Az allergiás asthma pathomechanizmusának genomikai vizsgálata

Az allergiás asthma pathomechanizmusának genomikai vizsgálata Doktori értekezés Tölgyesi Gergely Készült a Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézetében Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola

Programvezető: Prof. Dr. Falus András, egyetemi tanár, D.Sc Témavező:

Dr. Szalai Csaba, tudományos tanácsadó, D.Sc

Hivatalos bírálók:

Dr. Igaz Péter, egyetemi tanársegéd, Ph.D Dr. Arányi Tamás, tudományos főmunkatárs, Ph.D

Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Sasvári Mária, egyetemi tanár, D.Sc Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Matkó János, tudományos tanácsadó, D.Sc Dr. Kiss András, egyetemi adjunktus, Ph.D

Budapest 2008

TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS ............................................................................................................................................ 4 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS.................................................................................................................... 5 2.1. AZ ASTHMA EPIDEMIOLÓGIÁJA ......................................................................................................... 5 2.2. AZ ASTHMA GENOMIKAI HÁTTERE .................................................................................................... 9 2.2.1. Humán génasszociációs vizsgálatok eredményei ...................................................................... 9 2.2.2. Funkcionális genomikai eredmények.......................................................................................13 2.2.2.1. Génexpressziós microarray vizsgálatok alapján azonosított gének asthmában ................................. 13 2.2.2.2. A mikroRNS-ek szerepe az immunfolyamatok szabályozásában......................................................... 16

2.3. AZ ASTHMA PATHOMECHANIZMUSA ................................................................................................18 2.3.1. Légúti gyulladás és hiperreaktivitás .........................................................................................18 2.3.2 Gyulladásos sejtek ......................................................................................................................19 2.3.2.1. Hízósejtek ........................................................................................................................................... 19 2.3.2.2. Makrofágok ........................................................................................................................................ 20 2.3.2.3. Dendritikus sejtek............................................................................................................................... 21 2.3.2.3. Eozinofil granulociták ........................................................................................................................ 22 2.3.2.4. Neutrofil granulociták ........................................................................................................................ 23 2.3.2.5. T-limfociták ........................................................................................................................................ 23 2.3.2.6. B-limfociták........................................................................................................................................ 26 2.3.2.7. Bazofil granulociták ........................................................................................................................... 27 2.3.2.8. Vérlemezkék (trombociták)................................................................................................................. 27 2.3.2.9. A légutak strukturális sejtjei............................................................................................................... 27

2.3.3. Az asthma szabályozásában szerepet játszó fontosabb citokinek és kemokinek......................29 2.3.3.1. Citokinek ............................................................................................................................................ 29 2.3.3.2. Kemokinek.......................................................................................................................................... 32

2.3.4. Az oxidatív stressz szerepe az asthma pathogenezisében .........................................................33 3. CÉLKITŰZÉSEK ...................................................................................................................................37 4. FELHASZNÁLT ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ..............................................................................39 4.1. KÍSÉRLETI ÁLLATOK.........................................................................................................................39 4.2. AZ ALLERGIZÁLÁS ÉS A KÍSÉRLETI ELRENDEZÉS ISMERTETÉSE.....................................................39 4.3. TÜDŐELLENÁLLÁS (RL) MÉRÉSE .....................................................................................................41 4.4. BRONCHOALVEOLARIS LAVAGE (BAL) ...........................................................................................42 4.5. SZÖVETTAN .......................................................................................................................................42 4.6. RNS SZEPARÁLÁS, KONCENTRÁCIÓMÉRÉS ÉS MINŐSÉGELLENŐRZÉS............................................43 4.7. GÉNEXPRESSZIÓS MICROARRAY MÉRÉS ..........................................................................................43 4.8. A MICROARRAY ADATOK STATISZTIKAI ÉS BIOINFORMATIKAI ÉRTÉKELÉSE ................................44 4.9. GENE ONTOLOGY ELEMZÉS .............................................................................................................45 4.10. GÉNKÉSZLET FELDÚSULÁSI ELEMZÉS (GENE SET ENRICHMENT ANALYSIS, GSEA) ..................46 4.11. MIKRORNS EXPRESSZIÓS MICROARRAY MÉRÉS ...........................................................................48 4.12. A MIKRORNS MICROARRAY ADATOK BIOINFORMATIKAI ÉRTÉKELÉSE ......................................49 4.13. REVERZ TRANSZKRIPCIÓ ÉS MRNS EXPRESSZIÓ MÉRÉS TAQMAN VALÓS IDEJŰ PCR MÓDSZERREL ...........................................................................................................................................49 4.14. MIKRORNS EXPRESSZIÓ MÉRÉS TAQMAN VALÓS-IDEJŰ PCR MÓDSZERREL .............................50 4.15. IMMUNOHISZTOKÉMIAI ANALÍZIS ..................................................................................................51 4.16. A PARAOXONÁZ-1 ELLENES ANTITEST SPECIFICITÁSÁNAK MEGHATÁROZÁSA WESTERN BLOT MÓDSZERREL ...........................................................................................................................................51 4.17. A HUMÁN VIZSGÁLATOKBA BEVONT SZEMÉLYEK JELLEMZŐI ......................................................52 4.18. GENOMIÁLIS DNS SZEPARÁLÁS .....................................................................................................53 4.19. A PON1 GÉN -108C/T POLIMORFIZMUSÁNAK (RS705379) GENOTIPIZÁLÁSA 5’ NUKLEÁZ TAQMAN ALLÉLSPECIFIKUS PCR MÓDSZERREL ...................................................................................53

2

4.20. A PON1 GÉN Q192R POLIMORFIZMUSÁNAK (RS662) GENOTIPIZÁLÁSA EGY BÁZISOS PRIMER EXTENZIÓS MÓDSZER FELHASZNÁLÁSÁVAL BECKMAN SNPSTREAM GENOTYPING RENDSZEREN ......54 4.21. A TNFΑ -308A PROMÓTER POLIMORFIZMUS GENOTIPIZÁLÁSA PCR-RFLP MÓDSZERREL .......54 4.22. PARAOXONÁZ AKTIVITÁS MEGHATÁROZÁSA ................................................................................55 4.23. ARILÉSZTERÁZ AKTIVITÁS MEGHATÁROZÁSA ..............................................................................56 4.24. CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE SPECIFIKUS IGG ÉS IGA ANTITESTEK MEGHATÁROZÁSA ..........56 4.25. TELJES ÉS SPECIFIKUS SZÉRUM IGE SZINTEK MEGHATÁROZÁSA .................................................56 4.26. STATISZTIKAI MÓDSZEREK .............................................................................................................56 5. KUTATÁSI EREDMÉNYEK ................................................................................................................58 5.1. AZ ALLERGIÁS ASTHMA PATHOMECHANIZMUSÁBAN SZEREPET JÁTSZHATÓ PON1 GÉN AZONOSÍTÁSA GÉNEXPRESSZIÓS MICROARRAY TECHNOLÓGIA SEGÍTSÉGÉVEL OVALBUMIN-INDUKÁLT ALLERGIÁS ASTHMA EGÉR MODELLEN....................................................................................................58 5.1.1. Légúti gyulladás ........................................................................................................................58 5.1.2. Génexpressziós microarray elemzés .........................................................................................61 5.1.3. Kiválasztott gének expressziójának validálása független TaqMan valós-idejű PCR módszerrel ...........................................................................................................................................63 5.1.4. Gene Ontology elemzés .............................................................................................................64 5.1.5. Gene Set Enrichment elemzés (GSEA).....................................................................................64 5.1.6. mikroRNS expressziós microarray elemzés..............................................................................68 5.1.7. Kiválasztott mikroRNS-ek expressziójának validálása független TaqMan valós-idejű PCR módszerrel ...........................................................................................................................................68 5.1.8. A PON1 fehérje szintje erősen csökkent az allergiás gyulladásban szenvedő egerek tüdejében .............................................................................................................................................................70 5.1.9. A PON1 gén -108T/C ésQ192R polimorfizmusai nem mutattak összefüggést az asthmára való hajlammal....................................................................................................................................72 5.1.10. Fordított összefüggés figyelhető meg a szérum PON1 aktivitás és az asthma tüneteinek súlyossága között a vizsgált betegek esetében.....................................................................................73 5.2 A TNFΑ -308A PROMÓTER POLIMORFIZMUS ASTHMA KIALAKULÁSÁBAN BETÖLTÖTT SZEREPE CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE FERTŐZÖTT GYERMEKEKBEN ............................................................75 6. EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE.....................................................................................................78 6.1. AZ ALLERGIÁS ASTHMA PATHOMECHANIZMUSÁBAN SZEREPET JÁTSZHATÓ PON1 GÉN AZONOSÍTÁSA GÉNEXPRESSZIÓS MICROARRAY TECHNOLÓGIA SEGÍTSÉGÉVEL OVALBUMIN-INDUKÁLT ALLERGIÁS ASTHMA EGÉR MODELLEN....................................................................................................78 6.2. A TNFΑ -308A PROMÓTER POLIMORFIZMUS ASTHMA KIALAKULÁSÁBAN BETÖLTÖTT SZEREPE CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE FERTŐZÖTT GYERMEKEKBEN ............................................................84 7. KÖVETKEZTETÉSEK..........................................................................................................................86 8. ÖSSZEFOGLALÁS ................................................................................................................................88 9. SUMMERY..............................................................................................................................................89 10. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ..............................................................................................................90 11. IRODALOMJEGYZÉK .......................................................................................................................94 12. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK ...........................................119 12.1. KÜLFÖLDI, IMPAKT FAKTORRAL RENDELKEZŐ TUDOMÁNYOS FOLYÓIRATOKBAN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK .........................................................................................................................................119 13. EGYÉB KÖZLEMÉNYEK ................................................................................................................119 14. HAZAI TUDOMÁNYOS KONFERENCIÁK ..................................................................................120 15. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS.............................................................................................................121

3

1. Bevezetés Az allergiás asthma komplex, multikfaktoriális betegség. Kialakulását az immunrendszer irányítását végző megszámlálhatatlan gén összehangolt működésében bekövetkező zavar okozza, klinikai megjelenéséhez azonban a genetikai hajlamosító tényezők

mellett

a

környezeti

hatások

(allergén

jelenléte,

fizikai

terhelés,

levegőszennyezettség) elengedhetetlenül szükségesek. A betegség kialakulásának hátterében álló összetett genetikai mechanizmusok feltárása jelenleg intenzív kutatások tárgya. A humán genom megszekvenálásának, valamint a molekuláris genetika és az informatika napjainkban zajló ugrásszerű fejlődésének köszönhetően új tudomány jött létre, mely megteremtette a genom léptékű molekuláris genetikát, a genomikát. A genomika egyik nagy ágának, az úgynevezett struktúrális genomikának egyik legfontosabb feladata a betegséget okozó, illetve az arra hajlamosító génváltozatok (mutációk, polimorfizmusok) azonosítása, valamint azok együttes öröklődésének, haplotípusainak a vizsgálata, mely nagy segítséget nyújthat az asthma genetikai hátterének felderítésében, valamint új diagnosztikai és terápiás eljárások kifejlesztésében. A genomika másik nagy irányzata, a gének kifejeződését (expresszióját) vizsgáló funkcionális genomika lehetőséget nyújt a betegségek összetett pathomechanizmusainak hátterében zajló génszintű változások monitorozására. A nagyfelbontású, több tízezer gén együttes expresszióját vizsgálni képes génexpressziós microarray módszerek segítségével képesek lehetünk új, az asthma pathogenezisében eddig még nem vizsgált, esetlegesen kulcsfontosságú

szerepet

játszó

gének

azonosítására,

valamint

azok

kapcsolatrendszerének a feltárására. A jelen dolgozatban ismertetésre kerülő saját kísérleteinkben a genomika mindkét nagy irányzatát felhasználtuk az allergiás asthma tanulmányozása során. Vizsgálati eredményeink újabb adatokat szolgáltathatnak a betegség bonyolult pathomechanizmusának felderítéséhez és mélyebb megértéséhez.

4

2. Irodalmi áttekintés 2.1. Az asthma epidemiológiája Napjainkban feltűnően nő az allergiás betegek száma. Ebben valószínűleg a környezet, a levegő emelkedő szennyeződése, az élelmiszerekben lévő tartósítószerek, színezékanyagok, a fokozott gyógyszerfogyasztás és bizonyos fertőzések jelentik az alapvetően oki tényezőket. Különös jelentőségűnek látszik a gyermekkorban kezdődő allergiás tünetcsoport, de felnőttként is előfordul, hogy valaki, szinte minden előzetes tünet nélkül allergiás panaszokról számol be. A külső hatások mellett alapvető jelentőségűnek bizonyul a genetikai háttér, amelyet azon empirikus ismeret is alátámaszt, hogy egyes emberek családilag halmozottan fokozottabban hajlamosak egy- vagy sokféle allergiára, túlérzékenységre. Maga az allergia (a szó jelentése: eltérés az eredeti állapottól) kifejezés, melyet von Pirquet vezetett be 1906-ban, a gazdaszervezet megváltozott reakcióját jelenti egy adott ágenssel való második vagy többszöri találkozás során. A reakciót 1921-ben Prausnitz és Küstner írta le, a kutatók a kísérletet saját magukon végezték el. A halra allergiás Küstner szérumát Prausnitz bőrébe fecskendezték, majd halból készült extraktumot az így érzékenyített bőrbe oltották, amit rövid időn belül jellegzetes bőrreakció követett. Az „érzékenyítő” anyagot reaginnak nevezték el. Csak 1967-ben sikerült egymástól függetlenül Johansennek (Svédország) és az Ishizakas házaspárnak (Egyesült Államok) kimutatni, hogy ez az anyag egy immunglobulin (Immunglobulin E), amely egészséges egyénnél igen kis mennyiségben mutatható ki, allergia esetén többszörösére nő, bélféreg, protozoon fertőzésnél pedig extrém magas értéket is elérhet. 1968-ban Gell és Coombs négy típusba sorolta a hiperszenzitivitási reakciókat, az elsőbe azokat a túlérzékenységeket sorolva, melyeket IgE mediál. Ha allergiáról esik szó, feltétlenül fontos az atópia fogalmának említése. Az atópia kifejezést, melynek jelentése: nem megfelelő, az 1920-as években Coca és Cooke használta először az allergiás rhinitis-re és a bronchiális asthmára, hogy elkülönítse az allergiától, később azonban az atópia kifejezést gyakran az allergia kifejezéssel szinonimaként használták. 2001-ben az EAACI (European Academy of Allergology and Clinical Immunology) újradefiniálta az allergia és atópia kifejezéseket (1). Definíció szerint az atópia: egyéni, vagy családi hajlam IgE izotípusú antitestek termelésre

5

kisdózisú allergénekkel (általában fehérjékkel) szemben; és olyan betegségek kialakulására, mint az asthma, a rhinoconjunctivis, vagy az ekcéma/dermatitis. Az EAACI új nomenklatúrát javasolt a különféle allergiás betegségekre, így az asthmára is: az immunológiai mechanizmusok által mediált asthmát allergiás asthmának, míg a régebben intrinsic asthmának nevezett betegséget nem allergiás asthmának definiálta. Egy általánosan elfogadott meghatározás szerint: „Az asthma a légutak krónikus gyulladásos betegsége. A gyulladás következtében visszatérően lépnek fel sípoló légzéssel, dyspnoeval, mellkasi feszüléssel, köhögéssel járó epizódok, főként éjszaka és kora reggel. A tünetek kiterjedt, változó mértékű légúti áramlási nehezítettséggel kapcsolatosak, ami spontán, vagy gyógyszeres kezelés hatására rendszerint reverzibilis. A kórképet különböző stimulusokkal szemben fennálló fokozott bronchiális reaktivitás jellemzi” (2) . Az asthma egyik fő jellemzője tehát a spontán, vagy gyógyszer (β2mimetikum) hatására reverzibilis obstruktív ventilációs zavar. A diagnózis felállítása az anamnézis, a fizikális és légzésfunkciós vizsgálat, az obstrukció reverzibilitásának vizsgálata (pharmacodynamiás próba) és más diagnózisok lehetőség szerinti kizárása útján történik. Kérdéses esetekben a légúti hiperreaktivitás (LHR) kimutatása megerősíti a kórismét. Ma már egyértelműen bizonyított, hogy az asthma hátterében a légutak gyulladásos elváltozása, károsodása áll. A legtöbb szakértő az asthmát egyre inkább egy szindrómának tekinti. Számos különböző légútkárosító folyamat (pl.: respiratory syncytial vírus – RSV – fertőzés) és

inhalatív ágens (allergének, izocianát, dízel-

üzemanyag égéstermék, stb.) a tüdőben hasonló, vagy részben hasonló patológiás elváltozások kialakulásához és ezzel párhuzamosan nehézlégzéshez, diffúz légúti obstrukcióhoz vezethet (3), ami nehezíti a pontos diagnózis felállítását. Az asthma és az egyéb allergiás betegségek előfordulási gyakorisága az elmúlt években drasztikusan megemelkedett, különösen a fejlett országokban (4, 5). Az asthmaés allergia-kutatás legbonyolultabb kérdése, hogy mi állhat a betegség rendkívüli gyakoriság-növekedésének a hátterében, továbbá mi az oka annak, hogy főként a fejlett, úgynevezett „nyugati típusú” társadalmak érintettek? Számos, különböző populációkon elvégzett genetikai vizsgálat egyértelműen bizonyította az asthma örökölhető voltát. Ha egyik szülő sem allergiás, akkor az allergiás betegség előfordulási gyakorisága gyermekeikben csak 11-13%, míg ha mindkét szülő érintett, akkor ez 50- 70%-ra nő (6).

6

Egypetéjű ikrekben az asthma konkordanciája 26-75% között van (6-8), tehát a betegség együttes előfordulásának valószínűsége meglehetősen tág tartományban mozog. Ez felveti, hogy a genetikai meghatározottságon túl nagy jelentősége lehet a környezeti hatásoknak is. Humán genetikai asszociációs vizsgálatokban eddig több mint 120 gént hoztak összefüggésbe az allergiás hajlammal, valamint az asthma iránti fogékonysággal (9). Mindebből következik, hogy az asthma multifaktoriális betegség, melynek kialakulásában a részben még ismeretlen

számú gén és a környezeti hatások

kölcsönhatása játszik döntően fontos szerepet. Számos környezeti és életvezetéssel kapcsolatos tényező szerepét vizsgálták az allergiás betegségekkel és az asthmával kapcsolatban:

bizonyos

allergének

(pl.:

házipor-atka,

parlagfű)

(10,

11),

környezetszennyező anyagok (pl.: dízel-üzemanyag égéstermékek) fokozott expozícióját (12); táplálkozási szokások megváltozását (pl.: kevés probiotikum fogyasztását) (13); túlzott antibiotikum-használatot (14) mind összefüggésbe hozták a kórkép megnövekedett gyakoriságával. Az elmúlt másfél évtized asthma-kutatását uraló egyik elmélet – a higiéné-hipotézis – szerint az allergiás betegségek gyakoribbá válásáért részben a korai életévekben elszenvedett fertőzések számának és gyakoriságának, valamint bizonyos mikroorganizmusok által termelt anyagok (pl.: lipopoliszacharid – LPS) expozíciójának a csökkenése lehet felelős (15). Először egy 1989-ben készült tanulmányban számoltak be arról, hogy az idősebb testvérek száma és a szénanátha kialakulási valószínűsége között fordított arányosság figyelhető meg (16). Ennek hátterében valószínűleg az újszülött- vagy kisgyermekkorban a testvérektől elkapott fertőzések védő szerepe állhat. Számos további vizsgálatban erősítették meg, hogy a korai baktérium és vírusfertőzéseken való átesés (17), valamint a krónikus féregfertőzés (18) véd az asthmás fenotípus kialakulásától, feltehetően az immunrendszer fejlődésének előnyös befolyásolása révén. Kimutatták, hogy a fejlődő országok elmaradott régióinak lakosai, valamint az alacsony jövedelmű családokban, illetve farmgazdaságokban élők (a fejlett országokban is) egyformán nagy baktériumexpozíciónak vannak kitéve, és ez a környezet csökkenti az allergiás megbetegedések kockázatát. A fertőzések védő hatása csak gyermekkorban igazolt. Ugyanakkor a természet-közeli életmód, az állatok közvetlen közelsége (farmokon) nagy mennyiségű nem kórokozó, talajban élő baktérium kontaktusával jár együtt. A természetes

7

immunrendszer a betegséget nem okozó mikrobák egyes molekuláris elemeit (LPS, peptidoglikánok, nem-metilált citozin-guanozin motívumok stb.), valamint a gombákból származó (pl.: β-glukánok) egyéb bioaktív vegyületeket szintén felismeri, ami egyes esetekben az adaptív immunválaszt regulációs T-sejt (Treg) proliferáció és tolerancia irányába tolhatja el (19, 20). Mindezek alapján feltételezik, hogy a védőoltások és antibiotikum terápia következtében ritkábbá váló (vagy kevésbé súlyos lefolyású) infekciók, a kis mértékű bélféreg átfertőzöttség, valamint a csökkent környezeti mikrobaexpozíció (alacsony csíraszám) az immunrendszer szabályozási zavarát okozza (21), ami az allergiás betegségek előretörését eredményezheti. Mind gyermekkori, mind felnőttkori asthmában szerepet játszhatnak légúti vírus (Rhinovirus, RSV) (22) és baktériumfertőzések (Chlamydia, Mycoplasma) (23, 24) az asthma exacerbatiók kialakulásában. A Chlamydophila pneumoniae fertőzés és az asthma közötti kapcsolat biológiailag kézenfekvő, hiszen az asthmára a légutak krónikus gyulladása jellemző, a Chlamydia fajok pedig a fertőzött szervek krónikus gyulladását okozhatják. A környezeti tényezők közül a legszorosabb kapcsolatot az asthma kialakulásával (25, 26) és exacerbatiójával (27) összefüggésben az aktív vagy passzív dohányzás esetében találtak. Mivel a dohányfüst jelentős mennyiségben tartalmaz LPS-t (28), elképzelhető hogy más összetevői mellett részben ez is szerepet játszhat hatásában. Egy másik vizsgálat kimutatta, hogy asthmával vagy más allergiás betegségekkel szemben örökletesen fogékony (0-1 éves) gyermekek esetében az otthoni (házipor) LPS expozíció független rizikófaktora bármilyen (esetenként ismétlődő) nehézlégzésnek (29).

Már kialakult

asthmában a betegség súlyossági foka egyenesen arányos a házipor LPS-tartalmával (30). Egy nemrég megjelent közlemény arról számol be, hogy a Th1 polarizációt serkentő Influenza vírussal való fertőzés nemhogy enyhítette, hanem ellenkezőleg, egyenesen súlyosbította a légúti gyulladást kísérletesen előidézett egér asthma modellen (31). Az ehhez hasonló eredmények alapján egyre inkább úgy tűnik tehát, hogy a higiénéhipotézis, bár számos érv szól mellette, kiegészítésre szorul, és egyre inkább egy új definíció, az úgynevezett módosított higiéné-hipotézis van kialakulóban, mely szerint bizonyos fertőzések, mint például a Hepatitis A gyakoriságának visszaesése csökkentik, míg más fertőzések, mint az RSV és az Influenza vírus, pedig növelik az asthma kialakulásának a kockázatát.

8

2.2. Az asthma genomikai háttere 2.2.1. Humán génasszociációs vizsgálatok eredményei Mint azt már ez előző fejezetben említettük, az asthma egy komplex, multikfaktoriális betegség. Genomikai alapú kutatásait rendkívül megnehezítik az egyes emberek között lévő genetikai különbségek, valamint a különböző területeken élő emberekre ható eltérő környezeti tényezők. Előfordulhat, hogy ugyanaz a polimorfizmus az élet különböző időszakában érvényre jutva (eltérő környezeti tényezők miatt) más-más allergiás betegség kialakításában vesz részt. Ugyanakkor az egészséges szervezet nagydózisú allergénnel való találkozása öröklődő, kóros hajlam nélkül is válaszolhat nagymennyiségű IgE termeléssel bizonyos körülmények között, és létrejöhet az allergiás kórkép (fenokópia jelensége). Erre példaként lehet felhozni a szakmai ártalmak következtében fellépő allergiát (32). Mostanáig több mint 600 génasszociációs tanulmányt közöltek és több mint 120 gént hoztak kapcsolatba az asthmához és atópiához köthető fenotípussal, ezek közül többet ismételt kísérletekben is megerősítettek. Az elmúlt néhány évben pozicionális klónozással sikerült azonosítani a következő asthmához köthető géneket: ADAM33 (33), DPP10 (34), GPRA (35), HLA-G (36), CYFIP2 (37), SFRS8 (38), ORMDL3 (39). Egyes gének genetikai variánsai több populációban és tanulmányban is nagyon következetes módon

asszociációt mutattak az asthma fenotípussal.

Különösen fontos az az

alábbiakban felsorolt mintegy 10 gén, melynek genetikai variánsai 10, vagy annál több tanulmányban is asszociációt mutattak a betegséggel: IL4, IL13, ADRB2, HLA- DQB1, TNFα, LTA, MS4A2, IL4R, CD14 és ADAM33. Érdemes megemlíteni, hogy a pozicionális klónozással elsőként felfedezett ADAM33 (33) gént eddig több mint 10 független vizsgálatban is összefüggésbe hozták az asthmával. Ezek a lókuszok, illetve a bennük előforduló gének valószínűleg valósan reprezentálják azokat a lókuszokat, melyek a betegség kialakításában fontos szerepet játszanak. Néhány jelölt, asthmához köthető gén kromoszómális elhelyezkedéséről, vélhető funkciójáról, valamint a kapcsolódó fenotípusokról az 1. táblázat nyújt tájékoztatást (mérete miatt a táblázatot több részletben ábrázoltam).

