgált postmenopausalis csontszövetben (lásd 9. táblázat). A RUNX2 transzkripciós aktivitásának szabályozását összetett jelpályák segítik elő87, amelyek tartalmazzák a növekedési faktorok (mint pl. munkánkban a szignifikáns változást mutató PDGFA és FGFR1) jelátvitelét biztosító MAPK hálózatot, extracelluláris mátrix fehérjéket (a szignifikánsan változást mutató 10 gént a 9. táblázat sorolja fel) és a TGFB/BMP család komponenseit (a szignifikáns változást mutató 5 gént a 9. táblázat sorolja fel) (19. ábra). Ezekben a jeltovábbító rendszerekben a RUNX2 komplex fokozza a célgének átíródását, ami a menopausaban gyors turnoverrel járó csontátépüléshez vezet.

67

RUNX2 COL1A1 ALPL MMP13 OPG BGLAP

BMP2 RANKL

SPP1

TGFb1

23. ábra: A RUNX2 jelátviteli mechanizmusainak összefoglalása.

Egy másik alapvető osteoblast-specifikus transzkripciós faktor, az SP7 (Osterix) expressziója az előzőekhez hasonlóan szintén nagyobb volt postmenopausas nőkben. Az SP7 kulcsfontosságú a funkcionális osteoblastok kialakulásában és a RUNX2 korai differenciálódást szabályozó hatását követően lép az osteoblastogenesis folyamatába88,89. Postmenopausaban az SP7 túlzott kifejeződése fokozhatja az osteoblastok érési és proliferációs tevékenységét. PCA segítségével nagy számban azonosítottunk géneket, amelyeknek szerepe lehet

a

csontszövet

postmenopausas

és

premenopausas

állapotainak

megkülönböztetésében. A transzkripciós mintázat alapján ezek a gének elsősorban növekedési faktorok (TGFB/BMP jelátviteli útvonal, PDGFA, FGFR1, EGFR) és az

68

extracelluláris mátrixot alkotó kollagén molekulák génjei. Ez a megfigyelés alátámasztja a szignifikancia teszt eredményeit, amely segítségével kimutattuk, hogy a COL2A1 és számos keresztkötő kollagén (COL3A1, COL5A1, COL5A2, COL9A1, COL12A1, COL15A1) gén aktivitása szignifikánsan növekszik postmenopausas humán csontszövetben. A minor kollagének, mint a COL3A1, COL5A1 vagy a COL5A2 képezik a csont szerves mátrixának szerkezetét, illetve ezek alkotják azt a központi molekuláris struktúrát, amelyre az I. típusú kollagén polimerizálódik90. A COL9A1 és a COL12A1 periodikusan kapcsolódik az elsődlegesen jelenlévő kollagén rostok (COL1 és COL2) felszínére. Elmondhatjuk, hogy a menopausaval összefüggően megváltozott hormonális állapot fokozza a horizontális összeköttetéseket biztosító minor kollagének átíródását, aminek szerepe lehet a módosult csontszöveti metabolizmusban. A diszkriminancia analízis felfedett olyan, az ösztrogén-receptorok kétféle típusa (ER-béta, ER-alfa) által szabályozott eltérően expresszálódó géneket, melyek segítségével egyértelműen megállapítható a nem osteoporotikus humán csontszövet menopausas állapota (7. ábra). Az ösztrogén-receptorok (elsősorban ER-béta) jelátviteli útjának sérülése és emiatt a nem megfelelő géntranszkripció a csontátépülés megbillent egyensúlyához

vezethet.

A

különféle

extacelluláris

mátrix

fehérjék

és

a

TGFB/activin/nodal pálya jelmolekulái szintén nagy szétválasztó erővel rendelkeznek a két vizsgált csoportot illetően, ami hasznos információ lehet a jövőben (7. ábra).

5.1.1 Az immunológiai mechanizmusok szabályozásában szerepet játszó gének eltérő csontszöveti kifejeződésének azonosítása postmenopausas nőkben Többváltozós diszkriminancia analízis felhasználásával megismertünk néhány, a postmenopausalis

csontban

jellemző

expressziós

mintázattal

rendelkező

immunológiailag fontos géncsoportot (11. ábra). A post- és premenopausas csontfenotípusok legtökéletesebb elválását a T sejtes immunválaszt reprezentáló gének esetén figyelhetjük meg. Általánosan igazolt, hogy a T-limfociták és a csontsejtek működése több ponton is szorosan kapcsolódik egymáshoz pl: az osteoblastok hivatásos antigén prezentáló sejtként működve naív T sejteket aktiválnak91, valamint, az effektor T-limfociták képesek az osteoclastok érését a RANK/RANKL/OPG rendszeren keresztül szabályozni31. Azt találtuk, hogy az antigén prezentációs rendszer több

69

komponensének (adhéziós molekulák, kostimulátorok és citokinek) mRNS átíródása megváltozik postmenopausas nők csontszövetében. Ezen kívül, kimutattuk a betegcsoportok egyértelmű szétválását a fagocitózis markereit kódoló gének expressziós mintázata alapján is. Adataink azt valószínűsítik, hogy a menopausat követően átalakult csontanyagcsere

változásokat

indít

a

nem

fajlagos

védekező

mechanizmus

regulációjában.

5.2 Új kandidáns gének összefüggése a menopausat követő csontvesztéssel A

csúcscsonttömeg

50-85%-ban

genetikailag

determinált.

Család-

és

ikervizsgálatok eredményei a törési rizikót befolyásoló paraméterek (pl.: csontminőség, combnyak geometria, izomerő, csontturnover, BMI, menopausalis életkor) genetikai meghatározottságát igazolták92-94. Számos olyan monogénes eltérésről tudunk, amely ritka, csontrendszeri eltérésekkel járó öröklődő betegséghez vezet, de a csontvesztés pathogenesisének pontos genetikai hátterét nem ismerjük. Kutatásunkban öt új, kandidáns gén 21 polimorfizmusának összefüggését vizsgáltuk a postmenopausas csontvesztéssel. Az öt kiválasztott gén közül négy gén polimorfizmusainak szerepét nem közölték korábban a nemzetközi irodalomban. Három olyan individuális SNP-t találtunk, amelyek szignifikáns összefüggést mutattak a csontdenzitással. Az FGFR1 a tirozin-kináz receptor családba tartozó transzmembrán molekula, amely osteoblastokon és osteoclastokon is megtalálható és a mesenchymális őssejt osteogén differenciálódásában játszik szerepet95-97. Az FGFR molekulacsalád jelentőségét mutatja, hogy másik tagja, az FGFR3 mutációja okozza a domináns öröklődésű achondropláziát. Az FGFR3 mutációit kapcsolatba hozták a szkeletális deformitásokkal járó Pfeiffer és Kallmann szindrómákkal98 és a gén haplotípusait a koponya normál variációival találták összefüggőnek99. Jelen vizsgálatunkban az FGFR1 génben található rs6996321 polimorfizmus szignifikánsan befolyásolta a lumbális BMD-t. Valószínűleg ez az intronikus SNP így inkább genomikus markerként szerepelhet, mint a gén működését közvetlenül befolyásoló variáns. A génben található 4 SNP-ből konstruált FGFR1 haplotípus önálló befolyással bírt a lumbális

70

csontdenzitásra, alátámasztva a feltételezést, hogy az FGFR1 génnek szoros kapcsolata lehet a csont-metabolizmussal és variánsai befolyással bírnak a csökkent csonttömeg kialakulására. A FABP3 gén promóterében található rs10914367 SNP homozigóta recesszív genotípusa szignifkánsan korrelált a magasabb femur BMD-vel. Az SNP a gén promóter régióját, 1. exonját és 1. intronját taggeli és a szekvencia analízis során transzkripciós faktor (TF) kötő helyeket azonosítottunk a lókuszt tartalmazó génszakaszon. Az ’A’ allél esetén a következő négy TF képes a génszakaszhoz kötődni, több mint 90%-os homológiát feltételezve (az rs10914367 allél aláhúzásával); FOXP3 – forehead box protein P3 (GCCAAC), C/EBPbeta – CCAAT enhancer binding protein beta (CCAA), PR-A and PR-B – progeszteron receptor A és B izoforma (AACACCA). A ’G’ allél esetében ezek a TF kötő helyek „eltűnnek”, amely alapján feltételezhető, hogy a polimorfizmusnak transzkripció-regulátor szerepe lehet. A FABP3 a zsírsavmetabolizmusban játszik szerepet, a sejtek zsírsavfelvételét és a zsírsavak intracelluláris transzportját regulálja100 és korábban összefüggésbe hozták a diabetes mellitus és az elhízás pathogenesisével100,101. A molekula expresszálódik a csontvelő eredetű mesenchymális őssejteken102, és a gén expresszióját a PPARγ is befolyásolja, amely transzkripciós faktor összefüggését leírták a csontvesztés folyamatával. A PPARγ a mesenchymális őssejtek adipogén differenciálódását serkenti és gátolja az osteogén fejlődési utat103. Fenti eredményeink alátámasztják a korábban feltételezett kapcsolatot a csont és a lipid metabolizmus között104-106.

