Fej-nyak daganatok genomikai analízise

Fej-nyak daganatok genomikai analízise dr. Gombos Katalin előbírálati anyag PhD értekezéshez

Program és témavezető:

Dr. Ember István

Program és témavezető:

Dr. Kiss István intézetvezető egyetemi tanár Orvosi Népegészségtani Intézet

Daganatok Molekuláris Epidemiológiája Doktori Program Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Doktori Iskola vezetője: Dr. Kovács L. Gábor

Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar, 2016

TARTALOMJEGYZÉK

I. BEVEZETÉS .............................................................................................................4 I.1. Fej-nyaki daganatok epidemiológiája ...................................................................4 I.2. A szájüregi, mesopharynx és hypopharynx daganatok kialakulása .......................6 I.3. A pajzsmirigydaganatok kialakulása ....................................................................9 I.4. Genomika, génexpressziós vizsgálatok .............................................................. 11 I.5. Epigenetika és a miRNS szabályozás ................................................................. 13 1.6. A molekuláris epidemiológia szerepe a genomikai és epigenetikai vizsgálatokban ................................................................................................................................ 19 II. CÉLKITŰZÉSEK ................................................................................................... 21 II.1. Szájüregi laphámsejtes karcinoma miRNS mintázatának vizsgálata .................. 21 II.2. A szájüregi laphámrákok esetén azonosított miRNS-ek target mRNS molekuláinak expressziós vizsgálata ........................................................................ 21 II.3. A meso- és hypopharynx daganatok miRNS mintázatának vizsgálata ............... 22 II.4. Pajzsmirigydaganatok expressziós microarray .................................................. 22 III. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ........................................................................... 23 III.1. Mintagyűjtés ................................................................................................... 23 III.1.1Szájüregi daganatok mintagyűjtése ............................................................. 23 III.1.2. Meso- és hypopharynx laphámrákok mintái .............................................. 23 III.1.3.Pajzsmirigydaganatok mintagyűjtése ......................................................... 25 III.2. Laboratóriumi feldolgozás ............................................................................... 26 III.2.1. Szájüregi, meso-, hypopharynx és pajzsmirigy tumorok teljes RNS izolálása. .............................................................................................................. 26 III.2.2. Reverz transzkripció. ................................................................................ 27 III.2.3. Quantitatív real-time PCR. ........................................................................ 27 III.2.4. Microarray vizsgálat ................................................................................. 29 III.2.5. Statisztikai analízis ................................................................................... 31 IV. EREDMÉNYEK .................................................................................................. 33 IV.1. Szájüregi daganatok és a normál nyálkahártya miRNS mintázatának összehasonlító vizsgálata ......................................................................................... 33 IV.2. Szájüregi daganatok mRNS expressziója ......................................................... 44 IV.3. Meso- és hypopharynx daganatok térképbiopsziás mintáinak miRNS expressziós analízise ................................................................................................ 45 2

IV. 4. Pajzsmirigy microarray vizsgálat eredményei:................................................ 52 V. MEGBESZÉLÉS .................................................................................................... 56 V.1 Szájüregi, meso-és hypopharynx daganatok eredményeinek megbeszélése ........ 56 V.2. A pajzsmirigydaganatok microarray expressziós eredményeinek megbeszélése 63 VI. ÚJ EREDMÉNYEK ............................................................................................. 67 VII. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ............................................................................... 70 IX. IRODALOMJEGYZÉK ........................................................................................ 73 X. FÜGGELÉK ........................................................................................................... 86

3

I. BEVEZETÉS I.1. Fej-nyaki daganatok epidemiológiája A fej-nyaki régió a koponyaalap és kulcscsont közötti területet foglalja magában, ezért az itt előforduló daganatok mind lokalizációt tekintve, mind szövettanilag, mind pedig klinikai tünetképzés illetve viselkedés alapján nagyon sokrétűek. A szakirodalomban és a klinikai gyakorlatban is a fej-nyak tumorok kategória kettős entitást jelent. Szűkebb értelemben ide soroljuk a középfül, az orrüreg és az orrmelléküregek, a szájüreg, a garat,

a gége daganatait, tágabb értelemben

ide

tartoznak

a

pajzsmirigy,

mellékpajzsmirigy rosszindulatú elváltozásai, a nyálmirigyek és a régió bőrtumorai is. Magyarországon az összes daganatos morbiditás 3-4%-át kitevő fej-nyak daganatok felelősek az összdaganatos mortalitás 10%-áért (1). Az IARC Globocan statisztikai rendszer alapján Magyarország az európai országok között az első helyen áll az ajak, szájüreg és garatdaganatokat összesítő listán a daganatincidencia, mortalitás és 1-3-5 éves prevalencia tekintetében mindkét nemet illetően (2). Ez az a daganattípus, melynél az elmúlt 30 évet tekintve a legsötétebbek a hazai statisztikák, tekintve, hogy a mortalitási ráta a négyszeresére nőtt. Míg az 1980-as években Franciaország vezette az európai mortalitási listát, 16 esettel 100000 lakosra nézve és 2008-ban ezek az adatok 6 esetre redukálódtak, Magyarországon az 1980-ban regisztrált 8/100000 eset 2012-re 15,5/100000 esetre emelkedett, így mi lettünk a lista vezetői. Azok az országok, melyeket hasonló statisztikai sajátosságok jellemeznek fej-nyaki daganatok terén, sem rendelkeznek ilyen magas mortalitási mutatókkal (3, 4). A halálozási adatok növekedését támasztja alá a Központi Statisztikai Hivatal 2012-es adata is, mely szerint a szájüregi, garat daganatok okozta mortalitás korstandardizált aránya férfiak esetében 25,6/100 000 fő, nők esetében 5,4/100000 fő volt (4). A 2013-as évben felfedezett és bejelentett esetek a szájüreg és a garat daganatait illetően (BNO C00-C14) össesen 3665 esetet jelentenek férfiaknál és 1013-at nőknél, ehhez hozzáadódnak a gége daganatai, 1046 esettel a férfiaknál és 207 új megbetegedést számlálva a nőknél. Leggyakoribbak ezen lokalizáción belül a gége és a szájüregi régió tumorai, de a meso-, hypophyarynx daganatok előfordulása is folyamatosan emelkedik, mortalitásuk 50% feletti (5, 6). A szájüreg és gége malignus daganatainak száma az 55-60 éves populációban a 4

legmagasabb, ám egyre inkább megfigyelhető fiatalabb életkorban is. Az elszomorítóan magas mortalitás hátterében az áll, hogy ezek a daganatok legtöbbször késői stádiumokban (III., IV.) kerülnek felismerésre és a klinikai prognózisuk függ a hisztopatológiai stádiumuktól. Míg az I. és II stádiumú tumoros betegeknek az 5 éves túlélése 70%-ra tehető, ez a III., IV. stádiumúaknál csak 50% (7-9). A pajzsmirigydaganatok kialakulása mintegy 5 %-ban familiáris halmozódást mutat és a multiplex endokrin neoplázia szindrómák részeként jelentkezik. A fennmaradó 95%-ért környezeti etiológiai tényezők tehetők felelőssé. Kiemelt szerepe van az ionizáló sugárzásnak, amely elsősorban a papilláris pajzsmirigyrákok előfordulását segíti elő, valamint az adott földrajzi terület jódellátottságának, amely az összes göbös pajzsmirigy elváltozás gyakoriságát növeli (10). Magyarország a mérsékelten jódszegény országok közé tartozik, ezért sok göbös pajzsmirigy megbetegedés van. A betegség kockázata függ az életkortól. A pajzsmirigy carcinoma incidenciája jelenleg Európa különböző országaiban1,2-8/100000 férfiak esetén és 2,0-24,2/100000 nőknél, míg a halálozási arány 0,2-1,2/100000 férfiaknál és 0,4-9,9/100000 nőknél (11, 12). Magyarországon ez az arány 2012-ben férfiaknál 2,9/100000 és nőknél 8,8/100000, míg a halálozási arány a két nemben együttesen 0,6/100000. A 2013-as országos összesítésben regisztrált új esetek 162 pajzsmirigy malignomát jelentenek férfiaknál és 581-et a nőknél.

A

pajzsmirigy carcinoma ritka 16 év alatti gyermekekben és csak kivételesen fordul elő 10 éves kor előtt. Felnőttekben az incidencia az életkorral előrehaladva nő: 16-40 év között folyamatosan emelkedik, amit egy plató szakasz követ (13, 14). A benignus elváltozások előfordulási aránya a malignus tumorokénál jóval nagyobb, a népesség 510%-ánál jelentkezik élete során klinikailag szignifikáns pajzsmirigy göb. A népegészségügyi és klinikai problémát a rendkívül gyakori benignus elváltozások között a malignus daganatok megbízható elkülönítése és időben való azonosítása jelenti (1). Ennek fontos szerepe a lokális és szisztémás daganatinváziót megelőzően a korai stádiumban való daganat felismerésben van, mivel ebben a stádiumban a pajzsmirigy rosszindulatú szövetszaporulatai műtéttel teljes egészében eltávolíthatók, a betegek számára a teljes gyógyulás érhető el. A finomtű aspiráció közel 30 éve szolgál a pajzsmirigy elváltozások standard citologiai diagnosztikájának eszközeként, noha az így nyert minta 20-25%-ban önmagában alkalmatlan a pontos diagnózis felállítására. Ezekben az esetekben csak sebészi kimetszés és szövettani értékelés után válik lehetővé a pajzsmirigy elváltozás pontos meghatározása (10- 15). 5

I.2. A szájüregi, mesopharynx és hypopharynx daganatok kialakulása A fej-nyak tumorok 98%-a sporadikusan fordul elő, szekvenciális kialakulást mutat és a környezet által indukált (16). A tumoroknál számos környezeti tényező játszik szerepet a malignus daganat kialakulásában. Egyik legfontosabb etiológiai faktornak az orális prekurzor léziók (OPL) tartoznak. Ezek a leukoplákia, erytroplákia, orális hairy leukoplákia. A leukoplákia 3-25%-ban szenved el malignus transzformációt, az erytroplákia mintegy 50%-ban, ezért komoly figyelmet igényelnek a klinikumban (1718). Egyértelműen bizonyított, hogy a dohányzás kiemelt rizikófaktora a laphámráknak, különösen az Indiában elterjedt dohánylevél és bételdió rágás. Epidemiológiai vizsgálatok a bételdió rágás és a hagyományos dohányzás összehasonlításakor a bételdió rágással összefüggésben találták a szájüregi, elsősorban ajak és bucca daganatok magasabb incidenciáját (19). A dohányzás daganatkeltő hatása a cigarettafüstben nagy mennyiségben jelen lévő policiklusos aromás szénhidrogénekkel magyarázható, melyek pontmutációk, DNS egyes és kettős szál törések képződésén keresztül vezetnek diszplasztikus, daganatos elváltozáshoz. Közülük is kiemelendő a dimetil-benzantracén, a metil-kolantrén, a benzpirén (20, 16). A cigarettán kívül a pipázás, a bételdiórágás nem csak a garat, hanem ajak, szájüregi és bucca daganatok kialakulását is potencírozza (17, 19). Szájüregi garat- és gégedaganatoknál ki kell emelni az alkohol és dohányzás szinergista hatását (20). Az alkohol és a fej-nyaki daganatok közti kapcsolat régóta ismert. Az alkohol biokémiai átalakulása során keletkező acetaldehid a nyálkahártya funkcionális, metabolikus és morfológiai elváltozását okozza, illetve patogén mikróbák megtelepedéséhez vezet, ami krónikus gyulladásos állapotot tart fent (21-23). A gyulladás következtében fokozódó nyálkahártya diszplasztikus

proliferáció, léziók

halmozott

keletkeznek.

genetikai Az

érintett

elváltozások terület

és

ezek

karcinogenezisre

talaján való

fogékonysága nő. Az aldehid dehidrogenáz, az alkohol dehidrogenáz, a citokróm P450 enzimrendszer és a metilén tetrahidrofolát reduktáz génjeinek polimorfizmusában, vagyis az alkohol és a folát metabolizmusában is kereshető az összefüggés arra, hogy egyeseknél az alkoholfogyasztás miért növeli kifejezettebben a daganat kialakulásának rizikóját, míg másoknál miért kevésbé (24).

6

A Humán papillomavírus (HPV) szintén fontos szerepet játszik a fej-nyaki laphámrákok, kiemelten az oropharyngeális laphámrákok, (elsősorban a nyelvgyök és tonsilláris tumorok) kialakulásában. A HPV a papovavírusok családjába tartozik, több mint 110 altípusa ismert. Örökítőanyaga cirkuláris kettős szálú DNS (25). A HPV benignus elváltozásokért – mint a papillóma – és malignus daganatok kialakulásáért – főként verrucosus és basaloid laphámrákok – egyaránt felelőssé tehető (26). A vírusgenom episzomális jelenléte a hámsejtek jóindulatú proliferációját indukálja. Ha azonban linearizálódik és integrálódik a nukleáris genomba, rosszindulatú elváltozást képes kialakítani (27). Epidemiológiai szempontból a vírus alfajokat a malignus daganatok kialakulásának kockázata szempontjából alacsony, közepes és magas kockázatú vírus alfajok szerint csoportosítjuk (28). Azonban arra is van adat, hogy alacsony rizikójú vírus karcinómát alakíthat ki; ez úgy lehetséges, hogy a vírus episzomálisan lévő cirkuláris DNS-e linearizálódik, és így képes beépülni a genomba (29, 30). A vírus DNS állománya nyolc nagy proteint kódol. Az L1 és L2 víruskapszid fehérjék episzómális expressziója a HPV fertőzés jelenlétét, a vírusproliferációt jelzi, míg a daganatos transzformációért két onkoprotein, az E6 és E7 felelős; az E6 gén által kódolt fehérje a p53 fehérjét, míg az E7 gén fehérjéje a retinoblastoma tumor szuppresszor fehérjét (Rb) inaktiválja, ennek következményeképp gátlódik az apoptózis és károsodik a sejtciklus szabályozása (31). Az E7 fehérje Rb gátló hatása a p16 fehérje megjelenésével

mutat

szoros

összefüggést,

immunhisztokémiai

kimutatása

a

vírusgenom integrálódásának megbízható markere. A HPV típusa és a tumor lokalizációja között szoros az összefüggés, a nyelvgyöki területen és a garatban a HPV 16 és 73 mutat különösen magas előfordulást (26-32). A garat daganatainak HPVpozitivtása 40% felett van (25,33). A nők fej-nyaki daganatainak a fertőzöttsége duplája a férfiakénak (26). A HPV-pozitív oropharyngeális tumorok az alkohol és dohányzás által indukált HPV negatív tumoroktól jól elkülöníthető molekuláris sajátosságokkal rendelkeznek, vad típusú p53 jelenléte és magas p16 fehérje expresszió jellemző rájuk. Klinikai szempontból is eltérő módon viselkednek, radio- és kemoterápiára jól reagálnak, kevésbé jellemző rájuk a lokális recidíva és a szekunder primer tumor kialakulása, jobb prognózisúak. Mindezen szempontok miatt az oropharyngeális laphámsejtes daganatok rutinszerű HPV genotipizálása klinikai és epidemiológiai szempontból is fontos volna (34, 35). Valószínűleg szoros összefüggés vonható a

7

szexuális szokások, az anogenitális traktus HPV fertőzöttsége és a garatdaganatok kialakulása között (36). Epstein-Barr vírus (EBV) bizonyítottan szerepet játszik, és szoros összefüggésbe hozható a nasopharygealis daganatok kialakulásával (37, 38). Mindezek mellett a rossz szájhigiéne, a vegyszer expozíciók, környezeti karcinogének, táplálkozási hiányállapotok is szerepet játszhatnak a fej-nyaki daganatok kialakulásában (39, 40).

Környezeti és életmódbeli tényezők

Fej-nyak daganat kialakulásának esélyhányadosa férfiak

nők

dohányzás és tumor s együtt

1,5-37,7

5,1-107,9

alkohol

1,7-8,8

1,3-9,1

dohányzás

1,9-3,6

2,9-5,0

már kialakult rákmegelőző állapot (leukoplakia)

12,7

4,3

magas kockázatú HPV fertőzés (16+18)

6,2

alacsony kockázatú HPV fertőzés (6+11)

2,8

I. táblázat: A fej-nyak daganatok kialakulását elősegítő legjelentősebb környezeti és életmódbeli tényezők és azok rákkialakulás kockázatában játszott szerepe A fej-nyak daganatok kialakulásának jelenleg széles körben elfogadott modellje, az úgynevezett cancer-field avagy daganat szöveti szerveződési terület elmélet. A teljesen ép, egészséges enyhén elszarusodó laphámon, nyálkahártyán több környezeti ártalom eredőjéből, több genetikai változás (például: kromoszóma aberráció, pontmutáció, amplifikáció) jön létre. Ezek a károsodást elszenvedett iniciált sejtek a mucosa stratum basaléjában találhatók, melyekből osztódással egy folt lézió (patch) fejlődik ki, amely a megváltozott genetikai állományú sejtek „leánysejtjeit” tartalmazza. Így az eredeti genetikai változásból, klonális expanzió révén létrejön a cancer-field (41, 42). Ez a terület klinikailag illetve hisztopatológiailag sem mutat eltérést a normál mucosához képest. A cancer-field létrejötte elősegíti az OPL kialakulását: leuko-erytroplakia. A prekurzor lézióban létrejövő további genetikai és epigenetikai változások in situ illetve 8

invazív tumor létrejöttét eredményezik. Természetesen a cancer-field újabb, egyidejű prekurzor léziók és második primer tumor fejlődését is könnyen elősegítheti (43).

1. ábra: A fej-nyak daganatok kialakulásának szekvenciája és összefüggése a laphám rákokban igazolt genetikai eltérésekkel (forrás: Robert I Haddad, Dong M Shin: Recent advances in head and neck cancer, NEJM 359:1143-1154, 2008)

I.3. A pajzsmirigydaganatok kialakulása A pajzsmirigy rosszindulatú daganatainak 90%-a follicularis sejtekből, azaz a thyreocytákból indul ki. A rosszindulatú pajzsmirigydaganatok mintegy 70-80%-át a papilláris karcinóma (PTC) adja (44). A daganat gyakran infiltratív módon növekszik, multicentrikus és gyakran ad nyirokcsomó áttétet. A daganatok 15-20%-a follikuláris karcinóma. A follikuláris karcinóma a benignus adenómához szövettani szempontból nagyon hasonló, a malignitás megítélésében az érinvázió és a daganat-tok beszűrődése ad támpontot. A parafollikuláris sejtekből származik a primer pajzsmirigydaganatok 35%-a, a medulláris karcinóma (más néven C-sejtes karcinóma). A daganat 80%-ban sporadikus, 20%-ban a multiplex endokrin neoplázia 2A-2B klinikai tünetegyüttesének részjelenségeként manifesztálódik. A pajzsmirigyrákok közel 5 %-át az anaplasztikus 9

(differenciálatlan) karcinómák adják, amelyek többnyire a korábbi differenciált formákból alakulnak ki, de ritkán de novo is keletkezhetnek (44, 45). A follikuláris sejtekből kiinduló daganatok génmutációi fontos szerepet játszanak a különböző szövettani

típusú

karcinómák

kialakulásában,

illetve

az

egymásból

történő

átalakulásban.

2. ábra: A Pajzsmirigydaganatok kialakulásában és dedifferenciálódásában szerepet játszó mutációk A pajzsmirigy follikuláris sejtjeiből kiinduló rosszindulatú daganatok diferenciált papilláris carcinoma valamint follikuláris típusú daganatok csoportjaiba sorolhatók. A legtöbb daganatban azonosítani lehet olyan genetikai módosulást, amely megváltozott jelátviteli aktivációban játszik szerepet. A PTC mintegy 50%-ban tartalmaz BRAF gén mutációt, mely döntő többségében a V600E valin/glutamát szubsztitúciót eredményez a fehérjetermékben (46). A RAS géncsalád mutációja (K-RAS, H-RAS, N-RAS) mintegy 20-40%-ban megtalálható a follikuláris adenomákban is, 40-50%-ban a FTC-ben, mintegy

10-15%-ban

a

PTC-ben,

20-55%-ban

a

rosszul

differenciált

pajzsmirigyrákokban (PDTC) és 20-60%-ban az anaplasztikus daganatokban (47, 49). A RET génre jellemző interkromoszomális transzlokáció a PTC 20-40%-ában és a PDTC kevesebb, mint 10%-ánál mutat ilyen eltérést (50-52). A FTC esetén gyakran előfordul a PAX8/PPARϒ fúziós gén módosulás is (53). A jódhiány a differenciált pajzsmirigydaganatok megoszlását jelentősen megváltoztatja, a jól differenciált PTC

10

aránya kisebb, míg a rosszabb prognózisú FTC előfordulása gyakoribb a jódhiányos területeken (54, 55). A mutációs spektrum ismerete azonban sajnos nem elegendő a daganatok biológiai viselkedésének megítélésére és prognosztikájára. A daganatok molekuláris viselkedése egy széles funkcionális genomikai hálózat működésétől függ, mely a nukleáris és mitokondriális DNS mRNS és szabályozó miRNS interferencián alapul. A megváltozott mRNS és miRNS struktúra és funkció eredhet a daganatokban előforduló DNS szekvencia módosulásból esetleg direkt onkogén aktiváció hatására is létrejöhet.

I.4. Genomika, génexpressziósvizsgálatok Az előző alfejezetekben bemutatásra került a fej-nyak daganatok kialakulását befolyásoló tényezők szerepe. Ezeket a tényezőket összegezve külső környezeti (fizikai, kémiai és biológiai és szociális környezetünk), életmódbeli, pszichés és öröklött vagy szerzett genomikai és epigenetikai szerepük szerint lehet csoportosítani. Látható, hogy esetenként eltérő mértékben ugyan, de egyaránt meghatározzák egy-egy daganattípus kialakulását. A sejtek szintjén daganatképződés minden esetben mikroevolúciós folyamatként értelmezhető: egy szomatikus sejt sorozatos genetikai változásai során előnyt szerzett utódsejtjeiből indul ki (3. ábra). A változások a sejtben található nukleáris és mitokondriális DNS-t érintik, és a sejt homeosztázisát fenntartó génkészlet összehangolt működésében bekövetkező zavart hoznak létre (17, 58, 59). A betegség kialakulásának hátterében álló összetett genetikai mechanizmusok feltárása jelenleg is intenzív kutatások tárgya.

11

3. ábra: Karcinogenezis A tumor genom szekvenálása, valamint a molekuláris genetika és az informatika napjainkban zajló fejlődése megteremtette a genom léptékű molekuláris genetikát, a genomikát. A genomika két fő kutatási iránya a strukturális és a funkcionális genomika. A strukturális genomika a betegségek illetve az arra hajlamosító génváltozatok (mutációk, polimorfizmusok) azonosítása, valamint azok együttes öröklődésének (kapcsoltsági analízis) és haplotípusainak (asszociációs analízis) vizsgálata. Szerepe a fej-nyak daganatok és pajzsmirigy daganatok vonatkozásában a meghatározott génrégiókhoz köthető eltéréseinek felderítésében és az új diagnosztikai és terápiás eljárások kifejlesztésében van. A genomika másik nagy irányzata, a gének kifejeződését vizsgáló funkcionális genomika lehetőséget nyújt az általunk vizsgált daganattípusok összetett külső és belső etiológiai tényezők által befolyásolt transzkripciót érintő változások monitorozására (61, 62). A nagyfelbontású, több tízezer gén együttes expresszióját vizsgálni képes génexpressziós microarray módszerek segítségével képesek lehetünk új, a tumorok patogenezisében eddig még nem vizsgált gének azonosítására, valamint azok kapcsolatrendszerének a feltárására (63, 64). Az elmúlt évtizedben teret hódító microarray technikákkal lehetővé vált nagyszámú gén expressziójának összehasonlítása egymástól eltérő sejtekben, szövetekben, illetve ugyanazon típusú sejtek vagy szövetek eltérő állapotaiban. A messenger RNS (mRNS) 12

expressziós microarray-k lehetőséget nyújtanak a tumorgenom genetikai eltéréseinek és a

gének

expressziós

mintázatának

átfogó

analízisére,

új,

eddig

ismeretlen

betegségspecifikus genetikai változások azonosítására. Ezek az eltérések azokra a kromoszómális régiókra, génekre hívják fel a figyelmet, melyek specifikusan érintettek egy adott daganat típus esetén, vagy a karcinogenezis meghatározott stádiumában (6567). Az mRNS expressziós microarray technika során a kiválasztott és a vizsgálatban szereplő génekkel komplementer, tumor génspecifikus target oligonukleotidokat szilárd hordozóhoz kötik. Ehhez a felülethez hibridizáltatják az adott sejttípusból származó RNS-ről készített jelölt egyszálú cDNS (ritka esetben cRNS) molekulákat. A hibridizáció mértékéből lehet következtetni a vizsgált gének expressziós szintjére. A nagyszámú gén kifejeződésének egyidejű vizsgálata révén szerzett információ lehetőséget nyújt arra, hogy a microarray-k segítségével újabb, a daganatkialakulás folyamatát jellemző gének szerepét térképezzünk fel (63, 67).