9

Kromoszómális lokalizáció

2q14

2q33

5q31-q33

Vizsgált populáció

Kandidáns gén

funkció

Fenotípus

Német, olasz

IL-1 géncsalád

Gyulladásos válasz befolyásolása

Asthma, atópia

Ausztál, Egyesült királyág

DPP10

Kemokin és citokin reguláló hatás

Asthma, magas IgE

Brit, holland, norvég

CTLA-4

T-sejt aktiváció és fejlődés szabályozása

Asthma, magas IgE

IL-4, IL13, GMCSF

IgE izotípus váltás, Th2 válasz indukció

Asthma, magas IgE, LHR

IL-5

Eosinophil aktiváció, érés

Asthma

IL-9

T, B és hízósejt funkciók szabályozása

Asthma

SPINK5

Lehetséges szerep epitél sejt fejlődében

Atópia, asthma

CD14

Bakteriális LPS kötő receptor

Magas IgE, atópia

TIM1, TIM3

Th1, Th2 fejlődés

Asthma

ADRB2

b2-agonisták gátlása

Asthma

Amish, német, USA fehér, USA latinamerikai, kínai, koreai

10

Kromoszómális lokalizáció

5q31-q33

Vizsgált populáció

Kandidáns gén

funkció

Fenotípus

Amish, német, USA fehér, USA latinamerikai, kínai, koreai Német, hutterita

Leukotriene C4 synthase

Leukotrién szintézis enzime

Aspirin intoleráns asthma, asthma

CYFIP2

Adhézió fokozása CD4+ sejtekben

Asthma

ZFR, NPR3, ADAMTS12 PRLR, IL7R, LIFR, PTGER4 HLA-D HLA-G TNFα

Diverz funkciók

Asthma, BHR

Antigén prezentáció Immunreguláció Proinflammatórikus citokin

Specifikus IgE Asthma, BHR Asthma

Sejtadhéziós molekulák és citokinek termelődésének serkentése Antigén prezentáció Proinflammatórikus citokin

Asthma

Sejtadhéziós molekulák és citokinek termelődésének serkentése Ismeretlen funkció

Asthma

5p13

6p21.3

USA fehér, holland, kínai, japán

HLA-D TNFα

6p21.3

USA fehér, holland, kínai, japán

Finn, Kanadai, ausztrál

GPRA

Ausztál fehér és őslakos, kínai

FcεRI-β

Nagy affinitású IgE receptor

Atópia, asthma

CC16

Légúti gyulladás szabályozása

Asthma

Japán

CHRM1

Légúti konstrukció, gyulladás és epitél sejt proliferáció

Asthma

7p

11q13

LTA

LTA

11

Specifikus IgE Asthma

Asthma, atópia

Kromoszómális lokalizáció

Vizsgált populáció

11p Kaukázusi, japán, indiai, tajvani 12q14.3-q24.31

Kandidáns gén

funkció

Fenotípus

ETS-2, ETS3 INF- γ

Transzkripciós faktor IL-4 activitás gátlása IL-4 termelés, hízósejtérés

Asthma

SCF STAT6

Citokin regulált transzkripciós faktor NO: értágító hatás, immunreguláció

NOS1 12q24.21– q24.33 13q

14q22.1-24

16p21

17q11.2-q21

20p13

Asthma, magas IgE, atópia

Asthma

Dán

SFRS8

CD45 splicing szabályozása

Asthma

Ausztrál, brit

PHF11, (SETDB2, RCBTB1

Transzkripcionális szabályozás

Magas IgE

USA fehér és afroamerikai

DP2R

T sejt kemotaxis

Asthma

Mexikói

Arginase 2

Asthma

Kínai, német, spanyol

IL-4R

NO produkció gátlása IL-4 és IL-13 receptor alphaalegysége

Magyar, koreai

RANTES, MCP-1, eotaxin ORMDL3 ADAM33

Leukocyta attrakció és stimuláció

Asthma

Ismeretlen funkció Lehetséges szerep a hörgő összehúzódás és légúti simaizomzat hipertrófia és hiperpláziaban

Asthma Asthma, LHR

Brit, német USA fehér, angol, német, japán

Atópia, asthma

1. táblázat. Jelölt asthmához köthető gének kromoszómális elhelyezkedése, vélhető funkciója és a hozzájuk köthető fenotípusok.

12

2.2.2. Funkcionális genomikai eredmények 2.2.2.1. Génexpressziós microarray vizsgálatok alapján azonosított gének asthmában Jelenleg a microarray technológia számít a funkcionális genomika legerősebb és legnagyobb felbontással rendelkező vizsgálati eszközének. Alkalmazásával lehetőség nyílik

adott

betegséghez

társuló

génexpressziós

mintázatok

azonosítására,

betegségaltípusok finomabb elkülönítésére, új gyógyszercélpontok keresésére, és a gyógyszertervezés során az adott gyógyszerjelölt molekula hatásának vizsgálatára. A microarray adatok értékelésére és a kapott rengeteg adat

biológiailag helytálló

interpretációjára szakosodott bioinformatikai módszerek tárháza egyre bővül. Különböző online adatbázisok lehetőséget nyújtanak ahhoz, hogy más kutatók által elvégzett microarray adatokat összevethessük saját mérési eredményeinkkel, valamint azokat beleillesszük a sejtekben, szövetekben lejátszódó összetett biológiai folyamatok bonyolult hálózataiba. A microarray vizsgálatokat feltétlenül szükséges lehetőleg több szinten in-silico, valamint laboratóriumi módszerekkel is validálni. Az in-silico történő validálás során az eredményeinket irodalmi és publikus adatbázisokban szereplő adatokkal vetjük össze. A laboratóriumi validálás során kiválasztott gének esetében visszaellenőrizzük, hogy a microarray mérés során kapott expressziós változások más módszerekkel mérve azokkal pontosan korrelálnak-e. Ez általában magában foglal különböző mRNS (pl. valós idejű PCR mérés, Northern blot) és fehérjeszintű (ELISA, Western blot, immunohisztokémia) expressziót vizsgáló eljárásokat. Az elmúlt években számos, az asthma pathomechanizmusának mélyebb megértését célzó microarray vizsgálat történt meg, humán, egér és majom fajok különböző szöveti eredetű mintáinak felhasználásával. Érdekes, hogy olyan tanulmány, melyben asthmás betegek tüdő vagy bronchus szöveti expresszióját hasonlították volna össze egészséges donorokéval, eddig még nem született. A humán eredmények döntően in-vitro, míg az in-vivo eredmények elsősorban egereken elvégzett kísérletekből származnak. A fejezet további részében e kísérletek közül ismertetek néhányat röviden a teljesség igénye nélkül. A humán kísérletek során IL-4-gyel valamint IL-13-mal stimulált bronchialis epitél sejtek (40, 41), simaizom sejtek (40), tüdő fibroblasztok (40), valamint aktivált

13

hízósejtek génexpressziós mintázatainak tanulmányozására került sor. Az IL-4 és IL-13 kezelések hatására számos gén expressziója fokozódott az epitél és simaizom sejtek, valamint a fibroblastok esetében, viszont csak kevés gén tekintetében volt átfedés a három különböző sejttípus között (42). Más szerzők a légúti epitél sejtek IL-4 és IL-13 kezelése során indukálódott gének közül 12 kiválasztott és validált gén expressziós profilját vetették össze asthmások bronchiális biopsziáiból származó minták expressziós profiljaival (41). A 12 génből négy - SERPINB3-4, KAL-1, és MAP17 szintén növekedett expressziót mutatott az asthmás mintákban, és ezeket fehérje szinten is sikerült kimutatni. Kiderült továbbá az is, hogy a SERPINB4 gén által kódolt SSCA2 protein sikeresen képes gátolni a házipor atka fő allergénjének számító Derp1 cisztein-proteáz aktivitását (43). Szintén microarray módszerrel találtak rá humán tüdő fibroblasztok vizsgálata során a POSTN génre, amely a periostin fehérjét kódolja, ami számos extracelluláris mátrix alkotó fehérjét (fibronektin, tenascin-C, kollagenV) képes kötni. A gén expressziója jelentős mértékben indukálódott IL-4 és IL-13 kezelés hatására TGF-β független módon (44). A periostin fehérje más, szubepitheliális fibrózisban szerepet játszó extracelluláris mátrix fehérjékkel együtt fordult elő allergén indukált asthmás

vad típusú egerek

valamint humán asthmás betegek esetében is, azonban IL-4 vagy IL-13 génkiütött ovalbumin-inhalált

egerek tüdejében ez nem volt megfigyelhető. A fehérje szerepe

kulcsfontosságú lehet az asthmára jellemző subepitheliális fibrózis kialakításában. Számos microarray vizsgálat foglalkozott a humán hízósejtekben aktiváció hatására végbemenő génexpressziós változásokkal is. Ilyen módon sikerült azonosítani a PAI-1 (45) fehérjét, mely erőteljesen indukálódott aktiváció hatására. A PAI-1 gátolja a plazminogén aktivátor működését, így az kevésbe hatékonyan képes plazminogénből plazmint előállítani, mely az extracelluláris mátrix degradációjának fokozódását eredményezi. Mindezek alapján feltételezhető, hogy a hízósejtek a PAI-1 termelésén keresztül részt vehetnek az asthmában bekövetkező légúti „remodeling” folyamatában. Egy másik fehérje - az amphiregulin - a hízósejtek FcεRI-en keresztül történő aktivációját követő emelkedett expresszióját két kutatócsoport egymástól függetlenül is kimutatta (46, 47). Az amphiregulin serkentőleg hatott a tüdő fibroblastok proliferációjára, és hatására jelentősen emelkedett a mucin fehérjét kódoló MUC5AC gén expressziója humán légúti epitél sejtvonalon.

14

Az

egereken

elvégzett

microarray

vizsgálatok

általában

tüdőszöveti

génexpressziós változások nyomon követését célozták meg. Egy jelentős kísérletben a szerzők ovalbuminnal vagy Aspergillus fumigatus-al indukált asthmás (48) egerek tüdő génexpressziós profiljait hasonlították össze. A két különböző allergénnel kiváltott légúti gyulladás

fenotípusosan megegyezik, viszont az indukálódott géneknek mindössze

körülbelül a fele mutatott csak átfedést. Az átfedő gének között három, az arginin felvételében és metabolizmusában szerepet játszó ARG1, ARG2 és CAT gének emelkedett expresszióját figyelték meg, melyek közül az ARG1 növekedett szintjét humán asthmások bronchialis biopsziás mintáin is sikerült megerősíteni. Az arginint a NO-szintáz enzim NO-vá alakítja, így az említett három molekula indukciója befolyással lehet a NO szintézisre, mely bronchoprotektív hatású anyag. Egy nemrég elvégzett génasszociációs vizsgálat az ARG1 gént az akut bronchodilatátor válasz új jelölt génjeként nevezte meg (49). Egy másik kutatócsoport egy egyedülálló kísérletsorozatban megpróbált választ keresni arra, hogy vajon mi állhat a hátterében annak a jelenségnek, hogy az A/J egértörzs az allergén indukált LHR-re erősen hajlamos, a C3H/HeJ törzs viszont erősen rezisztens (50). Vizsgálataik során tüdőszöveti génexpressziós vizsgálatok, SNP- alapú genotipizálás, valamint úgynevezett QTL (quantitative trait locus) analízis kombinált alkalmazásával azonosították a C5 (complement factor 5) gént. Kiderült, hogy az LHR-re erősen hajlamos A/J egerekben a C5 génjének 5’-exonjában egy 2 bázispár méretű deléció van, amelynek következtében

defektust szenved a C5 fehérje kifejeződése.

Humán monocitákon elvégzett vizsgálatok során a szerzők bizonyították, hogy a C5 fehérje képes a monociták IL-12 termelését

fokozni,

mely

a Th2

irányú

immunpolarizációs folyamatok hatékony gátló citokinje. A defektes expressziójú C5 fehérje miatt ez a visszacsatolási mechanizmus nem működik rendesen, és ennek fontos szerepe lehet az asthmára jellemző Th2-es immunfolyamatok túlműködésében. A majom kísérletekben a szerzők IL-4-gyel vagy pedig Ascaris suum antigénnel kiváltott asthmát jellemző génexpressziós változásokat vizsgáltak (51). Számos kemokin és citokin génjének megnövekedett expresszióját figyelték meg (pl. MCP-1, MCP-3, eotaxin), mely eredmények jól korreláltak mások megfigyeléseivel.

15

2.2.2.2. A mikroRNS-ek szerepe az immunfolyamatok szabályozásában Az utóbbi évtized felismerése, hogy a nem transzlálódó kis RNS-molekulák, az úgynevezett mikroRNS-ek (miRNS), fontos szabályozó szerepet töltenek be — befolyásolva a transzláció folyamatát és a messenger RNS turnovert — a sejt fehérjekészletének

poszttranszkripciós

szintű

szabályozásában.

Szerkezeti

jellegzetességük, hogy kb. 21-26 nukleotidból állnak, és prekurzor alakjaik a mRNSektől eltérően kettős szálat alkotnak. Az érett miRNS-ek keletkezésében egyrészt egyes ribonukleázoknak (DICER), effektor működésükben a RISC-nek (RNA induced silencing complex) van szerepe. Az érett miRNS-ek jellemzően a megfelelő mRNS-ek 3’-végi, nem transzlálódó részéhez (3’-UTR) kapcsolódnak. Ezt követően, a szabályozás döntően a transzláció gátlása révén valósul meg, de a mRNS-t lebontó endonukleázok aktiválásával (RNS-degradáció) is történhet. A cél mRNS 3’-UTR végéhez kötődéshez nem szükséges az RNS heteroduplex közötti teljes komplementaritás. A jelen adatok alapján, a célszekvenciához kapcsolódás következménye növényekben inkább RNSdegradáció vagy a kromatin metilációs mintázatának módosításával a transzkripciós csendesítés, míg állatokban inkább a transzláció gátlása (52). Emberben eddig több mint 540 mikroRNS gént írtak le, de bioinformatikai becslések szerint számuk meghaladhatja az 1000-et is (53, 54). Valószínűnek tarják, hogy a humán gének mintegy 30%-a miRNS-ek szabályozása alatt áll. A komplexitást növeli, hogy a miRNS-el szabályozott mRNS-ek többsége nem is egyetlen miRNS szabályozása alatt áll, és ebből kitűnik, hogy a feladatuk valószínűleg a génexpresszió finomhangolása (55). A miRNS-ek többségének célpontja azonban egyelőre kísérletesen nem bizonyított. Az a tény, hogy a miRNS-ek mRNS-specificitása a puszta szekvencia ismeretében elfogadható hibával becsülhető, lehetővé teszi a bioinformatika bevonását a cél mRNS-ek predikciójába. Érdekes, hogy a növényektől a gerincteleneken át az emlősökig, az ismert miRNS-mediált szabályozó folyamatok általában olyan alapvető funkciók érzékeny beállításában vesznek részt, mint az osztódás, a sejthalál vagy a differenciálódás (55). Ezt tükrözi az informatikai módszerekkel prediktált gének funkcióinak eloszlása is (útvonalanalízis) (56).

16

Egyre több, rendkívül friss tanulmány számol be arról, hogy a mikroRNS-ek az immunrendszer bonyolult működésében rendkívül fontos szabályozó szerepet töltenek be. Egy nemrég megjelent tanulmányban leírták, hogy a miR155 mikroRNS-re deficiens egerek T és B sejt, valamint dendritikus sejt működése zavart, valamint növekedett légúti remodeling jellemző rájuk (57). Egy másik kísérletben szintén a miR155-el kapcsolatban megfigyelték, hogy az expressziója jelentősen megnövekedett kísérleti egerekben LPS hatására, továbbá kimutatták, hogy a miR155 fő célpontjai valószínűsíthetően az LPS jelátvitelben szerepet játszó fehérjéket kódoló transzkriptumok (58). Ezzel szemben az LPS kezelés egy másik mikroRNS, a miR125b expresszióját csökkentette. Sikeresen kimutatták továbbá, hogy az említett miR125b a TNF transzkriptumának 3’-UTR régióját célozza meg, így LPS hatására bekövetkezett csökkenése fontos szerepet játszhat a stimulus következményeként kialakuló emelkedett TNF termelésben. A miR155-t túlexpresszáló transzgenikus egerek LPS stimulációra magasabb szintű TNF termeléssel válaszolnak és fokozottan érzékenyek az LPS/d-galaktózamin-indukált szeptikus sokkra. Egy másik kutatócsoport mintegy 200 mikroRNS expressziós profilját vizsgálta humán monocitákban (59). Ezek közül a miR-146a/b, miR-132, és a miR-155 mutatkozott endotoxin reszponzívnak. A miR146a gén promóter elemzése során kiderült, hogy az NFκB transzkripciós faktor szabályozása alatt áll. Ráadásul predikciós eredmények alapján kimutatták, hogy a miR146a/b bázispárosodás kialakítására képes a citokin és Toll-like receptorok jelátvitelében szereplő két kulcsfontosságú adaptor protein, a TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6) és az IRAK (IL-1 receptor-associated kinase 1) transzkriptumának 3’-UTR régiójával. Ennek a biológiailag helytálló voltát sikerült invitro módszerekkel is igazolni: a miR146 sikeresen csökkentette a célgének expresszióját, bizonyítva ezzel a gyulladásos immunválasz során betöltött jelentős szerepét. A fejezet által nyújtott rövid áttekintés rámutat a génexpresszióval foglalkozó vizsgálatok hasznos és egyre bővülő szerepére és alkalmazhatóságára a biológiai kutatások során. A génexpressziós biológia mélyebb megértése kulcsfontosságú szereppel bír a jövőben esetleges új terápiás és diagnosztikai eljárások kifejlesztésében.

17

2.3. Az asthma pathomechanizmusa 2.3.1. Légúti gyulladás és hiperreaktivitás Az asthma bronchiale legfontosabb jellegzetessége a légúti gyulladás, melyre jellemző a légúti epitél részleges lehámlása, a bronchusfal ödémás duzzanata, a fokozott mucus-elválasztás és perivaszkuláris valamint peribronchiális – elsősorban limfociták és eozinofil granulociták alkotta – gyulladásos infiltráció (60). A BAL folyadékban (BALF) emelkedett számban találhatók hízósejtek, eozinofil (és neutrofil) granulociták valamint limfociták. Allergiás („extrinsic”) asthmában a folyamat hátterében egy vagy több antigén (allergén) hatására kialakuló, specifikus immunglobulin E (IgE) termelődéséhez kötött,

túlzott

mértékű

immunaktiváció

áll,

amely

exogén

(pl.:

folyamatos

allergénexpozíció) és endogén stimulusok következtében krónikus légúti gyulladás formájában nyilvánul meg. A betegek egy kisebb csoportját képező úgynevezett nem allergiás („intrinsic”) asthmások betegsége rendszerint idősebb korban jelentkezik és többnyire súlyosabb lefolyású, de a tüneteik lényegében azonosak (61). Ezen betegek esetében nem bizonyítható a szisztémás IgE túltermelés, illetve a bőrteszt pozitivitás, ugyanakkor viszont az allergiás formához hasonló elváltozások hátterében baktérium vagy vírusfertőzések hatására fellépő fokozott lokális IgE képződés állhat (62). A bronchusok krónikus eozinofilsejtes gyulladása önmagában felelős lehet az asthma tüneteként jelentkező köhögés, mellkasi szorító érzés kialakulásáért, továbbá szerepet játszik a hörgőrendszer simaizomzatának specifikus (allergén) és különböző aspecifikus provokáló anyagok (pl.: methacholin, hisztamin, hiperozmotikus oldatok, desztillált víz) hatására fellépő LHR kiváltásában is, mely az asthma definíció szerinti tünete. Ugyanakkor kimutatták, hogy asthmásokban a légúti gyulladás és az LHR között nincs szoros korreláció (63).

18

2.3.2 Gyulladásos sejtek 2.3.2.1. Hízósejtek Az elmúlt évtizedek során a hízósejteket elsődlegesen effektor funkciójú sejteknek hitték, azonban egyre több olyan eredmény lát manapság napvilágot, mely egyértelműen bizonyítja, hogy ezen sejtek aktív résztvevői az immunválasz szabályozásának (64, 65). A hízósejtek képesek MHC I és MHC II molekulákon keresztül antigéneket prezentálni antigén-specifikus T sejtek számára (66, 67). Sejtfelszínükön kifejeződik a Toll-like receptor-2 és Toll-like receptor-4 (TLR2, TLR4), amely valószínűsíti a veleszületett immunitásban való részvételüket is. Asthmában kulcsfontosságú szerepet játszanak, mind atópiás, mind nem-atópiás és foglalkozási asthmában a hízósejtek krónikus aktivációja és fokozott szekréciós tevékenysége, degranulációja figyelhető meg. Számos gyulladáskeltő (IL-4, IL-5, IL-13) és profibrotikus citokinek (TGF-β, FGF), továbbá gyulladásos mediátorok (hisztamin, Prosztaglandin D2, Leukotrién C4) és szerin proteázok (triptáz, kimáz) termelésére képesek. Asthmásokban a hízósejtek elsősorban a légúti simaizom-sejtkötegek között szaporodnak fel, ellentétben a limfocitákkal és az eozinofilekkel, melyek asthmában a simaizmot nem infiltrálják, továbbá azzal csak gyenge kapcsolat kialakítására képesek. A hízósejtek viszont képesek a simaizomsejtekkel szoros kapcsolatot létesíteni (68), és az általuk termelt vegyületek (TGF-β, FGF, kimáz) révén hozzájárulnak a remodeling, azaz a simaizomzat hipertrófia és hiperplázia, valamint egyes fibrotikus elváltozások (pl.: bazálmembrán-megvastagodás) kialakulásához. Ugyanakkor bronchokonstriktor hatású mediátorokat is képesek termelni (pl.: triptáz, IL-4, IL-13, hisztamin, PGD2, LTC4). A hízósejtek az 1. típusú (azonnali) túlérzékenységi reakcióban IgE-függő módon aktiválódnak. Ennek feltétele, hogy az immunrendszer az allergénnel szemben – az első expozíció alkalmával – specifikus IgE típusú ellenanyagokat képezzen (atópia). Az antitestek a hízósejteken expresszált nagy affinitású FcεRI-hez kötődnek, így az allergén ismételt expozíciója az FcεRI keresztkötése révén a sejtek gyors aktiválódását és degranulációját eredményezi. A hízósejtek tehát elsődlegesen allergén vagy egyéb indirekt stimulusok (pl.: fizikai terhelés és hiperventiláció okozta ozmotikus és

19

hőmérsékletváltozások, köd) hatására kialakuló akut bronchusgörcs létrehozásában vesznek részt. A légúti epitélben fellelhető hízósejtek pedig a kehelysejt-metaplázia és a fokozott nyákszekréció kialakításában játszanak szerepet (69). Mindezek révén hozzájárulnak a légúti obstrukció kialakulásához. Feltehetően részt vesznek az IL-4 citokin környezet létrehozásában, valamint a krónikus légúti gyulladás fenntartásában is citokintermelésük (IL-4, IL-13) révén (69). Hízósejt hiányos KitW/KitW-v egerekben intranazális úton OVA-val történő szenzitizálás majd provokáció után nem alakul ki eozinofil sejtes légúti gyulladás és LHR. Ha azonban ezeknek a hízósejt hiányos egereknek

adoptív transzfer útján vad típusú hízósejteket adnak be az allergén

szenzitizáció és provokáció előtt, az asthmára jellemző fenotípusos tünetek kialakulnak (70). Fontos azonban megemlíteni, hogy ha a hízósejt hiányos egereket nem intranasális, hanem intraperitoneális úton szenzitizálják, akkor a hízósejtek hiánya

mellett is

kialakulnak az asthmára jellemző fenotípusos elváltozások (70, 71). 2.3.2.2. Makrofágok A vérben keringő monocitákból képződő makrofágok a felszínükön található alacsony affinitású IgE receptoron (FcεRII) keresztül aktiválódhatnak allergének hatására. A légutakban található alveoláris makrofágok szerepet játszhatnak az immunválasz irányának meghatározásában, mivel az őket ért stimulusoktól függően különböző mediátorokat képesek elválasztani, hozzájárulva ezzel a citokin környezet kialakításához. Fiziológiás körülmények között, IL-10 termelése révén gátolják az effektor limfociták működését, de megfigyelték, hogy asthmásokban, allergén expozíciót követően ez jelentősen csökken (72, 73). A makrofágok IL-12 szintézise szintén mérséklődik asthmában, ami a Th2-irányú

immunfolyamatok kialakulásának egyik

eleme lehet (74). Az alveoláris makrofágok antigénprezentáló képessége kisebb, mint például a peritoneális makrofágoké (75). Ezt a funkciót a tüdőben nagyobb részt a dendritikus sejtek töltik be.