5.3 A glükokortikoid indukálta in vitro génexpressziós változások csontsejtekben Jelen tanulmányunkban bebizonyítottunk, hogy a glükokortikoid analóg dexametazon legalább hat különböző, a csontanyagcserében szerepet játszó gén kifejeződését befolyásolja mind izolált, mind klónozott egér osteoblastokon és ezek közül a legjelentősebb a BMP-8 expressziójára gyakorolt kiemelkedő hatása. Napjainkra több mint harminc csont morfogenetikus fehérjét (BMP) írtak le. A BMP-k a fehérjék TGF-β szupercsaládjába tartoznak és nagy szerepet játszanak a

71

születés utáni csontfejlődésben és remodellingben107. A BMP szignalizáció az 1-es és 2es típusú BMP-receptorokon át a Smad1, 5 és 8 molekulákon keresztül közvetítődik, illetőleg a Smad4-el kialakított komplexe a sejtmagba transzlokálódik, ahol olyan más, a transzkripciót befolyásoló faktorokkal hatnak együtt, mint például osteoblastokban a Runx2107. Az egér BMP-8 gén a 4. kromoszómán helyezkedik el és ismereteink

szerint

fontos

szerepet

játszik

a

jelenlegi

megtermékenyített

petesejt

beágyazódásában és a placentális fejlődésben108. Kutatók beszámoltak a BMP-8 jótékony

hatásairól

a

spermatogenesisben

és

a

mellékvese

integritásának

fenntartásában109-111. Néhány közlemény jelent meg jelentős BMP-8 kifejeződésről osteosarcomaban, Dupuytren fibroblastokban és kissejtes tüdőcarcinomában112-114. Cho és munkatársai leírtak egy BMP-8 expresszió-mentes periódust gyógyuló törések esetében a 14-21 nap között, amikor az osteoblastok működése a legaktívabb115. Ezek az adatok, illetve a mi eredményeink megerősítik a BMP-8 csontképződésre kifejtett gátló hatását. A BMP-8 expresszióját eddig nem írták le normálisan funkcionáló osteoblastokban. A DEX hatására kialakuló BMP-8 mRNS és fehérje kifejeződés nagyságrendbeli emelkedése kulcsfontosságú lehet a glükokortikoid (GC) hatás közvetítésében és megmagyarázhatja a csökkent osteoblast aktivitást GC kezelés hatására. A glükokortikoidok biológiai hatását a magreceptorok szteroid hormon receptor alosztályába tartozó glükokortikoid receptorok (GR) közvetítik. A GR-k a sejtmagban levő gének direkt vagy indirekt szabályozásával számos fiziológiás folyamatot befolyásolnak. A ligand aktiválta receptor dimerek a génexpressziót az adott gén promoter

régiójában

elhelyezkedő

specifikus

GRE

génszakaszokhoz

kötve

szabályozzák. GR számos sejttípuson megtalálható, többek között csontsejteken is, és számos csonthoz kapcsolódó génről igazolták, hogy található bennük GRE szekvencia22. Vizsgálatainkban

egy

web-alapú

keresőprogrammal

(TESS,

http://www.cbil.upenn.edu/tess), négy GRE szekvenciát is azonosítottunk a BMP-8 gén -1k promoterében, amelyek akár közvetlenül is magyarázhatják a jelentős DEX hatást (24. ábra).

72

GR DEX

GRE Bmp8a ⇑ Smad3 ⇓ → SOX9 ⇓ → Col2a1 ⇓ MMP2 ⇓

DEX

apoptózis

DEX

GR

osteoblast

24. ábra: A DEX feltételezett hatásmechanizmusa a génekben elhelyezkedő GRE szekvenciák közvetítésével.

Az új kutatások azt mutatják, hogy a GC-k gátolják a mátrix fehérjék termelődését úgy, mint az 1-es típusú kollagén és az osteocalcin. Mindazonáltal, a GC-k indukálhatják az osteoblast érési útvonalon az érett osteoblastok elköteleződését, ezzel azt is jelezve, hogy a GC hatás az osteoblastok érése során jelentősen eltérhet különböző koncentráció és/vagy sejtállapot, illetve differenciáltsági fokozat esetében25. Jelen vizsgálatainkkal kimutattuk, hogy a DEX nagyon specifikus hatással bír a sejtéletképességre és adott gének kifejeződésére már nanomoláris koncentrációban is. Mérsékelt mRNS mennyiség változást detektáltunk egy TGF-beta jelátvivő molekula, a Smad3 gén esetében, ami összhangban van azzal a megfigyeléssel, hogy a Smad3 aktivitás csökken DEX kezelés hatására116. Az általunk tapasztalt COL2A1 szintézis csökkenés lehetséges, hogy a SOX9 transzkripciós faktor által közvetített csökkent Smad3 aktivitás eredménye117. A Smad3 fontos szerepet játszik a csontfejlődés szabályozásában. Alkalikus foszfatáz aktivitás emelkedést és fokozott mineralizációt vált ki MC3T3-E1 sejtekben118. A COL2A1 és Smad3 expresszió csökkenéseket is mind izolált, mind immortalizált osteoblast sejteken demonstráltuk. Smad3

knock-out

egerek

osteopeniásak

73

csökkent

kortikális

és

trabekuláris

csontmennyiséggel. Valószínűsíthető, hogy a csökkent BMD ezekben az egerekben annak a következménye, hogy az osteoblastok képtelenek ellensúlyozni az osteoclastok aktivitását119. A BMP-4 fehérjéről ismert, hogy az osteoclastok aktivitásának szabályozásán keresztül befolyásolhatja a csontfejlődést. BMP-4 fehérjét nagy mennyisében expresszáló egerekben súlyos osteopenia alakul ki, emelkedett osteoclast számmal120. Vizsgálatunkban mérsékelt BMP-4 expresszió emelkedést tapasztaltunk DEX kezelés hatására, ami szintén szerepet játszhat a GC-k csontra kifejtett negatív hatásainak közvetítésében. Ehhez járul az általunk megfigyelt, emelkedett MMP2 aktivitás, ami a fokozott mátrix elemek bontásában nyilvánulhat meg. Számos vizsgálat szerint a GC-k a fokozott apoptózison és a lassított sejtcikluson keresztül csökkentik mind az osteoblast, mind az osteoclastok számát23,121. Eredményeinkben a DEX-kezelés apoptotikus jeleket adott mind immortalizált, mind izolált egér osteoblastok esetében. Ez a hatás nagymértékben hasonló volt a két sejttípuson, ami aláhúzza azt, hogy az egyszerűbben fenntartható klónozott sejtvonal megfelelő modell a GC-k osteoblastokra kifejtett hatásának vizsgálatára. A FACS analízis és a konfokális mikroszkópos elemzés is korai Annexin-V-FITC jelölődést mutatott, ami az apoptózis korai és specifikus jele. A BMP-8 specifikus siRNS alapú géncsendesítés szignifikánsan növelte a DEX indukálta MC3T3-E1 sejtpusztulását a kontroll – DEX-al nem kezelt sejtekhez - képest. Ezen eredményeink alapján a BMP-8 génterméket egyfajta védekező- vagy védőmechanizmus részeként képzeljük el, mely molekula kiesése egymagában is elegendő ahhoz, hogy a sejtek egy szintetikus glükortikoidra adott specifikus válaszát jelentősen módosítsa.

74

6 KÖVETKEZTETÉSEK Az postmenopausas csontvesztést befolyásoló genetikai faktorok és a genetikai tényezők egymással való kapcsolata teljes egészében nem ismert. Az egyes gének, génváltozatok egyedi hatása csekélynek bizonyult a korábbi vizsgálatokban. A menopausat követő multifaktoriális változások hátterében poligénes hatás és az egyes gének egymással való interakciója valószínűsíthető.

• Vizsgálatunkba a postmenopausalis és premenopausas nők csontszövetében szignifikánsan eltérő génexpressziós mintázatot mutattunk ki. A genetikai adatelemzésben új megközelítési módok, ill. statisztikai rendszerek alkalmazása (DFA, PCA) lehetővé tették számos olyan új gén, illetve géncsoport azonosítását, amelyeket a menopausa csontra kifejtett hatásaival eddig még nem hoztak összefüggésbe. A transzkripciós hálózatban megfigyelt változások tovább segíthetik az ösztrogén hiányában módosuló csontanyagcsere folyamatok megértését. •

Kimutattuk a postmenopausalis csont immunológiai szempontból meghatározó transzkriptomikai eltéréseit és a genetikai adatok alapján egyértelműen megkülönböztettük a postmenopausalis és premenopausalis fenotipusokat. Azonosítottunk olyan, az immunrendszer működéséhez szorosan kapcsolt géneket, amelyek markánsan megváltozott kifejeződése eddig nem volt ismert a postmenopausalis csontvesztés vonatkozásában.