I.5. Epigenetika és a miRNS szabályozás A humán genom mintázatainak értékelése igen összetett, és a környezetnek sokkal jelentősebb szerepe van a sejt DNS állományának modulálásában, mint ahogy azt korábban hittük. A környezeti hatások és a genetikai kód közötti kapcsolatot az epigenetikai tényezők jelentik, melyek a humán genom gyors adaptációjáért felelősek, a folyamatosan változó fizikai, kémiai és biológiai környezetben. Ennek következtében nagy szerepet játszanak az egyént meghatározó tulajdonságok létrejöttében. Az epigenetika definíció szerint magában foglalja azokat az öröklődő, fenotípusbeli és génkifejeződésbeli változásokat, melyek nem járnak együtt a DNS szekvencia megváltozásával. Az epigenetikai mechanizmusok közé tartozik a DNS metiláció, a hisztonfehérje módosulások, a kromatin remodeling, a polycomb fehérjecsoportok és a rövid nem kódoló RNS molekulák (miRNS, siRNS, piRNS és snoRNS és snRNS) által közvetített szabályozás (68-70). A mikro-RNS-ek (miRNS) molekulacsoportját az 1990-es években fedezték fel egy mikroszkopikus nematódában (Caenorhabditis elegans). Ezt követően más fajokban majd humán vonatkozásban is azonosították jelenlétüket (71). A miRNS-ek rövid, 1925 bázispár hosszúságú RNS szekvenciák, melyek intra- és intergenikus szakaszról 13

íródnak át. Nem transzlálódnak, így fehérjeterméket nem kódolnak. Szintézisük több lépéses folyamat: a transzkripciót RNS-polimeráz III. végzi. Az átírás során létrejövő elsődleges termék egy 1-3 kb hosszú, kettős szálú prekurzor molekula, a primer miRNS (pri-miRNS). Jellegzetessége, hogy szekunder hajtű-struktúrákat (stem loop) tartalmaz. Ezután a DROSHA endoribonukleáz és kofaktora, a DGCR-8 (di George syndrome critical region) a stem loop részeket leválasztja. Az így keletkezett 70-100 nukleotid hosszúságú pre-miRNS már képes kijutni a citoplazmába a Ran-GTPáz aktivitású Exportin-5 segítségével. Az érett miRNS végső kialakítását a DICER ribonukleáz és kofaktora, a TRBP (Tar RNA binding protein) végzi a terminális hurok eltávolításával, és így kialakul a 19-25 bázispár hosszúságú, kettős szálú miRNS. Ez egy aktív vezérszálból és egy passenger szálból áll. A dupla szálú (ds) miRNS beépül a RISC-be (RNA induced silencing complex) ribonukleotid komplexbe. Itt a kettős szálú miRNS szétcsavarodik, elválik egymástól, majd a vezérszál stabilizálódik a passenger szál pedig elbomlik. Ezt követően kötődésük a mRNS-sel a RISC komplexhez kapcsoltan történik. A RISC, dsRNS kötő fehérjéket, protein kináz RNS aktivátort valamint argonauta fehérjéket (emlősökben négy változat ismert: AGO-1-4) tartalmaz. A komplexet a miRNS irányítja a vele homológ szakaszokat tartalmazó mRNS szálhoz. A miRNS a cél mRNS-hez kötődve szabályozza annak működését. A szabályozás történhet a target mRNS 3’ UTR (untranslated region) szakaszához történő kapcsolódással, de kötődhet az 5’ UTR szakaszhoz vagy ORF-hez (open reading frame) is. Így a miRNS blokként gátolja a transzlációt, vagy lebontó endonukleázokat aktiválva a mRNS degradációját okozza. A kötődéshez, így a szabályozáshoz a humán sejtekben nem szükséges a teljes komplementaritás (72-74). Eddig több mint 30000 miRNS-t azonosítottak (www.mirbase.org). Az emberi genom hozzávetőlegesen 50-60%-át szabályozzák a miRNS-ek. Az érett miRNS mRNS-hez kötődő specifikus (seed) régiójának rövidsége miatt (5-10 mer) viszonylag kis számú szekvenciavariánssal lefedhető a teljes mRNS exom. Ebből kifolyólag egy mRNS-t több miRNS szabályozhat, és egy miRNS több mRNS transzlációját befolyásolhatja (72-73). Ezáltal válik lehetővé a génexpresszió finom hangolása, a sejt életfolyamatainak – a differenciáció, a sejtosztódás, az apoptózis, az intermedier anyagcsere folyamatok gyors és harmonikus szabályozása, a homeosztázis fenntartása (75). Ha a sejtek életfolyamatainak bármely területén változás következik be, a miRNS mintázat, a miRNS-ek mennyisége és szabályozó képességük módosulása az élettani funkciók 14

megváltozásához vezet. Gyulladásos folyamatokban, szövetkárosodás során, daganatos betegségekben detektálhatók az ilyen eltérések. Ugyanakkor természetes élettani folyamatokban, például a magzati növekedés és differenciáció kapcsán a magzat és a placenta folyamatos miRNS kifejeződés változása is megfigyelhető (76, 77). Adott szövet daganatos és egészséges sejtjeit összehasonlítva a miRNS mintázat eltérést mutat. Ez egyrészt eredhet közvetlenül a DNS szekvencia sorrendet érintő struktúrális változásból, mivel a miRNS gének többnyire olyan intergénikus szakaszokon, fragilis kromoszóma régiókban találhatók, melyek daganatokban gyakran szenvednek mutációt, deléciót, transzlokációt, töréseket (72, 73). Genom szintű változásokon kívül a miRNSek érése során bekövetkező módosulások, epigenetikus eltérések is vezethetnek eltérő miRNS kifejeződéshez (78, 79). Ezen kívül a miRNS-ek vezikuláris aktív transzportja is bizonyítást nyert (80). A megváltozott miRNS szabályozást mutató sejt így a szomszédos sejtekben zajló poszttranszkripciós szabályozó folyamatokra is hatással lehet, néhány közleményben a szöveti szerveződést, morfosztázist fenntartó illetve azt befolyásoló faktorként említik (81, 82). A miRNS-ek strukturális és funkcionális változásai hidat képeznek a genetikai és epigenetikai szintű változások között. Kismolekulák, melyek külső hatásra azonnali funkcionális genomiális változásokat indukálhatnak, ugyanakkor megteremtik a génkifejeződés stabil kémiai hátterét az egyes sejtgenerációk között. Aszerint, hogy mely gént regulálják, a miRNS-ek viselkedhetnek onkogénként (onkomir) illetve tumorszupresszor génként (83, 84). A miRNS-ek kifejeződése nagyfokú sejt és szövet specificitást mutat, mely meghaladja a mRNS és hosszú nem kódoló RNS szakaszok (lncRNS) szöveti szintű kifejeződésbeli eltéréseit. A miRNS-ek kémiailag nagyon stabil szerkezetűek és magas átható képességű molekuláris vizsgálatokkal jól reprodukálhatóan kimutathatók szövetekből, szérumból, plazmából, nyálból, vizeletből és egyéb testnedvekből, még formalin fixált paraffinba ágyazott archív patológiai szövetmintákból is (85). A miRNS expressziós profil-elemzés a fej nyak daganatokon kívül számos más daganatos megbetegedés vonatkozásában mutatkozott alkalmasnak a normál és tumor szövet

differenciálására és a

szövetspecifikus alcsoportok elkülönítésére (78-88).

15

A vizsgálatainkban alkalmazott és a dolgozat érdeklődésének fókuszában álló fej-nyak daganatokban jellegzetes expressziós eltéréseket mutató miRNS-eket a II. táblázat mutatja be.

miRNS

kifejeződés a fej-nyak daganatokban

miR-21

fokozott

miR-27a

fokozott

miR-34a

csökkent

miR-93

csökkent/fokozott

miR-143 miR-146a miR-148a miR-155 miR-191 miR-196a miR-203 miR-205 miR221/222 miR-223

target gén p53, PDCD4, SMAD PLK2 p53, SIRT DH-2, PTEN

funkció tumor gátlás, növekedés és osztódás fokozása, fokozott invazivitás és migráció, TGF-β aktiváció, epiteliálismesenchimális átalakulás tumor gátlás, fokozott sejtproliferáció tumor serkentés, növekedés gátlás, sejtdifferenciáció nem tisztázott, fokozott tumor és annak gátlása is igazolt

invázió és migráció gátlás, csökkent sejtadhéziós képesség gyulladásos jelátvitel antiapoptotikus jelátvitelhez való fokozott PPARγ kapcsolása, NFκB konstitutív aktiváció sejtdifferenciációhoz valamint kemoterápia csökkent/fokozott ? érzékenységhez kapcsolódóan volt kimutatható p53, SOCS, epiteliális-mesenchymális transzformáció, fokozott STAT daganatinvázió TGF-β? fokozott? malignus transzformáció, sejtmigráció? TIMP3? JNK, fokozott daganat progresszió, sejtinvázió TIMP,MMP fokozott FGF neoplasztikus transzformáció tumor szabályozás, PTEN gátlás és aktiváció fokozott/csökkent PTEN szövettípustól függően csökkent

GLI3

fokozott

p27, PTEN

fokozott

JNK

sejtciklus reguláció gátlása, tumor gátlás tumor gátlás

II. táblázat: miRNS kifejeződés tumor daganatokban A miR-21 szerepét a fej-nyak daganatok kialakulásában számos korábbi tanulmány igazolta. A miR-21 elsődleges célmolekulája a sejtciklus szabályozásában szerepet játszó Tp53 gén mRNS terméke, melynek fehérjetranszlációs gátlása révén jelentős onkomirként szerepel (90, 91). Fokozott kifejeződését bizonyították melanoma malignumban és szájüregi lokalizációjú squamocelluláris carcinomákban (92). A miR-34a az irodalmi adatok alapján egybehangzóan tumor szuppresszor tulajdonságú miRNS,

melyet

elsősorban HPV asszociált

fej-nyak daganatokban csökkent

kifejeződéssel azonosítottak (93). Fokozott expressziójukat elsősorban vad típusú p53 16

gén jelenléte esetén lehet kimutatni. Az NFκB p65 alegység végzi a miR-34a promoter specifikus transzkripcióját. Az NFκB kötődése nem jön létre p53 mutáció esetén. Apoptózist serkentő hatásukat a sirturin géncsalád (SIRT1 és SIRT6) mRNS termékeinek gátlása révén fejti ki (94, 95) A miR-93 szerepe a daganatkialakulásban még erősen tisztázatlan. Az irodalmi adatok számos

ellentmondásos

eredményt

tartalmaznak.

Nasopharyngeális

karcinóma

sejtvonalakon emelkedett expressziójuk igazolódott miRNS expressziós microarray vizsgálat során. Szerepét kimutatták HIF-1 és NFκB gátlása révén az apoptotikus folyamatok serkentésénél, másrészről PTEN gátlása révén ellenkező irányú apoptózis szabályozásban is (96, 97). Nasopharyngeális karcinómában igazolták a miR-143 daganatinvázió gátló hatását a GLI family zinc finger 3 (GLI3) gén mRNS termékének csendesítésén keresztül. A miR143 tumorszuppresszor funkciójával kapcsolatban azonban fej-nyak daganatok vonatkozásában még kevés az irodalmi adat (98). A miR-146a és miR-196a az NFκB antiapoptotikus jelátviteli folyamatokban központi szerepet játszó gén promoter specifikus represszorának, a peroxisome proliferatoractivated receptor γ-nak (PPARγ), hatékony gátlói (100). Szerepük a gyulladásos folyamatok és a karcinogenezis kapcsolódási pontjaiban, a gyulladásban levő sejtek immortalizációjában jelentős (101, 102). A miR-155 egy fej-nyak daganatok esetén gége laphám karcinomában korábbi tanulmányok során azonosított miRNS, mely a sejtciklus folyamatos aktiválódását, apoptózis gátlást, daganatinváziót segíti elő a p53 gátlása révén, valamint a suppressor of cytokine signaling proteins (SOCS) fehérjecsalád és a signal transducer and activator of transcription (STAT) transzkripciós faktor gátlásával (103, 104). A miR-191 a hypoxia inducible factor -1 (HIF-1) által aktivált miRNS. Transzkripciója részben NFκB által történik és a transforming growth factor β (TGF-β) kifejeződését serkenti még pontosan nem ismert mechanizmus szerint hipoxiás körülmények között (105). A miR -203 és -205 szerkezetüket tekintve sok hasonlóságot mutató miRNS-ek, szerepük mégis eltérő. A miR-203 elsősorban neoplasztikus transzformációért felelős, 17

egyértelműen onkomirként számontartott szekvencia, melynek szerepe fej-nyak laphámsejtes daganatokban, szájüregi, oesophagus és cervix laphámrákokban is igazolt. A miR-205 szerepe erősen kérdéses. A PTEN transzlációt gátló és serkentő hatását is megfigyelték

különböző

sejtvonalakon,

de

adenocarcinoma

laphámkarcinoma

elkülönítésnél alkalmazható markernek bizonyult tüdődaganatokból származó biopsziás mintaanyagon (106, 107). A miR-221 és -222 nagyfokú homológiát mutató miRNS-ek. Szájüregi daganatok esetén a

daganatok

rossz

prognózisával

és

a

tumorinvázió

mértékével

mutatott

összefüggéseket. Hatásuk a sejtciklus szabályozásában résztvevő p27 transzlációs gátlása révén fejtik ki. (108, 109). A miR-223 fokozott expresszióját elsősorban nyelőcső eredetű laphámrákokban igazolták több ízben. Egy esetben azonban nasopharyngeális karcinóma miatt kezelt betegek serum mintáiból is kimutatták emelkedett mennyiségű jelenlétét a keringésbe jutó miRNS frakcióban (110). Az említett miRNS-eket fókuszált vizsgálatokban, önmagukban, illetve nagy áthatoló képességű vizsgálatokban genom szinten elemezte az irodalom. Együttes, többféle lokalizációból származó primer humán laphámsejtes karcinómán történő értékelésük eddig még nem valósult meg.

A fej-nyak daganatok vonatkozásában általam

kiválasztott miRNS-ek legtöbbje közvetlenül vagy közvetett módon kötődik az NFκB jelátviteli rendszerhez, együttes vizsgálatuk ebből a szempontból is érdekes lehet. Ez a jelátviteli hálózat Toll-like receptorokon, TNFα receptoron, Tirozin-kináz receptoron és adhéziós receptorokon (pl. T-sejt receptorok) keresztül aktiválódó transzkripciós faktor, amely elsősorban a sejttúlélést és sejtproliferációt segíti elő. Széleskörű receptoriális aktivációja miatt számos fizikai és biológiai hatás képes aktiválni (bakteriális, virális antigének, UV, lymphotoxin, TNFα, szabadgyökök stb). Aktivációjakor a sejt túléléséhez szükséges antiapoptotikus folyamatokat elősegítő és az apoptotikus folyamatokat gátló fehérjék átíródását serkenti (111-113). Normál esetben nagyon kis mértékben expresszálódik a sejtekben, ill. a jelen lévő NFκB fehérje egy őt inaktiváló IKB komplexhez (Inhibitor kappa B α +β egységhez) lehorgonyozva található a cytoplasmában. Aktivációkor ezt a kötést egy ún NEMO (IKBγ komplex) lehasítja (foszforilálja az IKB α+β IKK segítségével) és az NFκB p50 és p65 (más néven RelA) alegységek felszabadulnak, transzportálódnak a sejtmagba, ahol transzkripciós aktivátorként és promoter specifikus aktivátorként szerepelnek az antiapoptotikus 18

fehérjék átírásakor, ill. a proapoptotikus fehérjék transzkripciós represszorai (4. ábra; 111).

4. ábra: Az NFκB jelátviteli rendszer receptoriális aktivációja (átdolgozott ábra, forrás: www.clinsci.org)

I.6. A molekuláris epidemiológia szerepe a genomikai és epigenetikai vizsgálatokban Az elmúlt évtizedben a molekuláris biológia technológiai eszköztára óriási fejlődésen ment keresztül, lehetővé téve az emberi genom egyidejű vizsgálatát a teljes DNS szekvenciára és az arról átíródott teljes RNS transzkriptomra vonatkozóan. 2001-re a Human Genome Project keretein belül megvalósult a humán haploid genom teljes szekvenálása, ezt követően párhuzamosan az azonosított gének kromoszóma lokalizációjára, funkciójára és kifejeződésére irányuló vizsgálatok, valamint a diploid genomra vonatkozó allél polimorfizmus vizsgálatok is elindultak és a genom átfogó analízise népegészségügyi vonatkozásban is megjelent (64-66, 114-116). Megszületett a Human Genome Epidemiology (HuGE), a molekuláris epidemiológia genomikát magában foglaló iránya. A megelőző orvostan örök törekvése, hogy a betegségeket egy nagyon korai stádiumban, a patomorfológiai és klinikai manifesztációt megelőzően felismerje. A törekvés alapja, hogy korai fázisban, vagy ennél is szerencsésebb esetben a betegségmegelőző állapot felismerésekor a folyamatok nagyobb arányban és hatékonyabban kezelhetők, sőt esetleg visszafordíthatók. Megakadályozható ezáltal a 19

betegség folyamatának progressziója, generalizációja és a szövődmények is. Mivel a daganatos betegségek kialakulása a környezeti tényezők és genetikai-epigenetikai faktorok interakciójából ered, érthető az a törekvés, hogy a felismerést, az azonosítás lehetőségét minél korábbi stádiumra, illetve az azt megelőző, még csak a potenciális veszélyeztetettséget jelentő, magas kockázattal járó periódusra hozzuk előre. A biomarker azonosítás és fejlesztés folyamatának elengedhetetlen eszköze a molekuláris epidemiológia is (5. ábra, 69, 87).

5. ábra: A molekuláris epidemiológia kapcsolódási pontjai a molekuláris genomika elemeihez

20

II. CÉLKITŰZÉSEK II.1. Szájüregi laphámsejtes karcinoma miRNS mintázatának vizsgálata A korai stádiumú szájüregi daganatok autológ normál szájnyálkahártya szövetek miRNS expressziós eltéréseinek azonosítása révén vizsgálatunk célja egy 12 miRNS-t tartalmazó daganatspecifikus biomarker panel összeállítása volt. Az általunk kiválasztott miRNS-ek egy részét a szájüregi daganatképződésben az irodalmi adatok alapján igazoltan résztvevő miRNS-ek közül választottuk (miR-21, -34a, -146a, -155, 221). Ennek célja az volt, hogy eredményeink összevethetőek legyenek a módszertanilag megegyező irodalmi adatokkal, azonban vizsgálatainkhoz számos olyan miRNS-t is kiválasztottunk, melyek a p53 és NFκB jelátviteli útvonalhoz kapcsolódó mRNS termékeket szabályoznak, de szerepük a szájüregi daganatokban még nem igazolódott (miR-27a, -148a, -196a, -223). Célunk volt továbbá az is, hogy miRNS expressziós eredményeinket a daganat klinikai, szövettani sajátosságaival és a betegek környezeti és életmódbeli etiológiai tényezőivel is összehasonlítsuk. Ilyen módon lokalizáció-specifikus, daganat stádium- és szöveti grade- specifikus, valamint egyes expozícióra specifikus miRNS kifejeződés mintázatot szerettünk volna azonosítani.

II.2. A szájüregi laphámrákok esetén azonosított miRNS-ek target mRNS molekuláinak expressziós vizsgálata A szájüregi daganatokban az első vizsgálatsorozatban kiválasztott szignifikáns expresszió változást mutató miRNS-ek target mRNS molekulái közül célzottan az NFκB jelátviteli útvonalhoz kapcsolódó receptoriális és transzkripciós fehérjéket kódoló mRNS-ek (tumor nekrózis faktor α interacting protein 1(Tnip1), vascular cell adhesion molecule (Vcam), nukleáris faktor kappa B 1 és 2 (Nfκb1, Nfκb2), Toll-like receptor-1 (Tlr1) és inhibitor of κ light polypeptide gene enhancer in B-cells, kinase γ (Iκbkg) expressziójának vizsgálata volt a célunk. Olyan miRNS-mRNS molekuláris szabályozó modulokat szerettünk volna bemutatni, amelyek funkcionális szerepet játszanak a gyulladások és a karcinogenezis kapcsolatában.

21

II.3. A meso- és hypopharynx daganatok miRNS mintázatának vizsgálata Mesopharynx és hypopharynx daganatokban általunk meghatározott térképbiopsziás mintavételi stratégia szerint a daganatok és a daganatot körülvevő ép nyálkahártya miRNS kifejeződésének mintázatát szerettük volna elemezni. Célunk a körülvevő

morfológiailag

ép

szövetek

miRNS

kifejeződési

daganatot

mintázatainak

összehasonlításával a tumortól való távolság függvényében a karcinogenezist elősegítő molekuláris szerveződési terület kiterjedésének modellezése volt. Vizsgálatunkat a szájüregi daganatoknál legkifejezettebb eltéréseket mutató miRNS markerek (miR-21, 27a, -34a, -143, -146a, -148a, -155 és -221) alkalmazásával terveztük.

II.4. Pajzsmirigydaganatok expressziós microarray Vizsgálatunk során a korai stádiumú follikuláris jellegű pajzsmirigydaganatok (follikuláris adenoma, follikuláris karcinoma és papilláris karcinoma) mRNS expressziós analízisét tűztük ki célul a teljes humán exomra vonatkozóan, magas denzitású microarray technológia alkalmazásával. Célunk volt, hogy műtéti úton nyert pajzsmirigy szöveti mintatípuson meghatározzuk a szövettanilag igazolt pajzsmirigy tumorokra jellemző génexpressziós mintázatokat. Olyan mRNS markercsoport kiválasztására törekedtünk, amely a cytopatológiai döntéshozatalt elősegítheti, hasznosan kiegészítheti.

22

III.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

III.1. Mintagyűjtés III.1.1 Szájüregi daganatok mintagyűjtése A szövettanilag igazolt szájüregi laphámrák minták a PTE KK Fogászati és Szájsebészeti Klinikán operált, de neoadjuváns ill. irradiációs kezelésben nem részesült betegek szövetmintáiból származnak. A mintavétel a betegek beleegyezésével történt a regionális kutatásetikai bizottság engedélyével (engedély szám 2012/4682). Mintáinkat a szájüregi tumorok esetén a tumorból és a rekonstrukciós lebeny távoli széléből vettük 40 betegtől (III. táblázat).

III.1.2. Meso- és hypopharynx laphámrákok mintái a Fül-, Orr-, Gégészeti és Fej-, Nyaksebészeti Klinikán diagnosztizált és operált betegektől származnak. A mintavétel itt is a betegek beleegyező nyilatkozatával és a regionális kutatásetikai bizottság engedélyével történt. Mintáinkat egységes eljárás szerint a tumorszélből (0), a daganattól 1 cm-re (1), a daganattól 2cm-re (2) illetve a tumortól legalább 3 cm-re (3) fekvő ép nyálkahártyaszövetből vettük (6. ábra). A miRNS expressziós analízis során összesen 52 szövetmintát vizsgáltunk 13 betegtől, melyből 5 hypopharynx, 8 mesopharynx daganatból származott. A tumor szövetminták kliniko-patológiailag II-es, III-as és IV-es stádiumú laphámsejtes karcinómának feleltek meg (III. táblázat). A tumor szövetminták kliniko-patológiailag a szájüregi daganatoknál I-II-es, míg a meso- és hypopharynx daganatoknál II-es, III-as és IV-es stádiumú laphámsejtes karcinómának feleltek meg. A PTE KK Fogászati és Szájsebészeti Klinika beteganyagából származó szájüregi daganatok leggyakoribb lokalizációja férfiaknál a nyelv, nőknél pedig az ajak volt. A szájüregben található korai stádiumú operabilis daganatok 53%-a tartozott a TNM I, a fennmaradó 47% pedig a TNM II kategóriába. A meso- és hypopharynx daganatok többségére pedig az előrehaladott (TNM IV) klinikai stádium volt jellemző. Csupán egy hypopharynx tumor esetében igazolódott TNM II stádium. A vizsgálatban résztvevő betegek átlagéletkora 63,8 év volt. A férfi: női arány pedig 7:1. 23

Szám szerint Daganatok lokalizációja és

Férfiak

Nők

Teljes

Férfiak

Nők

TNM I

3

0

3

5,55

0

TNM II

0

5

5

0

9,25

TNM I

5

3

8

9,25

5,55

TNM II

3

0

3

5,55

0

TNM I

8

0

8

14,81

0

TNM II

8

0

8

14,81

0

TNM I

3

0

3

5,55

0

TNM II

3

0

3

5,55

0

TNM III

3

0

3

5,55

0

TNM IV

4

1

5

7,41

1,85

TNM II

1

0

1

1,85

0

TNM III

1

0

1

1,85

0

TNM IV

2

1

3

3,7

1,85

44

10

54

18,5

TNM tumor s

Ajak

Bucca

Nyelv Szájfenék

Mesopharynx

Hypopharynx Összes

III.