20

2.3.2.3. Dendritikus sejtek A dendritikus sejtek specializált, professzionális antigénprezentáló sejtek, melyek szerepe kulcsfontosságú az adaptív immunválasz kialakításában és irányításában. A dendritikus sejtek hálózatot képeznek a légúti epitélben, képesek „periszkópszerűen” kinyúlni a légúti epitél sejtek szoros kötelékéből, ezáltal folyamatosan felveszik és feldolgozzák a belélegzett környezeti antigéneket, majd a mediasztinális nyirokcsomókba vándorolva prezentálják azokat a naív T-sejteknek. Egerek tüdejében bizonyított, hogy az intraepiteliális CD103+ dendritikus sejtek felszínén kifejeződik számos olyan sejtadhéziós fehérje (claudin-1, claudin-7 és zonula-2), melyeken keresztül a dendritikus sejtek tight-junction kapcsolatot alakítanak ki a légúti epitél sejtekkel (76). Ez az aktív kapcsolat magyarázatot ad arra, hogy miként képesek a dendritikus sejtek a légúti epithelium barrier funkciójának megtörése nélkül folyamatosan monitorozni a légutakba került antigéneket. A belélegzett veszélytelen antigénekre fiziológiásan a szervezet immuntoleranciával válaszol (77). Ez alapvetően kétféle módon valósulhat meg: a természetes immunitást stimuláló ágensek hiányában a dendritikus sejtek nem aktiválódnak (alacsony marad a fő hisztokompatibilitási komplex – MHC – és a kostimulációs molekulák expressziója) és nem jön létre T-sejtes immunválasz, tehát anergia alakul ki (78). Amennyiben viszont a dendritikus sejtek aktiválódnak, de az antigén feldolgozását és prezentációját nem kísérik veszélyt jelző, úgynevezett „danger”szignálok (79), akkor az immunválasz során IL-10 termelő Treg sejtek proliferálódnak (77). Újabb kutatási eredmények rámutattak arra, hogy az inhalációs tolerancia fenntartásában kulcsfontosságú szabályozó szerepet játszanak a plazmacitoid dendritikus sejtek (80), melyek képesek elnyomni a tüdőből származó mieloid dendritikus sejteket, így azok kevésbé hatékonyan képesek effektor T-sejteket generálni. A dendritikus sejtek ily módon tehát kulcsfontosságú szerepet játszanak az allergiás immunfolyamat kialakulásában: felveszik és feldolgozzák az allergént, majd a regionális nyirokcsomókba vándorolva kapcsolatba lépnek a naiv T-limfocitákkal. Az antigénprezentáció során a természetes immunstimulusok jelenléte és minősége, a kostimulációs szignálok, a dendritikus sejt típusa és a helyi citokin környezet együttesen határozzák meg az immunválasz irányát, így a T limfociták további differenciálódását 1-es típusú T-helper sejt (Th1) vagy Th2 illetve Treg irányba. A citokinek szerepe ebben a folyamatban döntő

21

fontosságú. Az alveoláris epitélsejtek és makrofágok nagy mennyiségben képesek granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktort (GM-CSF) termelni, amely elősegíti az éretlen dendritikus sejtek mieloid dendritikus sejtté fejlődését, és ily módon az antigénprezentáció során a limfociták differenciálódását Th2-es irányba tolja el (81). Állatkísérletekben kimutatták, hogy a mieloid dendritikus sejtek nélkülözhetetlenek a Th2-es immunválasz és az eozinofil gyulladás kialakulásához. 2.3.2.3. Eozinofil granulociták Az eozinofil infintráció az allergiás gyulladás fő jellemzője. Az allergén inhalációját követő késői allergiás válasz során a BALF eozinofil sejtszáma lényegesen megnő, és a tüdőben kialakul a jellegzetes peribronchiális és perivaszkuláris eozinofil beszűrődés. Az eozinofil sejtek számos mediátort – például major basic protein (MBP), eosinophil cationic protein (ECP), eosinophil peroxidase (EP) – termelnek, melyek hozzájárulnak az asthmában jellegzetes légúti epitél károsodás létrehozásához és a gyulladás súlyosbításához (82). Az MBP interferálhat a NO szintézisével (gátolja az L arginin-felvételt), továbbá az EP révén oxigénből származó reaktív szabadgyökök is felszabadulnak. Mindez arra utal, hogy az eozinofil sejtek közreműködnek az LHR kiváltásában is. A csontvelői prekurzor sejtekből differenciálódó eozinofil granulocitákat számos mechanizmus vonzza a légutakba (83). A késői allergiás válasz során a tüdőben bekövetkező lokális eozinofil sejtszám-emelkedés a perifériás vérben ugyanezen sejtpopuláció csökkenésével, továbbá eozinofil progenitorok megjelenésével jár együtt (84). Az eozinofil sejtek toborzásának főbb lépései: adhézió a légúti erek vaszkuláris endotéliumán, migráció a szubmukózába és aktiváció. A sejtek kitapadását elősegíti, hogy az eozinofilek felszínén bizonyos adhéziós molekulák jelennek meg: az LFA-1 a vaszkuláris endotél sejtek felszínén kifejeződő ICAM-1-gyel létesítenek kapcsolatot (85, 86), míg a VLA-4 a VCAM-1-gyel kapcsolódik (87). Az eozinofil sejtek aktiválódásához és túléléséhez bizonyos növekedési és érési faktorok jelenléte szintén szükséges. Az allergiás gyulladás során főként a GM-CSF és az IL-5 tölti be ezt a szerepet (88), ugyanis hiányukban az eozinofilek apoptózis-készsége fokozott (89). Az eozinofil sejtek vándorlását a keringésből a légutak falába és a bronchoalveoláris térbe számos

22

kemotaktikus hatású anyag termelődése szintén előmozdítja. Ilyen kemokinek pl. a RANTES, az eotaxin 1-3, és a MCP-4 (90). 2.3.2.4. Neutrofil granulociták Habár enyhe és középsúlyos asthmások légutaiban az eozinofil és nem a neutrofil granulociták dominálnak, súlyos asthmások indukált köpetében mégis jelentős számban fellelhetők a neutrofil sejtek (91, 92). Akut súlyos asthmában elhunytak légutaiban szintén nagy mennyiségű neutrofil található (93). Mindez részben a neutrofil sejtek jellegzetes, rendkívül gyors migrációs kinetikájával (94) és a szteroid kezelés neutrofil granulociták apoptózisát gátló hatásával (89, 95) lehet megmagyarázható. Ugyanakkor súlyos asthmások köpetében emelkedett IL-8 koncentráció mérhető (91), ami a neutrofilek aktív toborzására utal ezekben a betegekben. Ily módon valószínűsíthető, hogy a neutrofil granulociták szerepet játszanak az akut exacerbatiók kialakulásában, és – egyes megfigyelések szerint – jelenlétük együtt jár a szteroid-válaszkészség csökkenésével is. E betegek esetében az akut exacerbatiók hátterében nem csak tisztán allergiás immunmechanizmusok állhatnak. 2.3.2.5. T-limfociták A 2. típusú T-helper sejtek (Th2) kulcsfontosságú szerepet játszanak az asthmás kórfolyamat beindításában és a betegség fenntartásában. Egészséges egyének tüdejében található leukociták csak kis része limfocita. Asthmában ezzel szemben a légutakban nagy mennyiségben jelennek meg a CD4+ Th2 sejtek (96). A legjelentősebb Th2-es citokinek (IL-4, IL-5, IL-13) fehérje és mRNS koncentrációja a BALF-ban, a BAL sejtekben és a bronchusbiopsziás mintákban megemelkedett (96, 97). A Th1 és Th2 sejtek az általuk termelt citokinek révén kölcsönösen képesek egymás differenciálódását és működését gátolni (98). Számos vizsgálatban kimutatták, hogy a Th1-es sejtek és az általuk termelt citokinek (IFN-γ, IL-12) képesek meggátolni a Th2-es sejtek által koordinált

eozinofil

gyulladás,

fokozott

nyáktermelődés

és

LHR

kifejlődését

állatmodellekben (99, 100). Ugyanakkor más kísérletekben a már kialakult allergiás gyulladást és LHR-t a Th1-es sejtek súlyosbították (31, 101). A Th1-es sejtek specifikus

23

antigén hiányában is képesek Th2 limfocitákat toborozni a gyulladás helyére (102), ami az egyik magyarázata lehet annak, hogy milyen módon súlyosbíthatják a Th1 sejtek az allergiás gyulladást. Epidemiológiai adatok alapján, a 60-as évektől kezdődően nem csak az allergiás betegségek prevalenciája nő, hanem ezzel párhuzamosan a Th1 aktivációhoz kötött (auto-) immunbetegségek, mint az I. típusú cukorbetegség, a szklerózis multiplex vagy a Crohn-betegség esetében is hasonló tendencia figyelhető meg (103). Mindezek alapján valószínű, hogy a felsorolt betegségek előretörésében az immunrendszer olyan szabályozási zavara állhat, mely érinti a naiv T helper sejt differenciálódás és az immuntolerancia folyamatát. A fejezet további részeiben ezért a T helper sejtek fejlődésének főbb jellemzőit ismertetem a teljesség igénye nélkül. A Th1 irányú differenciálódás fő irányítói az IL-12, valamint az egyes típusú interferonok (IFN-α, IFN-β) melyek elsődleges forrásai az intracelluláris patogének által aktiválódott makrofágok és dendritikus sejtek. Az általuk termelt IL-12 beindítja a természetes ölősejtek (NK sejtek) IFN-γ termelését, mely mindhárom sejttípus IL-12 termelését autokrin módon pozitív visszacsatolással fokozza. Az antigén prezentáló, valamint az NK sejtekből felszabaduló IFN-γ gátolja a Th2-es irányú differenciálódást a továbbiakban (104). Az IFN-γ a naiv T helper sejthez kapcsolódva aktiválja a STAT1 transzkripciós faktort JAK1, valamint JAK2 mediált úton. Mindezen molekuláris folyamatok a már említett T-bet transzkripciós faktor indukcióját, valamint a sejtek felszínén az IL-12 receptor megjelenését eredményezik. A T-bet működése réven a naiv T helper sejt Th1-es citokineket termelő sejtté alakul, és a saját maga által is termelt IFN-γ útján hozzájárul a lokális környezetében lévő még naiv T helper sejtek Th1 irányú fejlődéséhez. Az IL-12 hatására fokozódik a Th1 sejtek felszínén az IL-18 receptor kifejeződése, így a dendritikus sejtekből származó IL-18 hatása a Th1 fejlődés későbbi szakaszában érvényesülhet, és befolyásolhatja a sejtek működését és érését (105, 106). A Th2 irányú polarizáció a mieloid dendritikus sejtek révén jön létre IL-4 és IL13 gazdag citokin környezetben. Ezen citokinek elsődleges forrása jelenleg nem ismert, de a hízósejtek (69) és a natural killer T-sejtek (NKT) is képesek a termelésére (107), később, a már kialakult krónikus betegségben a Th2 sejtek maguk a fő citokin termelők. Az IL-4 hatására a naiv T helper sejtek STAT6 transzkripciós faktor termelése fokozódik, mely indukálja a GATA-3 transzkripciós faktor expresszióját. A Th1 irányú fejlődést

24

irányító T- bet és a GATA-3 egymásra antagonista módon hatnak. Ha az IL-12, IFN-γ és a T-bet mennyisége magas, akkor a GATA-3 termelés gátlódik, amennyiben viszont az IL-4 és a GATA-3 szintje emelkedett, a T-bet expressziója represszált (108). Figyelemre méltó állatkísérletes eredmény, hogy a Th1-es differenciálódást irányító, Th2-es polarizációra pedig gátló hatású T-bet gén célzott kiütése önmagában elegendő volt az asthmában tapasztalható légúti gyulladás, LHR és szövettani elváltozások létrejöttéhez (109). Az IL-4 hatásán kívül az allergiás Th2-es immunválasz korai fázisában a makrofágokból, hízósejtekből és a dendritikus sejtekből nagy mennyiségű IL-6 is felszabadul, mely serkentőleg hat az IL-4 gén expressziójára, az IFN-γ génjét szabályozó STAT1 transzkripciós faktor aktivitását viszont gátolja, megakadályozva ezzel az IFN-γ termelődését. Az elmúlt években egy mindaddig ismeretlen, új T helper sejttípust azonosítottak, mely különbözik mind a Th1, mind a Th2 helper populációtól és főként IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 és TNF-α citokineket termel, melyek a makrofágokon, epitél és endotél sejteken, valamint a fibroblasztokon hatnak elsődlegesen. Ennek eredményeképpen e sejtekből gyulladásos faktorok és kemokinek szabadulnak fel, melyek granulocitákat (főként neutrofilokat) toboroznak a helyszínre (110), általános szöveti gyulladást hozva ezzel létre. A Th17 névre keresztelt sejtpopuláció kulcsfontosságú szereppel bír autoimmun betegségekben, valamint az extracelluláris baktériumok elleni védekezésben. Érésükhöz IL-6, IL-21, és TGF-β szükséges, teljes funkcióval rendelkező effektor sejtté válásukhoz pedig az IL-23 citokin jelenléte szükséges. A sejtpopuláció immunológiai eredetű betegségekben betöltött szerepe jelenleg aktív kutatás tárgya. A CD4 + T sejtek aberráns

működése

rendkívül

sokféle

autoimmun

és

pathomechanizmusában elsődlegesen fontos szereppel bír.

allergiás

betegség

Ezen sejtpopulációk

kialakulásának, differenciálódásának mélyebb megértése segítségével a jövőben esetleg hatékonyabb kezelések kidolgozására nyílik majd lehetőség. Az immuntolerancia fenntartása fontos szereppel bír a szervezet belélegzett antigénekre (allergének) adott reakciójában, melyek normális esetben fiziológiásan nem indukálnak gyulladásos választ. A nyálkahártya-felszín a környezetben található nem toxikus ágensek (potenciális allergének) folyamatos expozíciójának van kitéve, rendszerint ezek az antigének mégsem váltanak ki immunválaszt. Ennek oka egyrészt az,

25

hogy a légúti hám nyákbevonata, valamint az epitél sejtek közötti szoros sejtkapcsolat (tight junction) gátolja az immunrendszer és az antigének találkozását (barrier funkció), másrészt viszont aktív mechanizmusok is akadályozzák a specifikus immunválasz kialakulását. A belélegzett antigének fiziológiás körülmények között képesek specifikus T-sejt anergia kiváltására, továbbá elősegítik a Treg sejtek differenciálódását. Ebben a folyamatban az antigénprezentáló sejteknek kitüntetett szerepe van. A mucosa dendritikus sejtjeinek felszínén – egyéb immunstimulusok hiányában – alacsony az MHC II és a kostimulációs molekulák expressziója, továbbá IL-10-et is termelnek (77), ami elősegíti a T-sejt anergia kialakulását, továbbá IL-10 és TGF-β termelő Treg sejtek felszaporodását. Az IL-10 csökkenti az MHC II és a CD80 expresszióját a dendritikus sejteken (111). Mindezek a mechanizmusok együttesen vezetnek az immuntolerancia kifejlődéséhez. Allergiás asthmásokban azonban a belélegzett ártalmatlan antigének (allergének) specifikus Th2-típusú immunválaszt váltanak ki. A számos, eddig feltárt genetikai hajlamosító tényezőn (polimorfizmuson) kívül a természetes (veleszületett) immunitás bizonyos stimuláló ágensei szintén fontos szerepet játszhatnak a kórfolyamatban. Az antigénprezentáló sejtek felszínén expresszálódó PRR-ek a természetes immunrendszer fontos elemei. Endogén és exogén ligandjaik (pl.: a PAMPok) meghatározó szerepet töltenek be a T-sejt differenciálódás folyamatában, ily módon befolyásolhatják az allergiás asthma kialakulását és kórlefolyását. 2.3.2.6. B-limfociták Allergiás kórállapotokban a B sejtek izotípusváltása következik be, melynek nyomán IgE termelő plazmasejtekké differenciálódnak. Ezt az átalakulást részben az IL4 idézi elő. Egyes újabb eredmények arra utalnak, hogy az IgE szisztémásan, illetve lokálisan fellépő túltermelése allergiás, illetve nem allergiás asthmában egyaránt kulcsfontosságú eleme a pathomechanizmusnak (61).

26

2.3.2.7. Bazofil granulociták Asthmás betegek légutaiban kissé emelkedett számban találhatók bazofilok, és ez tovább nő allergén inhaláció után, továbbá az indukált köpetben is megjelennek ezek a sejtek (112). Ugyanakkor mennyiségük sokkal kevesebb, mint az eozinofil granulocitáké, és pontos funkciójuk sem ismert. Számos vizsgálati eredmény utal arra, hogy a hízósejtekéhez részben hasonló szerepet töltenek be az asthma pathomechanizmusában. 2.3.2.8. Vérlemezkék (trombociták) Egyes bizonyítékok arra utalnak, hogy a trombocitáknak is szerepe lehet az asthma kórfolyamatában. A Th2-es gyulladás során felszabaduló kemokinek képesek a trombociták aktiválódását és aggregációját kiváltani (113), és az aktivált trombociták pedig RANTES-t termelnek (114). Asthmások bronchusbiopsziás mintáiban emelkedett trombocitaszám figyelhető meg, és allergén provokáció hatására jelentősen esik a keringő trombociták száma (115), valószínűleg a tüdőbe irányuló migrációjuk következtében. 2.3.2.9. A légutak strukturális sejtjei A hám- és endotélsejtek, fibroblasztok, epitél valamint a simaizomsejtek, tehát légutakat alkotó szövetek sejtjei mind képesek különféle proinflammatorikus anyagok termelésére. A strukturális sejtek, a krónikus kórfolyamat során bizonyos mediátorok fő forrásaivá válhatnak, mivel számuk még súlyos gyulladás esetén is messze meghaladja az inflammatorikus sejtek mennyiségét. A légúti epitélsejtek különösen fontos szerepet játszanak az immunfolyamatok szabályozásában. E sejtek találkoznak elsőként a belélegzett környezeti allergénekkel, sérülésük és lehámlásuk az asthma patológiájának elsődleges jelensége, valamint az inhalációs kortikoszteroidok hatásának elsődleges célsejtjei. Nemrég derült fény arra, hogy e sejtek nemcsak a természetes immunválasz közvetítésében és aktivációjában, hanem az adaptív immunválasz szabályozásában is kitüntetett szerepet játszanak a dendritikus sejtekkel, T és B sejtekkel való interakciójukon keresztül. Az epitél sejtek CCL20 (MIP-3a) termelésük révén (116) képesek a dendritikus sejtek CCR6 kemokin receptoron keresztüli tüdőepitéliumba történő migrációs aktivitását fokozni. A CCL20 termelés kiváltásában elsősorban allergének, PAMP-ok, valamint citokinek (TNF, IL-1, 27

IL-4, IL-13 és IL-17) vesznek részt. A CCR6 génkiütött egerekben antigén provokációt követően csökken az LHR, légúti eozinofília és a szérum IgE szint, mely jól bizonyítja a receptoron keresztül történő dendritikus sejtmigráció allergiás gyulladásban betöltött fontos szerepét (117). A légúti epitél sejtek számos, a dendritikus sejtek működését különböző módon befolyásolni képes citokin - TSLP, GM-CSF, IL1β, IL-33, osteopontin és IL-25 – termelésére képesek, melyek révén aktívan hozzájárulnak a Th2 irányú immunfolyamatok beindításához. A TSLP közvetlenül képes úgy aktiválni a dendritikus sejteket, hogy azok a naiv CD4 + T-sejteket Th2 típusú sejtek irányába fogják kizárólagosan polarizálni (118). A Th2 irányú polarizációt és citokin termelést tovább erősíti az IL-25, melyet az epitél sejtek, bazofil és eozinofil granulociták termelik (119). Az epitél sejtek által nagy mennyiségben termelt TSLP Th2-es típusú allergiás légúti gyulladásban betöltött kulcsfontosságú szerepére kétségkívül a legmeggyőzőbb bizonyítékokat a citokint a tüdőben kondicionálisan túltermelő, illetve a citokint kódoló génre kiütött állatkísérletek eredményei jelentik. A TSLP tüdőbeli túltermelése fokozott Th2-es választ

eredményezett az egerek tüdejében, míg a génkiütött, TSLP-t nem

termelő Tlspr−/− egerek esetében nem sikerült allergén specifikus Th2-es típusú légúti gyulladást előidézni (120). A dendritikus sejtekre gyakorolt hatásuk mellett a légúti epitél sejtek mind a Th1, mind pedig a Th2 sejtek tüdőbe történő migrációját képesek indukálni. A simaizom sejtek, fibroblasztok, epitél sejtek által termelt IL-33 Th2 sejtekben fokozza az IL-5, IL-13 produkcióját in-vitro. Kísérleti egerekben az IL-33 adagolása eozinofíliával, mucus túltermeléssel járó Th2-es gyulladáshoz vezetett a tüdőben és az emésztő traktusban (121), bizonyítva ezzel a citokin allergiás gyulladásban játszott fontos szerepét. Összefoglalva tehát elmondhatjuk, hogy a légúti epitél sejtek kulcsfontosságú szerepet játszanak a tüdőben zajló különféle irányú immunfolyamatok modulációjában.

28

2.3.3. Az asthma szabályozásában szerepet játszó fontosabb citokinek és kemokinek

2.3.3.1. Citokinek A citokinek viszonylag kis méretű (8-80 kDa) glikoproteinek, melyek fontos szerepet játszanak az immunválasz folyamán a sejtek közötti információtovábbításban és az immunregulációban. Hatásukat endokrin, parakrin és autokrin módon fejtik ki, szabályozzák a sejtek érését, aktivációját, proliferációját, differenciálódását, a kemotaxist valamint részt vesznek az immunfolyamatok utolsó, effektor fázisában is. Asthmában az immunsejtek, illetve a strukturális sejtek közül az endotél, a légúti epitél és simaizomsejtek termelnek jelentős mennyiségű citokint, részt vállalva ezzel a krónikus gyulladás kialakításában, szabályozásában és fenntartásában. Néhány citokin esetében számos kutatási eredmény utal arra, hogy kitüntetett szerepet töltenek be az asthma pathomechanizmusában. Az IL-3 pluripotens hematopoetikus növekedési faktor, melynek mRNS expressziója jelentősen fokozott az asthmás betegekből nyert BALF sejtekben és biopsziás mintákban. Fő forrása az aktivált Th2-es limfocita. Fontos szerepet tölt be a hízósejtek szöveti túlélésében, az eozinofil infiltráció kialakulásában, ugyanakkor jelentős hatása van más mieloid sejtek differenciálódására és migrációjára is. A GM-CSF fokozza a neutrofil granulociták IL-3 válaszkészségét. Az IL-4 talán az egyik legfontosabb citokin allergiás betegségekben és asthmában. A gyulladt légutakban számos sejttípus: bazofil és eozinofil granulociták, hízósejtek és egyes limfocita altípusok (NKT-sejtek) termelik, de fő forrása valószínűleg a Th2-es limfocita. Ugyanakkor viszont az IL-4 egyik legfontosabb funkciója, hogy jelenlétében a naiv Th0 limfocitákból az antigénbemutatás és a kostimulációs szignálok hatására Th2-es sejtek differenciálódnak. Bár az előrehaladott, krónikus asthmában az IL4 nagy mennyiségben van jelen (mivel sok sejt termeli), az allergiás gyulladás kialakulásának korai fázisában kérdéses, hogy milyen forrásból származik ez a citokin. A korai allergiás válaszban fontos szerepet játszó hízósejtek képesek IL-4 termelésére (69). Egy nemrég megjelent közlemény szerint a BALF-ból nyerhető limfociták jelentős hányada (mintegy 60%-a) NKT-sejt (107), amely szintén termel IL-4-et, így ezek a

29

sejttípusok is lehetnek az IL-4 elsődleges forrásai. Az IL-4 másik fontos szerepe (az IL13-mal együtt), hogy aktiválja a B-limfocitákat és izotípusváltást indukál, melynek hatására a B-sejtek IgE-termelő plazmasejtekké differenciálódnak. Az IL-4 fokozza az endotél sejteken a VCAM-1 expresszióját (122).

Transzgén egereken végzett

megfigyelések szerint szerepe lehet az asthmában jellegzetesen fokozott mucinszekréció (és MC5AC génexpresszió), valamint a kehelysejt-metaplázia kialakulásában is (123). Szintén állatkísérletes eredmények mutatják, hogy IL-4 génkiütött egerekben nem hozható létre az allergiás gyulladás és LHR hagyományos (OVA) modellje. Ezekben az állatokban nem termelődik allergénspecifikus IgE, nem infiltrálják Th2-sejtek a légutakat és nem alakul ki sem eozinofil gyulladás, sem LHR (124). Mindez jól mutatja ezen citokin alapvető szerepét a kórfolyamat korai fázisában. Másrészről viszont ugyanezen modell létrehozásának egy előrehaladottabb szakaszában, a már érzékenyített állatok allergén (OVA) inhalációi alatt hatástalan az IL-4-et neutralizáló antitest (125). Az IL-4 gátolja a makrofágokban az IFN-γ és az IL-12 szintézisét, amivel hozzájárul a Th1 irányú differenciálódás gátlásához. Összefoglalva tehát az IL-4 nélkülözhetetlen mind a Th2 dominancia kialakulásában, mind a fokozott IgE termelés megindításában, ezért alapvető jelentősége van az asthma kifejlődésének korai szakaszában. Az eozinofília létrehozásában valószínűleg az IL-5 a legfontosabb mediátor. Leginkább a Th2-es limfociták termelik, de kimutatható hízósejtekben és magukban az eozinofilekben is (126). Asthmásokból nyert BALF jelentős mennyiségben tartalmazza, és koncentrációja tovább nő allergénprovokáció után, vagy akut súlyos asthmában (127). Az IL-5 elősegíti az eozinofilek differenciálódását, érését (128), meghosszabbítja életidejüket (129), továbbá részt vesz az aktivációjukban (130). Az IL-5 mobilizálja az eozinofil sejteket a csontvelőből és más kemotaktikus anyagok (pl.: eotaxin) termelésének szabályozása révén hozzájárul a gyulladás helyére irányuló migráció és homing (131, 132) megvalósulásához. Anti-IL-5 antitest (mepolizumab) adását követően határozottan csökken az eozinofil sejtszám mind a vérben, mind az asthmás légutakban (indukált köpetben), azonban az LHR és a klinikai tünetek nem változnak jelentős mértékben (133, 134). Mindez megkérdőjelezi az eozinofil sejtek szerepét a perzisztáló asthmatikus tünetek fenntartásában.