•

Kutatómunkánk során néhány gén – ALPL, FABP3, FGFR1, MMP2, TIMP2 – polimorfizmusainak

összefüggését

vizsgáltuk

a

postmenopausalis

csontvesztéssel. Az öt gén új kandidánsként szerepelhet a további humán vizsgálatokban, mivel az ortológ-modell, a szarvas-agancsképzés kapcsán kerültek

először

látóterünkbe,

génexpressziós

változásaikat

humán

csontszövetben is leírtuk. Régóta tudjuk, hogy a tartós, szisztémás glükokortikoid kezelés egyik jelentős mellékhatása a csontvesztés. Az elöregedő, jelentős gyógyszer felhasználó civilizált társadalmak számára minden tekintetben fokozódó problémát jelentenek a csontrendszer

75

megbetegedései. Az ezekben szenvedő emberek száma emelkedik, azonban a pontos okokozati összefüggésekről, lezajlásuk lépéseiről nagyon kevés információ áll rendelkezésünkre. Munkánk során a nyugati felnőtt lakosság jelentős részét érintő szteroid okozta csontvesztés a megnövekedett glükokortikoid mennyiség hatására, a csontanyagcserében szerepet játszó gének kifejeződésében bekövetkező változásokat kerestünk. •

Eredményeink azt mutatják, hogy a GC terápia egyértelmű génexpressziós profil változást eredményez olyan gének esetében is, amelyek jelentős szerepet játszanak a csontfejlődésben és a remodellingben aktívan résztvevő csontsejtek működésében. Ezek a változások csökkent csontképződés és növekedő csontbomlás irányába mutatnak, amelyek a csonttömeg csökkenéséhez vezetnek.

•

A csontmetabolizmusban új szereplőnek számító BMP-8 kifejeződésében bekövetkező markáns változások vélhetően további kutatásokat indukálhatnak, amelyek jelentősen hozzájárulhatnak a glükokortikoid indukálta csontvesztés pathomechanizmusának jobb megértéséhez. A géncsendesítéses vizsgálatok bizonyították

a

BMP-8

fontos

szerepét

a

GC

jelek

továbbításában

osteoblastokon, a knock-down eredmények a BMP-8, a DEX hatással szembeni, védő szerepét támasztják alá.

76

7 ÖSSZEFOGLALÁS A primer és szekunder csontvesztés hátterében álló komplex genetikai hatások még teljes egészében nem tisztázottak. Tudjuk, hogy a menopausat követő ösztrogén hiányos állapotban gyorsul a remodeling, fokozódik a gyulladást mediáló citokinek expressziója. Jelenlegi ismereteink alapján a glükokortikoidok többféle módon is befolyásolják a csontképződést, elsősorban az osteoblastok funkciójának gátlásán keresztül.

Azonban

a

fent

említett

mechanizmusok

pontos

genomikai

és

transzkriptomikai okait nem ismerjük. Ezért célunk volt postmenopausas nemi hormonok hiányában szignifikánsan változó csontszöveti expressziót mutató gének meghatározása, illetve néhány új kandidáns

génben

található

egypontos

nukleotid

polimorfizmus

azonosítása

postmenopausalis nőkben. Egy aktív glükokortikoid analógnak, a dexametazonnak (DEX) az osteoblastok életképességére és a csontfejlődésben szerepet játszó gén kifejeződésére

gyakorolt

hatásának

vizsgálata.

Továbbá

az

immunrendszer

szabályozásában központi szerepet betöltő gének expressziós mintázatának analízise postmenopausas és premenopausas nem osteoporotikus csontszövetekben. Mann-Whitney U teszt segítségével több gén - köztük az extracelluláris mátrix fehérjéket és emésztő enzimeket kódoló gének, TGFB/BMP jelátviteli útvonalon szabályozódó gének, transzkripciós faktorok, növekedési faktorok, és egyéb a csontanyagcserével kapcsolatos kandidáns gének - esetén találtunk szignifikánsan változó expressziós mintázatot postmenopausas nők csontszövetében a premenopausas kontroll mintákéhoz képest. Diszkriminancia analízis alkalmazásával rámutattunk az ösztrogén-receptorok kétféle típusa (ER-béta, ER-alfa) által szabályozott géncsoportra, melyek erőteljesen elválasztják a postmenopausas és premenopausas fázisban lévő csontszövetet. Immunológiai szempontú komplex transzkripciós profil vizsgálat alapján képesek voltunk jellemezni a humán csontszövet eltérő menopausas stádiumait. DEX kezelés hatására hat gén (a Smad3, prokollagén II alpha 1, prokollagén IX alpha 1, mátrix metalloproteináz-2, csont morfogenetikus fehérje-4 és -8) mutattak szignifikáns, idő- és koncentrációfüggő expresszió változást. A csont morfogenetikus fehérjék egy tagja (BMP-8) két nagyságrendbeli mRNS mennyiség változást és jelentősen emelkedett fehérjeszintet mutatott Western-blot analízissel. A géncsendesítéses

77

vizsgálatok bizonyították a BMP-8 fontos szerepét a GC jelek továbbításában osteoblastokon, az siRNS mediálta gén knock-down eredmények a BMP-8, a DEX hatással szembeni, védő szerepét támasztják alá. A csontszöveti multiplex transzkripciós profil elemzés segítségével azonosítottunk olyan géneket, melyek kiemelkedő szerepet játszhatnak az ösztrogén hiányában bekövetkező gyors csontvesztésben. Emellett genetikai információink hozzájárulhatnak az immun- és csonthomeosztázis összefüggéseinek további értelmezéséhez, illetve a postmenopausalis, módosult csontszöveti mikrokörnyezetben zajló immunológiai mechanizmusok

megértéséhez.

Eredményeink

felvetik

a

BMP-8

szerepét

a

glükokortikoidok csontsejtekre gyakorolt hatásának közvetítésében, és ebből kifolyólag a glükokortikoid-indukálta csontvesztés kialakulásában.

78

8 SUMMARY Primary (postmenopausal) and secondary (such as the glucocorticoid-induced) osteoporosis is a multifactorial disease with high heritability but its exact genetic background is still poorly understood. Oestrogen deficiency at the time of menopause results in marked increases in bone resorption and formation, leading to rapid bone loss. Also, glucocorticoids partly detain bone formation via the inhibition of osteoblastic function, hovewer, the exact mechanism is not fully understood (of this inhibition remains elusive). The aim of my study, were to determine the influence of the menopausal changes on metabolism of bone tissue. So, we investigated a genes characterized by significantly changed mRNA expression rates in postmenopausal versus premenopausal bone tissue and to describe the interrelationships among these genes using multivariate data analysis. Also, the functional interaction between the immune system and postmenoausal bone metabolism has been established at both molecular and cellular levels. Secondary, in our study we examined the effect of dexamethasone, (an active glucocorticoid analogue,) on cell viability and expression of bone formation. The Mann-Whitney U test indicated significant differences in the expression of any genes of postmenopausal and premenopausal women. These genes, including extracellular matrix molecules and digesting enzymes, genes belonging to the transforming growth factor-beta/bone morphogenic protein pathway, transcription factors, growth factors, and other candidate genes, were significantly up-regulated in postmenopausal women compared with premenopausal women. Canonical variates analysis demonstrated that postmenopausal and premenopausal bone tissues can be distinguished by expression analysis of genes controlled via estrogen receptor-alpha and genes coding for extracellular matrix molecules. As a result of dexamethasone treatment we have detected significant apoptotic cell death, and others, including Smad3, type-2 and -9 collagen, matrix metalloproteinase-2, bone morphogenetic protein-4 and bone morphogenetic protein-8 showed significant changes in their expression on a time and concentration dependent manner. Bone morphogenetic protein-8, (a novel player in bone-metabolism,) exhibited a two orders of magnitude elevation in its mRNA level and highly elevated protein concentration by

79

Western-blot in response to dexamethasone treatment. The knockdown of Bmp-8 by RNA interference significantly increases dexamethasone induced cell death, confirming a messenger role in the glucocorticoid-induced bone loss. Also, our results support the important role of BMP-8 in bone metabolism, especially induced by glucocorticoids.

80

9 IRODALOMJEGYZÉK [1]

Lakatos P: A kalciumháztartás és a csontszövet anyagcsere-betegségei. Medicina: Budapest, 1999.

[2]

Lakatos P, Takács I: Metabolikus csontbetegségek. Medintel: Budapest, 2006.

[3]

Khosla S: Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology 2001;142:5050-5055.

[4]

Lorenzo J, Horowitz M, Choi Y: Osteoimmunology: interactions of the bone and immune system. Endocrine reviews 2008;29:403-440.

[5]

Yasuda H, Shima N, Nakagawa N, Yamaguchi K, Kinosaki M, Mochizuki S, Tomoyasu A, Yano K, Goto M, Murakami A, Tsuda E, Morinaga T, Higashio K, Udagawa N, Takahashi N, Suda T: Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proc Natl Acad Sci 1998;95:3597-3602.

[6]

Aubin JE, Bonnelye E: Osteoprotegerin and its ligand: a new paradigm for regulation of osteoclastogenesis and bone resorption. Osteoporos Int 2000;11:905-913.

[7]

Simonet WS, Lacey DL, Dunstan CR, Kelley M, Chang MS, Luthy R, Nguyen HQ, Wooden S, Bennett L, Boone T, Shimamoto G, DeRose M, Elliott R, Colombero A, Tan HL, Trail G, Sullivan J, Davy E, Bucay N, Renshaw-Gegg L, Hughes TM, Hill D, Pattison W, Campbell P, Sander S, Van G, Tarpley J, Derby P, Lee R, Boyle WJ: Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell 1997;89:309319.

[8]

Teitelbaum SL, Ross FP: Genetic regulation of osteoclast development and function. Nat Rev Genet 2003;4:638-649.

[9]

Schoppet M, Preissner KT, Hofbauer LC: RANK ligand and osteoprotegerin: paracrine regulators of bone metabolism and vascular function. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002;22:549-553.