Százalékos megoszlás

Teljes

14,8

20,36

29,62

11,1

14,8

9,25

100

táblázat: Az általunk vizsgált szájüregi és garatdaganatok lokalizáció és TNM tumor s szerinti megoszlása

6. ábra (az anatómiai grafika forrása: Robert Morreale, Visual Explanations)

24

III.1.3. Pajzsmirigydaganatok mintagyűjtése A pajzsmirigyszövet minták a Debreceni Egyetemen diagnosztizált és az egyetem I. számú Sebészeti Klinikáján műtött pajzsmirigy tumoros betegek mintáiból származnak. Szövettani vizsgálat alapján a minták három fő típusa: follikuláris adenoma, follikuláris karcinoma és papilláris karcinoma. Kontrollként normál pajzsmirigy szövetet használtunk. Normál pajzsmirigy (No=20), follikuláris adenoma (No=8), follikuláris karcinoma ( No=7), papilláris karcinoma (No=10.) A kiválasztott malignus daganatok tumornagyság szerint T1 és T2 N0M0 stádiumnak feleltek meg. A T1 stádiumba tartozott a follikuláris karcinóma minták 85,7%-a és a papilláris karcinómák 80%-a. Az összes malignus daganat nőkben fordult elő. A normál minták és a follikuláris adenoma minták között volt csupán nemi megoszlás, a normál pajzsmirigy szövetek 85%-ban női páciensektől, 15%-ban férfiaktól származott, hasonlóan a follikuláris adenomákhoz, ahol 84%-os női és 16%-a férfi arány fordult elő. A daganatok daganattípusnak, tumorstádiumnak és nemnek megfelelő szám szerinti megoszlását a IV. táblázat mutatja be.

Daganattípus

Tumor stádium

ffi

nő

összes

2

6

8

T1

0

6

T2

0

1

T1

0

8

T2

0

2

3

17

Follikuláris adenoma Follikuláris karcinóma Papilláris karcinóma

7

Normál pajzsmirigy szövet

IV.

Szám szerinti megoszlás

10

20

táblázat: A pajzsmirigydaganatok szövettani típus, tumor stádium és nemek szerinti megoszlása

25

III.2. Laboratóriumi feldolgozás III.2.1. Szájüregi, meso- és hypopharynxés pajzsmirigy tumorok teljes RNS izolálása A mintákat a műtétet követően azonnal -80 °C-ra fagyasztottuk a laboratóriumi feldolgozásig.

A teljes

nukleinsav

izolálás

menetét

a

szövetminták

izolált

homogenizálásával kezdtük, 60 mikrogramm (μg) kiindulási szövetből, melyhez 150 mikroliter (μl) lízispuffert adtunk (High Pure miRNA Isolation Kit, katalógusszám: 05080576001, Roche, Mannheim, Németország). Mintáinkat MagNA Pure Green Beeds (Roche) kerámiagyöngyös homogenizáló csövekbe mértük, és MagNA Lyzer (Roche) rázó homogenizátor segítségével homogenizáltuk. Ezt követően a nukleinsav izolálást a Roche High Pure miRNA izolációs kit vegyszereinek felhasználásával és a hozzá tartozó használati útmutatónak megfelelően végeztük. A 150μl lízispufferben oldott homogenizált szövetlizátumhoz 312μl nukleinsav kötő puffert (Binding Buffer) és 200μl Binding Enhancer oldatot mértünk, a nukleinsav tartalmú oldatkeveréket 3x5 másodpercig vortexeltük, majd pipettával a High Pure üvegszálas szűrőoszlopokra mértük, és Eppendorf 5430 R típusú centrifugán (Eppendorf, Bécs, Ausztria) 13000 fordulat/min centrifugálással az oszlopokon rögzítettük. Ezt követően 500μl etanol tartalmú mosópuffert (Wash Buffer) adtunk hozzá, ismét 13000 fordulat/min centrifugálást végeztünk, és az átfolyó oldatot leöntöttük. Ezt a lépést még 2 alkalommal ismételtük. Végül az izolációs oszlopot egy steril Eppendorf csőbe helyeztük, és 50μl elúciós oldatot (Elution Buffer) mértünk rá, majd a teljes RNS izolátumot az oszlopról egy percig 14000 fordulat/min végzett centrifugálással az Eppendorf csőbe gyűjtöttük. Az így nyert teljes RNS minőségét abszorpciós fotometriával (Maestro Nano spektrofotométer, Maestrogen, Hsinchu, Taiwan) ellenőriztük (260/280 nm A>1,9). Minőségi ellenőrzést követően a mintáinkat azonnal felhasználtuk a további vizsgálatainkhoz.

26

III.2.2. Reverz transzkripció A mRNS és miRNS frakciókat reverz transzkripcióval írtuk át cDNS-re. Mindkét RNS típusnál Universal cDNA synthesis kitet (Quiagen, Woburn, MA, USA) használtunk az átíráshoz, minden esetben a kitben szereplő random hexamer primer alkalmazásával. A mintaelőkészítésnél az izolált mRNS és miRNS frakciók mennyiségét abszorpciós fotometriával (Maestro Nano, Maestrogen) 260/280 nm hullámhosszon meghatároztuk. A reverz transzkripcióhoz egységesen 5 nanomol/µl koncentrációnak megfelelően higítottuk az izolált mRNS-t illetve miRNS-t és ezt a koncentrációt alkalmaztuk a reakcióoldat összemérésekor. A reakcióoldat 1μl reakciópuffert, 1μl 5 nmol/µl koncentrációra higított templát RNS-t, 0,5μl enzim mixet, 2,5μl nukleázmentes vizet tartalmazott 5μl össztérfogatban. Maga a reverz transzkripció folyamata PCR termocyclerben (Roche LC 2.0 pcr rendszer) végeztük, egy lépésben 42 °C-on 60 percig. Ezután a reverz transzkriptázt 95 °C-on 5 percig tartó ciklusban inaktiváltuk. A cDNS mintákat jégen hűtöttük 5 percig. Végül az egyszálú cDNS minőségi ellenőrzését 1%-os agaróz gélelektroforézissel végeztük. A reverz transzkripciót követően a cDNS mintákat egységesen -20 °C-ra hűtöttük és három napon belül használtuk fel a további PCR analízishez. III.2.3. Quantitatív real-time PCR A teljes szöveti RNS-ről átírt cDNS mintákat quantitatív PCR rendszerben (Roche LC480 rendszer és LightCycler 480 SYBR Green I Master Kit, Roche) amplifikáltuk. Az általunk vizsgált miRNS-eknek megfelelően specifikus primereket használtunk a Universal miCURY LNA primer setből (Exiqon, Vedbaek, Dánia) szájüregi minták esetén hsa-miR-21, -155, -191, -146ª, -221 és hsa-miR-222 specifikus primereket valamint saját tervezésű hsa-miR-21, -27a, -34a, -143, -146a, -148a, -155, -221és -223 specifikus primereket alkalmaztunk (TIB MOLBIOL, Gyál, Magyarország). Meso- és hypopharynx minták esetén hsa-miR-21, -27a, -34a, -143, -146a, -148a, -155, és -221nek megfelelően a megfelelően saját tervezésű specifikus primereket (TIB MOLBIOL, Gyál, Magyarország) használtunk a továbbiakban megadott szekvenciákkal. Referencia kontrollként mindkét esetben az 5s rRNS és U6 snRNS-nek megfelelő specifikus primereket használtuk a Universal miCURY LNA primer készletből (Exiqon, Vedbaek, Dánia). Primereink olvadási hőmérsékleteinek különbségei nem haladták meg a 2 °C-ot.

27

A következő célzott specifikus miRNS primereket használtuk: miR-21 • fw (5’ 3’): GCTTATCAGACTGATGTTGACTG • rv (5’ 3’): CAGCCCATCGACTGGTG

miR-27a • fw (5’ 3’): GCAGGGCTTAGCTGCTTG • rv (5’ 3’): GGCGGAACTTAGCCACTGT miR-34a • fw (5’ 3’): TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTG • rv (5’ 3’): GGCAGTATACTTGCTGATTGCTT

miR-143 • fw (5’ 3’): TGAGGTGCAGTGCTGCATC • rv (5’ 3’): GCTACAGTGCTTCATCTCAGACTC

miR-146a • fw (5’ 3’): TTGAGAACTGAATTCCATGG • rv (5’ 3’): GCTGAAGAACTGAATTTCAGAG

miR-148a • fw (5’ 3’)GAGGAAGACAGCACGTTTGGT • rv (5’ 3’)AAAGGCGCAGCGACGT

miR-155 • fw (5’ 3’): GTTAATGCTAATCGTGATAGGG • rv (5’ 3’): GCTAATATGTAGGAGTCAGTTGGA

miR-205 • fw (5’ 3’): CCTTCATTCCACCGGAGT • rv (5’ 3’): GAACTTCACTCCACTGAAATCTG

miR-221 • fw (5’ 3’): CCTGGCATACAATGTAGATTTCTG • rv (5’ 3’): AAACCCAGCAGACAATGTAGCT

miR-223 • fw (5’ 3’): CCGTGTATTTGACAAGCTGAGT • rv (5’ 3’): TGGGGTATTTGACAAACTGACA

28

A PCR reakcióoldat minden esetben 2μl primer mixet, 8μl 5nmol/µl koncentrációjú cDNS templátot és 10μl LC480 SYBR Green I Master mixet tartalmazott 20μl össztérfogatban. Az amplifikáció 8x12-es plate-en történt, az általunk tervezett forma szerint: PCR futásonként a plate 6 daganatspecifikus miRNS-t és 2 belső kontrollt tartalmazott, melyeket 10 ismeretlen nukleinsav koncentrációjú mintán, egy sor ismert koncentrációjú pozitív mintán és egy sor negatív kontrollal szemben (templát cDNS helyett vizet tartalmazott a reakcióoldat) vizsgáltunk. A target mRNS expresszió vizsgálatára a Roche Ready-To-Use Custom Panelt (Roche, Mannheim, Németország) alkalmaztuk, melyre a következő gének mRNS termékére specifikus primert választottuk ki: tumor nekrózis faktor α interacting protein 1 (Tnip1), vascular cell adhesion molecule (Vcam), nukleáris faktor kappa B 1 és 2 (Nfκb1, Nfκb2), Toll-like receptor-1 (Tlr1) és inhibitor of κ light polypeptide gene enhancer in B-cells, kinase γ (Iκbkg). Referencia génként a plate-en a glyceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (Gapdh) és a hypoxantin foszforibozil transzferáz (Hprt1) szerepeltek, génspecifikus primer szekvenciák a Universal Probe Libraryben elérhetők (UPL/ roche-appliedscience.com). Pozitív kontrollként a ß-actin szerepelt. A PCR 20µl végtérfogatban 5µl 5µmol/µl koncentrációjú cDNS templátot, 5µl vizet és 10µl LC480 SYBR Green I Master mixet tartalmazott. A reakciósorozatot technológiai duplikátummal végeztük, az expressziós fluoreszcens jelintenzitás értékeket átlagának megfelelően normalizáltunk.

III.2.4. Microarray vizsgálat A microarray vizsgálat az MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont Funkcionális Genomikai Laboratóriumában történt. Magas denzitású array létrehozásához 20000 humán génspecifikus oligonukleotidot (Sigma –Operon) reszuszpendáltunk 50%-os dimetil szulfoxid vizes oldatában és 300fmol/l koncentrációban PXM oligonucleotid lemezekre (Full Moon Biosystems, Sunnyvale, CA, USA) fixáltunk MicroGrid Total Array

System

spotter

(Biorobotics,

Cambridge,

UK)

segítségével

tetraspot

elrendezésben. (Spotátmérő: 200mm). A DNS lemezhez való fixálását 700mJ energiájú UV fénnyel végeztük (Startalinker, Stratagene, La Jolla, CA). Hibridizáció előtt a lemezeket 1-szeres SSC, 0,2% SDS, 1% BSA-t tartalmazó oldatban 40°C-on 30 percig fixáltuk, majd vízzel öblítettük és megszárítottuk.

29

A vizsgálandó minta előkészítése, hibridizáció. Az egyes szövetmintákból kinyert teljes RNS 2g-nyi mennyiségéből reverz transzkripciót végeztünk polydT primer tartalmú Genisphere expression Array 900 Detection system (Genisphrere, Hatfield, PA, USA) felhasználásával. 20µl teljes térfogatban 20 unit RNAsin (Fermentas, Vilnius, Lithuania), 1x first strand puffer és 200 unit M-MLV reverz transzkriptáz (Fermentas). Mind az első lépés- a cDNS hibridizáció, mind a második lépés a jelölő hibridizáció Ventana hibridizációs kamrában történt „antibody” protokoll szerint. Az első hibridizáció 40C-on történt 6 órán keresztül 2FGL2” hibridizációs pufferben(10x Denhart oldat, 0.25M natrium foszfát puffer, pH 7.0, 1mM EDTA, 1xSSC, 0.5%SDS), ezt követően 2.5l Cy3 és Cy5 reagenst és 200l „Chiphyb” hibridizációs puffert (Ventana) tettünk a lemezekre és 42C-on 2 órán keresztül inkubáltuk. Hibridizációt követően a lemezeket 0,2xSSCvel mostuk kétszer, 10 percen keresztül, majd szárítottuk és scanneltük. Scanning és az adatok kiértékelése. Minden array scannelése zöld (543nm- Cy3) illetve vörös (633nm –Cy5) lézerfény alatt történt Scan Array Lite 10m felbontóképességű konfokális fluorescens scannerrel (Gsilumonics, Billerica, MA). A kapott mintázatok kiértékelése GenePix Pro5.0 software (Axon Instruments Inc., Foster City, CA) segítségével történt. Az egyes spotok meghatározása automatikus pozicionálással történt. Az elkészült arrayk validációját real-time PCR módszerrel végeztük, RotoGene 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia), génspecifikus primerek valamint SybrGreen 1 kit (Roche, Manheim, Germany) használatával a felhasználási protokoll szerint. Minden daganatos és kontroll FNAB mintából izolált teljes RNS 2g-jából reverz transzkripció során cDNS-t készítettünk. A cDNS mintákat tízszeresére higítottuk és 2 l-t használtunk templátként a real time PCR meghatározáshoz. A PCR reakciókörülményeit minden primer párhoz optimalizáltuk. A fluoreszcens jelet minden extenziós lépés után 72C-on detektáltuk. A görbék kiértékelése RotoGene software segítségével történt. A kapott relatív expressziós értékeket két housekeeping gén a glyceraldehid-3-foszfát foszforiboziltranszferáz

dehidrogenáz (HPRT)

gének

(GAPDH) geometriai

ill.

a

hypoxantin

átlagának

megfelelően

normalizáltuk. Az expressziós értékeket Plaffl-módszer segítségével határoztuk meg.

30

III.2.5. Statisztikai analízis A szájüregi, meso- és hypopharynx daganatoknál real time PCR során kapott expressziós értékeket az LC480-as PCR gépen a LightCyclerExor4.0 szoftver segítségével a referencia gén expressziójához viszonyítva relatív quantifikációs analízissel számoltuk ki (ΔΔCp módszerrel). A kapott relatív quantifikációs arányszámokat – szájüregi daganatok esetén a tumoros és normál, míg meso- és hypopharynx daganatok esetén a tumoros mintákban, a tőle 1 cm-re, 2 cm-re lévő, illetve az ellenoldali ép szövetekben is összehasonlítva, kétszélű kétmintás t-próbával elemeztük SPSS 21.0 szoftver segítségével. A szájüregi daganatminták és a kontroll normál szövetek közti miRNS expressziós különbségek statisztikai értékelésére kétszélű kétmintás t-próbát végeztünk. A t-próbával statisztikai szignifikanciát mutató miRNS markereket teszt specificitás/szenzitivitás szempontjából, lehetséges biomarkerként való alkalmazás irányába vizsgáltuk reciver operating curve (ROC) analízissel. A szájüregi daganatok miRNS expressziós eredményeinek összefüggéseit a korral, nemmel, dohányzással, alkoholfogyasztással, tumormérettel, TNM stádiummal, grade-del, nyirokcsomó státusszal, recidíva státusszal (a kiújult daganatokat jelöli) és tumor lokalizációval történő összehasonlításban general linear models (GLM) regressziós elemzés segítségével értékeltük abból a célból, hogy jellegzetes miRNS kifejeződési sajátosságokat

találunk-e az epidemiológiai,

etiológiai és klinikai adatokkal

összefüggésben. A meso- és hypopharynx lokalizációjú daganatok térképbiopsziás mintáinak miRNS kifejeződését kétszélű kétmintás t-próbával hasonlítottuk össze a tumortól való távolság függvényében. A meso- és hypopharynx daganatok lokalizáció szerinti miRNS expressziós különbségeit többváltozós logisztikus regresszió analízist, alkalmaztunk. Minden lokalizációban készítettünk egy miRNS abszolút értékeket bemutató oszlopdiagrammot valamint egy miRNS expressziós kördiagrammot, mely az adott lokalizációban a daganatos, ill. normál szövetek miRNS kifejeződésének egymáshoz viszonyított arányát adja meg, így az abszolút értékeken túl bemutatja a miRNS mintázat egymásra vonatkoztatott arányaiban történő eltéréseket. A statisztikai próbákat és diagrammokat az SPSS 21.0 segítségével készítettük. A pajzsmirigydaganatok microarray expressziós profil értékelésénél az array minden humán génspecifikus dot-ján meghatározásra került a medián érték ill. az adott terület 31

háttér pixel intenzitása. A háttérre korrigált expressziós adatokból kiszűrtük a gyenge jelet adó valamint a pár magas intenzitású pixel miatt magas átlagintenzitást adó, ugyanakkor nem értékelhető spotokat. A technikai replikátumokat ugyanazon array-n belül átlagoltuk, a szignifikáns eltérést mutató technikai replikátumok adatait kizártuk. A vizsgálatokat mindkét fluoreszcens jelölővel elvégeztük, a kontroll és a tumorminták esetén, hogy az álpozitív és álnegatív értékek számát minimalizáljuk. Statisztikailag szignifikáns kifejeződésnek az egyes minták logaritmikus eltéréseinek átlagának a normális kétszeresét meghaladó értéket vettük. Normál pajzsmirigyszövetet használva kontrollként, a legalább kétszeres génexpresszió változásokat mutató géneket választottuk ki. A kiválasztott géneket az egyes szövettani diagnózisok alapján válogattuk szét, függetlenül attól, hogy csökkent expresszióról, fokozott expresszióról volt-e szó, valamint a különböző tumorok esetén azonosan megjelenő génexpresszió eltéréseket is meghatároztuk.

32

IV.

EREDMÉNYEK

A tumor szövetminták kliniko-patológiailag a szájüregi daganatoknál I-II-es, míg a meso- és hypopharynx daganatoknál II-es, III-as és IV-es stádiumú laphámsejtes karcinómának feleltek meg. A PTE KK Fogászati és Szájsebészeti Klinika beteganyagából származó szájüregi daganatok leggyakoribb lokalizációja férfiaknál a nyelv, nőknél pedig az ajak volt. A szájüregben található korai stádiumú operabilis daganatok 53%-a tartozott a TNM I, a fennmaradó 47% pedig a TNM II kategóriába. A meso- és hypopharynx daganatok többségére pedig az előrehaladott (TNM IV) klinikai stádium volt jellemző. Csupán egy hypopharynx tumor esetében igazolódott TNM II stádium. A vizsgálatban résztvevő betegek átlagéletkora 63,8 év volt. A férfi: női arány pedig 7:1.

IV.1. Szájüregi daganatok és a normál nyálkahártya miRNS mintázatának összehasonlító vizsgálata 1. vizsgálatsorozat A szájüregi daganatok és a daganattól távoli ép autológ normál mucosalis epitelium miRNS expressziós profiljának összehasonlítása során kapott eredményeket a 7. ábra mutatja be. A daganatminták és a normál szájnyálkahártya miRNS expressziós mintázatának statisztikai értékelése az V. táblázatban látható.

33

miRNS expresszió az 5s rRNS arányában 7.

ábra: A szájüregi laphámsejtes carcinoma (1) és az autológ normál szövetek (0) miRNS expressziós eltérései. A vizsgált miRNS-ek expressziós értékei az 5s referencia gén relatív kvantifikációs arányában.

34

A vizsgált miRNS

miR21 miR155 miR191 miR146 a miR221

miR222

A szájüregi daganatok és tumor szövetek miRNS kifejeződésének csoportstatisztikai adatai miRNS tu. std. std. kifejeződés status dev. hiba átlaga

t

Kétszélű kétmintás t-próba 95% konfidencia átlagok intervallum p átlagok különbségé érték különbsége -nek std. 35umo felső hibája érték érték

1

5,51

2,05

0,32

0 1 0

1,17 3,34 0,84

0,85 1,07 0,82

12,32 0,01 0,13 0,16 11,67 0,01 0,13

1 0 1 0 1

1,64 0,66 0,36 0,41 3,61

0,66 0,39 0,35 0,43 1,55

0,10 0,06 0,05 0,06 0,24

0 1

0,98 0,98

0

0,86

1,02 0,16 0,91 0,14 ,6465 0,10 5

4,33

0,35

3,63

5,03

2,50

0,21

2,07

2,92

7,93

0,03

0,97

0,12

0,73

1,22

-0,50

0,61

-0,04

0,08

-0,22

0,13

8,94

0,01

2,63

0,29

2,04

3,21

0,67

0,52

0,11

0,17

-0,23

0,47

V. táblázat: A szájüregi laphámsejtes tumor sin és a tumor nyálkahártya szövetek miRNS expressziós értékeinek kétszélű kétmintás t-próba analízise.

Minden vizsgált miRNS esetén fokozott kifejeződést találtunk a daganatszövetekben a kontroll szövetekhez képest, mely statisztikailag szignifikánsnak a miR-21, -155, -191 és -221 esetén igazolódott. A legmagasabb expressziós értékeket a miR-21, -155, és miR-221-nél találtuk, a miR-146a pedig nagyon alacsony mértékben volt jelen a daganatos és ép mintákban egyaránt. A legmarkánsabban elkülönülő expressziós különbséget daganatok és tumorszövetek között a miR-155 esetében találtuk. A miR-21 és -221 ugyan 4-5-szörösen fokozott expressziót is mutatott a tumorokban, de az értékek szórása ezekben az esetekben a miR-155-höz képest nagyobbnak bizonyult. A miR-191 vizsgálatakor a daganatokban enyhe, de statisztikailag szignifikáns emelkedést figyeltünk meg, míg a miR-146a és -222 nem mutatott értékelhető eltérést a kontroll mintákhoz képest. A miRNS mintázat adott lokalizációjú mintákon egymásra vonatkoztatott arányait (8. ábra) tekintve hasonlóságokat mutattak a daganatok esetén az ajak, a nyelv, a szájfenék és a gingiva szövetein. Nagyobb eltéréseket az expresszió arányaiban a bucca és a szájpad minták mutattak, előbbiben az összes expresszió felét a miR-21 adta, míg a szájpad lokalizációjú mintákban a miR-221/-155 expresszió dominál. Ép nyálkahártya esetén minden lokalizációban eltérő mintázatot látunk. 35

8.

ábra: A szájüregi daganatok (1) és normal szövetek (0) közötti eltérések a miRNS expresszió egymásra vonatkoztatott arányában, tumorlokalizáció szerint (1:ajak, 2:bucca, 3:nyelv, 4:szájfenék, 5:gingiva, 6:szájpad)

A szájüregi daganatok miRNS expressziós mintázata a ROC analízis során 90% vagy a feletti teszt hatékonyságot mutatott a miR-21, -155 és -221 vonatkozásában (9. ábra, VI. táblázat)

36

9. ábra:A vizsgált miRNS-ek reciver operating görbe (ROC) analízise

A vizsgált miRNS miR21

ROC görbe alatti terület analízis 95% konfidencia görbe intervallum alatti std. hiba p érték 37umo felső terület érték érték 0,93 0,02 0,01 0,88 0,99

miR155

0,92

0,03

0,01

0,85

0,99

miR191

0,88

0,04

0,01

0,80

0,96

miR146a

0,47

0,06

0,64

0,34

0,59

miR221

0,90

0,03

0,01

0,83

0,97

miR222

0,51

0,06

0,86

0,38

0,64

VI.

táblázat: A ROC görbe alatti terület statisztikai adatai

37

2. vizsgálatsorozat A szájüregi daganatok és autológ kontroll nyálkahártya szövetek miRNS expressziós analízisét a költséghatékonyság fokozása érdekében elvégeztük egy nagyobb számú, saját tervezésű primer szettel is. Az első vizsgálatsorozatban bevált szignifikáns expressziós eltéréseket tumor markerek reprodukálhatóságának ellenőrzését és újabb ígéretes miRNS-ek expressziójának meghatározását végeztük el, mely során miRNS expressziós eredményeinket életmódbeli expozíciós faktorokkal és klinikai adatokkal együtt elemeztük. A vizsgálatban a miR-21, -27a, -34a, -93, -143, -146a, -148a, -155, 196a, -203, -205, -221 és -223 kifejeződését vizsgáltuk a laphámrákokban és az autológ ép nyálkahártya szövetekben. A miRNS expressziós értékek relative kvantifikációs

miRNS expresszió az 5s rRNS arányában

eltéréseit a 10. ábra szemlélteti.