30

Az IL-9 fő forrása a Th2-es sejt. Fokozza az aktivált T-sejtek proliferációját, az IgE szintézist és előmozdítja a hízósejtek differenciálódását és osztódását. IL-9 transzgenikus állatban az asthmára jellemző elváltozások többsége megjelenik, így valószínűleg többféle módon is hozzájárul a betegség kialakulásához. Az IL-13-at szintén főleg a Th2-sejtek szintetizálják. Allergiás légutakban az expressziója fokozott, és allergénprovokáció hatására tovább nő. Az IL-13 és az IL-4 receptora részben azonos (IL-4Rα lánc), így hatásaik is átfednek. Az IL-13 részt vesz az IgE izotípusváltás indukciójában, a VCAM-1 expressziójának fokozásában és az IFN-γ és az IL-12 szintézisének gátlásában. Ezen kívül aktiválja az eozinofil sejteket (megnöveli a CD69 expresszióját) és megnyújtja életidejüket (135). Míg az IL-4 főleg az asthma kialakulásának korai szakaszában nélkülözhetetlen, az IL-13 valószínűleg a betegség későbbi stádiumában a krónikus gyulladás fenntartásában játszik fontos szerepet, mivel ekkor nagy mennyiségben képződik a gyulladt légutakban. Számos egyéb citokin vesz részt még az említetteken kívül a gyulladásos folyamat felerősítésében. A légúti epitélsejtek és makrofágok proteolitikus hatású allergének (pl. házipor atkák Derp1 allergénje) hatására nagymennyiségű GM-SCF-t képesek elválasztani, mely a dendritikus sejtek differenciálódását elősegítve az immunválasz Th2-es polarizációját idézi elő (81). A citokint túltermelő egerekben OVA inhaláció hatására megtört az inhalációs tolerancia, és előzetes OVA szenzitizáció nélkül is Th2-es légúti gyulladás alakult ki (136). Fontos néhány szót szólni a természetes immunitás két fontos citokinjéről, a TNFα-ről és az IL1β-ról is. Mindkét citokin elsődlegesen fontos funkcióval bír a gyulladásos kaszkád kialakításának kezdeti, upstream szakaszában. A már az előzőekben említett TSLP-vel szinergizálva képesek a hízósejteket aktiválni és Th2-es típusú citokinek termelésére serkenteni (137). Az IL1β és a TNFα fokozza a légúti epitélsejtek CCL20 termelését, a TNFα adagolása kísérleti állatokban önmagában elég volt az inhalációs tolerancia megtöréséhez (138). A TNFα génjének promóterében található polimorfizmust (-308G/A; G-A báziscsere) több tanulmány is összefüggésbe hozta az asthmával (139). A polimorf A-allél erőteljesebb TNFα expressziót okoz (140).

31

2.3.3.2. Kemokinek A kemokinek általában 8-10 kDa méretű kemoattraktáns hatású vegyületek, amelyek részt vesznek a különböző leukocitáknak a gyulladás helyére vonzásában. Több mint 50 különböző kemokint azonosítottak eddig, a receptoraik száma is 20 feletti. Egyes kemokinek szelektíven kötődnek bizonyos receptorokhoz, míg mások hatása átfedő. Alapvetően két nagy csoportjuk van: CC és CXC kemokineket különböztetünk meg aszerint, hogy aktív helyükön a két cisztein szomszédos, vagy azokat elválasztja egymástól egy másik aminosav. Asthmában főleg a T-limfocitákra, eozinofilekre és monocitákra ható CC kemokineknek van jelentősége. Az eotaxin, eotaxin-2, eotaxin-3, RANTES és az MCP-4 a CCR3 receptoron fejtik ki hatásukat (141), amely az eozinofil granulocitákon, Th2-sejteken és hízósejteken expresszálódik. Így ezek a kemokinek részt vesznek az allergiás gyulladásos infiltráció sejtes összetételének kialakításában (142). A promóter régiójában előforduló polimorfizmus (–403 G/A) befolyásolja a RANTES génjéről történő transzkripciót. Az MCP-1 a monocitákon, T-sejteken és hízósejteken is megtalálható CCR2-n hat. Neutralizálása a gyulladás és az LHR jelentős csökkenését eredményezi asthma modellekben (142, 143). Asthmás egyének tüdejében az MCP-1 fehérje szintje szignifikánsan emelkedett a nem asthmásokéhoz viszonyítva (144). Az MCP-1 promóterének –2518G polimorfizmusa pedig, amely emelkedett MCP-1 expresszióval jár, növelheti az asthma kialakulási kockázatát (145). A Th2-es sejtek felszínén megtalálható a CCR4 receptor is, melyhez MDC (monocita eredetű kemokin) és TARC kötődik (146). Az utóbbi kemokin epitél sejtekben is képződik (147) és valószínűleg részt vesz a Th2-es sejtek toborzásában, mivel mennyisége emelkedett az asthmások BALF-jában (148). A CXC kemokinek közül az IL-8 említendő, mivel koncentrációja megnő asthmások légutaiban (92). Az IL-8 főként a neutrofil granulocitákra ható kemoattraktáns, amely aktiválja is ezeket a sejteket, továbbá degranulációt,

és

a

nikotinsavamid-adenindinukleotid-foszfát

(NADPH)-oxidáz

aktiválása révén az „oxidatív robbanás” (respiratory burst) fokozódását váltja ki (149). Ez az oxidatív stressz erősödéséhez vezet és leginkább az asthma súlyos, neutrofíliával járó formáiban lehet fontos szerepe.

32

2.3.4. Az oxidatív stressz szerepe az asthma pathogenezisében Egyre több bizonyíték támasztja alá az oxidatív stressz kialakulásának fontos szerepét az asthma pathogenezisében. Noha az oxidatív stressz fellépése a gyulladásos sejtek által termelt reaktív oxigén származékok (reactive oxigen species, ROS) következményeként is felfogható, egyre inkább előtérbe kerül az a nézet, hogy az oxidatív stressz a légúti gyulladás kiváltó oka is lehet. A különböző reaktív oxigén származékok

keletkezhetnek

exogén

forrásokból

is,

mint

például

a

légköri

szennyezőanyagok és a dohányfüst (ami, hihetetlen módon, több mint 4700 különböző vegyi anyagot tartalmaz), valamint létrejöhetnek endogén enzimatikus úton a gyulladásos sejtek és légúti epitélsejtek által a különböző antigénekre, irritáló anyagokra és patogénekre

adott

gyulladásos

immunválasz

során.

Generálásukban

főként

a

mitokondriális légzési lánc, a NADPH oxidáz és a xantin/xantin-oxidáz rendszerek vesznek részt. A tüdő, fiziológiás funkciójánál fogva oxigén gazdag környezetben foglal helyet, hatalmas felülete és gazdag vérellátottsága miatt fokozottan kitett az oxidatív stressz okozta sérüléseknek. Számos vizsgálati eredmény (150-152) utal arra, hogy asthmában a reaktív oxigén-származékok mennyisége jelentősen megnő. A ROS-ok és például a NO együttes jelenléte következtében erősen oxidáló hatású úgynevezett reaktív nitrogén-származékok képződnek. Ilyen például a peroxinitrit, amely NO és szuperoxid anion egyesüléséből keletkezik (153). Ez a rövid életidejű, rendkívül reaktív anyag gyorsan kölcsönhatásba lép a keletkezés helyén található egyéb molekulákkal – többnyire fehérjékkel – és azok módosulását (nitrálását) okozza. Állatkísérletben kimutatták, hogy a peroxinitrit fokozza az LHR-t, és aktiválja az eozinofil sejteket (154), továbbá képes növelni az IL-8 (neutrofil kemoattraktáns) szintézisét. Másrészt viszont a fehérjék nitrálásában – 3nitrotirozin képződésében – a NO mellett az eozinofil granulocitákból származó eozinofil peroxidáznak is jelentős szerepe van (155). Ez a folyamat többnyire a fehérjék funkciójának károsodását eredményezi. A reaktív nitrogén származékok ily módon hozzájárulhatnak a légúti epiteliális sejtek károsodásához és lehámlásához asthmában. Amennyiben a ROS-ok a sejtmembránok közelében keletkeznek, láncreakciószerűen oxidálják a membrán foszfolipideket (lipid peroxidáció), melynek eredményeként lipid-

33

hidroperoxid molekulák jönnek létre. Mindezek a folyamatok a membránfunkciók károsodásához, receptor és enzimfunkciók inaktiválódásához valamint megnövekedett szöveti permeabilitáshoz vezetnek (156). A lipid peroxidáció számos más, biológiailag aktív molekula – reaktív aldehidek, izoprosztánok, vérlemezke aktiváló faktor mimetikumok – felszabadulását okozhatja. Az erősen diffúzibilis reaktív aldehid, az akrolein, olyan létfontosságú celluláris funkciók indukcióját képes kiváltani, mint például a sejtproliferáció, apoptózis, szignál útvonal (pl. NF-κB) aktiváció (157). Az izoprosztánok, melyek az arachidonsav ROS-katalizált izomerjei, rendkívül stabil vegyületek, a plazmában keringenek, és a vizelettel ürülnek ki (158). Relatív in-vivo stabilitásuk miatt az oxidatív stressz marker molekuláiként is használatosak mind asthmában, mint pedig COPD-ben (159). A 8-izoprosztán rendkívül erős hatású simaizom kontrakció stimulátor, melynek, sok egyéb kiváltó ok mellett jelentős szerepe lehet a légutak kontrakciójának kiváltásában (160). Az arachidonát alapú foszfolipidek ROS-ok általi degradációja számos erős hatású bioaktív anyag felszabadulásához vezet, melyek proinflammatórikus hatásúak, és a neutrofilok és monociták megnövekedett citokin szekrécióját és az endotél sejtekhez való erősebb adhéziójukat okozzák (161). A foszfatidilkolin ROS-ok általi módosítása egy különleges, egyedülálló molekulacsoport, az úgynevezett vérlemezke aktiváló faktorszerű lipidek (PAF) létrejöttéhez vezethet, melyek agonista módon hatnak a monociták és vérlemezkék PAF receptorán (162). A redox szenzitív molekuláris célpontok gyakran olyan transzkripciós faktorok és jelátviteli fehérjék (NF-κB, AP-1, p21ras, illetve különböző protein-tirozin foszfatázok), melyek erősen konzervált ciszteineket tartalmaznak. Ezek oxidációja, nitrozilációja illetve diszulfid hidak keletkezése révén megváltozhat a fehérje működése, mely hatással lesz az oxidációs/redukciós jelátvitel funkciójára. Kimutatták, hogy a JNK kinázt (c-Jun N-terminal kinase) szabályozó foszfatáz oxidáció okozta inaktivációja következtében a JNK hiperfoszforilálódott állapotban marad és aktivitása jelentősen megnő (163). A redox szenzitív transzkripciós faktorok (NF-κB, AP-1) aktiválódása miatt fokozódik a proinflammatorikus gének expressziója. Ezt még jobban erősíti a ROS-ok hiszton deacetiláz (HDAC-2, HDAC-5, és HDAC-8) inaktiváló hatása (164). Ez utóbbi jelenség kulcsfontosságú szereppel bír, mivel a kortikoszteroidok által közvetített gyulladásellenes

34

hatásban a hiszton deacetiláció következtében fellépő kromatin kondenzáció fontos szerepet játszik a proinflammatórikus génexpresszió gátlásában (165). A tüdőt érintő erős oxidatív hatások ellen számos nem enzimatikus és enzimatikus védekező rendszer alakult ki. A pleuraűri folyadék legfontosabb, nem enzimatikus védő antioxidánsai a glutation, aszkorbinsav (C-vitamin), húgysav, E vitamin, és az albumin, míg a legjelentősebb védő hatású enzimek a szuperoxid-dizmutáz, kataláz, tioredoxin, glutation-peroxidáz és a glutation-S-transzferáz. A ROS-ok által okozott sérülés hatására az antioxidáns molekulák koncentrációja jelentősen emelkedhet a pleuraűri folyadékban a légúti epitélsejtek permeabilitásának növekedése következtében a plazmából való beszűrődés miatt (166). A szervezet a két talán legfontosabb nem fehérje természetű antioxidáns anyag, az aszkorbinsav és E vitamin előállítására önmagában nem képes, azokat kizárólagosan csak a táplálkozás útján tudja magához venni. A vitaminok növekedett fogyasztása és az asthma tüneteinek javulása között fennálló összefüggést vizsgáló közlemények sok esetben egymásnak ellentmondóak. Egy tanulmányban kimutatták, hogy a megnövekedett C vitamin felvétel javítja az asthmás betegek tüdőfunkcióit (167), a megnövekedett E vitamin fogyasztás pedig az alacsonyabb szintű lipid peroxidációval mutatott korrelációt (168). Ugyanakkor, két nemrég megjelent közlemény nem mutatott ki jótékony hatást az említett két vitamin megnövekedett fogyasztásának köszönhetően asthmásoknál (169, 170). A tüdőben a glutation tripeptid rendkívül nagy mennyiségben fordul elő, tiolcsoportjai révén az intra- és extracelluláris antioxidatív védekező rendszer kiemelt szereplője. Számos kísérlet próbálta meg valamilyen módon megnövelni a tüdőbeli szintjét a fehérjének a bejuttatásával, de e törekvések általában kudarcot vallottak. A fő problémát egyrészt a kis fehérje rövid féléletideje (171), az alacsony hatékonyságú intracelluláris felvétel, valamint az általa okozott LHR növekedés jelentették (172). Alternatív módszer a glutation szint növelésére, ha nem magát a fehérjét, hanem a prekurzor ciszteinjét juttatják be a szervezetbe N-acetilcisztein formájában. Ennek az alkalmazhatósága szintén ellentmondásos, és nagy mértékben függ az alkalmazott dózis mennyiségétől orális adagolás során (173). Terápiás szempontból ígéretesnek tűnik a nemrég felfedezett potenciális antioxidáns hatású aromás tiol, a növényekben és állatokban természetes módon előforduló ergotionein alkalmazása (174), mely in-vitro

35

vizsgálatok alapján hatékonyan képes volt a peroxid kiváltott gyulladásos válasz és oxidatív stressz gátlására légúti epitél sejtekben (175). Az erdostein egy szintén nemrég felfedezett tiol, mely antioxidáns hatásain kívül még mukoaktív tulajdonságokkal is rendelkezik, és COPD-ben szenvedő

betegek esetén hatékonyan csökkentette az

exacerbátiók gyakoriságát és jelentős életminőség javulást okozott (176). Összefoglalásként elmondhatjuk, hogy az oxidatív stressz elleni védekező mechanizmusok mélyebb megértése kulcsfontosságú szereppel bír a tüdőt érintő gyulladásos betegedések eredményes kezelése szempontjából, és a jövőben lehetőséget nyújthat esetleges hatékony prevenciós módszerek kidolgozására is.

36

3. Célkitűzések Kutatásaink során az allergiás asthma pathomechanizmusának hátterében lévő genomikai tényezők vizsgálatához alapvetően kétféle megközelítést használtunk. 1. Állatkísérleteinkben ovalbumin-indukált allergiás asthmás egérmodellt alkalmaztunk, és az allergiás asthma kialakulásának különböző progressziós szakaszaiban vizsgáltuk a tüdő teljes gén és mikroRNS expressziós mintázatának az alakulását génexpressziós microarray mérések felhasználásával. E kísérletek során a következő szempontok megválaszolására helyeztük a hangsúlyt: •

Különböző

bioinformatikai

módszerek

segítségével

olyan

gének,

géncsoportok azonosítása, melyek eltérő expressziót mutatnak a különböző progressziós időpontokban. •

A kiválasztott gének expressziójának többszintű validálása.

•

Esetleg olyan gének, géncsoportok felismerése, melyeket eddig asthma szempontjából még nem vizsgáltak.

•

Azon mikroRNS-ek azonosítása, melyeknek tüdőszöveti expressziója eltérést mutat a kontroll és az allergiás asthmás egerek között, valamint ezen mikroRNS-ek validálása.

•

Amennyiben

az

állatmodell

segítségével

sikerül

eddig

az

asthma

szempontjából még nem vizsgált gént (géneket) találni, akkor annak milyen szerepe lehet a humán asthmában, illetve van-e valamilyen szerepe más betegségekben? Az állatmodellen alkalmazott génexpressziós vizsgálataink alapján sikeresen azonosítottunk egy, az asthma vonatkozásában még nem vizsgált, más multifaktoriális betegségekben azonban fontos szerepet játszó gént, a paraoxonáz 1 enzimet kódoló PON1-t, mely nagy mértékű csökkenést mutatott az asthmatikus progresszió előrehaladása során. Ezt követően szerettük volna megtudni, hogy vajon a csökkent PON1 szint emberek esetében is szerepet játszhat-e az akut asthma kialakulásában. Ennek a megválaszolására a következő kérdéseket tettük fel:

37

•

Mutat-e

emberekben a PON1 két legjobban vizsgált, a kódolt enzim

aktivitását és kifejeződésének mértékét bizonyítottan befolyásoló Q192R és 108 T/C genetikai polimorfizmus valamilyen asszociációt az asthmára való fokozott hajlammal? •

Van-e valamiféle összefüggés a szérum PON1 aktivitás és az asthmatikus tünetek súlyossága között kórházi kezelést igénylő súlyos asthmások betegek esetében?

2. Genotípus-környezet interakciós vizsgálataink során az asthmában fontos szerepet betöltő TNFα -308A promóter polimorfizmus Chlamydophila pneumoniae fertőzésben, valamint asthmára való hajlamban szerepet játszó esetleges módosító hatásait vizsgáltuk gyermekekben. Bár a Chlamydophila p. fertőzés viszonylag általános, nem minden fertőzött páciensben alakul ki asthma. Mindez arra enged következtetni, hogy bizonyos egyének genetikailag fogékonyabbak a Chlamydophila p. fertőzés krónikus légúti hatásaira. A kórokozóról számos rendszerben kimutatták, hogy indukálja a TNFα expresszióját, valamint számos adat bizonyítja e molekula fontos szerepét a gazdaszervezet baktérium elleni védekező rendszerében. Feltételezésünk szerint a TNF-α azon polimorfizmusa, mely befolyásolja a képződött géntermék mennyiségét, hatással lehet a fertőzésre, valamint a fertőzött páciensek asthmára való hajlamára. Hipotézisünk ellenőrzése céljából elemeztük a Chlamydophila p. fertőzés szerepét asthmás gyermekekben, vizsgálva a TNFα -308A promóter polimorfizmus esetleges módosító hatásait az asthmára való hajlamban.

38

4. Felhasznált anyagok és módszerek 4.1. Kísérleti állatok Kísérleteinkben 6-8 hetes nőstény BALB/c beltenyésztett egereket használtunk. Az SPF (meghatározott patogénektől mentes) állatokat a Charles River Laboratories hazai tenyészetéből (Isaszegről) szereztük be (higiénés státusukat a forgalmazó által rendszeresen végzett állatorvosi és szerológiai vizsgálatok biztosítják). Az egereket 38×23×18 cm méretű ketrecekben (maximum 6 állat/ketrec), 12/12 óra világos/sötét ciklusra beállított fényviszonyok között tartottuk. A ketreceket egy külön erre a célra kialakított, légkondicionált (hőmérséklet 24±2ºC, páratartalom: 60±10%), légcserélővel ellátott állatházban elhelyezett, HEPA szűrővel (leválasztás 0,3 µm-nél 99,997%) védett, túlnyomásos (50 Pa), szellőztetett ketrecszekrényben ( KAT-F-SZ-1000, Radel & Hahn, Mattersburg, Ausztria) helyeztük el. A műanyag ketrecaljakat, itató üvegeket folyékony felületfertőtlenítővel (Incidur liquid spray) tartottuk tisztán, a ketrecfedő rácsokat és az alomanyagot (Lignocell, JRS, Rosenberg, Németország) hőlégben (180ºC, 30 perc) sterilizáltuk, míg a tápot mikrohullámú sütőben (700W, 2 perc) csírátlanítottuk. Az állatok igény szerint kaptak OVA-mentes rágcsálótápot (R/M-Z+H, 15mm, Ssniff, Soest, Németország) és sósavval pH 3-ra savanyított ivóvizet. Az egereket csak az alkalmazkodás és a kísérlet ideje alatt tartottuk saját állatházunkban (tenyésztést nem végeztünk), hogy SPF státusukat minél jobban megőrizzék.

4.2. Az allergizálás és a kísérleti elrendezés ismertetése Kísérletünk során egy széles körben elterjedt allergiás asthma modellt használtunk. Az egereket ovalbuminnal szemben érzékenyítettük (szenzitizáltuk), majd ugyanezen fehérjével végzett légúti provokációval eozinofil légúti gyulladást hoztunk létre a tüdőben. A szenzitizációt a kísérlet 0. és 14. napján intraperitonealis (ip.) oltással végeztük. Az oltóanyag 20 µg OVA-t és 2,25 mg alumíniumhidroxidot (szuszpenzióban, Imject Alum) tartalmazott 100 µL PBS-ben oldva. Az allergizált állatok 100 µL -t kaptak a fenti oldatból, míg a kontrollok 100 µL PBS-t placeboként. Ezt követően, a kísérlet 28., 29. és 30. napján, naponta 20 percig 1% OVA-t tartalmazó aeroszol inhalációval kezeltük

39

az állatokat (allergénprovokáció). Az egereket egy műanyag dobozban helyeztük el, melybe szilikoncsövön keresztül bevezettük a kompresszorporlasztóval (LaborexSanesco, Bécs, Ausztria) létrehozott aeroszolt. A porlasztáskor OVA 1%-os, PBS-ben készült oldatát használtuk, míg a kontroll állatokat tiszta PBS aeroszollal kezeltük (placebo). Az allergizálás menetét, a kísérleti csoportok elrendezését, valamint a mintagyűjtések időzítését a 1. ábra szemlélteti. A tüdőszövet, a BALF, az RNS és a protein minták gyűjtése a 28. (1. csoport), valamint a 30. napon (2. csoport), 4 órával az allergén provokáció után, és a 31. napon (3. valamint a kontroll csoport) a tüdőellenállásmérés után történt az alábbiakban ismertetett módszerekkel.

1. ábra. Az általunk használt allergizálási protokoll menetének, valamint a mintagyűjtési időpontoknak és a kísérleti csoportok elrendezésének a szemléltetése. A kísérleti protokoll 0. és 14. napján az első, második és harmadik csoport állatait ovalbuminnal szemben érzékenyítettük a fehérje i.p. oltásával, majd ezt követően a 28., 29. és 30. napokon alkalmazott ovalbumin aeroszol inhaláltatásával végzett légúti provokációval eozinofil légúti gyulladást hoztunk létre a tüdőben. A kontroll csoport állatait tiszta PBS-sel oltottuk be, valamint tiszta PBS aeroszollal kezeltük (placebo). A tüdőszövet, a BALF, az RNS és a protein minták gyűjtése a 28. (1. csoport), valamint a 30. napon (2. csoport), 4 órával az allergén provokáció után, és a 31. napon (3., valamint a kontroll csoport) a tüdőellenállás mérés után történt.

40

4.3. Tüdőellenállás (RL) mérése A légúti reaktivitást, illetve LHR-t, azaz a methacholin (MCh: acetil-β metilkolin klorid) hatására bekövetkező RL-változást inhalatív módon, géppel lélegeztetett állatokon mértük. A 3. és a kontroll csoport egereit a 31. napon (24 órával az utolsó OVA vagy PBS provokáció után) ip. adott 100 mg/kg ketamine (WDT, Garbsen, Germany) és 10 mg/kg xylasine (Bayer, Leverkusen, Germany) 250 µL desztillált vízben oldott elegyével altattuk el. Ez az altatószer minimum 1 órás mély (sebészi) anesztéziát biztosít. A nyak bőrét elöl, a középvonalban egy kb. 1 cm-es hosszanti metszéssel nyitottuk meg, majd a lágyrészek tompa preparálását követően végeztük el a tracheotomiát. Az állatot 24G átmérőjű kanüllel (BD, San Jose, CA, USA), intubáltuk. Ezt követően az állatot egy teljestest-pletizmográfba helyeztük (Buxco Electronics, Sharon, CT, USA) és 150/perc frekvenciával, 6 mL / kg légzési térfogattal lélegeztettük (respirátor típusa: Inspira, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA). A tracheakanült 4-utas csatlakozó segítségével kötöttük össze a respirátor ki és bemeneti szárával, valamint a berendezéshez tartozó folyadék/gáz nyomáskülönbség-mérő száraz (gázfázisú) bemenetével. Ugyanezen szenzor nedves (folyadékfázisú) bemenetéhez egy vízzel telt nyomásmérő kanült csatlakoztattunk (ID:0,86 mm, OD: 1,27 mm, Intramedic PE-90, BD, San Jose, CA, USA) melyet az egér nyelőcsövébe vezettünk a pleuraűr magasságáig. Ily módon – közelítőleg – a transzpulmonális nyomás értékét tudtuk leolvasni a nyomásszenzor kimenetén. Az állathoz csatlakozó kanülöket a pletizmográf plexikamrájának erre a célra kialakított, légzáró ki- és bemeneti nyílásain vezettük keresztül, így biztosítva, hogy légáramlás csak a beépített pneumotachográf-membránon keresztül történjen. A mérések előtt végzett kalibrálás során a készülék meghatározta az 1 mL levegő befecskendezése alatti nyomásváltozás-görbét, kiszámolta a membrán aktuális ellenállását, így képessé vált az állat mellkasmozgása által keltett nyomásváltozásból a légátáramlás kiszámítására. A fenti paramétereket, valamint az egységnyi transzpulmonális nyomás hatására létrejövő légáramlás, azaz a tüdőellenállás (RL; H2Ocm / mL / s) értékét a szoftver (BioSystem XA, Buxco Electronics, Sharon, CT, USA) folyamatosan rögzítette. Az állatokat intratracheális úton bejuttatott aeroszolizált MCh oldattal provokáltuk, így határoztuk meg a légúti válaszkészséget (reaktivitást). Az alapvonal (PBS oldat belélegzése közben végzett) rögzítése után az egymást követő MCh dózisokat

41

ötpercenként, kétszeresen emelkedő dózisban (3,125, 6,25, 12,5, 25 és 50 mg/mL 4 µL össztérfogatú PBS-oldatban) nebularizáltuk a belélegzett levegőbe. A provokációt nem kumulatív módon végeztük, mivel az egyes MCh adagok után minden esetben megvártuk, amíg az RL értéke újra stabilizálódik az alapvonal körül (≤ 120%). Az MCh belélegzése után az RL meredeken emelkedett, majd elérte a csúcsértéket és rövid időn belül újra leesett közelítőleg az alapvonal értékéig. A kiértékelés során az egyes MCh dózisok beadása után mérhető RL csúcsértékét használtuk a válaszkészséget meghatározó mutatóként.