[10]

Canalis E, Economides AN, Gazzerro E: Bone morphogenetic proteins, their antagonists, and the skeleton. Endocrine reviews 2003;24:218-235.

81

[11]

Xiao YT, Xiang LX, Shao JZ: Bone morphogenetic protein. Biochem Biophys Res Commun 2007;362:550-553.

[12]

Gazzerro E, Canalis E: Bone morphogenetic proteins and their antagonists. Rev Endocr Metab Disord 2006;7:51-65.

[13]

Kawabata M, Imamura T, Miyazono K: Signal transduction by bone morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev 1998;9:49-61.

[14]

Granjeiro JM, Oliveira RC, Bustos-Valenzuela JC, Sogayar MC, Taga R: Bone morphogenetic proteins: from structure to clinical use. Braz J Med Biol Res 2005;38:1463-1473.

[15]

Rizzoli R, Bonjour JP, Ferrari SL: Osteoporosis, genetics and hormones. J Mol Endocrinol 2001;26:79-94.

[16]

Riggs BL: The mechanisms of estrogen regulation of bone resorption. J Clin Invest 2000;106:1203-1204.

[17]

Turner RT, Riggs BL, Spelsberg TC: Skeletal effects of estrogen. Endocrine reviews 1994;15:275-300.

[18]

Dykman TR, Gluck OS, Murphy WA, Hahn TJ, Hahn BH: Evaluation of factors associated with glucocorticoid-induced osteopenia in patients with rheumatic diseases. Arthritis Rheum 1985;28:361-368.

[19]

Adinoff AD, Hollister JR: Steroid-induced fractures and bone loss in patients with asthma. N Engl J Med 1983;309:265-268.

[20]

Yeap SS, Hosking DJ: Management of corticosteroid-induced osteoporosis. Rheumatology 2002;41:1088-1094.

[21]

Compston JE: Management of bone disease in patients on long term glucocorticoid therapy. Gut 1999;44:770-772.

[22]

Beavan S, Horner A, Bord S, Ireland D, Compston J: Colocalization of glucocorticoid and mineralocorticoid receptors in human bone. J Bone Miner Res 2001;16:1496-1504.

[23]

Weinstein RS, Jilka RL, Parfitt AM, Manolagas SC: Inhibition of osteoblastogenesis and promotion of apoptosis of osteoblasts and osteocytes by glucocorticoids. Potential mechanisms of their deleterious effects on bone. J Clin Invest 1998;102:274-282.

82

[24]

Canalis E, Pereira RC, Delany AM: Effects of glucocorticoids on the skeleton. J Pediatr Endocrinol Metab 2002;15 Suppl 5:1341-1345.

[25]

Canalis E: Clinical review 83: Mechanisms of glucocorticoid action in bone: implications to glucocorticoid-induced osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab 1996;81:3441-3447.

[26]

Canalis E: Mechanisms of glucocorticoid-induced osteoporosis. Curr Opin Rheumatol 2003;15:454-457.

[27]

Lukert BP, Raisz LG: Glucocorticoid-induced osteoporosis: pathogenesis and management. Ann Intern Med 1990;112:352-364.

[28]

Hodgson SF: Corticosteroid-induced osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am 1990;19:95-111.

[29]

Rucklidge GJ, Milne G, Bos KJ, Farquharson C, Robins SP: Deer antler does not represent a typical endochondral growth system: immunoidentification of collagen type X but little collagen type II in growing antler tissue. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 1997;118:303-308.

[30]

Borsy A, Podani J, Steger V, Balla B, Horvath A, Kosa JP, Gyurjan I, Jr., Molnar A, Szabolcsi Z, Szabo L, Jako E, Zomborszky Z, Nagy J, Semsey S, Vellai T, Lakatos P, Orosz L: Identifying novel genes involved in both deer physiological and human pathological osteoporosis. Mol Genet Genomics 2009;281:301-313.

[31]

Walsh MC, Kim N, Kadono Y, Rho J, Lee SY, Lorenzo J, Choi Y: Osteoimmunology: interplay between the immune system and bone metabolism. Annu Rev Immunol 2006;24:33-63.

[32]

Zallone A: Direct and indirect estrogen actions on osteoblasts and osteoclasts. Ann N Y Acad Sci 2006;1068:173-179.

[33]

Bouman A, Heineman MJ, Faas MM: Sex hormones and the immune response in humans. Hum Reprod Update 2005;11:411-423.

[34]

Weitzmann MN, Pacifici R: Estrogen regulation of immune cell bone interactions. Ann N Y Acad Sci 2006;1068:256-274.

[35]

Carlsten H: Immune responses and bone loss: the estrogen connection. Immunol Rev 2005;208:194-206.

83

[36]

Clowes JA, Riggs BL, Khosla S: The role of the immune system in the pathophysiology of osteoporosis. Immunol Rev 2005;208:207-227.

[37]

Cenci S, Toraldo G, Weitzmann MN, Roggia C, Gao Y, Qian WP, Sierra O, Pacifici R: Estrogen deficiency induces bone loss by increasing T cell proliferation and lifespan through IFN-gamma-induced class II transactivator. Proc Natl Acad Sci 2003;100:10405-10410.

[38]

Kellgren JH, Lawrence JS: Radiological assessment of osteo-arthrosis. Ann Rheum Dis 1957;16:494-502.

[39]

Benayahu D: Estrogen effects on protein expressed by marrow stromal osteoblasts. Biochem Biophys Res Commun 1997;233:30-35.

[40]

Bell PA, Chaturvedi S, Gelfand CA, Huang CY, Kochersperger M, Kopla R, Modica F, Pohl M, Varde S, Zhao R, Zhao X, Boyce-Jacino MT, Yassen A: SNPstream UHT: ultra-high throughput SNP genotyping for pharmacogenomics and drug discovery. Biotechniques 2002;Suppl:70-72, 74, 76-77.

[41]

Podani J: SYN-TAX 2000. User’s Manual. Scientia: Budapest,2001.

[42]

Dai JJ, Lieu L, Rocke D: Dimension reduction for classification with gene expression microarray data. Stat Appl Genet Mol Biol 2006;5:Article6.

[43]

Yeung KY, Ruzzo WL: Principal component analysis for clustering gene expression data. Bioinformatics 2001;17:763-774.

[44]

Raychaudhuri S, Stuart JM, Altman RB: Principal components analysis to summarize microarray experiments: application to sporulation time series. Pac Symp Biocomput 2000:455-466.

[45]

Podani J: Introduction to the Exploration of Multivariate Biological Data. Backhuys: Leiden,2000.

[46]

Jolliffe I: Principal Component Analysis. Springer: New York,1986.

[47]

Cattell R: The scree test for the number of factors. Multivar Behavioral Res 1966;1:140-161.

[48]

Xie Q, Ratnasinghe LD, Hong H, Perkins R, Tang ZZ, Hu N, Taylor PR, Tong W: Decision forest analysis of 61 single nucleotide polymorphisms in a case-control study of esophageal cancer; a novel method. BMC Bioinformatics 2005;6 Suppl 2:S4.

84

[49]

Curtin K, Wong J, Allen-Brady K, Camp NJ: PedGenie: meta genetic association testing in mixed family and case-control designs. BMC Bioinformatics 2007;8:448.

[50]

Furlan F, Lecanda F, Screen J, Civitelli R: Proliferation, differentiation and apoptosis in connexin43-null osteoblasts. Cell Commun Adhes 2001;8:367-371.

[51]

Itoh S, Itoh F, Goumans MJ, Ten Dijke P: Signaling of transforming growth factor-beta family members through Smad proteins. Eur J Biochem 2000;267:6954-6967.

[52]

Krishnan V, Bryant HU, Macdougald OA: Regulation of bone mass by Wnt signaling. J Clin Invest 2006;116:1202-1209.

[53]

Reya T, Clevers H: Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature 2005;434:843-850.

[54]

Koay MA, Brown MA: Genetic disorders of the LRP5-Wnt signalling pathway affecting the skeleton. Trends Mol Med 2005;11:129-137.

[55]

Brama M, Gnessi L, Basciani S, Cerulli N, Politi L, Spera G, Mariani S, Cherubini S, d'Abusco AS, Scandurra R, Migliaccio S: Cadmium induces mitogenic signaling in breast cancer cell by an ERalpha-dependent mechanism. Mol Cell Endocrinol 2007;264:102-108.

[56]

Fournier B, Gutzwiller S, Dittmar T, Matthias G, Steenbergh P, Matthias P: Estrogen receptor (ER)-alpha, but not ER-beta, mediates regulation of the insulin-like growth factor I gene by antiestrogens. J Biol Chem 2001;276:3544435449.

[57]

Kian Tee M, Rogatsky I, Tzagarakis-Foster C, Cvoro A, An J, Christy RJ, Yamamoto KR, Leitman DC: Estradiol and selective estrogen receptor modulators differentially regulate target genes with estrogen receptors alpha and beta. Mol Biol Cell 2004;15:1262-1272.

[58]

Kouzmenko AP, Takeyama K, Ito S, Furutani T, Sawatsubashi S, Maki A, Suzuki E, Kawasaki Y, Akiyama T, Tabata T, Kato S: Wnt/beta-catenin and estrogen signaling converge in vivo. J Biol Chem 2004;279:40255-40258.