10. ábra: Szájüregi daganatok (1) és kontroll tumor szájnyálkahártya szövetek (0) miRNS expressziója saját tervezésű primerekkel

38

A vizsgált miRNS

miR21 miR27a miR34a miR93 miR143 miR146a miR155 miR196a miR203 miR205 miR221 miR223

VII.

Kétszélű kétmintás t-próba

A szájüregi daganatok és tumor szövetek miRNS kifejeződésének csoportstatisztikai adatai tu status

Átlag

std. dev.

Std. hiba

1

4,89

2,3

0,59

0

1,56

2,21

0,57

1

3,41

1,93

0,50

0

0,96

0,86

0,22

1

2,05

2,33

0,60

0

3,95

2,5

0,64

1

3,28

1,69

0,44

0

1,09

1,4

0,36

1

2,41

2,06

0,53

0

0,55

0,47

0,12

1

0,46

0,42

0,11

0

2,04

2,25

0,58

1

5,46

3,13

0,81

0

0,71

0,75

0,19

1

4,43

3,11

0,80

0

1,25

2,38

0,62

1

3,73

2,06

0,53

0

1,04

2,17

0,56

1

3,4

2,34

0,60

0

0,53

0,82

0,21

1

3,87

2,55

0,66

0

0,63

0,32

0,08

1

5,72

3,09

0,80

0

0,68

0,44

0,11

95% konfidencia intervallum 39um felső o érték érték

t

p érték

átlagok különbsége

átlagok különbségének std. hibája

4,05

0,01

3,33

0,82

1,65

5,02

4,48

0,01

2,45

0,55

1,33

3,57

-2,16

0.04

-1,90

0,88

-3,71

-0,1

3,87

0,01

2,19

0,57

1,03

3,35

3,42

0,02

1,87

0,55

0,75

2,99

-2,68

0.01

-1,58

0,59

-2,79

-0,38

5,71

0,01

4,75

0,83

3,04

6,45

3,14

0,04

3,18

1,01

1,1

5,25

3,48

0,02

2,69

0,77

1,11

4,27

4,49

0,01

2,87

0,64

1,56

4,18

4,87

0,01

3,24

0,66

1,88

4,6

6,26

0,01

5,05

0,81

3,4

6,7

táblázat: Szájüregi daganatok miRNS expresszióinak párosított t-próba analízise

A panelen szereplő összes miRNS vonatkozásában szatisztikailag szignifikáns eredményeket kaptunk t-próbával (VII.táblázat) A daganatszövetek és tumor szövetek miRNS mennyiségének abszolút értékben a legkifejezettebb eltérések az előző vizsgálathoz hasonlóan a miR-155, -221 és -21 mutatta, de biztos markernek mutatkozott a miRNS expressziós átlagok különbségek nagyságát és a szignifikancia szintet együttesen figyelembe véve a miR-27a, -196a, -203, -205 és -223 is. A miRNS expresszió a teljes expresszió arányaiban kifejezve már sokkal jellegzetesebb eltéréseket 39

mutatott, mint az első vizsgálatsorozatban (11. ábra). Ennek fő oka a vizsgált miRNSek nagyobb száma volt. Mivel ebben az esetben 6 helyett 12 miRNS-t vizsgáltunk, részletgazdagabb aránybeli eltolódásokat figyelhettünk meg a daganatok egyes lokalizációiban. Hasonlóságokat a nyelvgyök és szájfenéki daganatok mintázatában lehetett észlelni, a többi lokalizáció nagyon eltérő miRNS arányokat mutatott. Normál szövetek ebben az esetben is markáns eltéréseket mutattak a lokalizációnak megfelelően.

11. ábra: a daganatos és autológ kontroll szövetek miRNS kifejeződési arányai az egyes szájüregi lokalizációkban (1:ajak, 2:bucca, 3:nyelv, 4:szájfenék, 5:gingiva, 6:szájpad)

40

12. ábra: A vizsgált miRNS-ek ROC görbe analízise

ROC görbe alatti terület analízise

A vizsgált miRNS

görbe alatti terület

std. hiba

p érték

miR21

0,87

0,07

miR27a

0,92

miR155

95% konfidencia intervallum 41umo érték

felső érték

<0,01

0,72

1,00

0,04

<0,01

0,82

1,00

0,97

0,02

<0,01

0,92

1,00

miR205

0,93

0,04

<0,01

0,84

1,00

miR221

0,91

0,02

<0,01

0,91

1,00

miR223

0,93

0,05

<0,01

0,83

1,00

miR34a

0,20

0,08

<0,01

0,03

0,37

VIII.

táblázat: A ROC görbe alatti terület statisztikai adatai

A ROC analízis során azonban az első vizsgálatsorozatunktól némileg eltérő eredményt kaptunk (12. ábra és VIII. táblázat). A 90% os szenzitivitás/specificitás arányt meghaladó miRNS-ek között nem szerepelt a miR-21, noha 87%-os aránnyal 41

megközelítette a kívánt értéket. A miR-221 valamint a miR-155 statisztikailag szignifikáns volt magas szenzitivitás/specificitás aránnyal, akárcsak az első vizsgálatban és nagyon jó markernek bizonyultak a miR-27a, -205 és -223 is. A miR-34a szuppresszor RNS, mint normal szöveteket jelző marker is ígéretesnek mutatkozott, de nem érte el a 10% alatti tartományt. Vizsgálatainkat kiegészítettük egy epidemiológiai és klinikai adatokat a miRNS kifejeződés értékeivel összehasonlító analízissel. Ebben figyelembe vettük a beteg neme, kora, a daganat lokalizációja, TNM tumor s, szövettani grade, tumor méret, nyirokcsomó metasztázis és a recidíva előfordulásának összefüggéseiben vizsgáltuk a miRNS expresszió eredményeit többváltozós regresszió segítségével. A miRNS mintázat a legjelentősebb eltéréseket a daganat lokalizáció, nem, kor, daganat tumor s és szövettani grade összefüggésében mutatta (IX. táblázat és a függelékben található I.táblázat).

Az

összes

változó

együttes

figyelembevételekor

a

satisztikailag

szignifikánsnak mutatkozó miRNS-ek a miR-34a, -143, -146a és -155 voltak.

42

Többváltozós variancia analízis Vizsgált hatás

Érték

F

p-érték

miR21

0,530

0,591

0,771

miR27a

0,322

1,406

0,350

miR34a

0,102

5,892

0,021

miR93

0,399

1,004

0,518

miR143

0,123

4,763

0,035

miR146a

0,101

5,937

0,021

miR155

0,088

6,878

0,015

miR196a

0,321

1,411

0,348

miR203

0,161

3,466

0,072

miR205

0,458

0,790

0,640

miR221

0,471

0,748

0,667

miR223

0,223

2,322

0,159

IX. táblázat: miRNS expresszió többváltozós variancia analízis eredménye a laphámrákok nem, kor, a daganat lokalizációja, TNM tumor s, szövettani grade, tumor méret, nyirokcsomó metasztázis és a recidíva előfordulásának összefüggéseiben. Általánosított lineáris modell (GLM) alkalmazásával (függelékben található I. táblázat) a daganat szövettani grade-jével szignifikáns összefüggést mutatott a miR34a, -143, 196a valamint a miR-223 expresszió. TNM státusszal szignifikáns összefüggést mutatott a miR-155, a tumor méretével a miR-93 kifejeződés, nyirokcsomó metasztázissal szignifikánsan pedig a miR-205 expresszió kapcsolódott.

43

mRNS expresszió a HPRT kifejeződés arányában

IV.2. Szájüregi daganatok mRNS expressziója

13. ábra: mRNS expresszió értékei szájüregi laphámrákokban(1) és autológ ép nyálkahártya szövetekben (0).

A vizsgálatban párosított kétszélű kétmintás t-próba alkalmazásával a vaszkuláris sejtadhéziós molekula (Vcam, p=0,50) és a toll like receptor 1 (Tlr1, p=0,27) mRNS kifejeződése mutatott szignifikánsan emelkedett expressziót a daganatos szövetekben az autológ normál szövetekkel történő összehasonlításban. Az Nfκb1 kifejeződése szintén egy emelkedett tartományban, középértékét tekintve 27-szeres emelkedést mutatott a Hprt kifejeződéséhez képest a daganatokban. A középértékhez képest azonban nagy szórást mutatott az egyes daganatmintákban. A kontroll minták esetén az Nfκb1 középértéke 15,8 volt, de néhány kontroll minta elérte a daganatokban talált expressziós értékek szintjét így a különbség statisztikai szignifikanciát nem ért el. A szignifikáns expresszió eltérést mutató Tlr1 a klasszikus NFκB aktivációs útvonal receptoriális serkentésének mediátora, míg a Vcam az Nfκb1 downstream targeteként szerepel a génhálózatban.

44

IV.3. Meso- és hypopharynx daganatok térképbiopsziás mintáinak miRNS expressziós analízise A meso- és hypopharynx daganatok vizsgálat sorozatában a tumorok és az általunk kidolgozott térkép biopsziás séma szerinti mikroszkóposan ép nyálkahártya területekről vett szövetminták egymással történő miRNS expresszióinak összehasonlítását végeztük (14.ábra). A daganathoz képest attól centiméterenként távolodva az ép nyálkahártya szövetekben jellegzetes miRNS kifejeződési mintázatot találtunk a tumortól való távolság függvényében (X-XIII. táblázat). A daganatszövetek és az 1 cm-re eső peritumorális makroszkóposan ép nyálkahártya szövetek közt szignifikáns expressziós eltérést csupán 3 miRNS, a miR-21, -27a és 221 esetén találtunk. A tumortól 2cm-re eső nyálkahártyához képest a daganatokban fokozott kifejeződése a miR-21, -27a, -146a, és -155-nek volt ugyanakkor a miR-34a és -143 szintje szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult. A tumor és a tőle 3 cm-re fekvő nyálkahártya már szignifikáns különbséget mutatott a miR-205 kivételével az összes vizsgált miRNS vonatkozásában, melyeknek a miR-34a és -143 kivételével a daganatokban volt emelkedett expressziójuk.

45

miRNS expresszió az 5s rRNS arányában 14. ábra: A miRNS expresszió 5s rRNS referencia gén tumor si kvantifikációs arányában kifejezett értékei a meso- és hypopharynx daganatokban és a daganatokat körülvevő ép nyálkahártya szövetekben. (0: tumor, 1: tumortól 1 cm-re, 2: tumortól 2 cm-re, 3: tumortól 3 cm távolságra levő ép nyálkahártya)

46

Kétszélű kétmintás t-próba

A meso-és hypopharynx daganatok miRNS kifejeződésének csoportstatisztikai adatai

A vizsgált tumortól miRNS való

miR21 miR27a miR34a

miR143 miR146a miR148a miR155 miR205

miR221

távolság (cm) 0

átlag

std. dev.

std. hiba

11,60

5,28

1,46

1

6,22

4,43

1,23

0

7,81

4,97

1,38

1

3,62

1,93

0,53

0

1,05

0,68

0,19

1

1,89

1,57

0,43

0

0,94

0,88

0,24

1

2,17

2,13

0,59

0

6,61

4,42

1,23

1

6,70

4,97

1,38

0

7,95

5,02

1,39

1

7,98

4,09

1,14

0

7,79

3,84

1,06

1

6,24

3,24

0,90

0

0,92

0,84

0,34

1

1,70

2,62

1,07

0

6,91

5,48

2,24

1

4,24

1,97

0,80

p érték

2,81

0,01

5,38

2,83

0,01

-1,77

alsó érték

felső érték

1,91

1,43

9,32

4,19

1,48

1,14

7,24

0,09

-0,84

0,47

-1,82

0,14

-1,93

0,07

-1,23

0,64

-2,55

0,08

-0,05

0,96

-0,08

1,84

-3,89

3,72

-0,01

0,99

-0,03

1,80

-3,73

3,68

1,11

0,28

1,54

1,39

-1,33

4,42

-0,69

0,51

-0,77

1,12

-3,28

1,73

1,12

0,29

2,67

2,38

-2,63

7,96

Kétszélű kétmintás t-próba

A meso-és hypopharynx daganatok miRNS kifejeződésének csoportstatisztikai adatai

A vizsgált tumortól miRNS való

átlag

std. dev.

std. hiba

0

11,60

5,28

1,46

2

3,42

2,84

0,79

0

7,81

4,97

1,38

2

3,03

1,86

0,51

0

1,05

0,68

0,19

2

4,58

5,49

1,52

0

0,94

0,88

0,24

2

5,32

3,52

0,98

0

6,61

4,42

1,23

2

3,15

2,77

0,77

0

7,95

5,02

1,39

2

5,08

4,14

1,15

0

7,79

3,84

1,06

távolság (cm) miR21 miR27a miR34a miR143

miR146a miR148a miR155

átlagok átlagok különbségének különbsége std. hibája

t

95% konfidencia intervallum

átlagok átlagok különbségének különbsége std. hibája

t

p érték

4,92

0,01

8,18

3,25

0,01

-2,30

95% konfidencia intervallum alsó érték

felső érték

1,66

4,75

11,61

4,78

1,47

1,74

7,82

0,03

-3,53

1,53

-6,70

-0,36

-4,35

0,01

-4,39

1,01

-6,47

-2,31

2,39

0,03

3,46

1,45

0,47

6,45

1,59

0,12

2,87

1,81

-0,85

6,60

2,10

0,05

3,06

1,46

0,05

6,06

47

miR205 miR221

A vizsgált miRNS

miR21 miR27a miR34a miR143 miR146a miR148a miR155 miR205 miR221

2

4,73

3,59

1,00

0

0,92

0,84

0,34

2

1,68

2,76

1,13

0

6,91

5,48

2,24

-0,64

0,54

-0,76

1,18

-3,38

1,87

1,45

0,18

3,73

2,58

-2,01

9,47

Kétszélű kétmintás t-próba

A meso-és hypopharynx daganatok miRNS kifejeződésének csoportstatisztikai adatai tumortól való átlag távolság (cm)

t std. dev.

std. hiba

0

11,60

5,28

1,46

3

1,61

0,78

0,22

0

7,81

4,97

1,38

3

1,73

1,13

0,31

0

1,05

0,68

0,19

3

6,89

4,75

1,32

0

0,94

0,88

0,24

3

7,55

4,93

1,37

0

6,61

4,42

1,23

3

3,16

3,14

0,87

0

7,95

5,02

1,39

3

2,18

2,79

0,77

0

7,79

3,84

1,06

3

3,33

4,70

1,30

0

0,92

0,84

0,34

3

5,75

5,83

2,38

0

6,91

5,48

2,24

3

0,83

0,97

0,39

átlagok p átlagok különbségének érték különbsége std. hibája

95% konfidencia intervallum alsó érték

felső érték

6,75

0,01

9,99

1,48

6,93

13,04

4,29

0,01

6,07

1,41

3,15

8,99

-4,38

0,01

-5,83

1,33

-8,58

-3,08

-4,76

0,01

-6,61

1,39

-9,48

-3,74

2,30

0,03

3,45

1,50

0,35

6,56

3,62

0,01

5,77

1,59

2,48

9,05

2,65

0,01

4,46

1,68

0,99

7,93

-2,01

0,07

-4,82

2,40

-10,18

0,53

2,68

0,02

6,08

2,27

1,02

11,13

X-XIII. táblázat: Meso-és hypopharynx daganatok miRNS expresszióinak összehasonlítása kétszélű kétmintás t-próbával a 3 cm-re fekvő tumor nyálkahártya szövet és a daganatszövet, valamint a daganattól 1cm és 2cm távolságban lévő ép nyálkahártya esetén

48

M

H

15. ábra: A meso-(M) és hypopharynx (H) lokalizációjú daganatok vizsgált miRNS egymáshoz viszonyított aránya a daganattól való távolság függvényében. A miRNS kifejeződés mintázata az egymásra vonatkoztatott kifejeződés arányában mindkét lokalizációban hasonló tumorszöveti miRNS aránybeli összetételt mutatott (15. ábra). A hasonlóság a tumortól 1 cm-re fekvő területek és tumoros szövetek közt is fennállt, mindkét lokalizáció esetén. Jelentősebb különbség a daganatszövetektől először 2 cm távolságban látható. Ez mesopharynx daganatok esetén a miR-21 és -155 csökkenés és tumorszuppresszor (miR-34a, -143) kifejeződési aránybeli növekedésében jelent meg, míg hypopharynx daganatoknál a tumorszuppresszor (miR-34a és miR-143) és gyulladásos mediátor miRNS (miR-146a) valamint a miR-148a közötti arányok megváltozásánál. A távolabbi (3-cm-re levő) ép szövetek, a szájüregi mintákhoz hasonlóan, már a tumorközeli szövetektől és lokalizáció szerint is nagyon erős aránybeli eltéréseket mutattak. A mesopharynx és hypopharynx minták miRNS expressziós adatait logisztikus regresszióval összehasonlítva a két lokalizáció között szignifikáns eltéréseket 49

tapasztaltunk. A statisztikai analízis a mesopharynx és hypopharynx mintákban előforduló miRNS miR -21, -27a, -34a, -143, -146a, -148a és -155 eredményeket hasonlította össze, és lépésenként távolította el a szignifikáns eltérést nem mutatómiRNS-eket a vizsgálatból. Az utolsó lépésben (4. lépés, ezt mutatja a XIV. táblázat)

az

egymás

zavaró

hatásától

megtisztított

eredményeket

láthatjuk.

Statisztikailag szignifikánsnak bizonyult a miR-21, miR-143 és miR155. Ezek a miRNS-ek a hypopharynxból származó mintákban szignifikánsan magasabb expressziós értékeket mutattak (p<0,05).

Vizsgált B miRNSkoefficiens ek

p érték

Esélyhányados (B)

95% konfidencia intervallum Alsó érték

Felső érték

miR21

0,278

0,006

1,32

1,08

1,61

miR143

0,652

0,001

1,92

1,32

2,77

miR155

0,332

0,041

1,39

1,01

1,91

XIV. táblázat: Bináris logisztikus regresszió a meso-és hypopharynx daganatok miRNS expressziós eredményeinek lokalizáció szerinti összehasonlítására.

A lokalizáció szerint lebontott expressziós mintázatbeli különbségeket a 16. és 17. ábra szemlélteti. A meso- és hypopharynx daganatok csupán néhány miRNS vonatkozásában mutattak enyhe eltéréseket. Így a miR-221 mesopharynx daganatokban jelent meg döntően, míg hypopharynx daganatokban emelkedettsége kevésbé volt jellemző, a hypopharynx daganatokat a miR-148 expresszió jellemezte. Ezek a jellegzetességek a peritumorális szöveteknél még 2 cm távolságban is észlelhetőek voltak. 3 cm-es távolságban megfigyelhető, hogy a hypopharynx esetén a miR-146a még a távoli ép szövetekben is aktív maradt.

50

16.ábra: Jobb tonsillát infiltráló mesopharynx laphám tumor miRNS expressziós mintázata

17. ábra: Hypopharynx daganat miRNS expressziós mintázata

51

IV. 4. Pajzsmirigy microarray vizsgálat eredményei: Vizsgálataink során 233 gén csökkent expresszióját és 25 gén fokozott expreszióját sikerült kimutatni a statisztikailag szignifikáns határérték felett normál pajzsmirigyhez viszonyítva. A mintákban kifejezettebben jelentkezett az expresszió csökkenés, bár számos gén fokozott expressziója is megfigyelhető volt. Az egyes szövettani altípusok jellegzetes génexpressziós mintákat mutattak, különösen a csökkent expresszió tekintetében. A Függelék IX-XIV.táblázatban tüntettük fel a follikuláris adenomára (FA), a follikuláris karcinomára (FTC) és a papilláris karcinomára (PTC) jellemző gének szignifikáns mértékű expressziócsökkenését, valalmint a szignifikáns over-

A megváltozott szabályozást mutató gének száma

expresszióikat. 127

140 120 100 76

80

40

fokozott expresszió

49

60

csökkent expresszió 18

20

2

7

0 FTA

FTC

PTC

tumor típus

18. ábra: A vizsgált pajzsmirigydaganatcsoportokban észlelt szignifikáns expressziós eltérést tumor gének egymáshoz viszonyított számbeli aránya. Az egyes altípusok differenciáltsági foka és metasztatikus képességével arányosan az alulexpresszált gének száma jelentős növekedést mutatott, míg a fokozott kifejeződést muatató gének száma alacsonyabb mértékű volt (18.ábra). Külön figyelmet fordítottunk azon gének meghatározására, amelyek több altípusra voltak jellemzők. A vizsgálatok során közös géneket döntő többségében a csökkent expressziókban tudtunk azonosítani. A fokozott expressziót tumor

gének között

átfedést az egyes szövettani csoportoknál tumor a follikuláris adenoma és follikuláris 52

karcinoma esetében az NFκB gén tekintetében találtunk. A XVI-XVIII .táblázatok az egyes szövettani alcsoportok szignifikáns eltérést mutate génexpresszióit tüntetik fel.