4.4. Bronchoalveolaris lavage (BAL) A BAL-t a 28. valamint a 30. napon 4 órával az allergén provokáció (az első illetve harmadik inhaláció) után, és a 31. napon a tüdőellenállás-mérés után végeztük tracheotomia alkalmazásával. Az állatok tracheakanüljére csatlakoztatott fecskendővel 600 µL steril, izotóniás, pH 7,4-es PBS-t injektáltunk a bronchoalveoláris térbe, majd 1 perc elteltével visszaszívtuk a folyadékot. Összesen háromszor ismételtük ezt meg, és a teljes beinjektált mennyiség átlagosan 81,9 ± 0,7%-át sikerült visszanyerni. A BAL folyadékot (BALF) 700 g-vel centrifugáltuk 10 percig 4ºC-on, majd a felülúszót több részre osztva -80ºC-ra fagyasztottuk a további mérésekig. A sejteket PBS-ben vettük fel, majd a sejtszuszpenzió egy részét azonos mennyiségű 0,4%-os tripánkék festékkel (Sigma, Budapest, Magyarország) kevertük össze. A sejteket Bürker kamrában számoltuk meg, és az összsejtszámot a hígítások figyelembevételével számoltuk ki. A maradék sejtszuszpenziót tovább hígítottuk PBS-sel és citocentrifugával (Hettich-Zentrifugen, Tuttlingen, Németország) tárgylemezre centrifugáltuk a sejteket. A preparátumokat Quick Panoptic (Cypress, Langdorp, Belgium) hematológiai festékkel festettük, és a sejtes összetételt fénymikroszkóp alatt határoztuk meg minimum 300 sejt azonosításával.

4.5. Szövettan A BAL mintavételt követően az állatok mellkasát megnyitottuk, majd óvatosan eltávolítottuk a bal oldali tüdőlebenyeket. A tüdőt fixáló oldatba (4% pufferolt formaldehid, pH 7,4) merítettük, majd 24 óráig fixáltuk. A dehidrálás és paraffinba

42

ágyazás után készített 5 µm vastagságú metszeteket hematoxilin-eosinnal festettünk meg, majd fénymikroszkóp alatt vizsgáltuk.

4.6. RNS szeparálás, koncentrációmérés és minőségellenőrzés Az egerek tüdőszövetéből az RNS-t RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) szeparáló oszlopok, valamint Trizol (Invitrogen) reagens felhasználásával izoláltuk a gyártó utasításai szerint. A kinyert RNS mennyiségét NanoDrop ND-1000 spektrofotométerrel (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) mértük meg, minőségét Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) készülék segítségével határoztuk meg. A továbbiakban csak azokat a mintákat használtuk fel a különböző microarray valamint valós idejű PCR mérésekhez, melyek RNS integritás száma meghaladta a 8,0-as értéket, tiszta gélszerű képet mutattak, nem tartalmaztak DNS kontaminációt, valamint a NanoDrop készüléken mért 260/280 és a 260/230 arányuk nagyobb volt, mint 1,8.

4.7. Génexpressziós microarray mérés A génexpresszió microarray vizsgálatokhoz Agilent Whole Mouse Genome Oligo Microarray 4x44K (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) lemezeket használtunk. 10001000 ng minőségellenőrzött teljes tüdő szövetből származó RNS-ből reverz transzkripciós

reakcióban

Low-input

RNA

Linear

Amplification

Kit

(Agilent

Technologies, Palo Alto, CA) felhasználásával cDNS-t szintetizáltunk olyan oligo-dT primerek alkalmazásával, amelyek a T7 RNS polimeráz enzim promóter szekvenciáját tartalmazták. Ezután egy in-vitro transzkripciós reakcióban a T7 RNS polimerázzal a cDNS molekulákról Cy3 illetve Cy5

fluoreszcens molekulákkal jelölt cRNS-t

készítettünk a gyártó utasításai szerint. Az ovalbuminnal szenzitizált és provokált állatokból származó RNS mintákat (1-es, 2-es valamint 3-as kísérleti csoportok) különkülön Cy5-al, a PBS szenzitizált és provokált kontroll állatokból izolált RNS-t pedig poolozás után Cy3-al jelöltük, és a továbbiakban közös referencia kontrollként használtuk. A jelölt cRNS-t tisztítottuk (RNeasy kit, Qiagen, Valencia, CA), és ezután NanoDrop ND-1000 spektrofotométer készüléken megmértük (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) a festék beépülésének a hatékonyságát, valamint a tisztított cRNS koncentrációját. Azokkal a mintákkal dolgoztunk csak tovább, amelyeknél a 43

festékbeépülési hatékonyság elérte a 9,0 pmol festék / µg cRNS értéket. 825 ng Cy3 illetve Cy5-el jelölt cRNS-t összekevertünk a hibridizációs reakcióhoz szükséges Agilent Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) megfelelő komponenseivel, majd kémiai módszerrel fragmentáltuk a jelölt cRNS molekulákat. A fragmentáció megkönnyíti a jelölt cRNS molekuláknak az array felületén található próbákhoz való kötődését. A fragmentációs reakció leállítását követően a mintákat 65 oCon 17 órán keresztül Whole Mouse Genome Oligo 4x44k microarray lemezekhez hibridizáltattuk. A hibridizáció során a mintákból származó különböző fluoreszcens jelöléssel rendelkező cRNS molekulák versengenek a microarray felületén lévő, velük komplementer 60 nukleotid hosszúságú próbákhoz való kötődésért. A hibridizáció során kialakult Cy5/Cy3 jelintenzitás arány megmutatja, hogy egy adott transzkriptum az egyes mintákban egymáshoz képest milyen mértékben fejeződött ki. Ezután a lemezeket az ózon biztos módszer szerint mostuk Stabilizing and Drying Solution (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) oldat felhasználásával, majd Agilent Microarray Scanner segítségével leolvastuk. A műveletek során alkalmazott összes lépés a gyártó utasításainak megfelelően történt (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, twocolor protocol version 5.6). A

leolvasás során nyert TIFF képeket a Feature Extraction

software version 7.5 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) programmal tömörítettük ki, majd a kapott adatokat a kétszínű oligonukleotid microarray formátumokra javasolt paraméterek alkalmazásával normalizáltuk.

4.8. A microarray adatok statisztikai és bioinformatikai értékelése A microarray adatok további bioinformatikai és statisztikai értékelését a GeneSpring 9.02 program (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) felhasználásával végeztük. A GeneSpring programban a normalizálás és az adatok transzformációja a gyártó által a kétszínű microarray formátumokra javasolt műveletek és paraméterek szerint történt. A kísérleti értelmezés megadása után az expresszálódó transzkriptumok közül a legalább kétszeres up vagy down-regulációt mutató géneket vetettük alá statisztikai elemzésnek a továbbiakban. A különböző kísérleti csoportok között eltérően expresszálódó gének statisztikai értékelését egyutas ANOVA-val végeztük. Tukey- HSD többszörös páronkénti összehasonlítást alkalmaztunk ezután annak a meghatározására,

44

hogy az elérő expressziót mutató gének valójában mely csoportok között mutattak eltérést. A csoportokon belül a kontrollhoz képest

eltérő változást mutató gének

statisztikai értékelését párosítatlan T-próbával végeztük. Ebben az esetben a kétszínű technológiából következően azt vizsgáljuk, hogy a hibridizáció során kialakult Cy5/Cy3 intenzitás arány (log2-es skálán, ha egyformán expresszálódik az adott gén, akkor a hányados 0) szignifikánsan eltér-e a nullától. Mivel a microarray adatok kiértékelésénél a statisztikai próbák során nagyszámú gén esetében tesszük fel a nullhipotézist, feltétlenül szükséges korrekciót használni az álpozitív találatok (úgynevezett első fajú hiba) számának a csökkentésére. Ezért az összehasonlítások során a Benjamini-Hochberg többszörös

hipotézis

korrekciót

használtuk

minden

esetben.

A

statisztikai

összehasonlítások alkalmával a korrigált p értéket 0,05 alatt fogadtuk el szignifikánsnak.

4.9. Gene Ontology elemzés A microarray adatértékelés során kapott eredmények alapján a különbözőképpen expresszálódó géneket génontológiai analízisnek vetettük alá. A Gene OntologyTM (GO) konzorcium adatbázisa a géntermékek

jellemzésének (úgynevezett GO terminusok,

osztályok) ellenőrzött rendszere, melyben tájékoztatást kaphatunk a génekről kifejeződő fehérjék molekuláris funkciójáról, valamint a különböző biológiai folyamatokban való részvételéről. Ezen kívül megtudhatjuk azt is, hogy az adott protein (ha szerkezeti elemről van szó például) milyen celluláris alkotórész kialakításában vesz részt.

A

GeneSpring program GO elemzés modulja azt vizsgálja, hogy egyes GO terminusok a microarray adatfeldolgozás során kapott génlistán belül milyen gyakorisággal fordulnak elő ahhoz a gyakorisághoz képes, amivel a teljes adathalmazon belül előfordulnak. Szemléletesen: vegyünk egy bizonyos GO osztályt, és nevezzük el „G”-nek. Tegyük fel, hogy van egy olyan microarray adatsorunk, amely „n” gént tartalmaz, ebből „m” gén a „G” GO terminusba sorolható. Ezután az adatfeldolgozás során az „n” génből valamilyen statisztikai próba felhasználásával „x” gént szignifikánsan megváltozott expressziójúnak találtunk. Tegyük fel, hogy ebből az „x” génből „y” a „G” GO terminusba tartozik. A kérdés az, hogy vajon van-e valamilyen feldúsulása „G”-nek, vagyis y/x szignifikánsan nagyobb-e, mint m/n. A GeneSpring program a hipergeometrikus eloszlás alapján p értéket számol az említett szignifikancia kifejezésére. A p érték az adott GO terminus

45

relatív fontosságát (az úgynevezett „enrichment score” értékét) jelzi a kiválasztott génlistán belül az összes gént tartalmazó adatsorhoz képes. Természetesen a többszörös összehasonlítások miatt itt is kellett p érték korrekciót alkalmazni. Az elemzéseink során csak azokkal a GO terminusokkal foglalkoztunk, amelyeknek a Benjamini-Yekutelli módszerrel korrigált p értéke kisebb volt, mint 0,01.

4.10. Génkészlet feldúsulási elemzés (Gene Set Enrichment Analysis, GSEA) Génkészlet feldúsulási elemzést (a továbbiakban GSEA) a GSEA v2. 0 program segítségével végeztük (177). A GSEA egy olyan számítógépes módszer, amely megmutatja, hogy vajon egy előzetesen meghatározott génkészlet (úgynevezett gene set) statisztikailag szignifikáns különbséget mutat-e két biológiai állapot között. A hagyományos génexpressziós microarray értékelés során általában valamilyen feltételek és statisztikai próbák alapján választunk ki bizonyos géneket. Sok esetben előfordul, hogy csak néhány gén, vagy legrosszabb esetben egyetlen gén sem halad át az adott szűrőkön. Gondot jelenthet az is, ha az előzőek ellentettje igaz, és túlságosan sok gént kapunk végeredményként, amit utána nehézkes lehet biológiailag értelmezni. A GSEA módszer áthidalja ezeket az analitikai akadályokat azáltal, hogy génkészletre fókuszál egyes gének helyett. A program egy úgynevezett rangsorolt génlistát készít, amelyben a rangsorolás alapja a két összehasonlítandó expressziós adatsor (biológiai csoport, például beteg kontra egészséges minta) közötti különbség. Ezt a különbséget többféle metrika alapján is generálhatjuk, melyek mindössze a szigorúságukban térnek el egymástól. A géneket a csoportok közötti különbségekből származtatott génexpressziós értéküknek megfelelően rangsorolja a program a legnagyobb mértékben up-regulált géntől kezdve a legnagyobb mértékben down-regulált génig.

Az elemzés elsődleges eredménye az

úgynevezett feldúsulási érték (Enrichment Score, ES), amely annak a fokát mutatja meg, hogy egy bizonyos génkészlet (például valamilyen jelátviteli útvonal) génjei egyenlően oszlanak-e el a rangsorolt listán, vagy pedig a rangsorolt lista tetején vagy az alján halmozódnak fel. Az algoritmus lefelé haladva pásztázza a rangsorolt listát, és növeli a futó-összegző statisztikát, ha egy gén eleme egy génkészletnek, és csökkenti, ha nem tartozik bele. Pozitív ES a rangsorolt lista tetején, míg a negatív ES a rangsorolt lista 46

alján jelez génkészlet feldúsulást. Ha több génkészletet tesztelünk egyszerre, szükséges az ES normalizálása, melyet a normalizált feldúsulási érték (Normalized Enrichment Score, NES) fejez ki. Azt, hogy egy adott génkészlet feldúsulása mennyire szignifikáns, a nominális p érték szimbolizálja. Azonban, ha több génkészlet feldúsulását vizsgáljuk egyszerre, mindenképpen szükséges annak a valószínűségnek a becslése, hogy egy adott NES érték mekkora eséllyel álpozitív, tehát csak a véletlen műve, hogy a génkészlet szerepel az eredmények között. Ennek a kifejezésére való az FDR-q érték (False Discovery Rate). Az elemzéseink során csak azokat a génkészleteket vettük figyelembe, melyek a program által javasolt FDR-q és nominális p értékhatárokon belül voltak (nominális p érték≤0,05, FDR-q≤5%). Az elemzéshez olyan génkészlet gyűjteményeket használtunk fel, melyek összesen 639 különböző biológiai folyamatokhoz tartozó géneket tartalmaztak. Ezek a génkészletek három nagy útvonal (pathway) adatbázisból származtak, melyek a következőek voltak: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), Biocarta és a Genmapp online pathway adatbázisok. Ezen kívül saját magunk is generáltunk génkészleteket, melyek feldúsulását szintén vizsgáltuk a microarray adatokon. Hat olyan génkészletet állítottunk össze irodalmi adatok alapján, amelyek különböző típusú tüdőt érintő betegség egér modelljein elvégzett génexpressziós microarray mérésekből származtak. Ezek közé tartoztak különböző bakteriális fertőzés modellek, bleomycin indukált tüdősérülés modell, valamint a Th2-es típusú gyulladással járó asthma modellek. A GSEA elemzések során minden esetben a 3. csoportot hasonlítottuk össze az 1. csoporttal. Pozitív NES a 3. csoporttal, míg negatív NES az 1. csoporttal való korrelációt fejezi ki.

47

4.11. MikroRNS expressziós microarray mérés A mikroRNS expressziós vizsgálatokhoz Agilent Mouse miRNA Microarray 8x15k lemezeket (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) használtunk fel, melyek felületén 567 különböző egér mikroRNS és 10 egér γ-herpesz vírus RNS található. A vizsgálataink során a 3. kísérleti csoport állatainak tüdő mikroRNS mintázatát kívántuk összehasonlítani a PBS-kezelt kontroll állatok tüdő mikroRNS mintázatával. A mikroRNS expressziós rendszer az Agilent génexpressziós microarray rendszeréhez hasonlóan fluoreszcens (jelen esetben egyszínű) Cy3 (Cyanine 3) festékkel jelölt célmolekulákat használ a mikroRNS expresszió detektálására. A minták jelöléséhez és a microarray lemezekhez történő hibridizációjához Agilent miRNA Labeling Reagent and Hybridization kitet (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) használtunk fel. 100ng minőségellenőrzött teljes RNS-t alkalikus foszfatáz (Calf Intestine Alkaline Phosphatase, TaKaRa) segítségével defoszforiláltunk, a defoszforilált RNS-t dimetil-szulfoxiddal (Sigma) denaturáltuk, majd T4 RNS ligáz enzim (Ambion, Austin, TX, USA) alkalmazásával egy Cyanine 3-pCp molekulát kapcsoltunk az RNS 3’ végéhez. Ez esetben minden egyes RNS molekula csak egy Cy3 fluoreszcens molekulával jelölődik. Ezt követően a jelölt mintákat Micro Bio-spin 6 (BioRad) oszlopok felhasználásával tisztítottuk (sótalanítás), vákuum centrifuga segítségével kiszárítottuk, majd DNáz és RNáz mentes desztillált vízben oldottuk fel. A továbbiakban a megjelölt, tisztított mintákat

összekevertük

Agilent

Gene

Expression

Hybridization

Kit

(Agilent

Technologies, Palo Alto, CA) megfelelő reagenseivel, majd microarray lemezekhez hibridizáltattuk 55 oC-on 20 órán át. A minták jelölése és hibridizációja során alkalmazott eljárások mindegyike a gyártó által megadott utasítások szerint történt. A microarray felületén elhelyezkedő próbák specificitását az adott, érett, mintegy 22 nukleotid hosszúságú miRNS-re a 2. ábrán látható megoldás biztosítja. Ezt követően Triton X-102-t tartalmazó mosóoldatok felhasználásával megmostuk a lemezeket, majd Agilent Microarray Scanner segítségével leolvastuk. A leolvasás során nyert TIFF képeket a Feature Extraction software version 9.5 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) programmal analizáltuk, majd a kapott adatok miRNA microarray formátumokra javasolt paraméterek alkalmazásával normalizáltuk.

48

2. ábra. A mikroRNS microarray eljárás során alkalmazott érett miRNS specifikus próbák vázlata. A próba 5’ végéhez kapcsolt hajtű azt biztosítja, hogy az adott mikroRNS prekurzor molekula ne tudjon a próbához kapcsolódni, csakis a rövid szekvenciájú érett forma kötődhessen be. A kapcsolat stabilitását fokozza a próba 5’ végéhez kapcsolt G nukleotid, mely a minta jelölése során beépített 3’ citozinnal fog kapcsolódni.

4.12. A mikroRNS microarray adatok bioinformatikai értékelése A mikroRNS microarray adatok további bioinformatikai és statisztikai értékelését, hasonlóan a génexpressziós adatokhoz, a GeneSpring 9.02 software (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) felhasználásával végeztük. A GeneSpring programban a normalizálás és az adatok transzformációja a gyártó által a miRNS microarray formátumokra javasolt műveletek és paraméterek szerint történt. A kísérleti értelmezés megadása után az expresszálódó mikroRNS-ek közül a legalább kétszeres up vagy downregulációt mutató mikroRNS-eket vetettük alá statisztikai elemzésnek a továbbiakban. A kontrollhoz képest

eltérő változás mutató mikroRNS-ek statisztikai értékelését

párosítatlan T-próbával végeztük Benjamini-Hochberg többszörös hipotézis korrekcióval. A statisztikai összehasonlítások alkalmával a korrigált p értéket 0,05 alatt fogadtuk el szignifikánsnak.

4.13. Reverz transzkripció

és mRNS expresszió mérés TaqMan

valósidejű PCR módszerrel 1 µg teljes RNS-ből kiindulva reverz transzkripciós reakcióban 1U MuLV reverz transzkriptáz enzim (Applied Biosystems, Foster City,CA), random hexamer primerek (Promega, Madison, WI), ), 5mM MgCl2, 1mM dNTP, valamint RNasin RN-áz gátló (Promega) felhasználásával 40 µl végtérfogatban cDNS-t szintetizáltunk 42 oC-on, 55 percen keresztül. Ezután az MuLV enzimet 5 perc alatt 95 oC-on inaktiváltuk. A valósidejű PCR reakciókat ABIPrism 7000 készüléken végeztük a gyártó utasításai szerint (Applied Biosystems, Foster City, CA) 1,5µl cDNS/well felhasználásával 25 µl-es végtérfogatban. A mérések során a HGPRT1 génjét használtuk háztartási kontrollnak. A 49

HGPRT-hez normalizált szignálértékeket az összehasonlító Ct (delta CT) módszer felhasználásával határoztuk meg. Az alkalmazott Taqman génexpressziós assay-k a 2. táblázatban láthatóak.

Mouse Pon1

Assay azonosító szám Mm01131704_m1

Mouse Chia

Mm00458221_m1

Mouse Clca3

Mm00489959_m1

Mouse Hprt1

Mm00446968_m1

Gén szimbólum

2. táblázat. Az mRNS expressziós mérések során alkalmazott Taqman assay-k

4.14. mikroRNS expresszió mérés TaqMan valósidejű PCR módszerrel A mikroRNS-ek expressziójának mennyiségi meghatározását TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems, Foster City, CA) felhasználásával kétlépéses RT-PCR reakcióval végeztük a gyártó utasításainak megfelelően. Az első lépésben 10 ng minőségellenőrzött, teljes RNS-ből speciális, hurkolt szerkezetű miRNS primerek alkalmazásával cDNS-t állítottunk elő a teljes RNS-ből TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) segítségével, amely a következő összetevőket tartalmazta: 100 mM dNTP (dTTP-vel), 50 U/µL MultiScribe™ reverz transzkriptáz, 10x-es reverz traszkripciós puffer, 20U/µL RN-áz gátló, nukleáz mentes víz. A reakció során alkalmazott inkubációs idők és hőmérsékletek a következők voltak: 16 ◦C 30 perc, 42 ◦C 30 perc, 85 ◦C 5 perc. Ezt követően a második lépésben valós idejű PCR amplifikáció történik TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) valamint adott mikroRNS specifikus primerek alkalmazásával azokra a cDNS molekulákra, amelyek a vizsgálni kívánt mikroRNS-t képviselik. A mérések során belső kontrollként speciális snoRNS-eket használtunk. Az értékelés során az alkalmazott belső kontrollokhoz viszonyított relatív expressziót határoztuk meg a már említett összehasonlító Ct (delta CT) módszer felhasználásával.

50

4.15. Immunhisztokémiai analízis A formalin fixált, paraffinba ágyazott egér tüdőszövetet mikrotómmal 5µm-es szeletekre vágtuk, majd SuperFrost lemezekre helyeztük rá. A mintákat ezután deparaffináltuk, és immunhisztokémiai analízist hajtottunk végre Biogenex i6000 automatizált rendszer segítségével (BioGenex Laboratories, San Ramon, CA, USA) a gyártó utasításainak megfelelően. A nyúlban előállított anti-PON-1 elsődleges antitestet (Sigma-Aldrich, törzsoldat koncetrációja 1mg/ml) 1:200 arányú hígításban 5 µg/ml-es végkoncetrációban használtuk. Az automatizált immunhisztokémiai jelölést és festést SS Non-Biotin Polymer HRP/DAB Detection Kit (BioGenex Laboratories, San Ramon, CA, USA) felhasználásával végeztük a gyártó utasításainak megfelelően. A tárgylemezeket PBS-ben, majd desztillált vízben tisztított fedőlemezekkel Hyper-mount (Shandon Inc., Pittsburgh, PA, USA) segítségével fedtük le. Az immunfestődés mértékét Nikon Eclipse E600 microscope (Nikon Spot Advanced Program, Nikon, Tokyo, Japan) mikroszkóppal vizsgáltuk. Minden negatív kontroll (nyúlszérum szekunder ellenanyaggal, elsődleges antitest

nélkül)

elhanyagolható

mértékű

hátteret

mutatott.

A

jel

intenzitását

denzitometriás módszerrel határoztuk meg lemezenként 10x-es nagyítás mellett három véletlenszerűen kiválasztott területet megmérésével az NIH Image program (Scion, Frederick, MD, USA) segítségével. A statisztikai értékelést 1-utas varianciaanalízis alkalmazása után Tukey- HSD többszörös páronkénti összehasonlítás felhasználásával végeztük. Reprezentatív célokra 20x-os nagyítással készítettünk felvételeket.

4.16. A paraoxonáz-1 ellenes antitest specificitásának meghatározása Western blot módszerrel A fehérje izoláláshoz az egyes kísérleti csoportokhoz tartozó egerekből a tüdőlebenyeket a következő összetételű pufferoldatban homogenizáltuk: 10 mmol/L TrisHCl (pH8.0, Sigma-Aldrich) 10 mg/mL leupeptin, 0.5 mmol/L EGTA, 2% NaF, 1% Triton X-100, 25 mmol/L fenil-metilszulfonil- fluorid, és 2% Na-ortovanadát. A szövettörmeléket centrifugálással eltávolítottuk, majd a fehérjeoldat koncentrációját Bradford módszerrel meghatároztuk. 10 µg fehérjét tartalmazó oldatot 4x-es töménységű treatment pufferrel kezeltünk, majd a mintákat 5 percen kereszül 100 ºC-on hővel denaturáltuk, jégen 3 perc alatt lehűtöttük, végül előre gyártott 10%-os poliakrilamid 51

gélekre (Ready Gel, Bio-Rad) vittük fel és 35 mA-on másfél órán keresztül futattuk. A géleket polivinilidén-diflourid membránra (Bio-Rad) blottoltuk át a gyártó utasításainak megfelelően. Ezt követően 5% tejport tartalmazó blokkoló oldat felhasználásával blokkoltuk, majd pedig nyúlban előállított anti-humán PON1 ellenes elsődleges antitesttel (Sigma-Aldrich, prediktált egér PON1 specificitású) inkubáltuk egy órán keresztül, majd friss mosóoldattal mostuk hatszor 5 percen át. Az elsődleges antitestet friss blokkoló oldatban 1:1000 hígításban használtuk 1µg/ml-es végkoncetrációban. A mosási lépések után ablot membránt friss blokkoló oldatban 1:10000 hígításban használt kecskében előállított torma-peroxidázzal konjugált anti-nyúl IgG szekunder ellenanyaggal (SigmaAldrich) inkubáltuk egy órán át, majd ismét mostuk hatszor 5 percen keresztül. Az immunreakció során kialakult sávokat ECL Plus Western blotting detektáló rendszer (GE Healthcare-Amersham) segítségével detektáltuk.