[59]

Lindberg MK, Moverare S, Eriksson AL, Skrtic S, Gao H, DahlmanWright K, Gustafsson JA, Ohlsson C: Identification of estrogen-regulated

85

genes of potential importance for the regulation of trabecular bone mineral density. J Bone Miner Res 2002;17:2183-2195. [60]

Lu T, Achari Y, Sciore P, Hart DA: Estrogen receptor alpha regulates matrix metalloproteinase-13

promoter

activity

primarily

through

the

AP-1

transcriptional regulatory site. Biochim Biophys Acta 2006;1762:719-731. [61]

Mueller MD, Vigne JL, Minchenko A, Lebovic DI, Leitman DC, Taylor RN: Regulation of vascular endothelial growth factor (VEGF) gene transcription by estrogen receptors alpha and beta. Proc Natl Acad Sci 2000;97:10972-10977.

[62]

Tou L, Quibria N, Alexander JM: Regulation of human cbfa1 gene transcription in osteoblasts by selective estrogen receptor modulators (SERMs). Mol Cell Endocrinol 2001;183:71-79.

[63]

Viereck V, Grundker C, Blaschke S, Siggelkow H, Emons G, Hofbauer LC: Phytoestrogen genistein stimulates the production of osteoprotegerin by human trabecular osteoblasts. J Cell Biochem 2002;84:725-735.

[64]

Wang J, Jarrett J, Huang CC, Satcher RL, Jr., Levenson AS: Identification of estrogen-responsive genes involved in breast cancer metastases to the bone. Clin Exp Metastasis 2007;24:411-422.

[65]

van den Wijngaard A, Mulder WR, Dijkema R, Boersma CJ, Mosselman S, van Zoelen EJ, Olijve W: Antiestrogens specifically up-regulate bone morphogenetic protein-4 promoter activity in human osteoblastic cells. Mol Endocrinol 2000;14:623-633.

[66]

Zhou S, Turgeman G, Harris SE, Leitman DC, Komm BS, Bodine PV, Gazit D: Estrogens activate bone morphogenetic protein-2 gene transcription in mouse mesenchymal stem cells. Mol Endocrinol 2003;17:56-66.

[67]

Cao L, Bu R, Oakley JI, Kalla SE, Blair HC: Estrogen receptor-beta modulates synthesis of bone matrix proteins in human osteoblast-like MG63 cells. J Cell Biochem 2003;89:152-164.

[68]

Monroe DG, Getz BJ, Johnsen SA, Riggs BL, Khosla S, Spelsberg TC: Estrogen receptor isoform-specific regulation of endogenous gene expression in human osteoblastic cell lines expressing either ERalpha or ERbeta. J Cell Biochem 2003;90:315-326.

86

[69]

Srivastava S, Weitzmann MN, Cenci S, Ross FP, Adler S, Pacifici R: Estrogen decreases TNF gene expression by blocking JNK activity and the resulting production of c-Jun and JunD. J Clin Invest 1999;104:503-513.

[70]

Romagnani S: Regulation of the T cell response. Clin Exp Allergy 2006;36:1357-1366.

[71]

Corthay A: A three-cell model for activation of naive T helper cells. Scand J Immunol 2006;64:93-96.

[72]

Steinman RM, Hemmi H: Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol 2006;311:17-58.

[73]

Schuurhuis DH, Fu N, Ossendorp F, Melief CJ: Ins and outs of dendritic cells. Int Arch Allergy Immunol 2006;140:53-72.

[74]

Hornef MW, Wick MJ, Rhen M, Normark S: Bacterial strategies for overcoming host innate and adaptive immune responses. Nat Immunol 2002;3:1033-1040.

[75]

Davey RA, Hahn CN, May BK, Morris HA: Osteoblast gene expression in rat long bones: effects of ovariectomy and dihydrotestosterone on mRNA levels. Calcif Tissue Int 2000;67:75.

[76]

Ikeda T, Yamaguchi A, Yokose S, Nagai Y, Yamato H, Nakamura T, Tsurukami H, Tanizawa T, Yoshiki S: Changes in biological activity of bone cells in ovariectomized rats revealed by in situ hybridization. J Bone Miner Res 1996;11:780.

[77]

Yokose S, Ishizuya T, Ikeda T, Nakamura T, Tsurukami H, Kawasaki K, Suda T, Yoshiki S, Yamaguchi A: An estrogen deficiency caused by ovariectomy increases plasma levels of systemic factors that stimulate proliferation and differentiation of osteoblasts in rats. Endocrinology 1996;137:469.

[78]

Hegedus Z, Czibula A, Kiss-Toth E: Tribbles: novel regulators of cell function; evolutionary aspects. Cell Mol Life Sci 2006;63:1632.

[79]

Sung HY, Francis SE, Crossman DC, Kiss-Toth E: Regulation of expression and signalling modulator function of mammalian tribbles is cell-type specific. Immunol Lett 2006;104:171.

87

[80]

Grill C, Gheyas F, Dayananth P, Jin W, Ding W, Qiu P, Wang L, Doll RJ, English JM: Analysis of the ERK1,2 transcriptome in mammary epithelial cells. Biochem J 2004;381:635.

[81]

Murakami Y: Involvement of a cell adhesion molecule, TSLC1/IGSF4, in human oncogenesis. Cancer Sci 2005;96:543.

[82]

Lin CY, Strom A, Vega VB, Kong SL, Yeo AL, Thomsen JS, Chan WC, Doray B, Bangarusamy DK, Ramasamy A, Vergara LA, Tang S, Chong A, Bajic VB, Miller LD, Gustafsson JA, Liu ET: Discovery of estrogen receptor alpha target genes and response elements in breast tumor cells. Genome Biol 2004;5:R66.

[83]

Schroeder TM, Jensen ED, Westendorf JJ: Runx2: a master organizer of gene transcription in developing and maturing osteoblasts. Birth Defects Res C EmbryoToday 2005;75:213.

[84]

Komori T: Requisite roles of Runx2 and Cbfb in skeletal development. J Bone Miner Metab 2003;21:193.

[85]

Stein GS, Lian JB, van Wijnen AJ, Stein JL, Montecino M, Javed A, Zaidi SK, Young DW, Choi JY, Pockwinse SM: Runx2 control of organization, assembly and activity of the regulatory machinery for skeletal gene expression. Oncogene 2004;23:4315.

[86]

Enomoto H, Shiojiri S, Hoshi K, Furuichi T, Fukuyama R, Yoshida CA, Kanatani N, Nakamura R, Mizuno A, Zanma A, Yano K, Yasuda H, Higashio K, Takada K, Komori T: Induction of osteoclast differentiation by Runx2 through receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) and osteoprotegerin regulation and partial rescue of osteoclastogenesis in Runx2-/- mice by RANKL transgene. J Biol Chem 2003;278:23971.

[87]

Franceschi RT, Xiao G: Regulation of the osteoblast-specific transcription factor, Runx2: responsiveness to multiple signal transduction pathways. J Cell Biochem 2003;88:446.

[88]

Nakashima K, Zhou X, Kunkel G, Zhang Z, Deng JM, Behringer RR, de Crombrugghe B: The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell 2002;108:17.

88

[89]

Kim YJ, Kim HN, Park EK, Lee BH, Ryoo HM, Kim SY, Kim IS, Stein JL, Lian JB, Stein GS, van Wijnen AJ, Choi JY: The bone-related Zn finger transcription factor Osterix promotes proliferation of mesenchymal cells. Gene 2006;366:145.

[90]

Gelse K, Poschl E, Aigner T: Collagens--structure, function, and biosynthesis. Adv Drug Deliv Rev 2003;55:1531.

[91]

Stanley KT, VanDort C, Motyl C, Endres J, Fox DA: Immunocompetent properties of human osteoblasts: interactions with T lymphocytes. J Bone Miner Res 2006;21:29-36.

[92]

Arden NK, Baker J, Hogg C, Baan K, Spector TD: The heritability of bone mineral density, ultrasound of the calcaneus and hip axis length: a study of postmenopausal twins. J Bone Miner Res 1996;11:530-534.

[93]

Arden NK, Spector TD: Genetic influences on muscle strength, lean body mass, and bone mineral density: a twin study. J Bone Miner Res 1997;12:2076-2081.

[94]

Kaprio J, Rimpela A, Winter T, Viken RJ, Rimpela M, Rose RJ: Common genetic influences on BMI and age at menarche. Hum Biol 1995;67:739-753.

[95]

Woei Ng K, Speicher T, Dombrowski C, Helledie T, Haupt LM, Nurcombe V, Cool SM: Osteogenic differentiation of murine embryonic stem cells is mediated by fibroblast growth factor receptors. Stem Cells Dev 2007;16:305318.

[96]

Aguirre JI, Leal ME, Rivera MF, Vanegas SM, Jorgensen M, Wronski TJ: Effects of basic fibroblast growth factor and a prostaglandin E2 receptor subtype 4 agonist on osteoblastogenesis and adipogenesis in aged ovariectomized rats. J Bone Miner Res 2007;22:877-888.

[97]

Kawaguchi H, Katagiri M, Chikazu D: Osteoclastic bone resorption through receptor tyrosine kinase and extracellular signal-regulated kinase signaling in mature osteoclasts. Mod Rheumatol 2004;14:1-5.