ID

Név

log. hányados

p érték

Follikuláris adenoma (FA) AB044385_1

Transmembrane molecule with thrombospondin module

2.225

0.001

AF152323_1

Protocadherin gamma A3

2.417

<0.05

AF387908_1

MHC class I antigen

2.087

0.010

BC000814_1

TG-interacting factor (tale family homeobox)

2.263

<0.05

BC003382_1

Sorting nexin 2

2.166

0.006

BC011027_1

Ectodysplasin A isoform 1 EDA1

2.285

0.001

NM031942_1

Cell division cycle associated protein 7 isoform 1

2.167

0.009

NM080798_1

Alpha 1 type XIII collagen isoform 2

2.460

<0.05

XM012425_1

Lysyl oxidase-like 1

2.196

<0.05

XM030577_1

Potential phospholipid-transporting ATPase Iia

2.203

0.001

XM051590_1

Nuclear pore protein GP210 precursor

2.004

<0.05

3.426/2.066

0.021/0.007

2.237

0.016

Follikuláris adenoma (FA)/ Follikuláris carcinoma (FTC) XM166349_1

Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells, NFKB Follikuláris carcinoma (FTC)

XM170650_1

Riken cDNA 4921522e24 Papilláris carcinoma (PTC)

AB083586_1

Putative G-protein coupled receptor

2.576

<0.05

AJ250014_1

Cyclin D1, CYLD1

2.235

<0.05

BC015753_1

GRO2 oncogene

2.088

<0.05 53

D89501_1

Salivary proline rich protein

P-B, PB1

K03208_1

Proline rich protein BstNI subfamily, PRB2

2.279

0.023

2.166

0.001

XV. táblázat: Fokozott kifejeződést tumor gének az egyes pajzsmirigydaganat csoportokban

ID

Név

log. hányados

p érték

log. hányados

FTA

p érték

FTC

AF153762_1

Bruton’s tyrosine kinase, BTK

-2.025

0.0075

-2.661

0.0140

AF208694_1

Impact

-2.594

0.0013

-2.689

0.0001

BC011634_1

G protein-coupled receptor 30, GPR30

-3.429

0.0004

-2.138

0.0420

BC021104_1

Apelin

-2.024

0.0011

-2.162

0.0280

Potassium channel protein

-2.396

0.0001

-3.810

0.0007

NM_016279_1

E-cadherin

-2.197

0.0001

-2.048

0.0416

NM_145752_1

CDP-diacylglycerol–inositol 3phosphatidyl-transferase isoform 2

-3.327

0.0002

-2.854

0.0001

M55513_1

FTA

PTC

BC002530_1

ADP-ribosylation factor-like 2, ARL2

-2.016

<0,05

-2.525

0.0086

NM_000946_1

Primase, polypeptide 1 (49kd); PRIM1

-2.160

<0,05

-3.368

0.0004

NM_001559_1

Interleukin 12 receptor, beta 2,IL12RB2

-3.000

<0,05

-2.593

0.0087

NM_002076_1

Glucosamine (N-acetyl)-6sulfatase precursor

-2.567

<0,05

-3.140

0.0003

NM_006298_1

Zinc finger protein 192, ZNF192

-2.003

<0,05

-2.037

0.0411

NM_006484_1

Dual-specificity tyrosine-(y)phosphorylation regulated kinase 1b isoform c

-2.050

<0,05

-2.870

0.0008

XM_007868_1

Sodium/hydrogen exchanger 5 (Na(+)/H(+) exchanger 5), NHE-5

-2.655

<0,05

-2.644

0.0071

54

FTC

PTC

AF052510_1

Phosphocholine cytidylyltransferase b

-2.562

0.0001

-2.123

0.0156

AF107044_1

DNA-binding protein,SOX21

-2.488

0.0010

-2.876

0.0075

AK091478_1

NIL-2-a zinc finger protein

-2.260

0.0004

-2.090

0.0051

NM_002662_1

Phospholipase d1, phophatidylcholine-specific; PLD1

-2.001

0.0001

-2.742

0.0005

NM_002753_1

Mitogen-activated protein kinase 10, isoform 1; MAPK10

-2.277

0.0002

-2.214

0.0092

NM_003691_1

Serine/threonine kinase 16, STK16

-2.250

0.0010

-3.074

0.0033

NM_005251_1

Forkhead box C2, FOXC2

-2.351

0.0012

-3.124

0.0001

XVI. táblázat: Az egyes pajzsmirigydaganat csoportok között átfedést tumor , szignifikánsan csökkent kifejeződést tumor gének

FTA ID

Név

FTC

PTC

log. hányados

p érték

log. hányados

p érték

log. hányados

p érték

AF140630_1

Urotensin-II

-2.264

0.004

-4.106

0.001

-2.46

0.001

AF294009_1

Eosinophilderived neurotoxin, RNS2

-2.113

0.024

-2.872

0.001

-2.501

0.014

AF308819_1

Nuclear receptorinteracting factor, PPARG

-2.647

0.001

-2.418

0.029

-2.371

0.001

XVII. táblázat: Mindhárom pajzsmirigydaganat típusnál szignifikáns csökkenést tumor gének

55

V. MEGBESZÉLÉS V.1 Szájüregi, meso-és hypopharynx daganatok eredményeinek megbeszélése A fej-nyak daganatok standard diagnosztikai kiértékelése évtizedek óta szöveti patomorfológiai alapon történik, melyet igen ritka esetben egészít ki molekuláris, a daganat biológiai viselkedését meghatározó eljárás (9, 17-19). Jelenleg intenzív kutatás folyik olyan markerek irányába, melyek a primer elváltozást illetve a daganatot körülvevő, molekuláris szempontból inhomogén szöveteket és áttéteket jellemezni tudják, valamint a tumor recidívát, korai fázisban azonosítják (62-67). A fej-nyak daganatok között a szájüregi, mesopharynx, hypopharynx valamint gége lokalizációjú laphám eredetű karcinomák daganatfejlődési modelljét az elmúlt évek során az irodalomban gyakran jellemezték a cancer field modellel (41-43). Az elmélet feltételezi, hogy a daganatképződést elindító környezeti etiológiai tényezők, valamint az egyéni érzékenységet meghatározó tényezők jellegzetes genomikai és epigenetikai változásokat hoznak létre a fenotípusosan ép nyálkahártya sejtekben. Az így létrejövő, nehezen meghatározható genetikailag vagy epigenetikailag módosult terület a „cancer field”, melyen a prekurzor elváltozások, a primer daganat, a daganat recidíva vagy esetlegesen az ismételt primer daganat előfordulhat. Az egyéni genetikai tulajdonságok által meghatározott, de morfostatikus (a kialakult szöveti architektúra fenntartását meghatározó) faktorként epigenetikai szinten is szerepet játszó miRNS-ek a nemzetközi irodalomban számos daganattípus molekuláris jellemzésében ígéretesnek bizonyultak (67, 73, 80-81, 88-89). Kutatásomban, igyekeztem ennek a laboratóriumi szempontból stabil és jól reprodukálhatóan kimutatható molekulának az előnyeit felhasználni cancer field meghatározásában. Vizsgálataimban csak a miRNS-mRNS kifejeződések kvantitatív

meghatározására

koncentráltam,

nem

került

sor

a

nukleinsav-

szekvenciasorrendet érintő változások felmérésére vagy követésére. Azonban a miRNS kifejeződés mennyiségi különbségeit tekintve is számos érdekes és jellegzetes eltérés mutatkozott a daganatok és az őket meghatározott távolságra körülvevő fenotípusosan ép szövetek szempontjából. Vizsgálatainkban szájüregi daganatok valamint meso- és hypopharynx daganatok esetén sikerült lokalizáció és daganat specifikus miRNS profilt kimutatni. Általánosan a 56

tumorszövetekre jellemző volt a miR-21, -155 és -221 fokozott kifejeződése, melyek minden lokalizációban megbízható daganatmarkernek bizonyultak. A szájüregi daganatok vonatkozásában a két vizsgálatsorozatban végzett ROC görbe alapján több marker (miR-21, -27a, -155, -191, -205, -221 és -223) esetében a diagnosztikai szenzitivitás a specifitás függvényében 90% feletti diagnosztikai hatékonyságot mutatott. A teszt hatékonyság vonatkozásában összesítésben a miR-221 míg a görbék alakját figyelembe véve az adatok egységnégyzetbeli elhelyezkedése alapján magas diagnosztikai szintnél minden lokalizációban a miR-155 bizonyult a legjobban alkalmazható markernek. Az összes vizsgálat áttekintésekor a legmarkánsabbnak és szinte minden összehasonlításban statisztikai szempontból is szignifikánsnak bizonyult a miR-21. Vizsgálatunkban minden szájüregi lokalizációban szignifikánsan fokozott expressziót mutatott. Kifejeződése a finomabb meghatározásra alkalmas térképbiopsziás anyagokban mesopharynx daganatokban a daganathoz közelebb fekvő ép szövetekben éles csökkenést és nagy tumorszövet specifitást mutatott, míg a hypopharynx daganatokban csupán a daganattól 3cm-re levő szövetekben esett szignifikáns mértékben. A logisztikus regressziós vizsgálat során a hypopharynx daganatokban a miR-21 értékei egyébként jelentősen magasabbnak is bizonyultak a mesopharynx daganatokénál. Ezt az eltérést valószínűsíthetően az okozta, hogy a hypopharynx daganatok rosszabb prognózisúak. Egy fej-nyak daganatok esetében a miRNS expressziók

prognosztikus

értékét

vizsgáló

metaanalízis

az

irodalmi

adatok

áttekintésekor magasabb miR-21 expressziót rosszabb túléléssel hozta statisztikailag szignifikáns összefüggésbe (HR:1,57 CI: 1,22-2,02, p<0,05) (117). Ezzel szemben a saját munkámban etiológiai és klinikai daganatjellemzőkkel való GLM vizsgálat, melyet a szájüregi daganatokon a 2. vizsgálatsorozatban végeztünk nem tudtunk kimutatni szignifikáns összefüggést a miR-21 vonatkozásában egyetlen, a daganat előrehaladott állapotát jelző faktorral szemben sem. A miR-34a és miR-143 tumor szuppresszor tulajdonságú miRNS-ek vonatkozásában megállapítható, hogy ugyan a ROC analízis nem értékelte magas szintre a diagnosztikai teszt hatékonyságukat, tehát önálló markerként való alkalmazhatóságukat nem támasztotta alá munkánk, mégis számos tekintetben volt jellegzetes kifejeződésük. A miR-34a-t HPV asszociált fej-nyak daganatok esetén több tanulmányban is csökkent kifejeződéssel azonosítottak. Hatásmechanizmusa tisztázott, gátolja a tumor proliferációban és daganatos neoangiogenezisben szerepet játszó E2F és survivin fehérjét és transzlációját (26, 29). 57

Vizsgálatunkban szintén alacsony expresszió jellemezte ezeket a miRNS-eket minden vizsgált lokalizációban. Mesopharynx daganatok esetén a daganattól távolabb eső szövetekben találtuk meg ezen miRNS-ek számottevő expresszióját, a hypopharynxban azonban a miR-34a már a daganattól 1 cm-re levő szövetekben megjelent. A szájüregi daganatok szövettani grade-jével ez a két miRNS mutatta a legszorosabb fordított arányú összefüggést. Összességében ezen miRNS-ek kifejeződésének eltűnése vizsgálatainkban szoros kapcsolatban állt a daganatos fenotípussal. A szájüregi daganatok összes klinikai paraméterét figyelembe vevő lineáris regressziós analízis esetén is szignifikáns marker maradt. Azonban míg a miR-34a daganat lokalizációt tekintve nem mutatott nagy eltéréseket és ép szövetekben stabilan expresszálódó markernek igazoltuk, addig a miR-143 esetén nagy expressziós arány beli különbségeket találtunk az egyéb vizsgálatban szereplő miRNS-ek kifejeződéséhez viszonyítva. A miR-146a és miR-148a szerepük a gyulladásos folyamatok és a karcinogenezis kapcsolódási pontjaiban, a gyulladásban levő sejtek immortalizációjában jelentős (99, 104, 106). Vizsgálatunkban mindkét miRNS a hypopharynx daganataira volt leginkább jellemző. Ebben a lokalizációban kifejeződésük a daganatokra és peritumorális szövetekre is jellegzetes volt és széles sávban a daganat körül megtalálható maradt. Szájüregi daganatokban ugyanakkor nem bizonyult kellően specifikus és szenzitív markernek, ugyanakkor a GLM analízis a 146a és a daganat grade között szignifikáns, egyenes arányú összefüggést mutatott. A miR-155 egy fej-nyak daganatok esetén gége laphám karcinomában korábbi tanulmányok során azonosított miRNS, mely a jelátviteli kapcsolataiban a daganat invázióval mutat szoros összefüggéseket (99, 100). Vizsgálatainkban a miR-155 bizonyult az egyik önállóan is alkalmazható, diagnosztikus teszt hatékonyságú, ugyanakkor specifikus daganatjellemzőkkel összefüggésbe hozható markernek. A szájüregi daganatokban ez volt az egyetlen olyan miRNS, ami mind a ROC (mindkét vizsgálatsorozat esetén 90% feletti hatékonyság) mind pedig a GLM analízis során (TNM stádiummal való összefüggésben) szignifikánsnak mutatkozott.

A mapping

biopsziás mintákban lokalizációtól függetlenül jelentős kifejeződést mutatott és még a daganatoktól 2 cm-es távolságra levő szövetekben is. Érzékenysége ellenére nagy mintaszám esetén is kellően specifikus maradt, kevés fals pozitív eredménnyel volt

58

összefüggése a ROC analízisben. Vizsgálatunkban egyértelműen a leghatékonyabb, malignitás gyanúját a peritumorális szövetekben megbízhatóan jelző marker. A miR-221 szerepe eddig elsősorban emlő karcinómában és központi idegrendszeri glioma esetén tisztázott, fej nyak tumorokban néhány vizsgálat történt, melyben a daganatok rossz prognózisával és a tumorinvázió mértékével mutatott összefüggéseket (99, 108, 109). Vizsgálatainkban megbízható onkomiR-ként szerepelt szájüregi daganatok esetén és a miR-21 és -155 kifejeződésekhez nagyon hasonlóan viselkedett. Szájüregi daganatok ROC vizsgálatánál mindkét esetben magas teszt hatékonyságot mutató marker. A daganatszövetekre a legmagasabb relatív kvantifikációs kifejeződés értékeket ennek a miRNS-nek az esetében találtuk. A térképbiopsziás mintáknál ez a miRNS kifejezetten a hypopharynx daganatokra és peritumorális szövetekre volt jellemző. A mesopharynx daganatok esetén nem mutatott szignifikáns eltérést. Ennek oka azon kívül, hogy a mesopharynx daganatokban ez a marker nem jellegzetes, lehet az is, hogy a mesopharynxban esetleg eltérő nukleotid-sorrendű variáns érik ki, melyet az általunk alkalmazott specifikus primer szekvenciák nem tudtak hatékonyan amplifikálni. A miR-27a egy, az irodalomban fej-nyak daganatokkal kapcsolatban eddig még kevéssé részletesen vizsgált miRNS (118). Vizsgálatunk során minden lokalizációban egyaránt nagyon hasonló viselkedést mutatott, mint a miR-21. A miR-21-el való szekvenciális hasonlóságaik miatt valószínűleg a mRNS célmolekuláinak egy részét képes a miR-27 is gátolni. A miR-191-et vizsgálatunkig csupán AML-ben azonosították egyetlen tanulmányban a miRBase adatbázis alapján (119). Szignifikáns expressziós emelkedését a szájüregi daganatokban jelen vizsgálat mutatta ki először. Publikációnkat követően számos más daganattípusban, pl. emlő és vastagbél daganatok esetében is leírták fokozott expresszióját. Fej-nyak daganatok nem invazív biomarker fejlesztése céljából végzett nyál alapú miRNS microarray vizsgálatsorozat szintén emelkedett mennyiségét igazolta (120). A mesopharynx és hypopharynx minták lokalizáció specifikus összehasonlításában elsősorban a miR-221 jelenléte, valamint a miR-21, 143 és 155 expresszió mennyiségi különbségei voltak megfigyelhetők. Az egyes daganatok és a daganattól különböző távolságra lévő szövetek azonban a miRNS expresszió egymáshoz viszonyított 59

arányainak eltéréseivel voltak a leginkább érzékletesen elkülöníthetők. Több marker együttes vizsgálata így nagyobb lehetőségeket rejt a daganattól meghatározott távolságra eső területek genomszintű jellemzésében. Érdekes, hogy minden marker esetében a mennyiségi szempontból legmagasabb expressziót a hypopharynx laphám daganatokban találtuk és az életmódbeli etiológiai faktorok jelenléte (dohányzás, alkoholfogyasztás) ebben a betegcsoportban bizonyult a legmagasabb mértékűnek. Azonban az alkoholfogyasztás és dohányzás összefüggését specifikus miRNS expressziós mintázatbeli eltéréssel nem sikerült igazolnunk sem a szájüreg, sem pedig a meso- vagy hypopharynx vonatkozásában. Mindent összevetve a miRNS kifejeződés mintázatának elemzése elsősorban az eltérő daganat lokalizáció elkülönítésében, valaminta peritumorális, fenotípusosan épnek tűnő, de epigenetikailag a daganat szöveti szerveződésében érintett peritumorális szövetek elkülönítésében bizonyult alkalmasnak. A peritumorális szövetek miRNS mintázatbeli jellemzői hasznosak lehetnek az R0 rezekción

átesett

betegek

recidíva

kockázatának

megítélésében,

esetlegesen

prognosztikus faktorként az utánkövetés során (melyhez azonban további, követéses vizsgálat szükséges). Az egyes miRNS-ek funkcionális megítélése szempontjából a szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek néhány közös jelátviteli összefüggést mutató mRNS célmolekulájának kifejeződését is meghatároztuk. A potenciálisan felmerülő mRNS targetek között olyan kapcsolódási pontot próbáltunk meghatározni, mely az összetett sejtrendszerek működését szabályozó egyik legfontosabb mechanizmust az apoptózist érinti. A daganatok esetében két ok vezethet az apoptózis programjának sérüléséhez, szabályozásának zavarához, végső soron a daganatsejt immortalizációjához. Az egyik a program hibás működése valamelyik résztvevő működészavara miatt (antiapoptotikus jelátvitel fokozott működése, proapoptotikus folyamatok csökkent aktivitása), a másik a program gátoltsága (például a túlélési faktorok túltermelése miatt). A közös kapcsolódási pontként meghatározható jelátviteli hálózatként az NFκB rendszert választottuk. A vizsgált gének részvétele az NFκB jelátviteli rendszerben egymáshoz kapcsolódóan az útvonal analízis térképen látható (19. ábra). Vizsgálatainkban statisztikailag szignifikáns különbség a daganat és a kontroll normál nyálkahártya mRNS mintázatában a Vcam és Tlr1 kifejeződésben volt. A Vcam agresszív daganatok neovaszkularizációt elősegítő molekuláris mechanizmusáért felelős, az NFκB rendszer aktiválja, míg a Tlr1 pedig az NFκB egyik sejtfelszíni receptorát kódoló mRNS, így 60

fokozott expressziója pozitív feedbackként az NFκB folyamatos aktivációjáért felelős, ami közvetlenül szabályozza az epitheliális szöveti architektúra kialakulásában fontos szerepet játszó Cyclin D1 (CYLD1) kifejeződést a PPARγ kifejeződést és közvetetten számos más transzkripciós faktort és sejtciklus szabályozásban résztvevő gént.

19. ábra: A RealTime Ready Custom Panel útvonal analízis eredménye

Az NFκB állandó aktivációja a tumorsejtekben klonális szelekciónál óriási előnyt jelent (121). Az Nfκb1 mRNS expresszióját a normál nyálkahártya szövetekben is számos esetben emelkedettnek találtuk. Ezen eredményünk szintén erősen alátámasztja a cancer field elméletet. A daganatterápia területén végzett eredmények is ígéretesek: SR-IKB alfa által okozott NFκB represszió jelentősen növelte a doxorubicin, daunorubicin és a sugárterápia hatékonyságát primer epitheliális sejtvonalakon (122). A PS 341 proteoszóma gátló készítmény az SR IκB hez hasonlóan növelte a CP11 által kiváltott apoptotikus választ számos tumor esetén. Ami fej-nyak tumorok esetén igen jelentős: az NFκB szuppresszió érzékenyíti a daganatsejteket a TRAIL (TNF-hez kapcsolódó apoptózis indukáló ligand)- indukálta apoptózisra ez mind fej-nyaki eredetű, mind 61

oesophagus laphámsejtes carcinomában igazolódott. Nagy figyelmet keltett szintén fejnyak laphámsejtes daganatok esetén az a felfedezés, hogy a 2 ME (2-metoxiösztradiol) egy endogén ösztrogén metabolit és a 11-p53 (11 polyarginin peptid p53) szuppresszálja az NFKB-t és nagyon jó hatásúak a szájüregi laphámrákok esetén (123, 124). Ez egy új ún. protein transzdukciós terápia: poli arginin kötött peptidek mRNS expressziós gátlást idéznek elő. Nagyon jó hatékonyságú, gyors, de csak rövid ideig áll fenn a hatása (egymással kombinálva méginkább fokozott a hatás, egyéb kemo- ill radioterápiás kombinációban pedig még ki sem próbálták őket). Hazánk egyik kiemelkedő népegészségügyi problémáját jelentik a fej-nyak daganatok. Ennek oka a daganatok késői stádiumban való felismerése, mely a megfelelő prevenciós stratégiák alkalmazásának elégtelenségéből, hiányából fakad.

A multimodális

daganatterápiás eszköztár fejlesztése mellett elterjedt törekvés a daganatok molekuláris jellemzőinek meghatározása. Kutatásunk során olyan új lehetőségeket kerestünk, mellyel a fej-nyak daganatok szöveti területen alapuló szerveződése molekuláris módszerrel modellezhető, így a különböző szempontok (lokalizáció, klinikai stádium, grade, etiológiai tényezők, szövettani alcsoportok) szerint csoportosított daganatok összehasonlíthatóvá válnak. A genomikai és epigenetikai tényezők között is fontos szerepet játszó szabályozó kismolekulák, a miRNS-ek funkcionális vizsgálatával sikerült olyan markereket azonosítanunk, amelyek elég érzékenynek és specifikusnak mutatkoztak a daganatos és daganat körüli fenotípusosan ép szövetek jelzésére és azok megkülönböztetésére a távolabb eső molekuláris szabályozás szintjén is ép nyálkahártya szövetektől. Ez megteremtheti a jövőben egy olyan daganatra specifikus biomarker panel kifejlesztését, amely magas kockázatú egyének és a daganat teljes kimetszésén átesett, gyógyult betegek követéses vizsgálatának hasznos részeként szolgálhat. Az általunk talált miRNS eltérések stádium, grade és lokalizáció szempontjából is specifikusak voltak, valamint érzékenyen változott egymáshoz viszonyított arányuk a daganatszövetektől való távolság függvényében. Változásaik kimutatható, a daganat neovaszkularizáció és immortalizációban szerepet játszó target mRNS expressziós változással is összefüggtek. Ezen megfigyelések alapján a fej-nyak daganatok területi szerveződésére

a

karcinogenezisük

funkcionális

keresztmetszeti

képére

is

rávilágíthatunk. Ez a későbbiekben hasznosan kiegészítheti a szövettani diagnosztikát és OPL esetén alkalmazva daganatok elsődleges megelőzését is. 62

V.2.

A

microarray

pajzsmirigydaganatok

expressziós

eredményeinek megbeszélése A noduláris pajzsmirigydaganatok korai diagnózisa és a megfelelő terápia a beteg teljes gyógyulását teszi lehetővé. A vizsgálati stratégia alapja a vékony tű aspirációs cytológia, amely alkalmas a szövettani diagnózishoz szükséges minta vételére. Az esetek közel 20%-ában azonban a nyert minta minőségileg, vagy éppen mennyiségileg alkalmatlan a pontos diagnózis felállítására, amely a biopszia ismétlését teszi szükségessé (9, 10, 16). Számos korábban publikált vizsgálat felhívja a figyelmet arra, hogy a génexpressziók vizsgálatával lehetőség nyílik a pajzsmirigydaganatok tipizálására. A feltérképezett gének óriási száma miatt, azonban nehéz pontosan meghatározni azokat a géneket, amelyek vizsgálata a szövettani vizsgálattal egyenértékű diagnosztikai értékelést tenne lehetővé (114, 125). Rosen és mtsai egy 6 génes modell használatával el tudták különíteni a benignus és malignus daganattípusokat (126). Bár kisszámú mintán végeztek vak, kontrolált vizsgálatot,

összesen

10

esetben

történt

pathológiai

vizsgálattól

független,

génexpresszión alapuló szövettani tipizálás, de így is magas szenzitivitás és specifitási eredményeket értek el. A vizsgálat kiemeli, hogy akár 6 génes modellel is lehetséges, a terápiás döntést segítő eredményt elérni. Természetesen a gének számának növelésével a tipizálás pontossága tovább javítható. Benignus és malignus pajzsmirigydaganatok génexpressziós

profiljának

génexpresszióihoz

meghatározását

viszonyított

szignifikáns

követően eltérést

a mutató

jóindulatú géneken

daganat végzett

hierarchikus cluster analízist követően Finley és mtsai ismeretlen diagnózisú pajzsmirigy mintákon végzett analízisük során 91,7-93%-os szenzitivitással és 96,2100%-os specifitással különítette el a jó- és rosszindulatú pajzsmirigydaganatokat (127). Az irodalomban megjelent közlemények alapján megállapíthatjuk, hogy az eddigi vizsgálatok nem törekedtek egy a cytológiai diagnózist kiegészíteni képes, mindenki által használható, megfelelő számú génből álló algoritmus kiválasztására (115, 116). Jelen vizsgálatunkban számos gént azonosítottunk, amelyek statisztikailag szignifikáns expressziós eltérést mutattak az egyes pajzsmirigydaganat altípusokban a normál szövethez viszonyítva. A daganat altípusokban mind csökkent expressziót, mind fokozott expressziót sikerült azonosítanunk, azonban az alulexpresszált gének száma jelentősen magasabb volt. Hangsúlyozandó, hogy meghatároztunk olyan géneket, 63

melyek csak az egyes altípusokban mutattak eltérést, ugyanakkor találtunk olyan géneket is, amelyek az egyes tulajdonságokra (follikuláris jelleg, malignus jelleg) voltak jellemzőek. Az egyes altípusokban előforduló közös gének szerepe vizsgálataink alapján ugyan nem azonosítható egyértelműen, de értelmezhetők a daganatképződés korai markereiként, amely így a korai diagnózisban vagy akár a prevencióban is szerepet kaphatnak a jövőben. Az emelkedett génkifejeződés az egyes daganat altípusokra egyedi mintázatot mutattak, amelyeknek a daganattípusok elkülönítésében a cytologiai diagnózis pontosításában lehet jelentősége. Az alulexpresszált gének száma jelentősen magasabb volt az agresszívabb tulajdonságú, kevésbé differenciált altípusokban, amely a rossz prognózis markereként válhat hasznossá. A fokozott expressziókban csupán egy közös gént találtunk, mely átfedést mutatott szövettani altípusok között, ez pedig FA és FTC esetén az NFκB volt. A FA-ban sikerült azonosítanunk a poli-adenozil-difoszfát-ribóz polimeráz 1 (PARP1) gén overexpresszióját. A PARP1 gén emelkedett expressziója valamennyi eukaryota sejt válaszreakciója a DNS-sérülést okozó károsító ágensek jelenlétére. A gén a DNS-repair aktivitásában, valószínűleg promoter funkcióval bír. Számos vizsgálat mutatta ki a PARP1 gén fokozott expresszióját malignus limfómákban (129). A cAMP responsive element binding protein (CREBBP) gén emelkedett expresszióját is igazoltuk a FA-ban. A gén a receptorokhoz kötődő jelátviteli mechanizmusokban játszik szerepet, különös tekintettel az inzulin receptorok és a növekedési hormonok jelátviteli mechanizmusaiban, de valószínűleg szerepet játszik a DNS-repair mechanizmusokban is, mint bizonyos promoterek koaktivátorai. Klinikai jelentősége AML-ben és Rubinstein-Taybi szindrómában van, ahol transzlokáció miatt funkciója kiesik (130), ugyanakkor spinális és bulbáris muscularis atrophiában azt találták, hogy a CREBBP gén over-expresszióját mutató sejtek védettek voltak a polyglutamine mediálta toxicitástól (131). Az elongation factor 1-α(EF1α) gén fokozott expressziója is kimutatható volt FA-ban. A gén a heat shock transcription factor 1 (HSF1) gén aktivációját végzi, amely folyamat csak EF1A jelenlétében történik meg. A HSF1 gén egy hő-sokk fehérje, amely a sejt-stressz elleni védelemben játszik szerepet. Az EF1A gén over-expressziója szintén a normál sejt génállomány változása elleni védelmet jelentheti (132). A homeobox 11 (HOX11) proto-onkogén fokozott expressziója azért érdemel különös figyelmet FA-nál, mert korábban kimutatták, hogy T sejtes ALL-ben a t(5;14) transzlokáció eredményekként a HOX11 gén aktiválódik, ezért feltételezik, hogy 64

a T-ALL leukemogenezisben játszik szerepet (133). A nuclear transcription factor, Xbox binding 1 (NFX1) gén emelkedett expressziója a HLA-DRA gén transzkripciójának gátlását eredményezi, ugynakkor FA-ban is igazoltuk magas expresszióját (134). Az ectodysplasin A-1 (EDA1) gén over-expresszióját FA-ban, míg az inhibitor of nuclear factor κ B ε(IKBε) gén fokozott expresszióját FTC-ban találtuk vizsgálatunk során. A két gén azért érdemel figyelmet, mert ugyanazon útvonalon fejtik ki hatásukat. NFκB komplex, melynek génje FTC-ben és FA-ban fokozott kifejeződést mutatott számos stimulus hatására aktiválódhat, mint pl. cytokinek, szabadgyökök, UV sugárzás, bakteriális és virális termékek. A tartósan fennálló NFκB gátlásnak ezzel szemben az immunsejtek nem megfelelő érésében és az elhúzódó sejtnövekedésben van szerepe. Az IKBεgén egy inhibitor proteint kódol, amely gátolja az NFκB komplex hatását, ezért nagy jelentősége van a FTC-ban, amelyben megnövekedett expresszióját igazoltuk. FAban azonban az EDA1 gén emelkedett expresszióját találtuk, amely aktiválja az NFκB indította transzkripciót (135). Feltűnik a FA és a FTC között a génexpressziókban mutatott különbség, hiszen FA-ban a kiváltó ágensre adekvát kompenzatórikus válasz történik, az NFκB hatásának növelését eredményező EDA1 gén fokozott expressziója, addig a FTC-ban az IKBε gén magas expressziója akár tumorgenetikus lépés is lehet, az immun-survaillence hatékonyságának csökkentése útján (136-138). Az adaptor-related protein complex 1, ß subunit (AP1B) és számos más gének fokozott expressziójának jelentősége napjainkban még tisztázatlan.