4.17. A humán vizsgálatokba bevont személyek jellemzői A PON1 génjének -108 T/C és Q192R polimorfizmusainak genotipizálását 302 asthmás (170 fiú, 132 lány; életkor 3-18 év, átlag 10,1 év, SD: 3,9) és 188 kontroll egészséges (99 fiú, 89 lány; életkor 3-18 év; átlag 11,1 év, SD: 4,2) végeztük el. A TNFα -308A polimorfizmusának genotipizálását pedig 144 asthmás (80 fiú, 64 lány, életkor 318 év; átlag 10,4 év, SD: 4,3) és 174 kontroll egészséges gyermek (95 fiú, 79 lány, életkor 3-18 év, átlag 11,5 év, SD: 4,3) esetében végeztük el. Az asthmás gyermekek a Budai Gyermekkórház Allergológiai szakambulanciáján jelentkeztek. Mindegyik gyermeknek szakorvos által diagnosztizált asthmája volt, melyet az alábbiak jellemeztek: (1) visszatérő, kezelést igénylő légszomj és kilégzési nehezítettség (dyspnoe); (2) orvos által diagnosztizált fulladás/fulladásos roham sípoló légzéssel; (3) bronchodilatátor kezelés hatására reverzibilis fulladás (sípoló légzés) és dyspnoe, melyet a FEV1 (1 másodperc alatti forszírozott kilégzési levegőtérfogat) segítségével határoztak meg (Piston). Az asthmás gyermekeket (vagy szüleiket) megtanították arra, hogy pontosan jegyezzék föl két héten keresztül tüneteiket és kezelésüket, valamint egy nap kétszer (este és reggel) mérjék meg PEF (kilégzési csúcsáramlás) értékeiket. Az 5-évesnél fiatalabb gyermekeknél – akiknél általában nem volt lehetséges se a PEV, se a FEV1 mérése – a betegség diagnózisát (és klasszifikálását) az egyéb tünetek alapján végezték el. A kontroll

52

gyermekeket véletlenszerűen választottuk ki a Budai Gyermekkórház Ortopédiai Osztályáról. Mindegyik gyermek Budapestről származott és a kaukázusi magyar populációhoz tartozott. Minden egyes vizsgálathoz rendelkeztünk szülői engedéllyel, a kutatást a Budai Gyermekkórház Etikai Bizottsága engedélyezte, és mindenben megfelelt a Helsinki Deklarátumban megfogalmazott alapelveknek. A szérum paraoxonáz és arilészteráz aktivitások mérését nyolc kórházi kezelésre szoruló asthmás felnőtt beteg esetében (3 férfi és 5 nő;: átlag életkor 54,5, SD±14,3) végeztük el különböző időpontokban. Az első vérvétel (0. nap) a beteg súlyos asthma exacerbátiókkal való kórházba kerülésekor történt, az ilyen esetekben alkalmazott iv. methylprednisolon kezelés megkezdése előtt. A második vérvételi időpont az alkalmazott gyógyszer iv. adagolásról orális adagolásra történő átállásakor (4. nap), a harmadik időpont pedig a kezelés végén (10. nap), a beteg asthma tüneteinek enyhülése után, a kórházból való eltávozáskor történt.

4.18. Genomiális DNS szeparálás Humán molekuláris genetikai vizsgálataink során a genomiális DNS-t a perifériás vérből származó mononukleáris sejtekből Qiagen DNA Blood Mini kit (Qiagen GmbH, Germany, Hilden) segítségével izoláltuk a gyártó utasításainak megfelelően.

4.19.

A

PON1

gén

-108C/T

polimorfizmusának

(rs705379)

genotipizálása 5’ nukleáz TaqMan allélspecifikus PCR módszerrel A PON1 gén -108C/T egypontos nukleotid polimorfizmusát TaqMan 5’ nukleáz allélspecifikus PCR módszerrel határoztuk

meg

(az assay katalógus száma:

C_11708905_10). A TaqMan PCR reakcióhoz szükséges összes komponenst az Applied Biosystems-től (Foster City, CA) származott. A reakcióelegy kb. 10-50 ng genomiális DNS mintát, 200 nM TaqMan próbát, 900 nM forward és reverse primer párt, 1x végkoncentrációban PCR „master mixet” tartalmazott. A műveletek során alkalmazott összes lépés a gyártó utasításainak megfelelően történt

53

4.20. A PON1 gén Q192R polimorfizmusának (rs662) genotipizálása egybázisos primer extenziós módszer felhasználásával Beckman SNPstream Genotyping rendszeren A PON1 gén által kódolt enzim aktív centrumának működését befolyásoló Q192R polimorfizmusát egybázisos primer extenziós módszer segítségével határoztuk meg Beckman SNPstream Genotyping rendszeren (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) a következő primerek alkalmazásával : PCRU: ATG TTT TAA TTG CAG TTT GAA TGA; PCRL: TAG ACA ACA TAC GAC CAC GCT; SNPU: GGC TAT GAT TCG CAA TGC TTC ACT ATT TTC TTG ACC CCT ACT TAC. A műveletek során alkalmazott összes lépés a gyártó utasításainak megfelelően történt.

4.21. A TNF-α -308A promóter polimorfizmus genotipizálása PCRRFLP módszerrel A

TNF-α

-308A

promóter

egypontos

nukleotid

polimorfizmusának

meghatározásához PCR-RFLP módszert alkalmaztunk, melynek paramétereit a 3. táblázat tartalmazza. A hasítás során kapott termékeket hagyományos gélelektroforézis segítségével választottuk szét, amelyhez 1 µg/ml etidium-bromidot tartalmazó, 4%-os töménységű

agaróz

fragmentumokat

gélt

használtunk

UV-fénnyel

fel.

megvilágítva,

eszközzel detektáltuk.

54

Végül KODAK

a

szétválasztott DC290

DNS-EtBr

géldokumentációs

SNP

TNFA -308 G/A

Szekvencia specifikus

5’-ATCTGGAGGAAGCGGTAGTG-3’

primerek

5’-AATAGGTTTTGAGGGCCATG-3’ 20 ng/µl DNS templát, 200 µM dNTP, 1.5 µM primer, 50 mM

PCR elegy összetétele

KCl, 2mM MgCl2, 10 mM Tris/HCl, 0,025 U/µl Taq DNS polimeráz (Promega) I. denaturáció 94ºC-on 15 perc II. 35 ciklus 1. denaturáció 95ºC-on 10 mp

Polimeráz láncreakció

2. primer bekötődés 57 ºC-on 30 mp 3. lánchosszabbítás 72 ºC-on 30 mp III. végső lánchosszabbítás 72 ºC-on 5 perc

Restrikciós endonukleáz enzim Restrikciós fragmentumok

3.

táblázat.

TNF-α

NcoI (Fermentas) inkubáció 37 ºC-on hasító helye: 5’-C^CATGG-3’ G allél: 220 bp A allél: 202+18 bp

-308A

promóter

egypontos

nukleotid

polimorfizmusának

meghatározásához használt PCR-RFLP módszer paraméterei

4.22. Paraoxonáz aktivitás meghatározása A

szérum

paraoxonáz

aktivitás

mérésekor

paraoxont

(O,O-dietil-O-p-

nintrofenilfoszfát; Sigma) alkalmaztunk szubsztátként, ami a szérumban levő paraoxonáz hatására 4-nitrofenollá alakul, abszorbciónövekedést okozva 412 nm-en. Méréskor 50 µl szérumhoz 1ml TRIS/HCL puffert (100 mmol/l, pH: 8) adtunk, mely 2 mmol/l CaCl2-t és 5,5 mmol/l paraoxont tartalmazott. A 4-nitrofenol keletkezését 412 nm-en 25 C0-on követtük Hewlett-Packard 8453 UV-Visible spektrofotométerrel. Az enzimaktivitás számolása a moláris extinkciós koefficiens (17100 M-1cm-1) segítségével történt. 1 U a paraoxonáz aktivitás, ha az enzim 1 perc alatt 1 nmol 4-nitrofenolt állít elő a szubsztátból a fent leírt kísérleti körülmények mellett.

55

4.23. Arilészteráz aktivitás meghatározása Az arilészteráz aktivitás meghatározása fenilacetát szubszrát hidrolízisével, spektrofotometriás módszerrel történt. A reakcióelegy 1 mM fenilacetátot tartalmazott 20 mM-os Tris-HCl (pH=8,0) pufferben. A reakciót a szérum hozzáadásával indítottuk, majd a 270 nm-en bekövetkező abszorbancianövekedést mértük. Az enzimaktivitás számolása a moláris extinkciós koefficiens (1310 M-1cm-1) segítségével történt.

Az

enzimaktivitást U/ml egységben fejeztük ki. 1 U az arilészteráz aktivitás, ha az enzim 1 perc alatt 1µmol fenilacetátot hidrolizál.

4.24. Chlamydophila pneumoniae specifikus IgG és IgA antitestek meghatározása A Chlamydophila p. specifikus antitestek meghatározás szérumból történt Sero CP-IgA, IgG protein ELISA kitek (Savyon Diagnostic Ltd.) segítségével a gyártó utasításai szerint. A kórokozóra pozitívnak az 1,1-es értékhatár (cut-off index, COI) feletti szérumokat tekintettük.

4.25. Teljes és specifikus szérum IgE szintek meghatározása A szérum teljes, valamint több mint 100 allergénre specifikus IgE szintjét Pharmacia CAP System műszerrel határoztuk meg. A teljes IgE szintet akkor vettük kórosan magasnak, ha meghaladta a 100 kU/L-t. Az allergén specifikus IgE-t 0,35 kU/L-t meghaladva vettük pozitívnak.

4.26. Statisztikai módszerek A statisztikai elemzésekhez a Microsoft Excel és a Statistica 7.0 programokat használtuk. T-próbát, egyutas és kétutas ANOVA-t és Tukey-HSD többszörös páronkénti összehasonlítást alkalmaztunk a kiértékelendő adatoktól függően. Genotípus vizsgálataink során az allélfrekvenciákat allélszámolással határoztuk meg. Ezeket az adatokat a MedCalc 5.0, SPSS 11.0 valamint az Arlequin 1.1 programok segítségével analizáltuk. A Hardy-Weinberg

egyensúlyt χ2 goodness-of-fit teszt

segítségével ellenőriztük. χ2 tesztet használtunk annak a megállapítására, hogy az

56

alléleloszlás tekintetében van-e különbség a két vizsgálati csoport között. A konfidencia intervallumokat 95%-nál adtuk meg. Korábban kimutatták, hogy a Chlamydophila p. fertőzésre adott immunválasz alakulásában lényeges szerepet játszik a fertőzött egyén neme, valamint az életkor, különösen gyermekkorban. E két zavaró tényező hatásának minimalizálása céljából az eredményeinket életkor és nem szerinti többszörös logisztikus regressziós analízisnek vetettük alá. A TNF-α -308A genotipizálása során a többszörös hipotézis tesztelést figyelembe véve Bonferroni korrekciót alkalmaztunk, és csak azokat az eredményeket tekintettük szignifikánsnak, ahol korrekcióval megállapított p érték kisebb volt, mint 5,6 x 10-3.

57

5. Kutatási eredmények A továbbiakban az értekezés alapját képező funkcionális genomikai és genotípuskörnyezet interakciós vizsgálataink eredményeit két külön alfejezetben (5.1 és 5.2) ismertetem.

5.1. Az allergiás asthma pathomechanizmusában valószínűleg szerepet játszó PON1 gén azonosítása génexpressziós microarray technológia segítségével ovalbumin-indukált allergiás asthma egér modellen 5.1.1. Légúti gyulladás A BALF mennyiségi és minőségi sejtösszetételére vonatkozó eredmények a 3. ábrán láthatóak. A 28. napon, 4 órával az első OVA inhalációt követően feldolgozott első, korai kísérleti csoport állatainál jelentős mértékben megemelkedett a BALF neutrofil sejtszáma. Ez a kezdeti neutrofil gyulladás a továbbiakban csökkenő tendenciát mutatott, és szinte teljesen megszűnt a kísérleti protokoll végső időpontjában (24 órával az utolsó OVA inhalációt követően) feldolgozott harmadik csoportban. Ezzel ellentétben a második (4 órával a harmadik OVA inhalációt követően) és a harmadik csoportban (24 órával a harmadik OVA inhalációt követően) nagymértékű BALF eozinofil granulocita sejtszám emelkedést tapasztaltunk, míg az első csoport esetében eozinofilok gyakorlatilag nem voltak kimutathatóak a BALF-ban. A BALF makrofág és összsejtszám értékek mindhárom csoport esetében emelkedettek voltak a placebo kontrollokhoz képest, a legnagyobb mértékű összsejtszám emelkedés a második és a 3. csoportban fordult elő. A kontroll BALF-ban sem neutrofil, sem pedig eozinofil sejtek nem voltak kimutathatóak. A kísérleti protokoll 31. napján, 24 órával az utolsó OVA inhalációt követően a harmadik csoport állatainál inhalált methacholin hatására a placebo kontroll állatokhoz képest súlyos LHR alakult ki (4. ábra). Ezzel bizonyítottuk a LHR kialakulását az általunk alkalmazott kísérletesen OVA-val indukált allergiás asthma modellrendszeren. A tüdőszövettani vizsgálatok alapján jelentős mértékű perivascularis és peribronchialis eosinophil infiltráció figyelhető meg a második csoport esetében, és ez a 58

jelenség még kifejezettebbé válik a harmadik csoportnál. Ezzel szemben az allergizálás korai stádiumában lévő első csoport állatainak tüdőszövettani képe gyakorlatilag nem különbözik

a

placebo

kontrollokétól,

a

későbbi

csoportokban

megfigyelhető

perivasculáris és peribronchiális eozinofil infiltráció nem alakul ki (5. ábra).

3. ábra. Az egér BALF mennyiségi és minőségi sejtösszetétele az OVA allergén provokációt követő különböző időpontokban a PBS placebo belélegeztetett kontroll állatokhoz képest. Egyutas ANOVA után Tukey-féle többszörös páronként összehasonlítást alkalmaztunk a különböző csoportok kontrollokkal történő hasonlításához. *P<0,05; **P<0,001 (n=6/csoport). 4. ábra. A szakaszos OVA inhaláció hatása az LHR-re (a tüdőellenállás – RL – változásra). OVA-val szemben érzékenyített állatokban 24 órával az utolsó allergén inhaláció után súlyos LHR alakul ki a placebo PBS-el érzékenyített és belélegeztetett kontroll állatokhoz képes. * P<0,05 OVAprovokált 3. csoport vs. kontroll (n=6/csoport).

59

A.

B.

C.

D.

5. ábra. Reprezentatív szövettani felvételek. A kontroll (A) és az első csoportban (B) nem jött létre jelentős szövettani elváltozás. Az allergizálás hatására a későbbi második (C), valamint harmadik csoport (D) esetében kiterjedt peribronchiális és perivasculáris eozinofi (az ábrán nyillal jelölve)- és kereksejtes beszűrődés alakult ki.

60

5.1.2. Génexpressziós microarray elemzés A kísérletesen előidézett allergiás asthma modell különböző progressziós stádiumain (az első allergén inhaláció után 4 órával, illetve harmadik allergén inhaláció után 4 valamint 24 órával) alkalmazott microarray vizsgálat rendkívül intenzív tüdőszöveti génexpressziós változásokra derített fényt. Az első, második, valamint a harmadik csoportban, külön-külön 533, 1554 illetve 1134 transzkriptum mutatott legalább kétszeres, statisztikailag szignifikáns növekedést illetve csökkenést a kontrollhoz képes. Mintegy 861 transzkriptum regulálódott legalább kétszeres mértékben különbözően az egyes kísérleti csoportok között. Az 6. ábrán látható, a microarray adatokon elvégzett Self Organizing Map clusterelemzés egyértelműen kimutatta az első (az allergénre adott korai választ képviselő) csoport génexpressziós mintázatának határozott elkülönülését a második és a harmadik csoporttól. A korábban a légúti gyulladás alfejezetben már ismertetett, az első csoportban megfigyelt

kezdeti

erőteljes

neutrophil

infiltrációval

összhangban

e

csoport

génexpressziós mintázata leginkább akut, nem atópiás gyulladásos és kemotaktikus válaszban

közreműködő

géneket

tartalmaz.

Ezek

között

számos

olyan

proinflammatorikus gén expressziója emelkedett meg jelentős mértékben, mely a neutrofil gyulladás kialakításában (TNF, CXCL1, CXCL2, IL6), valamint a makrofágok kemotaxisában (CCL2, CCL7) játszik fontos szerepet. Érdekes módon az asthmatikus progresszió későbbi szakaszát képviselő csoportok (második és harmadik csoport) egymáshoz nagymértékben hasonló génexpressziós jelleggel rendelkeztek. A harmadik csoport (mely a kialakult, kísérletesen előidézett OVA indukált allergiás asthmát jelképezi) esetében kapott génexpressziós eredmények között számos, nemrég azonosított „asthma gén” (ARG1, CHIA, TFF2, CLCA3) expressziójának erőteljes növekedését figyeltük meg.

61

6. ábra. A microarray adatokon elvégzett Self Organizing Map cluster-elemzés. A színtónus a gének expressziójának mértékét szimbolizálja, a skála log2-es alapú. Jól látható az allergénre adott korai választ képviselő csoport génexpressziós mintázatának határozott elkülönülése a második és a harmadik csoporttól.

62

5.1.3. Kiválasztott gének expressziójának validálása TaqMan valósidejű PCR módszerrel A microarray adatok statisztikai elemzése után három kiválasztott gén expresszióját mértük vissza TaqMan valósidejű PCR módszerrel. Amint az a 7. ábráról kitűnik, a microarray által mért értékek tökéletesen hasonló génexpressziós változásokat mutattak a legnagyobb mértékben emelkedett expressziójú CLCA3, a legnagyobb mértékben lecsökkent PON1, valamint a CHIA gének esetében, bizonyítva ezzel az általunk kapott microarray eredmények megbízhatóságát.

7.

ábra.

Három

expressziójának

kiválasztott

validálása

gén

TaqMan

valósidejű PCR módszerrel. Az ábrán az adott gének expresszióinak valósidejű PCR és microarray rendszeren mért értékeinek összehasonlítása látható. Az expressziós mintákban

változásokat mért

a

kontroll

expressziós

átlagára vonatkoztatva fejeztük ki.

63

értékek

5.1.4. Gene Ontology elemzés A microarray adatértékelés során kapott eredmények alapján a különbözőképpen expresszálódó géneket tartalmazó listákon génontológiai elemzést hajtottunk végre. Az elemzés célja az volt, hogy statisztikailag szignifikánsan (p<0,01) felülreprezentált géncsaládokat találjunk az egyes kísérleti csoportokban. A különböző csoportokban legfigyelemreméltóbb mértékben feldúsult géncsaládokról a 8. ábra nyújt bővebb tájékoztatást. Amint az várható volt, az immun és gyulladásos válaszhoz, valamint a citokin és kemokin működéshez kapcsolódó géncsaládok elemei minden egyes vizsgálati csoportban nagymértékben indukálódtak a kontrollhoz képest. Az akut gyulladásos válaszhoz, valamint a szerin típusú endopeptidáz inhibitor aktivitáshoz tartozó gének kizárólagosan a korai allergén provokációra adott választ képviselő első csoportban dúsultak fel. Ezzel ellentétben a humorális immunválaszt, fagocitózist, mitózist és sejtciklust szabályozó géncsaládok elemei az előrehaladott állapotban lévő és a kialakult allergén indukált asthmát képviselő második és harmadik csoportban mutattak feldúsulást. 5.1.5. Gene Set Enrichment elemzés (GSEA) A hagyományos génexpressziós adatértékelési munkafolyamatok elsősorban statisztikailag különbözőképpen regulálódó gének felismerésére helyezik a hangsúlyt, mely esetleg számos, valamilyen betegséghez, illetve fenotípushoz szorosan kapcsolódó gén figyelmen kívül hagyásához vezethet. Emiatt a microarray kísérletekből származó adathalmazok kiterjedtebb elemzése gyakran más, alternatív statisztikai módszerek alkalmazását követeli meg, különösképpen olyan esetekben, amikor a különbözőképpen regulálódó gének száma túl alacsony vagy túl magas, mely nehézkessé teszi a biológiailag helytálló következtetések levonását. A GSEA eljárás képes a fent említett akadályok áthidalására azzal, hogy különálló gének helyett génkészletekre (gene set) helyezi a hangsúlyt. Azt a feltételezést vizsgálja, hogy vajon egy előzetesen meghatározott génkészlet (például valamilyen biológiai jelátviteli útvonal) elemei statisztikailag szignifikánsan feldúsulnak-e (enrichment) a két összehasonlítandó vizsgálati csoport génexpressziós eredményei alapján létrehozott rangsorolt génlistán. 64

A GSEA elemzések során előre meghatározott biológiai útvonalakat képviselő génkészleteket használtunk fel. Ezen kívül, irodalmi adatok alapján összeállítottunk hat génkészletet is, amelyek elemei különböző típusú tüdőt érintő betegség egér modelljein elvégzett génexpressziós microarray mérésekből származtak. Ezek közé tartoztak különböző bakteriális fertőzések modellek, bleomycin indukált tüdősérülés modell, valamint a Th2-es típusú gyulladással járó asthma modellek. A GSEA elemzések során ezeket a génkészleteket társítottuk az alkalmazott OVA-indukált asthma modell különböző progressziós állapotaihoz. Minden esetben a korai választ képviselő első csoportot hasonlítottuk össze a kialakult asthmaszerű fenotípust mutató harmadik csoporttal. Az elemzéseink során csak azokat a génkészleteket vettük figyelembe, melyek a program által javasolt FDR-q és nominális p értékhatárokon belül voltak (nominális p érték≤0,05 FDR-q≤5%). Ezek az értékhatárok elég szigorúak ahhoz, hogy képesek legyünk a biológiailag helytálló génkészletek azonosítására. A GSEA elemzés során kapott legszignifikánsabb génkészletek eredményei a 9. ábrán láthatóak. A citokin és IL1 receptor jelátvitelhez kapcsolódó génkészletek egyértelműen csak az első csoporttal mutattak korrelációt. Ezzel szemben a T sejt receptor jelátvitelhez, sejtciklushoz, T helper és citotoxikus sejtekhez kapcsolódó útvonalak génkészletei viszont a harmadik csoporttal korreláltak. Érdekes eredmény, hogy azon génkészlet, mely a különböző neutrofil és makrofág infiltrációval járó, bakteriális fertőzésekhez köthető génexpressziós változásokat képviselte, kizárólagosan az allergénre adott korai választ modellező első csoporttal korrelált, mégpedig az összes génkészlet közül a legerősebb mértékben. Ezzel ellentétben azok a génkészletek, melyek a különböző, eozinofil infiltrációval és Th2-es citokin termeléssel járó modellekhez kapcsolódtak, kizárólagosan csak a harmadik csoporttal korreláltak, szintén a legerősebb mértékben. Az eredmények alapján elmondhatjuk, hogy a GSEA elemzések által kapott adatok nagy léptékű génexpressziós szinten is igazolták az általunk alkalmazott allergiás asthma modellrendszer helyességét. Ezen kívül sikerült biológiailag helytálló következtetéseket levonni a microarray vizsgálatok során kapott rendkívül bőséges adathalmazból.

65

8. ábra. Gene Ontology elemzés, mely a különböző csoportokban statisztikailag szignifikánsan (p<0,01)

felülreprezentált

géncsaládokat

ábrázolja. A -log10 (p érték) érték az adott GO kategória relatív fontosságát jelzi a kiválasztott génlistán belül az összes gént tartalmazó adatsorhoz képes. A sötétebb szín az adott ontológiai kategória magasabb szintű

szignifikáns

jelöli

egy

66

adott

felülreprezentációját csoporton

belül.

9.ábra. GSEA analízis. Az ábrán látható pozitív

NES-el

rendelkező

génkészletek (sárga és rózsaszínű) a kialakult allergén indukált asthmát képviselő harmadik csoporttal, míg a negatív

NES-el

rendelkező

génkészletek az allergénre adott korai

választ

csoporttal

modellező

mutatnak

szignifikáns

első

erőteljesen

korrelációt.

Az

elemzéseink során csak azokat a génkészleteket

vettük

figyelembe,

melyek a program által javasolt FDR-q

és

nominális

értékhatárokon

p

belül

voltak

érték≤0,05

FDR-

(nominális

p

q≤5%).

NES:

Normalised

Enrichment Score; NOM: nominal p value; FDR: False Discovery Rate

67

5.1.6. mikroRNS expressziós microarray elemzés A vizsgálataink során az allergénnel előidézett asthma kialakulása folyamán a tüdőben lezajló génexpressziós változások felderítése mellett célunk volt az említett folyamatot

kísérő

mikroRNS

szintek

változásának

monitorozása

is.

Ennek

meghatározásához mikroRNS expressziós microarray mérést végeztünk, mely során a harmadik

kísérleti

csoport

állatainak

tüdő

mikroRNS

mintázatát

kívántuk

összehasonlítani a PBS ingerelt kontroll állatok tüdő mikroRNS mintázatával. A microarray elemzés során tíz mikroRNS (miR-135b, miR-139-3p, miR-155, miR-21, miR-21*, miR-449a, miR-449c, miR-582-3p, miR-689, miR-711) mutatott legalább kétszeres mértékben megnövekedett, statisztikailag szignifikánsan eltérő expressziót a placebo kontrollhoz képes. 5.1.7. Kiválasztott mikroRNS-ek expressziójának validálása TaqMan valósidejű PCR módszerrel A mikroRNS microarray eredmények alapján három kiválasztott mikroRNS - a miR-155és a miR-21 ésa miR-135b – expressziójának validálását végeztük el TaqMan valós-idejű PCR módszerrel. Választásunk azért esett ezekre, mivel a kapott szignifikánsan változott mikroRNS-ek közül kizárólag ezek szerepével kapcsolatban volt hiteles szakirodalmi adat. Amint az a 10. ábráról kitűnik, a microarray által mért értékek tökéletesen hasonló expressziós változásokat mutattak a három kiválasztott mikroRNS esetében, bizonyítva ezzel az általunk kapott microarray eredmények megbízhatóságát. A valósidejű mikroRNS expressziós mérések során mindhárom vizsgálati csoportban megmértük a kiválasztott mikroRNS-ek expresszióját.