[98]

Vieira AR, Modesto A, Meira R, Barbosa AR, Lidral AC, Murray JC: Interferon regulatory factor 6 (IRF6) and fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) contribute to human tooth agenesis. Am J Med Genet A 2007;143:538545.

89

[99]

Coussens AK, van Daal A: Linkage disequilibrium analysis identifies an FGFR1 haplotype-tag SNP associated with normal variation in craniofacial shape. Genomics 2005;85:563-573.

[100] Chmurzynska A: The multigene family of fatty acid-binding proteins (FABPs): function, structure and polymorphism. J Appl Genet 2006;47:39-48. [101] Shin HD, Kim LH, Park BL, Jung HS, Cho YM, Moon MK, Lee HK, Park KS: Polymorphisms in fatty acid-binding protein-3 (FABP3) - putative association with type 2 diabetes mellitus. Hum Mutat 2003;22:180. [102] Xu Y, Mirmalek-Sani SH, Yang X, Zhang J, Oreffo RO: The use of small interfering RNAs to inhibit adipocyte differentiation in human preadipocytes and fetal-femur-derived mesenchymal cells. Exp Cell Res 2006;312:1856-1864. [103] Moerman EJ, Teng K, Lipschitz DA, Lecka-Czernik B: Aging activates adipogenic and suppresses osteogenic programs in mesenchymal marrow stroma/stem cells: the role of PPAR-gamma2 transcription factor and TGFbeta/BMP signaling pathways. Aging Cell 2004;3:379. [104] Nelson-Dooley C, Della-Fera MA, Hamrick M, Baile CA: Novel treatments for obesity and osteoporosis: targeting apoptotic pathways in adipocytes. Curr Med Chem 2005;12:2215-2225. [105] Nuttall ME, Gimble JM: Controlling the balance between osteoblastogenesis and adipogenesis and the consequent therapeutic implications. Curr Opin Pharmacol 2004;4:290-294. [106] Jadhav SB, Jain GK: Statins and osteoporosis: new role for old drugs. J Pharm Pharmacol 2006;58:3-18. [107] Chen D, Zhao M, Mundy GR: Bone morphogenetic proteins. Growth Factors 2004;22:233-241. [108] Zhao GQ, Liaw L, Hogan BL: Bone morphogenetic protein 8A plays a role in the maintenance of spermatogenesis and the integrity of the epididymis. Development 1998;125:1103-1112. [109] Ying Y, Liu XM, Marble A, Lawson KA, Zhao GQ: Requirement of Bmp8b for the generation of primordial germ cells in the mouse. Mol Endocrinol 2000;14:1053-1063.

90

[110] Zhao GQ, Hogan BL: Evidence that mouse Bmp8a (Op2) and Bmp8b are duplicated genes that play a role in spermatogenesis and placental development. Mech Dev 1996;57:159-168. [111] Zhao GQ, Deng K, Labosky PA, Liaw L, Hogan BL: The gene encoding bone morphogenetic protein 8B is required for the initiation and maintenance of spermatogenesis in the mouse. Genes Dev 1996;10:1657-1669. [112] Shin SS, Liu C, Chang EY, Carlson CS, Di Cesare PE: Expression of bone morphogenetic proteins by Dupuytren's fibroblasts. J Hand Surg 2004;29:809814. [113] Sulzbacher I, Birner P, Trieb K, Pichlbauer E, Lang S: The expression of bone morphogenetic proteins in osteosarcoma and its relevance as a prognostic parameter. J Clin Pathol 2002;55:381-385. [114] Henderson LJ, Coe BP, Lee EH, Girard L, Gazdar AF, Minna JD, Lam S, MacAulay C, Lam WL: Genomic and gene expression profiling of minute alterations of chromosome arm 1p in small-cell lung carcinoma cells. Br J Cancer 2005;92:1553-1560. [115] Cho TJ, Gerstenfeld LC, Einhorn TA: Differential temporal expression of members of the transforming growth factor beta superfamily during murine fracture healing. J Bone Miner Res 2002;17:513-520. [116] Iu MF, Kaji H, Sowa H, Naito J, Sugimoto T, Chihara K: Dexamethasone suppresses Smad3 pathway in osteoblastic cells. J Endocrinol 2005;185:131-138. [117] Furumatsu T, Tsuda M, Taniguchi N, Tajima Y, Asahara H: Smad3 induces chondrogenesis through the activation of SOX9 via CREB-binding protein/p300 recruitment. J Biol Chem 2005;280:8343-8350. [118] Sowa H, Kaji H, Yamaguchi T, Sugimoto T, Chihara K: Activations of ERK1/2 and JNK by transforming growth factor beta negatively regulate Smad3-induced alkaline phosphatase activity and mineralization in mouse osteoblastic cells. J Biol Chem 2002;277:36024-36031. [119] Borton AJ, Frederick JP, Datto MB, Wang XF, Weinstein RS: The loss of Smad3 results in a lower rate of bone formation and osteopenia through dysregulation of osteoblast differentiation and apoptosis. J Bone Miner Res 2001;16:1754-1764.

91

[120] Okamoto M, Murai J, Yoshikawa H, Tsumaki N: Bone morphogenetic proteins in bone stimulate osteoclasts and osteoblasts during bone development. J Bone Miner Res 2006;21:1022-1033. [121] Smith E, Coetzee GA, Frenkel B: Glucocorticoids inhibit cell cycle progression in differentiating osteoblasts via glycogen synthase kinase-3beta. J Biol Chem 2002;277:18191-18197.

92

10 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Originális cikkek kumulatív impakt faktora: 51,281 10.1 Az értekezés témájával összefüggő saját közlemények jegyzéke János P. Kósa*, Bernadett Balla*, János Kiss, Adrienn Borsy, János Podani, István Takács, Áron Lazáry, Zsolt Nagy, Krisztián Bácsi, Gábor Speer, László Orosz and Péter Lakatos: Effect of menopause on gene expression pattern in bone tissue of nonosteoporotic women Menopause 2009 March;16(2):367-377 * These authors equally contributed to this work

IF: 3,452 János P. Kósa*, Bernadett Balla*, János Kiss, János Podani, István Takács, Áron Lazáry, Zsolt Nagy, Krisztián Bácsi, Attila Karsai, Gábor Speer, Péter Lakatos: Postmenopausal Expression Changes of Immune System-Related Genes in Human Bone Tissue J Clin Immunol. 2009 Aug 7. [Epub ahead of print] DOI 10.1007/s10875-009-9321-9 * These authors equally contributed to this work IF: 3,248 Bernadett Balla; János P. Kósa; János Kiss; János Podani; István Takács; Gábor Speer; Krisztián Bácsi; Áron Lazáry; Zsolt Nagy; Péter Lakatos: Transcriptional profiling of immune system-related genes in postmenopausal osteoporotic versus non-osteoporotic human bone tissue Clin Immunol. 2009 May;131(2):354-9. IF: 3,606 Borsy, Adrienn; Podani, János; Stéger, Viktor; Balla, Bernadett; Kósa, János P.; Gyurján Jr., István; Molnár, Andrea; Szabolcsi, Zoltán; Szabó, László; Jáko, Eéna; Zomborszky, Zoltán; Nagy, János; Vellai, Tibor; Lakatos, Péter; Orosz, László: Identifying novel genes involved in both deer physiological and human pathological osteoporosis Molecular Genetics and Genomics 2009 Mar;281(3):301-13. IF: 2,838 Balla Bernadett, Kósa János, Takács István, Kiss János, Podani János, Borsy Adrienn, Lazáry Áron, Bácsi Krisztián, Nagy Zsolt, Speer Gábor, Orosz László, és Lakatos Péter: Menopauza hatása a csontszöveti génkifejeződésre posztmenopauzás és premenopauzás korú nem oszteoprotikus nőkben Magy Belorv Arch 2008; 61(3):208-219. IF: -

93

Áron Lazáry*, János P. Kósa*, Bálint Tóbiás, Judit Lazáry, Bernadett Balla, Krisztián Bácsi, István Takács, Zsolt Nagy, Tibor Mező, Gábor Speer, Péter Lakatos: Single nucleotide polymorphisms in new candidate genes are associated with bone mineral density and fracture risk Eur J Endocrinol. 2008 Aug;159(2):187-96. * These authors equally contributed to this work

IF: 3,791 Bernadett Balla*, János P. Kósa*, János Kiss, Adrienn Borsy, János Podani, István Takács, Áron Lazáry, Zsolt Nagy, Krisztián Bácsi, Gábor Speer, László Orosz and Péter Lakatos: Different Gene Expression Patterns in the Bone Tissue of Aging Postmenopausal Osteoporotic and Non-osteoporotic Women Calcif Tissue Int. 2008 Jan;82(1):12-26. * These authors equally contributed to this work

IF: 2,737 Kósa P. János, Kis Adrián, Bácsi Krisztián, Nagy Zsolt, Balla Bernadett, Lazáry Áron, Takács István, Speer Gábor és Lakatos Péter: Új, a glükokortikoidok csontsejtekre gyakorolt hatásának közvetítésében szerepet játszó gének azonosítása izolált és immortalizált egér osteoblast sejteken Magy Belorv Arch. 2007; 60. 435-441 IF: Áron Lazáry, Bernadett Balla, János P. Kósa, Krisztián Bácsi, Zsolt Nagy, István Takács, Péter P Varga, Gábor Speer and Péter Lakatos: Effect of gypsum on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 mouse osteoblastic cells.Biomaterials. 2007 Jan;28(3):393-9. IF: 6,262

10.2 További saját közlemények jegyzéke Bácsi Krisztián, Kósa János, Balla Bernadett, Lazáry Áron, Takács István, Nagy Zsolt, Speer Gábor és Lakatos Péter: A kalciummetabolizmus jelentősége a csontritkulás és a colorectalis daganat patogenezisében Orvosképzés 2009; LXXXIV, S2:101-110 IF: Szendrői Attila, Speer Gábor, Tabák Ádám, Kósa P. János, Horváth Henrik, Romics Imre, Lakatos Péter: A D vitamin, ösztrogén és calcium sensing receptor genotípusainak valamint a szérum kalciumnak a prosztatarák kialakulásában betöltött szerepe Uroonkológia (2009 March – elfogadott) IF: K. Bácsi, E. Hitre, J. P. Kósa, H. Horváth, Á. Lazáry, P. L. Lakatos, B. Balla, B. Budai, P. Lakatos, G. Speer: Effects of the lactase gene 13910 C/T and calcium-sensing receptor gene A986S G/T polymorphisms on the incidence and recurrence of colorectal cancer in Hungarian patients. BMC Cancer. 2008 Nov 3;8(1):317.