20. ábra: A pajzsmirigydaganatok különböző szövettani tipusainál észlelt génexpressziós eltérések és azok összefüggései 65

Az eddigi irodalomban megjelent vizsgálatok kontrollként jóindulatú elváltozásokat használtak, jelenlegi vizsgálatunk kontrollja, azonban normál pajzsmirigy szövet volt. Ez alkalmassá teszi, hogy kiindulási pont legyen a diagnosztikában használható gének meghatározásában. A fej-nyak daganatok speciális csoportját képző pajzsmirigydaganatok a genomikai analízis szempontjából előnyösen vizsgálható csoportot jelentenek. Könnyű mintavételi lehetőség nyílik a daganatkialakulás és fejlődés bármely fázisában. A daganatok kialakulásának mechanizmusa is, mely viszonylag kevés driver mutációhoz kötött, erősen eltér a laphám eredetű tumorokétól, ezért még a különböző szöveti entitások között is sok közös genomszintű eltérés mutatkozik. Vizsgálatunkkal az egyes szövettani altípusokra jellemző génexpressziós mintázatokat azonosítottunk, amelyek segítséget nyújthatnak azon gének meghatározására, amelyek alapján a biopsziás minta tipizálása a leghatékonyabban elvégezhető. A teljes genom-expressziós mintázat meghatározásán alapuló pajzsmirigy vizsgálatok a cytológiai eredményeket kiegészítve a kivizsgálási időt jelentősen lecsökkenthetik, amely a terápiás döntés meghozatalát lerövidíti, nagyobb lehetőséget adva a betegnek a teljes daganatmentesség elérésére. Az emelkedett expressziók elemzése révén betekintést kaphatunk a jó- és rosszindulatú daganatokban zajló összetett változásokba. A későbbiekben ezek megértése segíthet a daganatok képződésének alaposabb megismerésében,

és a primer

prevenció

megvalósítában.

66

VI.

ÚJ EREDMÉNYEK 1. A korai klinikai stádiumú szájüregi laphámsejtes karcinoma miRNS expressziós mintázatának meghatározása: a. A daganatok és ép nyálkahártya szövetek között szignifikáns miRNS kifejeződésbeli különbségeket találtunk a miR-21, -27a, 34a, -93, -143, 146a, 148a, -155, -191, -196a, -203, -205, -221 és 223. Ezek a miR-34a és -143 csökkent expressziójú miRNS-ek kivételével fokozott kifejeződést mutattak a daganatos szövetekben. A miR-21, -27a, -155, -191, -205, -221, -223 biomarker teszt hatékonyság szempontjából is alkalmazhatónak bizonyult

a

daganatos szövetek molekuláris elkülönítésére. b. Klinikai és etiológiai tényezőkkel való összehasonlításban a miRNS expressziós profil mintázatbeli eltérései statisztikailag szignifikáns lineáris regressziót mutattunk ki a daganat szövettani grade-jével a miR34a, -143, -196a és -223, TNM státusszal a miR-155, a tumor méretével

kapcsolódóan

a

miR-93,

valamint

nyirokcsomó

metasztázissal miR-205 esetében. c. minden statisztikai tesztet figyelembe véve a miR-155 bizonyult a szájüregi daganatok szempontjából önállóan is alkalmazható mértékben specifikus ugyanakkor szenzitív markernek is, mely nagyfokú

összefüggést

mutatott

a

daganatok

klinikai

előrehaladottságot jelző TNM klasszifikációjával. 2. Az NFκB jelátviteli útvonalat reprezentáló mRNS targetek kvantitatív realtime PCR expressziós analízisét végeztük el, melyen kimutattuk a szignifikáns funkcionális eltérést mutató mRNS transzkriptumokat: a. A fókuszált NFκB jelátviteli rendszerhez kapcsolódó mRNS expressziós vizsgálat a Vcam és Tlr1 mRNS kifejeződése mutatott szignifikánsan emelkedett expressziót a daganatos szövetekben, jelentős de statisztikailag nem szignifikáns emelkedést mutattunk ki az NfκB1 mRNS esetén is. A szájüregi daganatokban az NFκB jelátvitel tagjai a miRNS kifejeződés változásaival szinkron expressziós eltéréseket mutatnak. A Vcam mRNS fokozott 67

expressziója szorosan kapcsolódik a karcinogenezis inváziót, lokális progressziót meghatározó lépéséhez. A miRNS-mRNS modulok együttes vizsgálata alátámasztja a miRNS dereguláció jelátviteli rendszerben értelmezhető molekuláris hatását. és

3. Meso-

hypopharynx

daganatterület-modelljét

lokalizációjú

miRNS

laphámrákok

expressziós

profilok

molekuláris segítségével

határoztuk meg. a. A laphámrákot körülvevő fenotípusosan ép nyálkahártya szövetek miRNS expressziós összehasonlító vizsgálata során meghatároztuk a daganatokra és peritumorális ép területekre és jellemző miRNS mintázatot a daganattól való távolság szempontjából. A daganatos szövet az ép közvetlen környezetétől a miR-21, -27a és 221 mennyiségi

változásával,

míg

a

távolabbi

peritumorális

szövetsávokat a miR-21, -27a, -146a, és -155 expresszió eltéréseivel különíthetők el; a távol eső normál nyálkahártya a tumorhoz viszonyított magas miR-34a és -143 kifejeződéssel azonosítható. b. Lokalizáció-specifikus

miRNS-eket

azonosítottunk

a

mesopharynxban: miR-221 és hypopharynxban: miR-148a az expressziós mintázatok összevetésében. A miRNS mennyiségét tekintve a miR-21, -143 és -155 a hypopharynx daganatokban a mesopharynxénál

statisztikailag

szignifikánsan

magasabbnak

igazolódott. 4. Follikuláris pajzsmirigy adenoma, follikuláris pajzsmirigy karcinoma és papilláris pajzsmirigy karcinoma minták magas denzitású mRNS expressziós array vizsgálatát végeztük normál pajzsmirigy szövettel történő összehasonlításban. a. meghatároztuk az egyes noduláris pajzsmirigydaganatcsoportnak megfelelő szignifikáns mRNS expressziós eltéréseket a normál szövethez képest: 233 gén csökkent és 25 gén fokozott expreszióját. A

daganatokban

a

malignitás

mértékével

párhuzamosan

kimutatható volt a szignifikánsan csökkent kifejeződést mutató gének magasabb aránya. Az emelkedett expressziót mutató gének 68

specifikusak voltak az eltérő szövettani csoportokban és egyetlen kivétellel-, amely az NFκB volt FA és FTC esetén- nem mutattak átfedést, míg a csökkent kifejeződést mutató géneknél számos átfedést tapasztaltunk. Az átfedést mutató génekre kiemelt figyelmet fordítottunk, részletesen bemutattunk és csoportosítottuk minden szövettani csoportnál. Három gén mRNS termékét minden pajzsmirigydaganat esetén szignifikánsan csökkent kifejeződésűnek találtunk. Ezek az eosinophyl derived neurotoxin 2, urotensin II és a PPARγ voltak. b. meghatároztuk az egyes szövettani csoportok közötti átfedést mutató expressziós eltéréseket és a közösen szabályozott jelátviteli útvonalat. Ennek kulcselemeként azonosítottuk az NFκB gént és a hozzá kapcsolódó PPARγ, CYLD1, EDA valamint JNK apoptózist valamint szöveti architektúrát szabályozó hálózatot.

69

VII. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 5S rRNS

5S riboszomális ribonukleinsav

AGO 1-4

argonauta 1-4 fehérje

AML

akut myeloid leukémia

ALL

akut limfoid leikémia

AP1ß

adaptor-related protein complex 1, ß subunit

BRAF

V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1

cDNS

komplementer dezoxiribonukleinsav

CI

konfidencia intervallum

CREBP

cAMP responsive element binding protein

CYLD1

cyclin D1

DGCR-8

diGeorge syndrome critical region-8

DNáz

dezoxiribonukleáz

EBV

Epstein-Barr tumor

EDA-1

ectodysplasin A-1

EDTA

etiléndiamin-tetraecetsav

EF1α

elongation factor 1-α

EGFR

epidermális növekedési tumor receptor

ERK

extracellular signal-regulated kinase

FA

follikuláris adenoma

FTC

follikuláris pajzsmirigy karcinoma

FNAB

fine needle aspiration biopsy, finomtű biopszia

GADD45

growth arrest and DNA-damage-inducible transcript 45

GAPDH

glyceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz

GLM

general linear model

HNSCC

head and neck squamous cell carcinoma, fej-nyak laphámsejtes carcinoma 70

HOX11

homeobox 11

HPRT

hypoxantin foszforibozil transzferáz

HPV

Humán papilloma tumor

HSF1

heat shock transcription factor 1

IARC

International Agency for Research on Cancer

IKBKγ

inhibitor of κ light polypeptide gene enhancer in B-cells, kinase γ

IKBε

inhibitor of nuclear factor κ B ε

IL-8

interleukin 8

IL1β

interleukin 1β

JUNK

jun proto-onkogén kináz

RAS

rat sarcoma viral oncogene

RET

ret protoonkogén

KSH

Központi Statisztikai Hivatal

MAPK

mitogén aktivált protein kináz

miRNS

micro ribonukleinsav

mRNS

messenger ribonukleinsav

NfκB

nukleáris faktor kappa B

NFX-1

nuclear transcription factor, X-box binding 1

OPL

orális prekurzor lézió

ORF

open reading frame

PARP-1

poli-adenozil-difoszfát-ribóz polimeráz 1

PAX-8

paired box-8

PPARγ

peroxisome proliferator-activated receptor γ

PCR

polymerase chain reaction, polimeráz láncreakció

PDTC

poorly differentiated thyroid cancer, rosszul differenciált pajzsmirigyrák

pre-miRNS

prekurzor micro ribonukleinsav

pri-miRNS

primer micro ribonukleinsav

PTC

papilláris pajzsmirigy carcinoma 71

RISC

RNA-induced scilencing complex

ROC

reciver operating characteristic curve

RT

reverz transzkripció

RT-PCR

reverz transzkripciós polimeráz láncreakció

snRNS

small nuclear ribonukleinsav

SOCS

suppressor of cytokine signaling proteins

STAT

signal transducer and activator of transcription

TGF-ß

transzformáló növekedési tumor ß

TLR-1

Toll-like receptor-1

TNIP-1

tumor nekrózis tumor α interacting protein 1

TNFα

tumor nekrózis tumor

TNM

tumoros megbetegedések klinikai stádiumbeosztása (tumor, nyirokcsomó, metasztázis)

TRBP

Tar RNA binding protein

UTR

untranslated region

UV

ultraibolya sugárzás

VCAM

vascular cell adhesion molecule

VEGF

vaszkuláris endoteliális növekedési tumor

WHO

World Health Organization, Egészségügyi Világszervezet

72

IRODALOMJEGYZÉK

X. 1.

Ember I, Kiss I, Cseh K: Népegészségügyi orvostan. Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kara, Pécs, 189-190, 2013.

2.

http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx

3.

Páldy A: Népegészségügyi jelentés, 2005.

4.

Demográfiai Évkönyv, Magyar Központi Statisztikai Hivatal, 2011.

5.

Szanyi I, Gőbel Gy, Ablonczy R, Gerlinger I, Lujber L, Bauer M, Pytel J: Rosszindulatú fej-nyaki daganatok epidemiológiai adatainak elemzése 19832002 között a Dél-dunántúli régióban. Magyar Epidemiológia, 4: 197-206, 2007.

6.

http/www.honcology.hu

7.

Kásler M: Klímaváltozás és a fej-nyaki onkológia. Magyar Tudomány, 172: 154-160, 2011.

8.

Répássy G: Fül-Orr-Gégészet Fej-Nyak-Sebészet. Medicina Kiadó, Budapest, 343-350, 2011.

9.

Kásler M: Az onkológia alapjai. Medicina Kiadó, Budapest, 327-371, 2011.

10. Péter I. A pajzsmirigy rosszindulatú daganatai. In: Leövey A: A klinikai endokrinológia és anyagcsere-betegségek kézikönyve. Medicina, Budapest 2001:329-330. 11. Nagataki S, Nystrom E: Epidemiology and primary prevention of thyroid cancer. Thyroid, 12:889-896, 2002 12. Franceschi S, Boyle P, Maisonneuve P, La Vecchia C, Burt AD, Kerr DJ, McFarlane GJ: The epidemiology of thyroid carcinoma. Critical Reviews in Oncogenesis, 4:25-52, 1993. 13. Dean DS, Gharib H: Epidemiology of thyroid nodules. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 6:901-11, 2008. 14. Belfiore A, La Rosa GL, La Porta GA, Giuffrida D, Milazzo G, Lupo L, Regalbuto C, Vigneri R: Cancer risk in patients with cold thyroid nodules: relevance of iodine intake, sex, age and multinodularity. Am J Med, 93:363369, 1992. 15. Huszno B, Szybinski Z, Przybylik-Mazurek E, Stachura J, Trofimiuk M, BuziakBereza M, Golkowski F, Pantofliski J: Influence of iodine deficiency and 73

iodine prophylaxis on thyroid cancer histotypes and incidence in endemic goiter area. J Endocrinol Invest, 26:71-76, 2003. 16. Ember I: Orvosi Népegészségtan, Dialóg Campus Kiadó, Budapest-Pécs, 2007 17. Napier SS, Speigh P:, Natural history of potentially malignant oral lesions and conditions: an overview of the literature, J. Oral Pathol Med. 37:1-10, 2008. 18. Robbins: A patológia alapjai. Medicina könyvkiadó, Budapest 2009. pp.644645. 19. Jayant K, Notani P: Epidemiology of oral cancer. In:Rao RS, Desai PB: Oral cancer. Tata Press: India, 1991. pp. 1-17. 20. Blot JW, McLaughlin KJ, Winn MD, et al.: Smoking and Drinking in Relation to Oral and Pharyngeal Cancer. Cancer Res, 48: 3282-3287, 1988. 21. Bosetti C, Gallus S, Altieri A, Franceschi S, Dal Maso L, Talamini R, Levi F, Negri E, Rodriguez T, La Vecchia C: Wine, beer and spirits and risk of oral and pharyngeal cancer: a case-control study from Italy and Switzerland. Oral Oncol, 40: 904-909, 2004. 22. Riedel F, Goessler U, Hörmann K: Alcohol-related diseases of the mouth and throat. Dig Dis, 23: 195-203, 2005. 23. Boffetta P, Hashibe M: Alcohol and cancer. Lancet Oncol, 7: 149-156, 2006. 24. Druesne-Pecollo N, Tehard B, Mallet Y, Gerber M, Norat T, Hercberg S, Latino-Martel P: Alcohol and genetic polymorphisms: effect on risk of alcohol-related cancer. Lancet Oncol, 10: 173-180, 2009. 25. Gillison ML, Koch WM, Shah KV: Human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma: are some head and neck cancers a sexually transmitted disease?.Curr Opin Oncol, 11: 191-199, 1999. 26. Tamás L, Szentkúti G, Pál A, Kásler M, Gaudi I, Szentirmay Z: Humán papilloma vírusok előfordulása és jelentősége fej-nyaki daganatokban. FülOrr-Gégegyógyászat, 56: 4-12, 2010. 27. Szentirmay Z, Szántó I, Bálint I, Pólus K, Remenár É, Tamás L, Szentkúti G, Melegh Zs, Nagy P, Kásler M: Oki összefüggés a tumor HPV virus-fertőzés és a fej-nyaki tumor valamint a nyelőcső laphámrákjának egyes típusai között. Magyar Onkológia, 46: 35-41, 2002. 28. Badaracco G, Venuti A, Morello R, Muller A, Marcante ML: Human papillomavirus in head and neck carcinomas: prevalence, physical status and 74

relationship with clinical/pathological parameters. Anticancer Res, 20: 13011305, 2000. 29. Szentirmay Z, Pólus K, Szentkúti G, Kurcsics J, Csernák E, Tóth E, Kásler M: Human papillomavirus in head and neck cancer: molecular biology and clinicopathological correlations. Cancer Metastasis Rev, 24: 19-34, 2005. 30. Kahn T, Turazza E, Ojeda R, Bercovich A, Stremlau A, Lichter P, Poustka A, Grinstein S, zur Hausen H: Integration of human papillomavirus type 6a DNA in a tonsillar carcinoma: chromosomal localization and nucleotide sequence of the genomic target region. Cancer Res, 54: 1305-1312, 1994. 31. Manias DA, Ostrow RS, McGlennen RC, Estensen RD, Faras AJ: Characterization of integrated human papillomavirus type 11 DNA in primary and metastatic tumors from a renal transplant recipient. Cancer Res, 49: 25142519, 1989. 32. Jones DL, Münger K: Analysis of the p53-mediated G1 growth arrest pathway in cells expressing the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein. J Virol, 71: 2905-2912, 1997. 33. Bussu F, Sali M, Gallus R, Vellone VG, Zannoni GF, Autorino R, Dinapoli N, Santangelo R, Martucci R, Graziani C, Micciché F, Almadori G, Galli J, Delogu G, Sanguinetti M, Rindi G, Valentini V, Paludetti G: HPV infection in squamous cell carcinomas arising from different mucosal sites of the head and neck region. Is p16 immunohistochemistry a reliable surrogate marker?.Br J Cancer, 108: 1157-1162, 2013. 34. McKaig RG, Baric RS, Olshan AF: Human papillomavirus and head and neck cancer: epidemiology and molecular biology. Head Neck, 20: 250-265, 1998. 35. Lindel K, Beer KT, Laissue J, Greiner RH, Aebersold DM: Human papillomavirus positive squamous cell carcinoma of the oropharynx: a radiosensitive subgroup of head and neck carcinoma. Cancer, 92: 805-813, 2001. 36. Dsouza G, Kreimer AR, Viscidi R, Pawlita M, Fakhry C, Koch WM, Westra WH, Gillison M: Case-control study of human papillomavirus and oropharyngeal cancer. N Engl J Med, 346: 1944-1956, 2007. 37. Goldenberg D, Benoit NE, Begum S, Westra WH, Cohen Y, Koch WM, Sidransky D, Califani JA: Epstein-Barr virus in head and neck cancer assessed 75

by quantitative polymerase chain reaction. Laryngoscope, 114: 1027-1031, 2004. 38. Shimakage M, Sasagawa T, Yoshino K, Yutsudo M, Kimura M, Yamamott N, Yanoma S: Expression of Epstein-Barr virus in mesopharyngeal and hypopharyngeal carcinomas. Hum Pathol, 30: 1071-1076, 1999. 39. Gude D, Bansal D, Malu A: Revisiting plummer vinson syndrome. Ann Med Health Sci Res, 3: 119-121, 2013. 40. Li Q, Chuang Sc, Eluf-Neto J, Menezes A, Matos E, Koifman S, Wünsch-Filho V, Fernandez L, Daudt AW, Curado MP, Winn DM, Franceschi S, Herrero R, Castellsague X, Morgenstern H, Zhang ZF, Lazarus P, Muscat J, McClean M, Kelsey LT, Hayes RB, Purdue MP, Schwartz SM, Chen C, Benhamou S, Olshan AF, Yu G, Schantz S, Ferro G, Brennan P, Boffetta P, Hashibe M: Vitamin or mineral supplement intake and the risk of head and neck cancer: pooled analysis in the INHANCE consortium. Int J Cancer, 131: 1686-1699, 2012. 41. Braakhuis BJ, Leemans CR, Brakenhoff RH: A genetic progression model of oral cancer: current evidence and clinical implications. J Oral Pathol Med, 33: 317– 322, 2004. 42. Braakhuis BJ, Tabor MP, Kummer JA: A genetic explanation of Slaughter’s concept of field cancerization: evidence and clinical implications. Cancer Res, 63: 1727–1730, 2003. 43. Braakhuis BJ, Brakenhoff R, Leemans CR: Head and neck cancer: molecular carcinogenesis. Annals of Oncology, 16 (Supplement 2): 249 –250, 2005. 44. Hedinger C, Williams ED, Sobin LH: Histological typing of thyroid tumors. International Classification of Tumors. Vol 11. Second Edition. Springer Verlag, Berlin 1988. 45. Cavallari V, Albiero F, Cicciarello R, Gagliardi ME, Costa G, D’Alia C, Sturniolo G, Tonante A, Labate A, Torre V, Vermiglio F, Caillou B: Morphological changes of follicular cell basal borders and basement membranes in benign and malignant nodular lesions of the thyroid gland: an ultrastructural study. Ultrastruct Pathol, 28:199-207, 2004. 46. Nucera C, Goldfarb M, Hodin R, Parangi S: Role of B-RafV600E in differentiated thyroid cancer and preclinical validation of compounds against B-RafV600E Biochim Biophys Acta, 1795(2): 10, 2009. 76

47. Xing M:Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nat 48. Rev Cancer, 13(3): 184–199, 2013. 49. Howell GM, Hodak SP, YipL: RAS mutations in thyroid cancer. Oncologist, 18(8): 926–932 2013. 50. Liebner DA, Shah MH:Thyroid cancer. Pathogenesis and targeted therapy.Ther Adv Endocrinol Metab, 2(5): 173–195, 2011. 51. Tallini G, Asa SL: RET tumor si activation in papillary carcinoma. AdvAnat Pathol, 8:345-354, 2001. 52. Sugg SL, Ezzat S, Rosen IB, Freeman J, Asa SL: Distinct multiple ret/PTC gene rearrangements in multifocal papillary thyroid neoplasia. J Endocrin Metabol, 83:4116-4122. 1998. 53. Vu-Phan D, Grachtchouk V, Yu J, Colby LA, Wicha MS, Koenig RJ:The thyroidcancer PAX8-PPARG Fusion Protein activates Wnt/TCF responsive cells that have a transformed phenotype. Endocr Relat Cancer. 20(5): 10, 2013. 54. Huszno B, Szybinski Z, Przybylik-Mazurek E, Stachura J, Trofimiuk M, BuziakBereza M, Golkowski F, Pantofliski J: Influence of iodine deficiency and iodine prophylaxis on thyroid cancer histotypes and incidence in endemic goiter area. J Endocrinol Invest, 26:71-76, 2003. 55. Gilliland FD, Hunt WC, Morris DM, Key CR: Prognostic factors for thyroid carcinoma: a population-based study of 15698 cases for the Surveillance, Epidemiology and End Results (SEER) Program 1973-1991. Cancer, 79:564573, 1997. 56. Oláh E: Molekuláris onkogenetika, in: Kásler M: Az onkológia alapjai. Medicina Könyvkiadó Zrt, Budapest 2011, pp.49-69 57. Belbin TJ, Bergman A, Brandwein-Gensler M, Chen Q, Childs G, Garg M, Haigentz M, Hogue-Angeletti R, Moadel R, Negassa A, Owen R, Prystowsky MB, Schiff B, Schlecht NF, Shiften K, Smith RV, Zheng X: Head and Neck cancer: reduce and integrate for optimal outcome. In: Cannizzaro LA, Ramesh KH: Cancer Genomics. Karger, Basel, 2007., pp:92-109. 58. Alison MR, Burkert J, Wright NA, Leedham S: Stem cells and tumorigenesis. In: Alison MR: The cancer handbook. 2nd edition. John Wiley and Sons Ltd. West Sussex, 2007. pp 22-35.