68

10. ábra. A három kíválasztott mikroRNS (miR-21, miR-135b, miR-155) expressziójának validálása TaqMan valósidejű PCR módszerrel. Az ábrán az adott mikroRNS gének expresszióinak

valós-idejű

PCR

és

microarray

rendszeren

mért

értékeinek

összehasonlítása látható. Az expressziós változásokat a kontroll mintákban mért expressziós értékek átlagára vonatkoztatva fejeztük ki.

69

5.1.8. A PON1 fehérje szintje erősen csökkent az allergiás gyulladásban szenvedő egerek tüdejében Rendkívül érdekes felfedezés volt számunkra, amikor a legnagyobb mértékben csökkent expressziójú gének között azonosítottuk a paraoxonáz 1-et (PON1). A paraoxonáz 1 egy HDL kapcsolt laktonáz, melynek számos antioxidáns hatása ismert. Az oxidációs-redukciós (redox) rendszer egyensúlyának a fenntartása rendkívül fontos a tüdő oxidatív stressz elleni védekező mechanizmusában. Az asthmában szenvedő betegek légútjaiban emelkedett a gyulladásos sejtek – elsősorban az eozinofilek – száma, melyek a különböző erősen reaktív oxigén és nitrogén szabadgyökök elsődleges forrásai. Az oxidatív stressz fontos szerepet játszik az asthma kialakulásában, ezért egy, az oxidatív stressz ellen védő szerepű enzim nagymértékű csökkenése arra ösztönzött bennünket, hogy a továbbiakban részletesebben foglalkozzunk a PON1-el. Először arra voltunk kíváncsiak, hogy a microarray, valamint a valósidejű PCR mérés szerint is jelentős mértékben csökkent PON1 mRNS szint mellett valóban csökkent-e a kódolt fehérje szintje is (ez ugyanis nem minden esetben igaz). Immunhisztokémiai vizsgálattal sikeresen kimutattuk, hogy a PON1 fehérje szintje ténylegesen csökkent (11. ábra A és B) az előrehaladott allergiás asthmát modellező második és harmadik csoport egereinek a tüdejében a kontroll egerekhez képest. Érdekes módon, a tüdőben elsősorban a nem csillós bronchiális epitél sejtek (Clara sejtek) és az I. típusú pneumociták mutattak PON1 pozitivitást. Az immunohisztokémiai vizsgálat során alkalmazott PON1 kimutatására használt ellenanyag specifitását Western-blot módszerrel igazoltuk (11. ábra C).

70

A.

B.

C.

K1 K2 K3 K4

11. ábra. A. A PON1 fehérjeszint tüdőbeli csökkenésének immunohisztokémiai megerősítése. A második és a harmadik kísérleti csoport esetében szignifikáns csökkenés tapasztalható a kontrollokhoz képes (az ábrán a sötétbarna szín csökkenése). Főleg a nem csillós bronchiális epitél sejtek (Clara sejtek, nyilazva) és az aveoláris pneumociták mutatnak PON1 pozitivitást. B. A protein immunhisztokémiai specifikus szignáljának ábrázolása a kontrollokra vonatkoztatva, Tukey-féle többszörös páronkénti összehasonlítás *p<0.0001 C. A PON1 ellenes antitest specifitásának igazolása Western blot módszerrel. A várt méret 40 kDa. K1-K4-ig: kontroll minták 71

5.1.9. A PON1 gén -108T/C és Q192R polimorfizmusai nem mutattak összefüggést az asthmára való hajlammal A PON1 gén -108T/C és Q192R polimorfizmusaira vonatkozóan 302 szakorvos által diagnosztizált asthmás, valamint 188 kontroll nem asthmás gyermek genotipizálását végeztük el. Minden genotípus követte a Hardy-Weinberg eloszlást. Ahogy azt a 4. táblázatban láthatjuk, a vizsgált polimorfizmusok sem a genotípus eloszlás, sem pedig az allélfrekvenciák tekintetében sem különböztek a vizsgált csoportok között. Az allélfrekvenciák a -108 C allélra 47,7 % és 49,5%; míg a 192R allélra nézve 30,2% és 27,4% voltak az asthmás, valamint a kontroll populációban külön-külön.

Polimorfizmus

Genotípus

Genotípus

Genotípus

1/1*

1/2*

2/2*

Asthmás

71 (23,5%)

174 (57,6%)

Kontroll

44 (23,4%)

Populáció

-108T/C

Asthmás Q192R

Kontroll

85 (50,9%) 91 (53,2%)

Összesen

2-es allél frekvenciája

57 (18,9%)

302

47,70%

102 (54,3%)

42 (22,3%)

188

49,5%†

63 (37,7%

19 (11,4%)

167

30,20%

66 (38,6%)

14 (8,2%)

171

27,4%**

4. táblázat. A PON1 gén -108T/C és Q192R polimorfizmusainak genotípus eloszlása, valamint allélfrekvenciái a vizsgált asthmás és a kontroll populációkban. *1 gyakori allél; 2 = ritka allél; †P = 0.8 asthmás vs. kontroll gyermekek; **P = 0.4 asthmás vs. kontroll gyermekek (χ2 teszt)

72

5.1.10. Fordított összefüggés figyelhető meg a szérum PON1 aktivitás és az asthma tüneteinek súlyossága között a vizsgált betegek esetében A PON1 enzimnek nemcsak paraoxonáz, hanem arilészteráz aktivitása is van. Annak a kérdésnek a megválaszolására, hogy vajon a csökkent PON1 fehérjeszint nemcsak egerek, hanem emberek esetében is kapcsolatban állhat-e az asthmatikus tünetek súlyosságával, nyolc kórházi kezelésre szoruló asthmás beteg szérum paraoxonáz és arilészteráz aktivitásának vizsgálatát végeztük el különböző időpontokban. Az első vérvétel (0. nap) a beteg súlyos asthma exacerbátiókkal való kórházba kerülésekor történt, az ilyen esetekben alkalmazott iv. methylprednisolon kezelés megkezdése előtt. A második vérvételi időpont az alkalmazott gyógyszer iv. adagolásról orális adagolásra történő átállásakor (4. nap), a harmadik időpont pedig a kezelés végen (10. nap), a beteg asthma tüneteinek enyhülése után, a kórházból való eltávozáskor történt. Érdekes módon a szérum paraoxonáz és arilészteráz aktivitásainak a kezelés 4. napján mért értékei nem változtak a 0. napos értékekhez képest. Ezzel szemben szignifikánsan (ANOVA, Tukeyféle többszörös páronkénti összehasonlítás, p<10-3) emelkedett szérum paraoxonáz és arilészteráz aktivitást tapasztaltunk (12. ábra) a 10. napon, amikor a beteg a súlyos tünetek enyhülése után elhagyhatta a kórházat. A szérum arilészteráz aktivitás mind a nyolc vizsgált beteg esetében emelkedett volt a 0. napos értékekhez képest, a szérum paraoxonáz aktivitás a nyolc betegből hét esetében szintén szignifikánsan növekedett a 0. napos értékekhez képest. Mindez azt mutatja, hogy a szérum PON1 aktivitás és az asthma tünetek súlyossága között egyfajta fordított összefüggés állhat fent. A szérum paraoxonáz és arilészteráz aktivitása arányos lehet az enzim mennyiségével (természetes a korrekt fehérjeszint meghatározásához az aktivitás alapú mérési módszerek nem helytállóak, de nem állt módunkban ELISA módszert alkalmazni, mivel nincs kereskedelmi forgalomban PON1-et mérő ELISA kit).

73

12. ábra. Fordított összefüggés a szérum PON1 aktivitás és az asthmatikus tünetek súlyossága között. 0. nap: első vérvételi időpont, a beteg súlyos asthma exacerbátiókkal való kórházba kerülésekor, az ilyen esetekben alkalmazott iv. methylprednisolon kezelés megkezdése előtt; 4. nap: a második vérvételi időpont az alkalmazott gyógyszer iv. adagolásról orális adagolásra történő átállásakor; 10. nap: a harmadik vérvételi időpont a kezelés végén, a beteg asthma tüneteinek enyhülése után, a kórházból való eltávozáskor. Az enzim aktivitásokat az első időpontokban mért értékekhez normalizáltuk.

74

5.2 A TNFα -308A promóter polimorfizmusnak az asthma kialakulásában betöltött szerepe Chlamydophila pneumoniae fertőzött gyermekekben A Chlamydophila p. ellenes IgG antitest szérumbeli jelenléte arra utal, hogy az illető a múltban átesett egy Chlamydophila p. fertőzésen, míg IgA jelenléte mind akut, mind krónikus fertőzöttségre utalhat. Amennyiben az IgG pozitivitás IgA pozitivitással egyszerre fordul elő, az krónikus, vagy ismétlődő fertőzöttség meglétét bizonyítja. Vizsgálataink során 144 asthmás és 174 egészséges gyermekben hasonlítottuk össze a Chlamydophila p. fertőzöttséget (5. táblázat). A két csoport nem különbözött egymástól a fertőzöttség előfordulása szempontjából egyik ellenanyag tekintetében sem. Ehhez hasonlóan, a TNFα -308A ritka alléljainak gyakoriságában sem különbözött szignifikánsan a két csoport (6. táblázat). Asthmás páciensek

Kontroll páciensek

P*

Antitest

IgA

IgG

IgG+IgA

IgA

IgG

IgG+IgA

IgA

IgG

IgG+IgA

C.pneumoniae pozitivitás n (%)

43 (29,9)

64 (44,4)

29 (20,1)

55 (31,6)

84 (48,3)

37 (21,3)

0,8

0,6

0,9

5. táblázat. A Chlamydophila p. ellenes antitestekre pozitív asthmás és kontroll gyermekek száma és százalékos aránya. *Asthmás vs. kontroll egészséges gyermekek (χ2 teszt)

Polimorfizmus Populáció

TNF -308 G/A*

A*-allél Genotípus Genotípus Genotípus Összesen gyakorisága G/G* G/A* A/A*

Asthmás

99 (68,8%)

41 (28,5%)

4 (2,8%)

144

17

Kontroll

122 (70,1%)

47 (27,0%)

5 (2,9%)

174

16.4

6. táblázat. A TNFα -308 G/A genotípusainak eloszlása, valamint az allélfrekvenciái asthmás és kontroll egészséges gyermekekben. *A= ritka allél (χ2 teszt)

75

Ezután csoportosítottuk a vizsgált gyermekeket a TNFα genotípusaik alapján, majd a fertőzöttségi állapotuk szerint összehasonlítottuk az asthmás és a kontroll populációt. A mutáns allélt (TNFα -308A ) hordozó asthmások közül szignifikánsan több IgG pozitív Chlamydophila p. fertőzött volt, mind az ugyanebbe a genotípus-csoportba tartozó kontrollok között (20,1% vs. 9,2% asthmás vs. kontroll gyermek, P=0,002; OR (95% konfidencia intervallum)=4,08(1,75-9,52). Az eredmény a többszörös nem és életkor szerinti logisztikus regressziós korrekció után is szignifikáns maradt (7. táblázat, P=0,005; OR(95% konfidencia intervallum)=3,52 (1,52-7,53)). Amikor az asthmás, a TNFα -308 G/G homozigóta vad típusú alléllal rendelkező gyermekeket hasonlítottuk össze a megegyező genotípusú kontrollokkal, kevesebb asthmás gyermek mutatott C pneumoniae-specifikus IgG pozitivitást, mint kontroll egészséges (24,3% vs. 39,1% asthmás vs. kontroll gyermek, P = 0,01; OR (95% konfidencia intervallum) = 0,49 (0,23-0,81)), bár a P érték kissé magasabb volt, mint a Bonferroni korrekcióval megállapított érték (P = 5,6 x 10-3). Nem volt szignifikáns különbség a kontroll és az asthmás csoportok között a TNFα -308 genotípusok és a C. pneumoniae-specifikus IgA vagy a kombinált IgA+IgG pozitivitás tekintetében. A következőkben Chlamydophila p. pozitív asthmás és kontroll gyermekekben hasonlítottuk össze a TNF genotípusok előfordulását, vizsgálva ezzel az asthmára való hajlamban betöltött esetleges szerepüket fertőzöttek esetében. Megállapítottuk, hogy a TNFα -308 genotípusok eloszlása szignifikáns különbséget mutat a kórokozóra specifikus antitestre pozitív asthmás és kontroll egészséges gyermekek között. A ritka TNFα -308A allélt hordozó gyermekek aránya magasabb volt az asthmás, mint a kontroll egészséges csoportban a vad G/G allélra homozigóta gyermekekhez képest (8. táblázat, 45,3% és 54,7% asthmás vs. 19,0% és 81,0% kontroll egészséges gyermeknek volt G/A+A/A vs. G/G genotípusa, korrigált OR(95% konfidencia intervallum) = 3,31(1,62-6,88); P=0,005). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy összefüggés van a TNFα promóter régiójának -308A polimorfizmusa, a C. pneumoniae fertőzés és az asthma kialakulása között. A Chlamydophila p. IgG pozitivitás a TNFα -308A hordozóiban asszociál az asthmára való fokozott hajlammal.

76

ritka allél változat

C.pneumoniae

IgG IgA IgG + IgA

TNFα-308 G/G genotípusú A-allél hordozók egyének OR P OR P 0,49 3,52 0,01 0,005* (0,23(1,520,81) 7,53) 0,79 1,31 0,5 0,6 (0,41(0,551,41) 2,95) 0,82 1,29 0,7 0,8 (0,40(0,441,56) 3,12)

7. táblázat. Logisztikus regressziós elemzés a C pneumoniae-specifikus antitestek előfordulása és az asthma közötti asszociáció vizsgálatára a különböző TNFα-308 genotípusok szerint gyermekekben. *Asthmás vs. kontroll egészséges gyermekek

C.pneumoniae fertőzöttség státusz IgG pozitív (n = 148) IgA pozitív (n = 98) IgG +IgA pozitív (n = 66)

TNFα-308 A hordozók vs. G/G homozigóták OR 3,31 (1,626,88) 1,44 (0,623,11) 1,54 (0,524,23)

P 0,005 0,5 0,6

8. táblázat. Logisztikus regressziós elemzés a különböző TNFα-308 genotípusok gyakorisága és az asthma közötti asszociáció vizsgálatára Chlamydophila p. pozitív asthmás és kontroll gyermekekben.

77

6. Eredmények megbeszélése 6.1. Az allergiás asthma pathomechanizmusában valószínűleg szerepet játszó PON1 gén azonosítása génexpressziós microarray technológia segítségével ovalbumin-indukált allergiás asthma egér modellen Funkcionális genomikai vizsgálataink során egér modellrendszer segítségével vizsgáltuk az allergiás légúti gyulladás létrejöttének különböző progressziós szakaszait kísérő génexpressziós változásokat. Megfigyeltük, hogy az előzetesen OVA-val szenzitizált állatok BAL-jában már az allergénnel való első találkozás után rövid idővel (mintegy négy órával) jelentős makrofág és neutrofil sejtszám emelkedés következett be. Ez a neutrofil túlsúly a továbbiakban csökkenő tendenciát mutatott a progresszió során, és csaknem teljesen megszűnt az alkalmazott kísérleti protokoll végére, amikor a Th2-es típusú eozinofil dominanciájú légúti gyulladás és hiperreaktivitás kialakult. A neutrofilok eozinofilokat megelőző légutakba való beáramlásának ilyen korai és tranziens jelenségét már korábban is megfigyelték az allergiás légúti gyulladás különböző modellei esetében (94, 178, 179). Kísérleteink során sikeresen bizonyítottuk a gyulladásos sejtek allergén hatására bekövetkező e jellegzetes migrációs mintázatának a meglétét az általunk alkalmazott modellrendszerben. Az allergén által indukált légúti gyulladás kialakulását kísérő tüdőbeli gén és mikroRNS expressziós változások nyomon követésének céljából microarray méréseket végeztünk az alkalmazott kísérleti protokoll különböző időpontjaiban. Az allergénre adott válasz rendkívül nagyszámú, a klasszikus microarray adatelemző módszerekkel értékelve statisztikailag szignifikánsan eltérő expressziót mutató gént eredményezett az összes vizsgálati időpontban a kontrollhoz képest, valamint nagyszámú gén mutatott statisztikailag szignifikánsan változó expressziós mintázatot az egyes időpontok között is. Mindezen okok miatt, az asthmatikus választ kísérő biológiai folyamatok mélyebb, átfogóbb megértésének céljából GO és GSEA elemzést végeztünk el a kapott microarray adathalmazon. A GO analízis világosan kimutatta az immun és gyulladásos válaszhoz, valamint a citokin és kemokin működéshez kapcsolódó géncsaládok elemeinek rendkívül

78

erőteljes indukcióját minden egyes vizsgálati csoportban. Emellett sikerült az elemzés segítségével olyan géncsaládokat is találni, melyek eltérő indukciós mintázatot mutattak az egyes progressziós stádiumok között. E szerint az akut gyulladásos válaszhoz és a szerin

típusú

endopeptidáz

inhibitor

aktivitáshoz

tartozó

géncsaládok

elemei

kizárólagosan a korai allergén provokációra adott választ képviselő első csoportban, míg a humorális immunválaszt, fagocitózist, mitózist és sejtciklust szabályozó géncsaládok elemei az előrehaladott állapotban lévő és a kialakult allergén indukált asthmát képviselő második és harmadik csoportban mutattak feldúsulást. A GSEA elemzés torzítatlan, átfogó jellegű adatelemzése segítségével kétféle kérdést kívántunk megválaszolni. Egyrészt a technológia alkalmazásával sikerült biológiai útvonalakhoz kapcsolnunk a mérések során kapott génexpressziós mintázatokat. Ezek szerint a citokin és IL1 receptor jelátvitelhez kapcsolódó génkészletek egyértelműen csak a korai allergén provokációra adott választ képviselő első csoporttal mutattak korrelációt. Ezzel szemben a T sejt receptor jelátvitelhez, sejtciklushoz, T helper és citotoxikus sejtekhez kapcsolódó útvonalak génkészletei viszont kizárólagosan az előrehaladott állapotban lévő és a kialakult allergén indukált asthmát képviselő második és harmadik csoportban mutattak feldúsulást. A GSEA elemzés felhasználásával célunk volt a kapott microarray adatokat a kanonikus biológiai útvonalak elemzése mellett összevetni különböző típusú tüdőt érintő betegségek egér modelljein elvégzett génexpressziós microarray mérések eredményeivel is (48, 180). E szerint az allergénnel való első találkozást képviselő csoportban a neutrofil gyulladással jellemezhető különböző bakteriális fertőzés modellek eredményei alapján összeállított génkészlet, míg a kialakult allergén indukált asthmát képviselő harmadik csoportban a Th2-es típusú gyulladásos modellek génkészleteinek erősen szignifikáns feldúsulását figyeltük meg.

Ezek az eredmények sikeresen validálták a leukociták

allergén provokációt követő tüdőbe történő áramlásos kinetikájával és expanziójával kapcsolatos megfigyeléseinket, valamint rámutatnak a légúti gyulladás kialakulásának következtében a tüdőben lezajló intenzív sejtproliferációval társuló szöveti átrendeződés és fokozott immunaktiváció létrejöttére. Mindezek mellett a GSEA analízis gyors, eredményes és különböző technológiájú microarray rendszerek közötti összehasonlításra is alkalmazható volt, mivel a különböző tüdőbetegség modellek génexpressziós

79

vizsgálatai más technológiájú microarray rendszeren készültek, és az eredményeink az összehasonlítások alapján jól korreláltak egymással. A mikroRNS microarray elemzés során számos mikroRNS (miR-135b, miR-1393p, miR-155, miR-21, miR-21*, miR-449a, miR-449c, miR-582-3p, miR-689, miR-711) emelkedett expresszióját figyeltük meg a kialakult allergén indukált asthmát képviselő harmadik csoport egereinek a tüdejében a kontrollokhoz képest. Ezek közül három kiválasztott mikroRNS, a miR-155, miR-135b és miR-21 expresszióját valósidejű PCR módszerrel is sikeresen validáltuk. A mikroRNS-ek asthmában való részvételével foglalkozó tanulmányok száma csekély. A miR-155 számos tanulmány szerint kulcsfontosságú szerepet játszhat az immunfolyamatok regulálásában. A miR-155 génjére deficiens egerek T és B sejt, valamint dendritikus sejt működése zavart, valamint növekedett légúti remodeling jellemző rájuk (57). Expressziója jelentősen megnövekedett kísérleti egerekben LPS hatására, továbbá kimutatták, hogy a miR-155 fő célpontjai valószínűsíthetően

az

LPS

jelátvitelben

szerepet

játszó

fehérjéket

kódoló

transzkriptumok (58). A miR155-t túlexpresszáló transzgenikus egerek LPS stimulációra magasabb szintű TNF termeléssel válaszolnak és fokozottan érzékenyek az LPS/dgalaktózamin-indukált szeptikus sokkra. A miR-155 fontos a B sejtek nagy affinitású IgG1 izotípusú antitest termelésének regulálásában (181). Az általunk kapott, antigén provokációt követően erőteljesen indukálódott miR-155 expresszió alapján feltételezhető, hogy a mikroRNS szabályozó hatása az allergén indukált légúti gyulladás kialakulásában is központi szabályozó szerepet tölthet be. A miR-21 és miR-135b sejtproliferációban, apoptózisban és tumorgenezisben való fontos szerepét számos tanulmány bizonyította (182-185). A GSEA és GO analízisek során rendszerünkben a sejtproliferációval és a sejtciklussal kapcsolatos ontológiai kategóriák és génkészletek fokozott indukcióját figyeltük meg az allergén indukált asthmát képviselő harmadik csoportban a korai allergén provokációra adott választ képviselő első csoporthoz képes. Elképzelhető, hogy a folyamatok hátterében a fent említett mikroRNS molekulák fokozott expressziója állhat,

melyek

posztraszkripcionális

módon

befolyásolják

a

sejtciklussal

sejtproliferációval kapcsolatos jelátviteli pályák elemeinek az expresszióját.

és

Ezen

hipotézisek bizonyítására azonban a jövőben kiterjedt funkcionális vizsgálatok lennének szükségesek.