94

IF: 3,087 K. Bácsi, J. P. Kósa, Á. Lazáry, B. Balla, H. Horváth, A. Kis, Zs. Nagy, I. Takács, P. Lakatos, G. Speer: LCT 13910 C/T polymorphism, serum calcium, and bone mineral density in postmenopausal women. Osteoporos Int. 2009 Apr;20(4):639-45. IF: 4,290 Lazáry A, Speer G, Varga PP, Balla B, Bácsi K, Kósa JP, Nagy Z, Takács I, Lakatos P.: Effect of vertebroplasty filler materials on viability and gene expression of human nucleus pulposus cells. J Orthop Res. 2008 May;26(5):601-607. IF: 2,963 Lazáry A, Balla B, Kósa J, Bácsi K, Nagy Z, Takács I, Varga PP, Speer G, Lakatos P.: A szintetikus csontpótló graftok alkalmazásának összefoglalása. A gipsz szerepe a csontpótlásban: molekuláris biológiai megközelítéssel, saját eredményeink alapján Orv Hetil. 2007 Dec 23;148(51):2427-33. IF: Bácsi Krisztián, Kósa János, Lazáry Áron, Horváth Henrik, Balla Bernadett, Speer Gábor, Lakatos Péter: A CYP3A7-1C-polimorfizmus hatása a csont ásványianyagtartalmára posztmenopauzás nőkben Orv Hetil. 2007 Jul 8;148(27):1273-80. IF: Gábor Földvári, Márton Márialigeti, Norbert Solymosi, Zoltán Lukács, Gábor Majoros, János P. Kósa, Róbert Farkas: Hard Ticks Infesting Dogs in Hungary and their Infection with Babesia and Borrelia Species. Parasitol Res. (2007) 101:S25-S34 IF:1,512 Bácsi Krisztián, Kósa János, Lazáry Áron, Horváth Henrik, Balla Bernadett, Lakatos Péter és Speer Gábor: A dehidroepiandroszteron és dehidroepiandroszteron-szulfát jelentősége különböző kórállapotokban Orv Hetil. 2007 Apr 8;148(14):651-7 IF: Tóbiás Bálint, Both Mária és Kósa P. János: Egy genetikai kutatás eredményei a biológiaórán A biológia tanítása. 2007. Jan; XV(1):12-18 IF: Folhoffer A, Ferenci P, Csak T, Horvath A, Hegedus D, Firneisz G, Osztovits J, Kosa JP, Willheim-Polli C, Szonyi L, Abonyi M, Laszlo Lakatos P, Szalay F. : Novel mutations of the ATP7B gene among 109 Hungarian patients with Wilson's disease Eur J Gastroenterol Hepatol. 2007 Feb;19(2):105-111. IF: 1,830 Bacsi K, Kosa JP, Borgulya G, Balla B, Lazary A, Nagy Zs, Horvath C, Speer G, Lakatos P.: CYP3A7*1C polymorphism, serum dehydroepiandrosterone sulphate level

95

and bone mineral density in postmenopausal women Calcif Tissue Int. 2007 Mar;80(3):154-9. IF: 2,435 Gábor Speer, Péter Szenthe, János P. Kósa, Ádám G. Tabák, Anikó Folhoffer, Péter Fuszek, Károly Cseh and Péter Lakatos: Myocardial infarction is associated with the S allelic variant of the Sp1 binding site polymorphism of collagen type 1A1 gene Acta Cardiol. 2006 Jun;61(3):321-325. IF: 0,519 Bajnok É, Takács I, Tabák Á, Speer G, Nagy Z, Horváth C, Mészáros S, Kósa J, Nyíri P, Lakatos P: Génpolimorfizmusok lehetséges szerepe a toxikus adenoma és az azt kísérő osteopathia kialakulásában. Magyar Belorvosi Archívum, 2006. 60:97-102. IF: Speer Gábor, Szenthe Péter, Kósa P. János, Tabák G. Ádám, Nagy Zsolt, Folhofert Anikó, Cseh Károly, Lakatos Péter: Az 1-es típusú kollagén A1-génjének -1245 G/T polimorfizmusa összefügg a miokardiális infarktussal: az új patogenetikai faktor? Cardiologia Hungarica 2005;35:64-69 IF: M. Sárvári, I. Vágó, C. S. Wéber, J. Nagy, P. Gál, M. Mák, J. P. Kósa, P. Závodszky and T. Pázmány: Inhibition of C1q-beta-amyloid binding protects hippocampal cells against complement mediated toxicity, Journal of Neuroimmunology, Volume 137, Issues 1-2, April 2003, 12-18 IF: 3,054 Tamas Pazmany, János P. Kósa, Thomas B. Tomasi, Laszlo Mechtler, Andrea Turoczi and Attila Lehotzky: Effect of transforming growth factor-1 on microglial MHC-class II expression, Journal of Neuroimmunology, Volume 103, Issue 2, 3 January 2000, Pages 122-130 IF:3,355 Tamas Pazmany, Laszlo Mechtler, Thomas B. Tomasi, János P. Kósa, Andrea Turoczi and Zoltan Urbanyi: Differential regulation of major histocompatibility complex class II expression and nitric oxide release by –amyloid in rat astrocyte and microglia, Brain Research, Vol 835, Issue 2, 24 July 1999, 213-223 IF:2,302

96

10.3 Idézhető absztraktok Balla B, Kósa JP, Kiss J, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Lakatos P: Transcriptional profile of immune system-related genes in postmenopausal osteoporotic versus non-osteoporotic human bone tissue. ECTS 35th European Symposium on Calcified Tissues Barcelona, Spain, 2008. május 24-28. Calcif Tissue Int 2008, 82(S1):Su-P207 K. Bácsi, J. P. Kósa, B. Balla, Á. Lazáry, Z. Nagy, I. Takács, G. Speer, P. Lakatos: Decreased activity of lactase phlorizin hydrolase and bone mineral density in postmenopausal women. ECTS 35th European Symposium on Calcified Tissues Barcelona, Spain, 2008. május 24-28. Calcif Tissue Int 2008, 82(S1) Áron Lazáry, János P. Kósa, Bálint Tóbiás, Judit Lazáry, Bernadett Balla, Krisztián Bácsi, István Takács, Zsolt Nagy, Tibor Mező, Gábor Speer, Péter Lakatos: Single nucleotide polymorphisms in new candidate genes are associated with bone mineral density and fracture risk ECTS 35th European Symposium on Calcified Tissues Barcelona, Spain, 2008. május 24-28. Calcif Tissue Int 2008, 82(S1) Balla B, Kósa JP, Kiss J, Podani J, Takács I, Speer G, Nagy Zs, Lazáry Á, Bácsi K, Lakatos P: Immunológiailag releváns gének expressziójának összehasonlító elemzése osteoporotikus és nem-osteoporotikus nők csontszövetében. Magyar Osteoporosis és Osteoarthrológiai Társaság XVII. Kongresszusa Balatonfüred, 2008. május 21-24. Ca és Csont Lazáry Á, Kósa JP, Tóbiás B, Balla B, Bácsi K, Mező T, Takács I, Nagy Zs, Speer G, Lakatos P: Új kandidáns génpolimorfizmusok kapcsolata a csontdenzitással és a törési rizikóval, Magyar Osteoporosis és Osteoarthrológiai Társaság XVII. Kongresszusa Balatonfüred 2008. május 21-24. Ca és Csont Balla B, Kósa JP, Kiss J, Borsy A, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Orosz L, Lakatos P: Effect of estrogen deficiency on gene expression pattern in the bone tissue of postmenopausal versus premenopausal healthy women. ASBMR 29th Annual Meeting Honolulu, HI, USA, 2007. szeptember 16-19. J Bone Miner Res 2007, 22(S1):S261 G. Speer, Á. Lazáry, J.P. Kósa, B. Tóbiás, T. Mező, K. Bácsi, B. Balla, I. Takács, Z. Nagy, P. Lakatos. Multiplex SNP Genotyping and Data Analysis on 360 Hungarian Postmenopausal Women ASBMR 29th Annual Meeting Honolulu, HI, USA, 2007. szeptember 16-19. J Bone Miner Res 2007, 22(S1):