77

59. Jackson SP, Bartek J: The DNA-damage response in human biology and disease. Nature, 461: 1071-8. Review, 2009. 60. Smith IM, Mithani SK, Liu C, Chang SS, Begum S, Dhara M, Westra W, Sidranksy D, Califano JA.: Novel integrative methods for gene discovery associated with head and neck squamous cell carcinoma development. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 135(5):487-95, 2009. 61. Boyle JO, Gümüs ZH, Kacker A, Choksi VL, Bocker JM, Zhou XK, Yantiss RK, Hughes DB, Du B, Judson BL, Subbaramaiah K, Dannenberg AJ :Effects of cigarette smoke on the human oral mucosal transcriptome.Cancer Prev Res, 3(3):266-78, 2010. 62. Severino P, Alvares AM, Michaluart P Jr, Okamoto OK, Nunes FD, MoreiraFilho CA, Tajara EH: Global gene expression profiling of oral cavity cancers suggests molecular heterogeneity within anatomic subsites. Head and Neck Genome Project GENCAPO; BMC Res Notes 13: 1-113, 2008. 63. Liu CJ, Liu TY, Kuo LT, Cheng HW, Chu TH, Chang KW, Lin SC: Differential gene expression signature between primary and metastatic head and neck squamous cell carcinoma.J Pathol, 214(4):489-97, 2008. 64. Ziober AF, Patel KR, Alawi F, Gimotty P, Weber RS, Feldman MM, Chalian AA, Weinstein GS, Hunt J, Ziober BL: Identification of a gene signature for rapid screening of oral squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res, 15(12):5960-71, 2006. 65. Gottschlich S, Ambrosch P, Cordes C, Görögh T, Schreiber S, Häsler R: Gene expression profiling of head and neck squamous cell carcinoma using cDNA microarrays. Int J Oncol, 2006 Sep;29(3):605-13. 66. Kainuma K, Katsuno S, Hashimoto S, Oguchi T, Suzuki N, Asamura K, Usami S: Differences in the expression of genes between normal tissue and squamous cell carcinomas ofhead and neck using cancer-related gene cDNA microarray. Acta Otolaryngol, 126(9):967-74, 2006. 67. Severino P, Oliveira LS, Torres N, Andreghetto FM, Klingbeil Mde F, Moyses R, Wünsch-Filho V, Nunes FD, Mathor MB, Paschoal AR, Durham AM: Highthroughput sequencing of small RNA transcriptomes reveals critical biological features targeted by microRNAs in cell models used for squamous cell cancer research.BMC Genomics, e-pub: doi: 10.1186/1471-2164-14-735, 2013. 78

68. Lacko M, Braakhuis BJ, Sturgis EM, Boedeker CC, Suárez C, Rinaldo A, Ferlito A, Takes RP:Genetic susceptibility to head and neck squamous cell carcinoma. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 89(1):38-48, 2014. 69. Gombos K, Ember I: Molekuláris közegészségtan In: Ember I, Kiss I, Cseh K: Népegészségügyi orvostan. Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kara, Pécs, 189-190, 2013. 70. Marilena V, Iorio and Carlo M. Croce: MicroRNAs in Cancer: Small Molecules With a Hugh Impact. J Clin Oncol, 27: 5848-5856, 2009. 71. Molnár V, Bakos B, Hegyesi H, Falus A: Nem kódoló genom és mikroRNS-ek: új fejezet a genetika történetében. LAM, 18: 591-597, 2008. 72. Gőcze K, Gombos K, Pajkos G, Magda I, Ember Á, Juhász K, Patczai B, Ember I: Mikro-RNS-ek jelentósége a molekuláris epidemiológiában. Orvosi Hetilap, 152: 633-641, 2011.38 73. Tömböl Zs, Szabó P, Rácz K, Tulassay Zs, Igaz P: A mikro-RNS-ek jelentősége daganatos betegségekben. Orvosi Hetilap, 148: 1135-1141, 2007. Wang M, Wang Q, Zhang B: Response of miRNAs and their targets to salt and drought stresses in cotton (Gossypium hirsutum L.). Gene, 510: 26-32, 2013. 74. Valadi H, Ekström K, Bossios A, Sjöstrand M, Lee JJ, Lötvall JO: Exosomemediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol, 9: 654-659, 2007. 75. Chim SS, Shing TK, Hung EC, Leung TY, Lau TK, Chiu RW, Lo YM: Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin Chem, 54: 482-490, 2008. 76. Chen DB, Wnag W: Human placental microRNAs and preeclampsia. Biol Reprod, 88: 130, 2013. 77. Saito Y, Liang G, Egger G, Friedman JM, Chuang JC, Coetzee GA, Jones PA: Specific activation of microRNA-127 with downregulation of the protooncogene BCL6 by chromatin-modifying drugs in human cancer cells. Cancer Cell, 9: 435-443, 2006. 78. Meng F, Wehbe-Janek H, Henson R, Smith H, Patel T: Epigenetic regulation of microRNA-370 by interleukin-6 in malignant human cholangiocytes. Oncogene, 27: 378-386, 2008.

79

79. Azmi AS, Bao B, Sarkar FH: Exosomes in cancer development, metastasis, and drug resistance: a comprehensive review.Cancer Metastasis Rev, 32(3-4):62342, 2013. 80. Potter JD: Morphogens, morphostats, microarchitecture and malignancy. Nat Rev Cancer, 7(6):464-74, 2007. 81. Potter JD: Morphostats: a missing concept in cancer biology. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 10(3):161-70, 2001. 82. Gombos K, Horváth R, Szele E, Juhász K, Gocze K, Somlai K, Pajkos G, Ember I, Olasz L: miRNA expression profiles of oral squamous cell carcinomas. Anticancer Res, 33: 1511-1517, 2013. 83. Zen K, Zhang CY: Circulating microRNAs: a novel class of biomarkers to diagnose and monitor human cancers. Med Res Rev, 32: 326-348, 2012. 84. Lawrie CH, Gal S, Dunlop HM, Pushkaran B, Liggins AP, Pulfold K, Banham AH, Pezzella F, Boultwood J, Wainscoat JS, Hatton CS, Harris AL: Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma. Br J Haematol, 141: 672-675, 2008. 85. Katoh T, Sakaguchi Y, Miyauchi K, Suzuki T, Kashiwabara S, Baba T, Suzuki T: Selective stabilization of mammalian microRNAs by 3’ adenylation mediated by the cytoplasmic poly(A) polymerase GLD-2. Genes Dev, 23: 433438, 2009. 86. Ji X, Takahashi R, Hiura Y, Hirokawa G, Fukushima Y, Iwai N: Plasma miR208 as a biomarker of myocardial injury. Clin Chem, 55: 1944-1949, 2009. 87. Khoury MJ, Little J., Burke W: Human Genome Epidemiology: A Scientific Foundation for Using Genetic Information to Improve Health and Prevent Disease. Oxford University Press, New York, 2004 88. Khoury MJ, Bedrosian S, Gwinn M, Little J, Ioannidis JP: Human Genome Epidemiology: Building the evidence for using genetic information to improve health and prevent disease. Oxford University Press, New York, 2010 89. Braakhuis BJ, Brakenhoff RH, Leemans CR: Second field tumors: a new opportunity for cancer prevention?.Oncologist, 10: 493-500, 2005. 90. Zhu S, Wu H, Wu F, Nie D, Sheng S, MoYY: MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis. Cell Res, 18: 350–359, 2008.

80

91. Boldrup L, Coates PJ, Wahlgren M, Laurell G, Nylander K: Subsite-based alterations in miR-21, miR-125b, and miR-203 in squamous cell carcinoma of the oral cavity and correlation to important target proteins. J Carcinog, e-pub: doi: 10.4103/1477-3163.104007, 2012. 92. Wald AI, Hoskins EE, Wells SI, Ferris RL, Khan SA: Human papillomavirus alters microRNA profiles in squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN) cell lines. Head Neck, 33: 504–512, 2011. 93. Braakhuis BJ, Leemans Cr, Brakenhoff RH: A genetic progression model of oral cancer: current evidence and clinical implications. J Oral Pathol Med, 33: 317-322, 2004. 94. Li J, Wang K, Chen X, Meng H, Song M, Wang Y, Xu X and Bai Y: Transcriptional activation od microRNA-34a by NF-kappa B in human esophageal cancer cells. BMC Mol Biol, 13:4, 2012. 95. Lou G, Liu Y, Wu S, Xue J, Yang F, Fu H, Zheng M, Chen Z: The p53/miR34a/Sirt1 positive feedback loop in quercetin induced apoptosis. Cell Physiol Biochem, 35(6):2192-2202, 2015. 96. Jiang Y, Zhu Y, Wang X, Gong J, Hu C, Guo B, Zhu B, Li Y: Temporal regulation of HIF-1 and NFκB in hypoxic hepatocarcinoma cells. Oncotarget Online, 1949-2553, 2015. 97. Xu YF, Mao YP, Li YQ, Ren XY, He QM, Tang XR, Sun Y, Liu N, Ma J: MicroRNA-93 promotes cell growth and invasion in nasopharyngeal carcinoma by

targeting

disabled

homolog-2.

Cancer

Lett,

doi:

http://dx.doi.org/10.1016/j.canlet.2015.04.006, 2015. 98. Zhong W, He B, Zhu C, Xiao L, Zhou S, Peng X: MicroRNA-143 inhibits migration of human nasopharyngeal carcinoma cells by negatively regulating GLI3 gene. J South Med Univ 33(7): 1057-61, 2013. 99. Iorio MV and Croce CM: microRNA involvement in human cancer. Carcinogenesis 33: 1126-1133, 2012. 100. Cognetti DM, Weber RS, Lai SY: Head and neck cancer: an evolving treatment paradigm. Cancer, 113: 1911–1932, 2008. 101. Mydlarz WK, Hennessey PT and Califano JA: Advances and perspectives in the molecular diagnosis of head and neck cancer. Expert Opin Med Diagn, 4: 53–65, 2010. 81

102. Saintigny P, Zhang L, Fan YH, El-Naggar AK, Papadimitrakopoulou VA, Feng L, Lee JJ, Kim ES, Hong WK, and Mao L: Gene expression profiling predicts the development of oral cancer. Cancer Prevention Research, 4: 218-229, 2011. 103. Volinia S, Calin GA, Liu CG, Ambs S, Cimmino A, Petrocca F, Visone R, Iorio M, Roldo C, Ferracin M, Prueitt RL, Yanaihara N, Lanza G, Scarpa A, Vecchione A, Negrini M, Harris Cca and Croce CM: A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc Natl Acad Sci, 103: 2257-2261, 2006. 104. Ramdas L, Giri U, Ashorn C, Coombes RK, el-Naggar A, Kian Ang K, Story DM: miRNA expression profiles in head and neck squamous cell carcinoma and adjacent normal tissue. Head Neck, 31: 642-654, 2009. 105. Nappal N, Ahmad HM, Chameettachal S, Sundar D, Ghosh S, Kulshrestaha R: HIF-inducible miR-191 promotes migration in breast cancer through complex regulation of TGF-βsignalling in hypoxic microenvironment. Sci Rep, 13;5 9650 doi: 101038/srep09650, 2015. 106. Hezova R, Kovarikova A, Srovnal J, Zemanova M, harustiak T, Ehrmann J, Hajduch M, Svoboda M, Sachlova M, Slaby O: Diagnostic and prognostic potential of miR-21, miR-29c, miR-148 and miR203 in adenocarcinoma and squamous cell carcinoma of esophagus. Diagn Pathol, 10(1): 42, 2015 107. Patanic S, Mallick R, Kannisto E, Sharma R, Bshara W, Yendamuri S, Dhillon SS: miR-205 and miR-375 microRNA assays to distinguish squamous cell carcinoma from adenocarcinoma in lung biopsies. J Thorac Oncol, 10 (3): 446453, 2015. 108. Yang CJ, Shen WG, Liu CJ, Chen YW, Lu HH, Tsai MM, Lin SC: miR-221 and miR-222 expression increased the growth and tumorigenesis of oral carcinoma cells. J Oral Pathol Med, 40(7): 683-689, 2011. 109. Garofalo M, Di Leva G, Romano G, Nuovo G, Suh SS, Ngankeu A, Taccioli C, Pichiorri F, Alder H, Secchiero P, Gasparini P, Gonelli A, Costinean S, Acunzo M, Condorelli G, Croce CM: miR-221&222 regulate TRAIL resistance and enhance tumorigenicity through PTEN and TIMP3 downregulation. Cancer Cell, 16: 498-509, 2009.

82

110. Zeng X, Xiang J, Wu M, Xiong W, Tang H, Deng M, Li X, Liao Q, Su B, Luo Z, Zhou Y, Zhou M, Zeng Z, Li X, Shen S, Shuai C, Li G, Fang J, Peng S: Circulating miR-17, miR-20a, miR-29c, and miR-223 combined as noninvasive biomarkers in nasopharyngeal carcinoma. PloS One, 7(10):e46367, 2012 doi: 10.1371/journal.pone.0046367. 111. Greten FR, Eckmann L, Greten TF, Park JM, Li ZW, Egan LJ, Kagnoff M, Karin M: IKK alpha links inflammation and tumorigenesis in a mouse model of colitis-associated cancer. Cell, 118: 285- 296, 2004. 112. Pikarsky E, Porat RM, Stein I, Abramovitch R, Amit S, Kasem S, GutkovichPyest E, Urieli-Shoval S, Galun E, Ben-Neriah Y: NFKB functions as a tumor promoter in inflammation-associated cancer. Nature, 431: 461-466 2004. 113. Jung YJ, Isaacs JS, Lee S, Trepel J, Neckers L: IL-1beta –mediated upregulation of HIF1alpha as a critical link between inflammation and oncogenesis. FASEB J, 17: 2115- 2117, 2003. 114. Barden CB, Shister KW, Zhu B, Guiter G, Greenblatt DY, Zeiger MA and Fahey TJ: Classification of follicular thyroid tumors by molecular tumor sin: results of gene profiling. Clin Cancer Res, 9: 1792-1800, 2003. 115. Finley DJ, Arora N, Zhu B, Gallagher L, and Fahey TJ: Molecular profiling distinguishes papillary carcinoma from benign thyroid nodules. J Clin Endocrrinol Metab, 89: 3214-3223, 2004. 116. Gombos K, Szele E, Kiss I, Varjas T, Puskas L, Kozma L, Juhasz F, Kovacs E, Szanyi I and Ember I: Characterization of microarray gene expression profiles of early stage thyroid tumours. Cancer Genomics and Proteomics, 4: 403- 410, 2007. 117. Jamali Z, Asl Aminabadi N, Attaran R, Pournagiazar F, Ghertasi Oskouei S, Ahmadpour F: MicroRNAs as prognostic molecular signatures in human head and neck squamous cell carcinoma: a systematic review and metaanalysis.Oral Oncol, 51(4):321-431, 2015.) 118. Tian Y, Fu S, Qiu GB, Xu ZM, Liu N, Zhang XW, Chen S, Wang Y, Sun KL, Fu WN: MicroRNA-27a promotes proliferation and suppresses apoptosis by targeting PLK2 in laryngeal carcinoma. BMC Cancer, 18 (14) :678, 2014. 119. Smith B, Treadwell J, Zhang D, Ly D, McKinnell I, Walker PR, Sikorska M: Large-scale expression analysis reveals distinct microRNA profiles at different 83

stages of human neurodevelopment. PloS One, 15;5(6):e11109., 2010, doi: 10.1371/journal.pone.0011109. 120. Salazar C, Nagadia R, Pandit P, Cooper-White J, Banerjee N, Dimitrova N, Coman WB, Punyadeera C: A novel saliva-based microRNA biomarker panel to detect head and neck cancers. Cell Oncol, 37 (5): 331-338, 2014 121. Yu M, Yeh J, Van Waes C: Protein kinase casein kinase 2 mediates inhibitor KB kinase and aberrant nuclear factor KB activation by serum factors in head and neck squamous carcinoma cells. Cancer Res, 66: 6722- 6731, 2006. 122. Wang CY, Mayo MW, Baldwin AS: TNF- and cancer therapy-induced apoptosis: potentiation by inhibition of NFKB. Science 274: 784-787, 1996. 123. Cusack JC, Liu R, Houston M, Abendroth K, Elliott PJ, Adams J, Baldwin AS: Enhanced chemosensitivity to CPT11 with proteasome inhibitor PS-341: Implications for systemic NFKB inhibition. Cancer Res, 61: 3535-3540, 2001. 124. Visconti R, Cerutti J, Battista S, Fedele M, Trapasso F, Zeki K, Miano MP, de Nigris F, Casalino L, Curcio F: expression of the neoplastic phenotype by human thyroid carcinoma cell lines requires NfkappaB p65 protein expression. Oncogene, 15 1987-1994, 1997. 125. Jarzab B, Wiench M, Fujarewicz K, Simek K, Jarzab M, Oczko-Wojciechowska M: Gene expression profile of papillary thyroid cancer: sources of variability and diagnostic implications. Cancer Res, 65: 1587-97, 2005. 126. Rosen J, He M, Umbricht C, Alexander HR, Dackiw AP, Zeiger MA, Libutti SK: A six-gene model for differentiating benign from malignant thyroid tumors on the basis of gene expression. Surgery,138(6):1050-7, 2005 127. Finley DJ, Zhu B, Barden CB, Fahey TJ III:Discrimination of benign and malignant thyroid nodules by molecular profiling. Ann Surg, 240(3):425-37, 2004 128. Vasko VV, Gaudart J, Allasia C, Savchenko V, Di Christofaro J, Saji M, Ringel MD and De Micco C: Thyroid follicular adenomas may display features of follicular carcinoma and follicular variant of papillary carcinoma. Eur J Endocrinol, 151: 779-786, 2004. 129. Mahe E, Akhter A, Le A, Street L, Pournaziri P, Kosari F, Shabani-Rad MT, Stewart D, Mansoor A: PARP1 expression in mantle cell lymphoma: the utility

84

of PARP1 immunohistochemistry and its relationship with markers of DNA damage.e-pub: PMID:25143154 Hematol Oncol, 2014. 130. Camós M, Esteve J, Jares P, Colomer D, Rozman M, Villamor N, Costa D, Carrió A, Nomdedéu J, Montserrat E, Campo E: Gene expression profiling of acute myeloid leukemia with translocation t(8;16)(p11;p13) and MYST3CREBBP rearrangement reveals a distinctive signature with a specific pattern of HOX gene expression. Cancer Res, 66(14):6947-54, 2006. 131. McCampbell A, Taylor JP, Taye AA, Robitschek J, Li M, Walcott J, Merry D, Chai Y, Paulson H, Sobue G, Fischbeck KH: CREB-binding protein sequestration by expanded polyglutamine. Hum Mol Genet, 9(14):2197-202, 2000. 132. Shamovsky I, Gershon D: Novel regulatory factors of HSF-1 activation: facts and perspectives regarding their involvement in the age-associated attenuation of the heat shock response. Mech Ageing Dev, 125(10-11):767-75, 2004. 133. Hawley RG, Hawley TS, Cantor AB: TLX1 (HOX11) immortalization of embryonic stem cell-derived and primary murine hematopoietic progenitors. Curr Protoc Stem Cell Biol, e-publication: PMID:19085976, 2008. 134. Hume CR, Lee JS: Congenital immunodeficiencies associated with absence of HLA class II antigens on lymphocytes result from distinct mutations in transacting factors. Hum Immunol, 26(4):288-309, 1989. 135. Smahi A, Courtois G, Rabia SH, Döffinger R, Bodemer C, Munnich A, Casanova JL, Israël A: The NF-kappaB signalling pathway in human diseases: from incontinentia pigmenti to ectodermal dysplasias and immune-deficiency syndromes. Hum Mol Genet, 11(20):2371-5, 2002. 136. Ichikawa H, Takada Y, Murakami A, and Aggrawal BB: Identification of the novel blocker of IKBalpha kinase that enhances cellular apoptosis and inhibits cellular invasion through suppression of NFKB regulated gene products. J Immun, 174: 7383-7392, 2005. 137. Aggarwal BB: Nuclear factor KB: The enemy within. Cancer Cell, 6: 203-208, 2004. 138. Yamamoto Y, Gaynor RB: Therapeutic potential of inhibition of the NFKB pathway in treatment of inflammation and cancer. J Clin Invest, 107: 134-142, 2001. 85

X. FÜGGELÉK Faktorok közti összefüggés vizsgálata általánosított lineáris regressziós modellben Vizsgált faktor

Függő változó status

Corrected Model

,001

smoking

1,086

,441

alcohol

1,891

,121

TNMstage

1,748

,152

grade

3,674

,010

size

1,071

,451

,919

,565

1,381

,276

,854

,618

11,630

,004

smoking

2,664

,125

alcohol

3,344

,089

TNMstage

15,900

,001

grade

52,720

,000

size

14,378

,002

location

14,422

,002

lymphnode

1,299

,274

recidive

1,695

,214

status

7,011

,019

smoking

,564

,465

alcohol

,000

,987

TNMstage

,008

,932

grade

,262

,617

1,095

,313

location

,001

,977

lymphnode

,121

,733

recidive

,108

,747

status

6,038

,028

smoking

,017

,897

alcohol

,004

,949

TNMstage

,013

,909

grade

,609

,448

size

,091

,767

location

,051

,825

1,435

,251

lymphnode recidive status

miR21

size

miR27a

Sig.

55,978

location

Intercept

F

lymphnode

86

miR34a

recidive

,474

,502

status

6,560

,023

smoking

,162

,693

alcohol

,327

,576

TNMstage

,045

,835

grade

9,221

,009

size

2,308

,151

,791

,389

2,778

,118

,246

,627

2,207

,160

smoking

,275

,608

alcohol

,644

,436

TNMstage

1,025

,328

grade

1,994

,180

size

3,673

,076

location

,412

,531

lymphnode

,484

,498

recidive

,013

,911

status

9,755

,007

smoking

,296

,595

alcohol

,450

,513

TNMstage

,504

,489

grade

6,401

,024

size

2,212

,159

location

2,954

,108

lymphnode

,835

,376

recidive

,025

,878

4,267

,058

smoking

,085

,774

alcohol

,042

,840

2,730

,121

grade

,143

,711

size

,077

,785

location

,327

,577

2,945

,108

,261

,618

22,817

,001

smoking

1,054

,322

alcohol

1,104

,311

TNMstage

5,700

,032

,077

,786

3,809

,071

location lymphnode recidive status

miR93

miR143

status

TNMstage miR146a

lymphnode recidive status

miR155

grade size

87

miR196a

location

,179

,679

lymphnode

,543

,473

recidive

,823

,380

status

,042

,840

smoking

,001

,970

alcohol

,092

,766

TNMstage

,411

,532

7,140

,018

,103

,753

location

1,439

,250

lymphnode

2,709

,122

,132

,722

12,655

,003

smoking

,078

,784

alcohol

,097

,760

TNMstage

,418

,528

grade

,023

,882

size

,141

,713

location

,643

,436

lymphnode

,468

,505

recidive

,157

,698

status

,050

,827

smoking

,068

,798

alcohol

,317

,582

TNMstage

,022

,883

grade

,276

,607

size

,330

,575

location

,024

,879

lymphnode

5,039

,041

recidive

1,510

,239

status

6,138

,027

smoking

,281

,604

alcohol

,084

,776

TNMstage

,818

,381

grade

,148

,706

size

,263

,616

location

,472

,503

4,062

,063

recidive

,158

,697

status

9,216

,009

smoking

,026

,875

alcohol

,298

,594

TNMstage

,711

,413

grade size

recidive status

miR203

miR205

miR221

lymphnode

miR223

88

grade

11,996

,004

,272

,610

1,616

,224

lymphnode

,353

,562

recidive

,003

,958

status

8,273

,012

smoking

,013

,910

alcohol

,128

,726

TNMstage

,266

,614

grade

,543

,473

size

,029

,868

location

,532

,478

lymphnode

9,170

,009

recidive

4,652

,049

,023

,881

smoking

3,386

,087

alcohol

6,030

,028

TNMstage

,633

,440

grade

,473

,503

size

,248

,626

location

,050

,827

2,634

,127

,475

,502

size location

sex

status

age

lymphnode recidive

XVIII. táblázat: Faktorok közti összefüggés vizsgálata általánosított lineáris regressziós modellben

89

Num. ID

Name

1

AB002335_1

gi:2224614 – kiaa0337

2

AB018009_1

gi:5926731 – l-type amino acid transporter 1

3

AB028140_1

gi:12248916 – spinesin

4

AB051077_1

gi:18147119 – peroxin pex6p

5

AB081726_1

gi:23491809 – cam-kinase i like protein kinase beta

6

AF023917_1

gi:3387789 – pir1

7

AF127138_1

gi:5922724 – lysophosphatidic acid g protein-coupled receptor

8

AF153762_1

gi:7157918 – bruton’s tyrosine kinase

9

AF208694_1

gi:11494011 – impact

10

AF265577_1

gi:11907840 – orphan neurotransmitter transporter v7-3

11

AF467005_1

gi:18568349 – partitioning-defective 3 protein splice variant e

12

AJ277442_1

gi:11322269 – xylosyltransferase ii

13

AJ292566_1

gi:17932719 – aiolos isoform three

14

AK000092_1

gi:7019954 – cdna clone unnamed protein product.