97

Áron Lazáry, Gábor Speer, Péter Pál Varga, Bernadett Balla, Krisztián Bácsi, János P. Kósa, Zsolt Nagy, István Takács, Péter Lakatos Effect of vertebroplasty filler materials on viability and gene expression of mouse and human nucleus pulposus cells ASBMR 29th Annual Meeting Honolulu, HI, USA, 2007. szeptember 16-19. J Bone Miner Res 2007, 22(S1): K. Bácsi, J. P. Kósa, B. Balla, Á. Lazáry, Z. Nagy, I. Takács, G. Speer, P. Lakatos Decreased activity of lactase phlorizin hydrolase and bone mineral density in postmenopausal women ASBMR 29th Annual Meeting Honolulu, HI, USA, 2007. szeptember 16-19. J Bone Miner Res 2007, 22(S1): Balla Bernadett, Kósa János, Takács István, Kiss János, Podani János, Borsy Adrienn, Lazáry Áron, Bácsi Krisztián, Speer Gábor, Orosz László, Lakatos Péter: Ösztrogén hiányában fellépõ génexpressziós változás vizsgálata posztmenopauzás és premenopauzás nem oszteoporotikus nõk csontszövetében. MOOT XVI. Kongresszus 2007 05 24 Balatonfüred Ca és csont. 2007 Vol 10 (2):51 Lazáry Áron, Speer Gábor, Kósa János, Tóbiás Bálint, Balla Bernadett, BácsiKrisztián, Nagy Zsolt, Takács István, Mezõ Tibor, Lakatos Péter: Multiplex SNPgenotopozálás és adatfeldolgozás 360 posztmenopauzás nõ vérmintájából. MOOT XVI. Kongresszus 2007 05 24 Balatonfüred Ca és csont. 2007 Vol 10 (2):59 Bácsi Krisztián, Kósa János, Balla Bernadett, Lazáry Áron, Horváth Csaba, Nagy Zsolt, Takács István, Speer Gábor, Lakatos Péter: A laktáz phloriion hidroláz és a csontdenzitás kapcsolatának vizsgálata posztmenopauzális nõkben. MOOT XVI. Kongresszus 2007 05 24 Balatonfüred Ca és csont. 2007 Vol 10 (2):50 Kiss János, Szlávy Eszter, Balla Bernadett, Kósa János: Egy három éves biszfoszfonátkezelés hatása a csontok fibrosus dysplasiájára. MOOT XVI. Kongresszus 2007 05 24 Balatonfüred Ca és csont. 2007 Vol 10 (2):57 A Folhoffer, P Ferenci, T Csak, A Horvath, D Hegedus, G Firneisz, J Osztovits, JP Kosa, C Willheim-Polli, L Szonyi, M Abonyi, PL Lakatos, F Szalay. Novel mutations os ATP7B gene among 109 Hungarian patients with Wilson disease. Benefits of genetic analysis, Gut 2006 SVII (54), A190 A. Borsy, B. Balla, I. Gyurján Jr, V. Stéger, A. Molnár, Z. Szabolcsi, J. P. Kósa, Z. Zomborszky, P. Papp, T. Vellai, P. Lakatos, L. Orosz: Red deer biology for biomedica research on human osteoporosis ECTS 33rd European Symposium on Calcified Tissues Prague, Czech Republic, Calcified Tissue International. 2006 Vol 78 (Supl 1):S74 Lazáry Áron, Balla Bernadett, Kósa János, Takács István, Nagy Zsolt, Speer Gábor, Bácsi Krisztián,Koppány Viktória, Lakatos Péter: A gipsz hatása az osteoblastok

98

osztódására és differenciálódársára in vitro. MOOT Kongresszus 2006 05 24-27 Balatonfüred Ca és csont. 2006 Vol 9 (1):22 Balla Bernadett, Kósa János , Borsy Adrienn, Kis János, Lazáry Áron, Takács István, Nagy Zsolt, Speer Gábor, Bajnok Éva, Bácsi Krisztián és Lakatos Péter: Génexpresziós mintázat vizsgálata postmenopausas egészséges és osteoporotikus nők csontszövetében. MOOT Kongresszus 2006 05 24-27 Balatonfüred Ca és csont. 2006 Vol 9 (1):11 Kósa János, Kis Adrián, Balla Bernadett, Lazáry Áron, Takács István, Nagy Zsolt, Speer Gábor, Mező Tibor, Bácsi Krisztián és Lakatos Péter: Tartós glükokortikoid terápia okozta osteoporosis létrejöttében résztvevő gének kimutatása osteoblast sejteken. MOOT Kongresszus 2006 05 24-27 Balatonfüred Ca és csont. 2006 Vol 9 (1):19 Kósa János, Kis Adrián, Nagy Zsolt, Speer Gábor és Lakatos Péter: Glükokortikoid indukálta csontvesztés kialakulásában szerepet játszó gének azonosítása egér MC3T3 sejtvonalon és calvaria osteoblast sejteken. MEAT XXI Kongresszus 2006. 05. 18-20. Debrecen Magyar Belorvosi Archivum. 2006. LIX. (S1):49 Balla Bernadett, Kósa János, Takács István, Lazáry Áron, Bácsi Krisztián és Lakatos Péter:Génexpressziós mintázat vizsgálata prae- és postmenopausas egészséges nők csontszövetében. MEAT XXI Kongresszus 2006. 05. 18-20. Debrecen Magyar Belorvosi Archivum. 2006. LIX. (S1):24 Takacs, J.P.Kosa, G. Speer, A. Tabak, Zs. Nagy, J. Kiss, P. Lakatos: Differential Gene Expression in Bone Tissue of Postmenopausal Osteoporotic and Healthy Women. ASBMR 26th Annual Meeting, 2004 Seattle J Bone Miner Res 2004, (S1) Koppány V, Takács I, Bajnok É, Tabák A, Speer G, Nagy Zs, Kósa J, Lakatos P: Ösztrogén receptor-alfa gén XbaI polimorfizmusa toxikus adenomában és thyreogén csontvesztésben. Orvosi Hetilap 2004. 145(S3):1093. MEAT XX. kongresszus 2004, Szolnok, előadás Kósa J, Nagy Zs, Puskás L, Zvara Á, Speer G, Takács I, Bajnok É, Kökény G, Hamar P, Lakatos P: Az ösztrogén aktívitás átfogó transzkripcionális vizsgálata: ösztrogén regulálta gének egér csontban. Orvosi Hetilap 2004. 145(S3):1093-1094. MEAT XX. kongresszus 2004, Szolnok, előadás Speer G., Cseh K., Kósa J., Szenthe P., Nagy Z., Tabák Á., Lakatos P.: A COL1A1 gén SP1 kötőhelyet érintő polimorfizmusa miokardiális infarktusban. Magyar Belorvosi Archivum. 2004. LVII. (november): 120. Takács I., Kósa J., Speer G., Nagy Z., Tabák Á., Kiss J., Lakatos P.: A génexpresszió különbségei postmenopausás osteoporosisban szenvedő és egészséges nőkben. Magyar Belorvosi Archivum. 2004. LVII. (november): 129.

99

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Lakatos

Péter professzor segítőkészsége közismert.

Mégis

megkülönböztetett

tiszteletemet, elismerésemet és külön baráti köszönetemet fejezem ki azért - a mellett, hogy a Klinikán laboratóriumában biztosította a kutatómunkámhoz szükséges feltételeket -

elindított ezen az úton, valamint, hogy munkám során végig mellettem volt és határozottan támogatott. Szakmai útmutatásán túl atyai jó tanácsai, kritikai megjegyzései is segítettek a dolgozat elkészítésében. Korábbi közleményeim és jelen dolgozatom elkészítésében útmutatásai irányítottak. Szeretném megköszönni témavezetőmnek, dr. Speer Gábor adjunktus úrnak baráti segítségét, bíztatását a Ph.D. dolgozat megírására és természetesen, hogy elvállalta témavezetésemet és a dolgozatom kijavításával is segítette munkámat. Különös hálával tartozom dr. Takács Istvánnak, dr. Nagy Zsoltnak és dr. Tóth Tamásnak az együtt végzett munkáért és a sok szakmai segítségért. Köszönöm kutatócsoportunk tagjainak, elsősorban Balla Bernadettnek, dr. Lazáry Áronnak, dr. Bácsi Krisztiánnak, dr. Kis Adriánnak, Tóbiás Bálintnak és mindazoknak, akik az

elmúlt évek során tanácsaikkal és kritikájukkal támogatták munkámat. Köszönetemet fejezem ki Podani János professzor úrnak, aki megismertetett a többváltozós statisztikával, nélküle a dolgozat statisztikai kiértékelése sokkal közérthetőbb és semmitmondóbb lenne. Köszönöm az ELTE Genetika tanszékén dolgozó kollégák segítségét, elsősorban Borsy Adriennek, Stéger Viktornak, Vellai Tibor és Orosz László professzor uraknak.

Köszönöm laboratóriumunk minden kedves munkatársának, elsősorban Szabóné Sinkovits Tünde, Keresztényi Györgyi és Máté Edit türelmét és gyakorlati segítségét. Végül feleségem és lányaim segítségét köszönöm, akik az otthon melegét biztosították, melyből bármikor erőt meríthettem.

100

101