15

AK025436_1

gi:10437947 – homo sapiens cdna: flj21783 fis, clone hep00284; unnamed protein product.

16

AK027167_1

gi:10440229 – homo sapiens cdna: flj23514 fis, clone lng04628; unnamed protein product.

17

AK055683_1

gi:16550468 – cdna clone weakly similar to hypothetical zinc finger protein zk686.4 in chromosome iii

18

AK058200_1

gi:16554280 – cdna clone unnamed protein product.

19

AL035250_2

gi:11231170 – dj614c15.1.3 (endothelin 3, isoform 3); edn3

20

AY082588_1

gi:19697912 – rhophilin-1

21

BC001269_1

gi:12654850 – speckle-type poz protein

22

BC002383_1

gi:12803158 – proteasome (prosome, macropain) 26s subunit, non-atpase, 9 90

23

BC007380_1

gi:13938470 – similar to dactylaplasia

24

BC007517_1

gi:13960154 – ring finger protein (c3hc4 type) 8

25

BC007658_1

gi:14043325 – unknown (protein for mgc:747)

26

BC011634_1

gi:15079632 – similar to g protein-coupled receptor 30

27

BC017480_1

gi:17028349 – unknown (protein for mgc:15775)

28

BC017796_1

gi:17389518 – unknown (protein for mgc:22340)

29

BC017798_1

gi:17389524 – unknown (protein for mgc:22343)

30

BC021104_1

gi:18088893 – apelin

31

BC022001_1

gi:18314419 – pest-containing nuclear protein

32

BC022483_1

gi:18490366 – unknown (protein for mgc:26309)

33

BC023542_1

gi:23272117 – sortilin 1

34

BC032007_1

gi:21594217 – similar to transmembrane 6 superfamily member 1

35

L34657_1

gi:598221 – platelet endothelial cell adhesion molecule-1

36

M55513_1

gi:189653 – potassium channel protein

37

M63012_1

gi:190191 – serum paraoxonase

38

NM_000127_1

gi:4557570 – exostoses (multiple) 1

39

NM_006358_1

gi:5453917 – solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; peroxisomal membrane protein, 34kd), member 17; slc25a17

40

NM_006364_1

gi:5454041 – sec23 (s. cerevisiae) homolog a

41

NM_016106_1

gi:7706370 – vesicle transport-related protein

42

NM_016279_1

gi:16306540 – cadherin 9, type 2 preproprotein; cdh9

43

NM_017535_1

gi:8922158 – hypothetical protein dkfzp566h0824

44

NM_025085_1

gi:17149826 – hypothetical protein flj13340, isoform 2; flj13340

45

NM_033437_1

gi:15812215 – phosphodiesterase 5a, isoform 3; pde5a

46

NM_144781_1

gi:21735593 – programmed cell death 2, isoform 2; pdcd2 91

47

NM_145159_1

gi:21704278 – jagged 2, isoform b precursor; jag2

48

NM_145752_1

gi:22027474 – cdp-diacylglycerol–inositol 3phosphatidyltransferase isoform 2

49

XM_088140_1

gi:18600760 – similar to krab zinc finger protein kr18

50

XM_090790_1

gi:22048010 – hypothetical protein bc008134

51

XM_170621_1

gi:22062817 – similar to calcium-promoted ras inactivator

52

XM_170730_1

gi:22061912 – similar to hypothetical protein flj21127

XIX. táblázat Az FTC-re jellemző alulexpreszált gének

Num .

ID

Name

1

AB004677_1

gi:3599668 – dihydropyrimidinase

2

AB007894_1

gi:2662148 – kiaa0434

3

AB014532_1

gi:3327077 – kiaa0632 protein

4

AB022341_1

gi:5162883 – zip kinase

5

AB030824_1

gi:8272417 – transcription factor bteb2

6

AB059277_1

gi:17298095 – transcription factor elys

7

AB067628_1

gi:16303265 – wnt3

8

AF016365_4

gi:2873347 – hexokinase i

9

AF022913_1

gi:2558890 – gpi transamidase

10

AF026002_1

gi:2570859 – calcium-activated potassium channel beta subunit

11

AF037333_1

gi:2739207 – eph-like receptor tyrosine kinase hephb1c

12

AF042001_1

gi:2832265 – zinc finger protein slug

13

AF059194_1

gi:3068760 – basic-leucine zipper transcription factor mafk

14

AF087918_1

gi:7144622 – olfactory receptor 17-7

15

AF089094_1

gi:10503947 – calpain-like protease capn10f 92

16

AF105378_1

gi:4835726 – heparan sulfate d-glucosaminyl 3-osulfotransferase-4

17

AF117947_1

gi:6650765 – pdz domain-containing guanine nucleotide exchange factor i

18

AF131848_1

gi:4406690 – unknown

19

AF136631_1

gi:7416938 – neuritin

20

AF137386_1

gi:4927225 – plasmolipin

21

AF157483_1

gi:5616236 – retinoic acid receptor beta 4

22

AF160499_1

gi:6651285 – arylsulfatase d beta

23

AF164793_1

gi:8895088 – protein x 013

24

AF179849_1

gi:14599447 – lim homeobox protein 4

25

AF212238_1

gi:13182756 – htpap

26

AF212247_1

gi:11934694 – cda08

27

AF310133_1

gi:12044277 – krev interaction trapped 1

28

AF351824_1

gi:15146443 – sterolin-2

29

AF378304_1

gi:14165181 – zinc family member 5 protein

30

AF378524_1

gi:14583078 – nin283

31

AF459097_1

gi:23507038 – double-stranded rna-binding protein staufen2 long isoform

32

AF487905_1

gi:20162315 – mll/af4 fusion protein

33

AF521018_1

gi:21668044 – socius protein isoform 2

34

AF523265_1

gi:21930122 – unknown protein

35

AF523361_1

gi:21930120 – cd34 antigen

36

AJ252078_1

gi:7981271 – rpb10alpha

37

AJ428202_1

gi:21322704 – glutamate carrier

38

AK000017_1

gi:7019826 – cdna clone unnamed protein product.

39

AK000573_1

gi:7020760 – cdna clone unnamed protein product. 93

40

AK022977_1

gi:10434678 – cdna clone highly similar to mus musculus kinesin-like protein kif1b (kif1b) mrna

41

AK022987_1

gi:10434695 – cdna clone highly similar to mus musculus formin binding protein 30 mrna

42

AK024084_1

gi:10436373 – cdna clone weakly similar to complement c1r component precursor (ec 3.4.21.41)

43

AK024809_1

gi:10437205 – homo sapiens cdna: flj21156 fis, clone cas09878; unnamed protein product.

44

AK025510_1

gi:10438047 – homo sapiens cdna: flj21857 fis, clone hep02294; unnamed protein product.

45

AK027345_1

gi:14041958 – cdna clone highly similar to homo sapiens mitogen-activated protein kinase kinase kinase mekk2 mrna

46

AK027619_1

gi:14042420 – cdna clone moderately similar to putative serine/threonine-protein kinase p78 (ec 2.7.1.-)

47

AK092056_1

gi:21750559 – cdna clone moderately similar to mus musculus secretory carrier membrane protein 4 mrna

48

AL078621_3

gi:6013067 – ba395l14.5 (novel phosphoglucomutase like protein)

49

AL160132_1

gi:7228293 – hypothetical protein

50

BC002530_1

gi:12803412 – adp-ribosylation factor-like 2

51

BC006403_1

gi:13623576 – nck adaptor protein 1

52

BC007493_1

gi:13960103 – galactosidase, beta 1

53

BC009113_1

gi:14318629 – unknown (protein for mgc:18122)

54

BC009503_1

gi:14550505 – g1 to s phase transition 1

55

BC010451_1

gi:14714626 – cdc42 effector protein 4

56

BC011584_1

gi:15079508 – unknown (protein for mgc:20398)

57

BC012327_1

gi:15147379 – similar to v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma (avian) oncogene family, protein g

58

BC014879_1

gi:15928837 – rab, member of ras oncogene family-like 2b

59

BC015182_1

gi:15929505 – unknown (protein for mgc:10230) 94

60

BC015186_1

gi:15929513 – unknown (protein for mgc:14519)

61

BC016344_1

gi:16740982 – acid phosphatase, prostate

62

BC018734_1

gi:17511764 – similar to cgi-14 protein

63

BC020662_1

gi:18089075 – hypothetical protein flj20527

64

BC022513_1

gi:18490689 – coagulation factor viii, procoagulant component (hemophilia a)

65

BC024213_1

gi:18848169 – unknown (protein for image:3543906)

66

BC025422_1

gi:19343975 – cut-like 1, ccaat displacement protein (drosophila)

67

BC028351_1

gi:20306223 – similar to hypothetical protein dkfzp434l0850

68

BC028721_1

gi:20381108 – similar to solute carrier family 1 (high affinity aspartate/glutamate transporter), member 6

69

BC033731_1

gi:21707122 – dip13 beta

70

BC035609_1

gi:23272554 – myotubularin related protein 4

71

D38076_1

gi:534871 – ran-bp1(ran-binding protein 1)

72

D50406_1

gi:3810868 – st15

73

L01087_1

gi:558098 – protein kinase c-theta

74

L35848_1

gi:561638 – ige receptor beta subunit

75

M22199_1

gi:189978 – prkaca

76

NM_000152_1

gi:11496988 – gaa

77

NM_000946_1

gi:4506050 – primase, polypeptide 1 (49kd); prim1

78

NM_001559_1

gi:4504642 – interleukin 12 receptor, beta 2; il12rb2

79

NM_002076_1

gi:4504060 – glucosamine (n-acetyl)-6-sulfatase precursor

80

NM_002918_1

gi:19743876 – regulatory factor x1

81

NM_003436_1

gi:4507984 – zinc finger protein 135 (clone phz-17)

82

NM_005056_1

gi:4826967 – retinoblastoma-binding protein 2

95

83

NM_005937_1

gi:5174576 – myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, drosophila); translocated to, 6; mllt6

84

NM_006103_1

gi:18379363 – wap four-disulfide core domain 2, isoform 1 precursor; wfdc2

85

NM_006298_1

gi:5454177 – zinc finger protein 192

86

NM_006400_1

gi:13259506 – dynactin 2

87

NM_006484_1

gi:5922000 – dual-specificity tyrosine-(y)-phosphorylation regulated kinase 1b isoform c

88

NM_006796_1

gi:5802969 – afg3 atpase family gene 3-like 2

89

NM_006949_1

gi:5902127 – syntaxin binding protein 2

90

NM_007125_1

gi:19923384 – ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat gene, y chromosome; uty

91

NM_007159_1

gi:6005873 – sarcolemma associated protein

92

NM_007192_1

gi:19924176 – chromatin-specific transcription elongation factor large subunit

93

NM_013994_1

gi:7669484 – discoidin receptor tyrosine kinase isoform c

94

NM_016459_1

gi:7706002 – proapoptotic caspase adaptor protein

95

NM_018051_1

gi:21361686 – hypothetical protein flj10300

96

NM_018385_1

gi:14149719 – hypothetical protein flj11301

97

NM_080588_1

gi:18375659 – protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 7, isoform 2; ptpn7

98

NM_138323_1

gi:20336187 – paired basic amino acid cleaving system 4 preproprotein isoform e

99

NM_138925_1

gi:21040319 – son dna-binding protein, isoform a; son

100

U78551_1

gi:2130540 – mucin muc5b

101

XM_007868_1

gi:22070371 – similar to sodium/hydrogen exchanger 5 (na(+)/h(+) exchanger 5) (nhe-5)

102

XM_033379_1

gi:22050698 – similar to flj00156 protein

103

XM_043563_1

gi:15299156 – similar to insulin receptor-related protein 96

precursor (irr) (ir-related receptor) 104

XM_044546_1

gi:22041524 – similar to c25h3.8.p

105

XM_087346_1

gi:22042818 – similar to riken cdna 2610002k22

106

XM_166517_1

gi:20539607 – similar to homeobox protein hox-a7 (hox1a) (hox 1.1)

107

XM_170588_1

gi:22046031 – similar to ring finger protein 4

108

XM_172115_1

gi:22066951 – similar to mitogen-activated protein kinase 6 (extracellular signal-regulated kinase 3) (erk-3) (map kinase isoform p97) (p97-mapk)

109

XM_172494_1

gi:22049660 – similar to nuclear receptor coactivator 4

XX. táblázat: A PTC-re jellemző alulexpreszált gének

1 AF061190_1

gi:3779247 – ectodysplasin-a isoform eda-b

2 AF112210_1

gi:6563207 – heat shock protein hsp70-related protein

3 AJ009794_1

gi:3492779 – hug-1

4 AK022810_1

gi:10434424 – cdna clone unnamed protein product.

5 BC006380_1

gi:13623542 – unknown (protein for image:4099962)

6 BC007063_1

gi:13937906 – peroxiredoxin 1

7 L38707_1

gi:606756 – diacylglycerol kinase

8 M18112_1

gi:190166 – ppol

9 M22636_1

gi:337446 – small ribonucleoprotein 70 kd protein

10 M29548_1

gi:181966 – eef1a

11 NM_004380_1 gi:4758055 – creb binding protein 12 NM_012175_1 gi:15812185 – f-box only protein 3 isoform 1 13 NM_032033_1 gi:14042956 – fksg43 14

gi:22027652 – adaptor-related protein complex 1 beta 1 subunit NM_145730_1 isoform b 97

15

gi:22212926 – nuclear transcription factor, x-box binding 1 NM_147134_1 isoform 3; nfx1

16

gi:22070377 – similar to dhhc-domain-containing cysteine-rich XM_170813_1 protein XXI. táblázat: Az FA-ra jellemző túlexpreszált gének

gi:20555078 – similar to nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in b-cells inhibitor, epsilon; nfkbie

1

XM_166349_1

2

XM_170650_1 gi:22054585 – similar to riken cdna 4921522e24 XXII. táblázat:Az FTC-re jellemző túlexpreszált gének

1

AB083586_1 gi:20152235 – putative g-protein coupled receptor

2

AJ250014_1

3

BC008769_1 gi:14250617 – unknown (protein for mgc:2962)

4

BC015753_1 gi:16041745 – gro2 oncogene

5

D87465_1

gi:1665814 – kiaa0275

6

D89501_1

gi:1854451 – pbi

7

K03208_1

gi:190509 – prb2

gi:8250235 – cyld

XXIII. táblázat: Az PTC-re jellemző túlexpreszált gének

98

Köszönetnyilvánítás A dolgozatom létrejöttéhez nyújtott támogatásért köszönettel tartozom: 

 





Elsősorban témavezetőmnek, Dr. Ember István professzor úrnak, aki megteremtette a munkámhoz szükséges tudományos, szellemi és infrastruktúrális hátteret. Az együtt töltött évek során alapvetően ő inspirálta kutatói érdeklődésemet, támogatta munkámat és ösztönözte PhD hallgatói tevékenységemet. Dr. Kiss István jelenlegi témavezetőmnek, aki szakmai tapasztalatával segítette a dolgozatom összeállítását. Dr. Olasz Lajos professzor úrnak, akivel hosszú évek óta szoros és páratlan munkakapcsolatban dolgozunk a Fogászati és Szájsebészeti Klinika Maxillofaciális Sebészeti Részlegén előforduló daganatos esetek epidemiológiai és molekuláris analízisén. Dr. Gerlinger Imre professzor úrnak, dr. Szanyi István adjunktus úrnak, és dr. Orosz Évának, akik magas színvonalú szakmai munkájukkal a Fül-OrrGégészeti és Fej-Nyaksebészeti Klinika részéről tették lehetővé a precíz mintagyűjtést és pontos adatrögzítést. Az Orvosi Népegészségtani Intézet Molekuláris Genomikai munkacsoportjában egykor és jelenleg dolgozó tagoknak, akik szakmai támogatásukon kívül barátságukkal is megajándékoztak: dr Gőcze Katalinnak, dr. Szele Eszternek és dr. Juhász Krisztinának, akikkel a közösen végzett tudományos munka felejthetetlenné vált. A munkacsoport szakasszisztenseinek, Brunnerné Bayer Zsuzsának és Herczeg Mónikának akiktől a kísérletek technikai kivitelezését tekintve a legtöbbet tanultam az elmúlt évek során, és akik odaadó támogatásukkal folyamatosan mellettem álltak. Szántódiné Molnár Ágnesnek, aki egyik legfőbb ösztönzőm, minden publikációmhoz, előadásomhoz és szakmai anyagomhoz pótolhatatlan segítséget nyújt mind a mai napig.



A Nemzeti Kiválóság Programnak, amely az Apáczai Csere János doktorandusz ösztöndíjjal támogatta a szájüregi daganatokhoz kapcsolódó kísérleteim elvégzését.



Köszönöm szüleim, kisfiam és párom szerető és kitartó támogatását és a mindvégig belém vetett bizalmukat.

99

A dolgozat alapjául szolgáló közlemények 1. K Gombos, E Szele, I Kiss, T Varjas, L Puskás, L Kozma, F Juhász, E Kovács, I K Szanyi, I Ember Characterization of microarray gene expression profiles of early stage thyroid tumours. CANCER GENOMICS & PROTEOMICS 406) pp. 403-409. (2007) 1. Gomase V S

CURRENT DRUG METABOLISM 9 : 250-254 (2008)

2. Pacifico F

MOLECULAR AND CELLULAR ENDOCRINOLOGY 321 : 29-35 (2010)

3. Martín-Gómez L MARINE BIOTECHNOLOGY 13 : (2012) 4. Weber R

INTERNATIONAL JOURNAL OF ENDOCRINOLOGY 2015 : (2015)

2. Gy Gőbel, K Gombos, E Szele, E Kálmán, F Budán, I Gerlinger, F Fiscina, I Szanyi, Á Ember, Á Németh, I Ember Retrospective analysis of malignant salivary gland tumor sin Hungarian population between 1987-2006. EUROPEAN JOURNAL OF ONCOLOGY 1404) pp. 209-215. (2009) Impact factor: 0,325 1. * Gobel G Cancer Genomics and Proteomics 10 : 81-88 (2013)

3. Gőcze K, Gombos K, Juhász K, Ember I Környezeti karcinogének korai hatásainak mikro-RNS-alapú molekuláris epidemiológiai biomarkerekkel történő monitorizálása (új utak a primer prevencióban). MAGYAR EPIDEMIOLÓGIA 802) pp. 83-95. (2011) 1. * Szele E

MAGYAR EPIDEMIOLÓGIA 10 : 165-174 (2013)

2. * Juhász K

MAGYAR EPIDEMIOLÓGIA 9-10 : 29-40 (2012)

3.

Sinkovics J MAGYAR EPIDEMIOLÓGIA 9 : 35-65 (2012)

4. * Szirmai M MAGYAR EPIDEMIOLÓGIA 9 : 193-208 (2012)

4. Gőcze Katalin, Gombos Katalin, Pajkos Gábor, Magda Ingrid, Ember Ágoston, Juhász Krisztina, Patczai Balázs, Ember István Mikro-RNS-ek jelentősége a molekuláris epidemiológiában. ORVOSI HETILAP 152016) pp. 633-641. (2011) 1. * Wolher V MAGYAR EPIDEMIOLÓGIA 9 : 25-33 (2012) 2.

Sinkovics J MAGYAR EPIDEMIOLÓGIA 9 : 35-65 (2012)

3.

Lendvai G ORVOSI HETILAP 153 : 978-989 (2012)

100

5. Gobel G, Szanyi I, Revesz P, Bauer M, Gerlinger I, Nemeth A, Ember I, Gocze K, Gombos K Expression of NFkB1, GADD45A and JNK1 in Salivary Gland Carcinomas of Different Histotypes. CANCER GENOMICS & PROTEOMICS 1002) pp. 81-87. (2013) Impact factor: 1,862 1. Wang Yun TOXICOLOGY IN VITRO 29 : 1107-1115 (2015)

6. Gombos K, Horvath R, Szele E, Juhasz K, Gocze K, Somlai K, Pajkos G, Ember I, Olasz L miRNA Expression Profiles of Oral Squamous Cell Carcinomas. ANTICANCER RESEARCH 3304) pp. 1511-1517. (2013) Impact factor: 1,872 1.

Sarkar S

AMERICAN JOURNAL OF CANCER RESEARCH 3 : 465-477 (2013)

2.

Lu ZM

ONCOTARGETS AND THERAPY 7 : 525-533 (2014)

3.

Decsi G

LEGE ARTIS MEDICINAE 24 : 111-119 (2014)

4.

Nagpal N

FRONTIERS IN GENETICS 5 : (2014)

5.

Momen-Heravi F JOURNAL OF DENTAL RESEARCH 93 : 86-93 (2014)

6.

Zhou X

7.

* Orosz E

PLOS ONE 9 : (2014) ORVOSI HETILAP 155 : 1063-1070 (2014)

8.

Ogawa T

ORAL SURGERY ORAL MEDICINE ORAL PATHOLOGY AND ORAL RADIOLOGY 118 : 218-225 (2014)

9.

Sethi N

EUROPEAN JOURNAL OF CANCER 50 : 2619-2635 (2014)

10.

Cotrim AP

JOURNAL OF RHEUMATOLOGY 41 : 2102-2103 (2014)

11.

Mali SB

ORAL ONCOLOGY-EUROPEAN JOURNAL OF CANCER PART B 51 : E2-E3 (2015)

12.

Shen Lijun

TUMOR BIOLOGY 36 : 1993-2005 (2015)

13.

Wu Chuancheng DISEASE MARKERS & : 1-12 (2015)

14.

Xu Wenchao

MOLECULAR CARCINOGENESIS 54 : E148-E161 (2015)

15.

Wang Yin

INTERNATIONAL JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL PATHOLOGY 8 : 4555-4563 (2015)

16.

Wang Yin

INTERNATIONAL JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL PATHOLOGY 8 : 4773-4781 (2015)

17.

Zhang M

GENETICS AND MOLECULAR RESEARCH 14 : 16562-16576 (2015)

18.

Chen Dan

BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY 77 : 72-78 (2016)

19.

Tian X

MEDICINE 94 : (2015)

20.

Hou Y

MEDICINE 95 : (2016)

7. Orosz E, Gombos K, Revesz P, Kiss I, Pytel J, Gerlinger I, Szanyi I Mikro-RNS-expressziós mintázatok mesopharynx-hypopharynx laphámcarcinomákban. ORVOSI HETILAP 155027) pp. 1063-1070. (2014) 101

8. Rideg O, Gombos K, Miseta A, Kovács L G A humán papillómavírus nem válogat. IME: INFORMATIKA ÉS MENEDZSMENT AZ EGÉSZSÉGÜGYBEN 1308) pp. 58-62. (2014)

A dolgozat alapjául szolgáló könyvfejezet Gombos K, Ember I Molekuláris Közegészségtan. In: Ember István, Kiss István, Cseh Károly (szerk.) Dialóg Campus Tankönyvek – Natura Delectans sorozat, Budapest; Pécs: Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar, 2013. pp. 99-106. Összes közlemények száma: 45 Összesített impact factor: 31,906 Független idézetek száma: 130 Összes idézettség: 166

A dolgozat alapjául szolgáló közlemények alapján összesített impact factor:4,059 független idézettség: 28, összes idézettség: 34

102