80

Az

átfogó

biológiai

funkciókat

vizsgáló

elemzések

mellett

sikeresen

azonosítottunk egy, eddig az asthma szempontjából még nem vizsgált gént, a paraoxonáz-1-et (PON1), melynek az expressziója erőteljesen csökkent az asthmatikus progresszió során. A PON1 csökkent expresszióját immunhisztokémiai módszerrel fehérjeszinten is sikerült kimutatni az előrehaladott állapotban lévő és a kialakult allergén indukált asthmát képviselő második és harmadik csoport egereinek a tüdejében. A PON1 egy intenzíven tanulmányozott antioxidáns enzim, mely az alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL)

részecskék

oxidációja

során

keletkező

proinflammatórikus

lipidek

metabolizálásában vesz részt, ennél fogva jelentős antiaterogén hatással bír (186). Nemrég kimutatták, hogy a PON1 fehérjét túltermelő transzgenikus egerekben enyhébbek, míg PON1 génkiütött állatokban súlyosabbak a kísérletesen előidézett cukorbetegség tünetei a vad típusú kontrollokhoz képest (187). Egy másik kísérletben a humán PON1 gén túltermelése sikeresen megakadályozta az atherosclerosis kialakulását metabolikus szindrómás egerekben (188). Egyre több bizonyíték támasztja alá az oxidatív stressz kialakulásának fontos szerepét az asthma pathogenezisében. A tüdő allergének vagy patogének hatására aktiválódó immunválasza során a gyulladásos sejtekből, valamint a légúti epitélsejtekből felszabaduló ROS-ok károsítják a sejtek membránjait, lipid peroxidáció következik be, melynek eredményeként károsodnak a sejtek membránfunkciói, növekszik a szöveti permeabilitás, és mindezek a folyamatok szöveti károsodáshoz vezetnek (156). Az állatmodellen kapott eredményeink alapján okkal feltételezhető volt számunkra, hogy a csökkent PON1 szint emberek esetében is szerepet játszhat az akut asthma kialakulásában. Klinikai minták szérum PON1 aktivitásának monitorozásával kimutattuk, hogy az enzim aktivitása az asthmatikus tünetek javulásával párhuzamosan emelkedett. Mindez azt mutatja, hogy a szérum PON1 aktivitás és az asthmatikus tünetek súlyossága között egyfajta fordított összefüggés állhat fent. Nem tisztázott azonban, hogy ezért a változásért milyen mechanizmusok lehetnek a felelősek. Elképzelhető, hogy a gyulladásos sejtekből valamint a légúti epitélsejtekből felszabaduló ROS-ok által okozott megnövekedett lipid peroxidáció állhat a csökkenés hátterében, mivel kimutatták, hogy az oxidálódott lipidek gátolják a PON1 aktivitását (189), és asthmában a ROS-ok mennyisége jelentősen emelkedett (150-152). Ráadásul, számos más, oxidatív stresszel és

81

gyulladásos folyamatokkal társuló betegség esetében szintén csökkent PON1 aktivitásról számoltak be. Ezek közé olyan fontos, rengeteg embert érintő betegségek tartoznak, mint például a rheumatoid arthritis (190, 191), az atherosclerosis (192), a cukorbetegség (193) valamint a tüdőrák (194). Fontos megjegyezni azonban, hogy az állatmodellen kapott eredményeink, melyek a PON1 mRNS és fehérjeszint drasztikus csökkenését mutatták az asthmatikus progresszió során, másfajta feltételezésekre is okot adhatnak. Elképzelhető, hogy az allergén indukált folyamatok nem direkt módon gátolják az enzim aktivitását például a már említett oxidált lipidek generálásán keresztül, hanem már előbb, a génexpresszió szintjén is kifejtik a gátló hatásukat, csökkentve ezzel a PON1 gén expresszióját, és az ebből következő alacsonyabb fehérjeszint vezet az enzimaktivitás csökkenéséhez. Jelenleg azonban nehéz következetes választ adni az általunk tett megfigyelésekre. Számos egyéb funkcionális vizsgálatra lenne szükség annak a kérdésnek a megválaszolásához, hogy pontosan vajon milyen mechanizmusok szabályozhatják a PON1 gén expresszióját az allergén hatására bekövetkező gyulladásos válasz során. A PON1 génjének két legtöbbet vizsgált polimorfizmusát (Q192R és -108 T/C) számos tanulmányban összefüggésbe hozták az atherosclerosisra (195), cukorbetegségre (196), valamint a policystás ovarium-szindrómára (197) való megnövekedett hajlammal. A gén Q192R polimorfizmusa az enzim aktivitását (198), míg a -108 T/C promóter polimorfizmus a fehérje expresszióját csökkenti (199). Miután az oxidatív stressz fontos szerepet játszik az asthmában, valamint a PON1 antioxidáns védő szerepét befolyásoló SNP-k esetlegesen befolyásolhatják a betegségre való hajlamot, megvizsgáltuk az említett két SNP előfordulását asthmás és kontroll páciensekben, de egyik polimorfizmus esetében sem találtunk különbséget. Ezek szerint a PON1 génjének Q192R és -108 T/C polimorfizmusai az általunk vizsgált populációban nem játszanak szerepet a betegségre való fokozott hajlam kialakításában. Megfigyeléseink alapján feltételezhető, hogy a csökkent

PON1

aktivitás

valamilyen

módon

szerepet

játszhat

az

asthma

pathogenezisében. Ezt alátámasztja az a felnőttek esetében tett megfigyelés, mely szerint a rendszeres almafogyasztás negatívan korrelált az asthmával, valamint a mérsékelt vörösbor fogyasztása enyhítette asthmatikus rohamok súlyosságát (200). Ezek az ételek nagy mennyiségben tartalmaznak természetes antioxidáns hatású flavonoidokat, és egy

82

tanulmányban kimutatták, hogy a borban lévő flavonoidok fogyasztása növelte a vérben lévő PON1 aktivitást (201). Mindezek alapján elképzelhető, hogy a fent említett ételek protektív hatásukat a PON1 aktivitásának növelése réven fejtik ki. A PON1 génjéről nemrég kiderült, hogy az expresszióját az ismert antiatherogén és koleszterincsökkentő simvastatin képes pozitív módon szabályozni (202). A vegyület a koleszterinszintézis egyik fontos kulcsenzimét, a 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA-reduktáz képes gátolni. Ugyancsak leírták, hogy a simvastatinnak, függetlenül a plazma koleszterinszint csökkentő hatásától, gyulladáscsökkentő és immunmodulációs hatásai is vannak (203). A statinok gyulladáscsökkentő hatásmechanizmusa még nem teljesen feltárt. Valószínűleg a koleszterol endogén szintézise során képződő gyulladásos hatású izoprenoid molekulák gátlásával fejtik ki a hatásukat, lehetséges azonban az is, hogy a vegyület által okozott megnövekedett PON1 expresszió is szerepet játszik a gyulladásellenes hatásmechanizmusban. Egy tanulmányban beszámolnak arról, hogy a simvastatin hatékonyan csökkentette a gyulladásos citokinek szintjén allergén indukált egér asthma modellben, viszont nem volt hatással a szérum teljes IgE és allergén specifikus IgG1 és IgG2 szintjére (204). Ezt az eredményt nemrég egy másik kutatócsoport is megerősítette (205). Egy másik vizsgálat azonban, mely asthmás betegeken vizsgálta a simvastatin esetleges gyulladáscsökkentő hatásait és a vegyület esetleges terápiás alkalmazhatóságát asthmában, nem jelentett pozitív eredményeket (206), bár a vizsgált populáció mérete meglehetősen alacsony volt. A fenti eredményekből feltételezhető, hogy a PON1 gén által kódolt paraoxonáz-1 antioxidatív hatású enzim csökkent szintjének és ebből következő csökkent aktivitásának jelentős szerepe lehet az allergiás asthma pathomechanizmusában. Elképzelhető, hogy a PON1

szintjének

növelésével

járó

terápiás

eljárások

a

jövőben

hatákonyan

hozzájárulhatnak a betegség kezeléséhez, valamint esetleges prevenciós eljárások kifejlesztéséhez is. Mindezen feltételezések igazolásához azonban a jövőben számos vizsgálat elvégzésére van még szükség.

83

6.2.

A

TNFα

-308A

promóter

polimorfizmusnak

az

asthma

kialakulásában betöltött szerepe Chlamydophila pneumoniae fertőzött gyermekekben Génasszociációs vizsgálataink során kimutattuk, hogy a Chlamydophila p. IgG pozitivitás a TNFα -308A ritka allél változatot hordozó gyermekekben asszociál az asthmára való fokozott hajlammal. A TNFα -308A ritka allél változatot hordozó Chlamydophila p. IgG pozitív gyermekekben nagyobb eséllyel alakul ki asthma, mint a hasonló fertőzöttségi állapotú normál genotípusú gyermekekben. Fontos azonban megjegyezni, hogy az általunk elvégzett retrospektív eset-kontroll vizsgálatok során számos hiba fordulhat elő, melyek álpozitív illetve álnegatív eredményekhez vezethetnek. Ezeknek a hibáknak a minimalizálása céljából vizsgálataink során életkor és nem szerint egyeztettük az asthmás és a kontroll pácienseket, valamint a többszörös összehasonlítások során Bonferroni korrekciót használtunk az egyes típusú hibák számának csökkentésére. Fontos továbbá, hogy a vizsgált gyermekek között nem volt olyan, akinek súlyos asthmája lett volna, így elképzelhető, hogy az általunk tett megfigyelések súlyos asthmában szenvedő betegek esetében nem helytállóak. A Chlamydophila p. fertőzés és az asthma közötti kapcsolat biológiailag kézenfekvő, hiszen az asthmára a légutak krónikus gyulladása jellemző, a Chlamydia fajok pedig a fertőzött szervek krónikus gyulladását okozhatják. A Chlamydophila p. fertőzés viszonylag általános, és az a tény, hogy nem minden fertőzött páciensben alakul ki asthma, arra enged következtetni, hogy bizonyos egyének genetikailag fogékonyabbak a Chlamydophila p. fertőzés krónikus légúti hatásaira. A kórokozóról több vizsgálatban is kimutatták, hogy képes számos, az asthma pathogenezisében fontos szerepet játszó citokin és kemokin, többek között a TNFα, MCP-1 és a RANTES (145, 207, 208) expresszióját indukálni. A TNFα-ról kimutatták, hogy fontos szerepet játszik bakteriális fertőzések, ezzel együtt a Chlamydia fajok elleni védekező immunválaszban (209). Ezen kívül a TNFα az asthma krónikus gyulladásos folyamatainak egyik kulcsfontosságú koordinátora is egyben. Kimutatták, mind a TNFα receptorok hiánya, mind pedig a krónikus TNFα ellenes antitest kezelés vagy pedig a TNFα autoantitestek indukciója képes az allergén indukált légúti gyulladást tompítani egér állatmodelleken (210, 211). 84

Ráadásul a TNFα inhaláció rágcsálókban (212) és egészséges (213), illetve asthmás emberek esetében is (214) neutrofiliával társuló légúti túlérzékenység kialakulásához vezetett. A TNFα -308A allélt eddig 19 különböző tanulmányban vizsgálták eddig, és ebből mintegy hét tanulmány számol be a ritka A-allél és az asthma közötti asszociáció meglétéről (215). A vizsgálataink során nekünk nem sikerült összefüggést kimutatni a promóter polimorfizmus és az asthma között. Szignifikánssá vált azonban a különbség az asthmás és a kontroll populáció között, miután a pácienseket a TNFα -308 genotípusok és a C. pneumoniae specifikus IgG pozitivitás alapján csoportosítottuk. Ezek szerint a Chlamydophila p. fertőzés asthma kialakulásához vezethet azokban a genetikailag prediszponált gyermekekben, akik hordozzák a gén ritka -308A alléljét. Azonban azon megfigyelésünk, mely szerint a TNFα -308A allél csak a múltbeli fertőzésre utaló Chlamydophila p. ellenes IgG antitesttel együtt mutatott asszociációt az asthmára való fokozott hajlammal, a kórokozó-specifikus IgA vagy a kombinált IgA+IgG pozitivitás tekintetében pedig nem, nem támasztja alá a fent említett hipotézist. Összefoglalásképpen elmondhatjuk, hogy vizsgálataink során

összefüggést

sikerült kimutatnunk a TNFα promóter régiójának -308A polimorfizmusa, a Chlamydophila p. fertőzés és az asthma kialakulása között. Ezen az asthma kialakulásában fontosnak látszó genotípus-környezet interakció pontos szerepének a tisztázásához azonban még számos prospektív vizsgálat elvégzésére van szükséges a jövőben.

.

85

7. Következtetések 1.

Génexpressziós

microarray

vizsgálataink

eredményeit

összefoglalva

kimutattuk, hogy a szezitizált állatok tüdejében már az allergénnel való első találkozást követően rövid időn belül erőteljes génexpressziós változások voltak megfigyelhetőek. Átfogó bioinformatikai elemzések segítségével sikerült a vizsgálati időpontokban tapasztalt rendkívül bőséges génexpressziós adathalmazt biológiai útvonalakhoz és ontológiai kategóriákhoz kötni, és sikerült azonosítani az egyes progressziós időpontokban eltérő indukciós mintázatot mutató géncsoportokat. Ezen kívül a GSEA módszer felhasználásával sikeresen össze tudtuk vetni a különböző technológiájú microarray rendszereken elvégzett különféle tüdőt érintő betegség modelleken megfigyelt génexpressziós eredményeket a saját adatainkkal. Ismereteink szerint elsőként alkalmaztunk átfogó GSEA elemzést az experimentálisan előidézett allergiás asthma kialakulásának különböző progressziós szakaszait vizsgáló génexpressziós microarray adatokon. 2. MikroRNS microarray vizsgálataink során megfigyeltük az immunrendszer működésének

szabályozásában

résztvevő

miR-155

jelentősen

megnövekedett

expresszióját az allergizálódott állatok tüdejében. A miR-155 célzott szabályozása esetleg hatékony lehet az asthma terápiás kezelése szempontjából a jövőben. 3. Sikeresen azonosítottunk egy eddig asthma szempontjából még nem vizsgált gént, a PON1-t, mely rendkívül nagymértékben csökkent expressziót mutatott az asthmatikus progresszió során az általunk vizsgált egér allergiás asthma modellben. 4. A gén két legismertebb, funkcionális szempontból is fontos polimorfizmusa (Q192R és -108 T/C) és az asthmára való fokozott hajlam között azonban nem találtunk összefüggést az általunk vizsgált populációban. 5. Súlyos akut asthmás betegek esetében sikerült összefüggést kimutatnunk az asthmatikus tünetek súlyossága és a PON1 aktivitásának csökkenése között. Mindezekből következően elképzelhető, hogy a PON1 génje a jövőben az asthma kutatás egy esetleges új terápiás célpontjává válhat, valamint az általa kódolt enzim szérumbeli szintjének nyomon követése, mint diagnosztikai eszköz alkalmazható lehet

86

terápiás kezelést igénylő akut asthmás betegek esetében a kezelések hatékonyságának monitorozásában. 6. Genotípus-környezet interakciós vizsgálataink során kimutattuk, hogy a Chlamydophila p. IgG pozitivitás a TNFα -308A

ritka allél változatot

hordozó

gyermekekben asszociál az asthmára való fokozott hajlammal. A TNFα -308A ritka allél változatot hordozó Chlamydophila p. IgG pozitív gyermekekben nagyobb eséllyel alakul ki asthma, mint a hasonló fertőzöttségi állapotú normál genotípusú gyermekekben.

87

8. Összefoglalás Napjainkban egyre nő az allergiás asthma prevalenciája. Szerencsére ezzel párhuzamosan bővülnek azon genomikai ismertek és vizsgálati módszerek is, melyek hatékony segítséget nyújthatnak a betegség hátterében zajló bonyolult génexpressziós változások, valamint a betegségre való fokozott hajlam kialakításában szerepet játszó egypontos nukleotid polimorfizmusok

(SNP)

mintázatainak tanulmányozásában.

Munkám során különböző genomikai módszereknek az asthma kutatásban való gyakorlati alkalmazhatóságával foglalkoztam. Funkcionális genomikai vizsgálatainkban gén

és

mikroRNS

expressziós

microarray

technológia

felhasználásával

egér

modellrendszer segítségével vizsgáltuk az allergiás légúti gyulladás létrejöttének különböző progressziós szakaszait kísérő tüdőszöveti génexpressziós változásokat. Átfogó bioinformatikai elemzések segítségével sikerült az összes vizsgálati időpontokban tapasztalt rendkívül intenzív génexpressziós változásokat biológiai útvonalakhoz és génontológiai

kategóriákhoz

kötni.

MikroRNS

microarray

vizsgálataink

során

megfigyeltük az immunrendszer működésének szabályozásában résztvevő miR-155 megnövekedett expresszióját az „asztmás” állatok tüdejében. Sikeresen azonosítottuk egy eddig asthma szempontjából még nem vizsgált gént, az antioxidatív hatású paraoxonáz-1 enzimet kódoló PON1-t, mely nagymértékben csökkent expressziót mutatott az asthmatikus progresszió során az általunk vizsgált egér allergiás asthma modellben. Mindezen eredmények után a PON1 humán asthmában való esetleges szerepét vizsgáltuk asthmásokban.

A

gén

két

legismertebb,

funkcionális

szempontból

is

fontos

polimorfizmusa (Q192R és -108 T/C) és az asthmára való fokozott hajlam között nem találtunk összefüggést az általunk vizsgált populációkban. Súlyos akut asthmás betegek esetében viszont sikerült összefüggést kimutatnunk az asthmatikus tünetek súlyossága és a PON1 aktivitásának csökkenése között. Mindezekből következően elképzelhető, hogy a PON1 génje a jövőben az asthma egy esetleges új terápiás célpontjává válhat. Genotípus-környezet interakciós vizsgálataink során kimutattuk, hogy a Chlamydophila p. IgG pozitivitás a TNFα -308A

ritka allél változatot

hordozó

gyermekekben asszociál az asthmára való fokozott hajlammal. A TNFα -308A ritka allél változatot hordozó Chlamydophila p. IgG pozitív gyermekekben nagyobb eséllyel alakul ki asthma, mint a hasonló fertőzöttségi állapotú normál genotípusú gyermekekben. 88

9. Summary Asthma is a complex polygenic disorder, and its prevalence is on the rise. Fortunately, in parallel with this tendency, the more and more expanding knowledge of genomics and the rapidly developing technologies offer powerful tools to be able to gain deeper insight into the genetic background of the disease. In our studies, we used gene expression microarray and single nucleotid polymorphism (SNP)-based methods to investigate the pathogenesis of allergic asthma. We carried out gene and microRNA expression profile analysis in the lung of mice undergoing allergen-induced experimental asthma at different time points during the experimental protocol. The study showed extensive changes in gene expression in the lungs in response to allergen at all time points. We applied GO and Gene Set Enrichment Analyses in order to gain a comprehensive insight into the biological processes and functions of the asthmatic response. Using these methods, we were able to relate gene expression changes to cellular processes and integrate our results into multiple levels of information available in public databases. We identified the high upregulation of miR-155, a microRNA that plays an important role in the development of immune response, in the lungs of allergic mice. Among the top downregulated transcripts, an antioxidant enzyme, paraoxonase-1 (PON1) was identified. In human asthmatic patients we found that serum PON1 activity was reduced at asthma exacerbations, but increased in parallel with improving asthma symptoms. PON1 gene polymorphisms, which affect the expression and the activity of the coded enzyme, did not influence the susceptibility to the disease. Our observations suggest that an altered PON1 activity might be involved in the pathogenesis of asthma, and PON1 might be a potential new therapeutic target as well as a diagnostic tool for following up the effect of therapy. In our gene-environment interaction studies, we showed that C pneumoniaespecific IgG positivity is associated with asthma, when children carrying the TNFα -308A allele are considered. Furthermore, children infected with C pneumoniae in the past (IgG positivity) carrying the TNFα -308A allele have considerably higher risk of developing asthma than children with similar infection status carrying normal genotypes.

89

10. Rövidítések jegyzéke ACAAI: American College of Allergy, Asthma and Immunology ADAM33: A disintegrin and metalloproteinase domain 33 ADAMTS12: A disintegrin and metalloproteinase domain with thrombospondin type 1 motif 12 ADRB2: β2 adrenerg receptor ANOVA: analysis of variance (varianciaanalízis) ARG: arginase (argináz) BAL: bronchoalveolaris lavage BALF: bronchoalveolaris lavage folyadék CAT: savas kation traszporter CC16: Clara cell protein 16 CD: cluster of differentiation CHIA: chitinase, acidic (savas kitináz) CHRM1: cholinergic receptor muscarinic-1 CLCA3 (gob-5): Chloride channel, calcium activated, family member 3 COPD: Chronic obstructive pulmonary disease (krónikus obstruktív tüdőbetegség) CpG: nem-metilált citozin-guanozin motívumokat tartalmazó oligonukleotidok CTLA-4: Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 DPP10: dipeptidyl peptidase 10 (dipeptidil-peptidáz 10) DP2R: prostanoid D2 receptor CYFIP2: cytoplasmic fragile X mental retardation protein-interacting protein 2 dsRNS: kettősszálú RNS ECP: eosinophil cationic protein (eozinofil kationos fehérje) EGF: epidermal growth factor epidermális növekedési faktor ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay (enzimhez kötött immun teszt) EP: eosinophil peroxidase (eozinofil peroxidáz) ETS: epithelium specific transcription factor (epitélium specifikus transzkripciós factor) ERS: European Respiratory Society FcεRI: high affinity IgE receptor I (nagy affinitású IgE receptor I)

90

FcεRII: low affinity IgE receptor II (alacsony affinitású IgE receptor II) FDR: false discovery rate FEV1: forced expiratory volume (forszírozott kilégzési másodperctérfogat) FGF: fibroblast growth factor (fibroblaszt növekedési factor) GATA-3: a DNS GATA-szekvenciájához kötődő egyik transzkripciós faktor GINA: Global Initiative for Asthma GM-CSF: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (granulocita-makofág kolónia stimuláló factor) GPRA: G-protein coupled receptor for asthma susceptibility GO: Gene Ontology GSEA: Gene Set Enrichment Analysis HEPA: nagy hatékonyságú részecskeszűrő Hgmm: higanymilliméter HGPRT1: hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase HLA- DQB1: major histocompatibility complex, class II, DQ beta 1 ICAM-1: intercellular adhesion molecule (intercellularis sejtadhéziós molekula-1) IFN-γ: interferon-γ Ig: Immunglobulin IGF-1: insulin like growth factor-1 (inzulin-szerű növekedési factor) IL: interleukin ip.: intraperitonealis iv.: intravénás KAL-1: Kallmann syndrome 1 sequence LFA-1: leukocyta funkcionális antigén-1 LIFR: Leukemia inhibitory factor receptor LHR: légúti hiperreaktivitás LPS: lipopoliszacharid LTA: lymphotoxin-α LT: leukotrién MAP: mitogén aktivált protein kináz MBP: major bázikus protein

91

MCh: methacholin, acetil-β metilkolin klorid MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1 (monocita kemotaktikus protein-1) MCP-4: macrophag kemotaktikus protein-4 MDC: monocyta eredetű kemokin MHC: fő hisztokompatibilitási komplex MIP-2: macrophag inflammációs protein-2 MS4A2: high affinity IgE receptor NADPH: nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát NF-κB: nukleáris faktor κB NFY-β: β-subunit of nuclear factor Y NK-sejt: natural killer (természetes ölő) sejt NKT-sejt: natural killer T-sejtek (természetes ölő T-sejtek) nNOS: neuronal nitric oxid synthase (neuronalis nitrogén-monoxid szintetáz) NO: nitrogén-monoxid NPR3: Natriuretic peptide receptor C OR: odds ratio (esélyhányados) ORMDL3: ORM1-like 3 OVA: ovalbumin PAF: platelet activating factor (vérlemezke-aktiváló factor) PAI-1: plasminogen activator inhibitor type-1 (plazminogén aktivátor inhibitor) PAMP: pathogen-associated molecular patterns (patogénekhez kötött molekuláris mintázatok) PBS: fiziológiás foszfát-puffer PCR: polimeráz- láncreakció PDGF: platelet-derived growth factor (vérlemezke eredetű növekedési factor) PEF: kilégzési csúcsáramlás PG: prosztaglandinok PHF11: plant homeodomain finger protein-11 pO2: oxigén parciális nyomás pCO2: szén-dioxid parciális nyomás PON1: paraoxonáz-1

92

POSTN: periostin PRLR: Prolactin receptor PRR: mintázatfelismerő receptor PTGER4: Prostaglandin E4 receptor RANTES: regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted (T-sejtekben aktiváció hatására termelődő, feltehetőleg szecernálódó kemokin) RL: tüdőellenállás RT: reverz transzkripció ROS: reactive oxygen species (reaktív oxigén-származékok) RSV: respiratory syncytial virus SCF: stem cell factor (őssejt factor) SSCA2: squamous cell carcinoma antigen 2 SERPINB: serpin peptidase inhibitor, clade B SFRS8: splicing factor, arginine/serine-rich 8 SNP: single nucleotide polymorphism (egyespontos nukleotid polimorfizmus) SPF: specific pathogen free (meghatározott patogénektől mentes) STAT6: signal tranducer and activator of transcription 6 TGF-β: transforming growth factor-β (transzformáló növekedési faktor-β) Th1: 1. típusú T-helper sejtek Th2: 2. típusú T-helper sejtek TIM: T-cell integrin mucin-like receptor TLR: Toll-like receptor TNF-α: tumor nekrózis faktor-α TSLP: thymic stromal lymphopoietin Treg: regulációs T-sejt Tx: tromboxán VCAM-1: vascular cell adhesion molecule-1 (vascularis sejtadhéziós molekula-1) VEGF: vascularis endothelial growth factor (vasculáris endoteliális növekedési factor) VLA-4: very late antigén-4 vs.: versus ZFR: Zinc finger RNA binding protein

93

11. Irodalomjegyzék

1.

Johansson, S. G., J. O. Hourihane, J. Bousquet, C. Bruijnzeel-Koomen, S. Dreborg, T. Haahtela, M. L. Kowalski, N. Mygind, J. Ring, P. van Cauwenberge, M. van Hage-Hamsten, and B. Wuthrich. 2001. A revised nomenclature for allergy. An EAACI position statement from the EAACI nomenclature task force. Allergy 56:813-824.

2.

1997. New NHLBI guidelines for the diagnosis and management of asthma. National Heart, Lung and Blood Institute. Lippincott Health Promot Lett 2:1, 8-9.

3.

Wenzel, S. E. 2006. Asthma: defining of the persistent adult phenotypes. Lancet 368:804-813.

4.

Cookson, W. O., and M. F. Moffatt. 1997. Asthma: an epidemic in the absence of infection? Science 275:41-42.

5.

1998. Worldwide variations in the prevalence of asthma symptoms: the International Study of Asthma and Allergies in Childhood (ISAAC). Eur Respir J 12:315-335.

6.

Barnes, K. C., and D. G. Marsh. 1998. The genetics and complexity of allergy and asthma. Immunol Today 19:325-332.

7.

Duffy, D. L., N. G. Martin, D. Battistutta, J. L. Hopper, and J. D. Mathews. 1990. Genetics of asthma and hay fever in Australian twins. Am Rev Respir Dis 142:1351-1358.

8.

Barnes, K. C. 2000. Evidence for common genetic elements in allergic disease. J Allergy Clin Immunol 106:S192-200.

9.

Szalai, C., I. Ungvari, L. Pelyhe, G. Tolgyesi, and A. Falus. 2008. Asthma from a pharmacogenomic point of view. Br J Pharmacol 153:1602-1614.

10.

Lau, S., S. Illi, C. Sommerfeld, B. Niggemann, R. Bergmann, E. von Mutius, and U. Wahn. 2000. Early exposure to house-dust mite and cat allergens and

94

development of childhood asthma: a cohort study. Multicentre Allergy Study Group. Lancet 356:1392-1397. 11.

Cullinan, P., S. J. MacNeill, J. M. Harris, S. Moffat, C. White, P. Mills, and A. J. Newman Taylor. 2004. Early allergen exposure, skin prick responses, and atopic wheeze at age 5 in English children: a cohort study. Thorax 59:855-861.

12.

Peden, D. B. 2005. The epidemiology and genetics of asthma risk associated with air pollution. J Allergy Clin Immunol 115:213-219; quiz 220.

13.

Ellwood, P., M. I. Asher, B. Bjorksten, M. Burr, N. Pearce, and C. F. Robertson. 2001. Diet and asthma, allergic rhinoconjunctivitis and atopic eczema symptom prevalence: an ecological analysis of the International Study of Asthma and Allergies in Childhood (ISAAC) data. ISAAC Phase One Study Group. Eur Respir J 17:436-443.

14.

Bjorksten, B. 2004. Effects of intestinal microflora and the environment on the development of asthma and allergy. Springer Semin Immunopathol 25:257-270.

15.

Eder, W., M. J. Ege, and E. von Mutius. 2006. The asthma epidemic. N Engl J Med 355:2226-2235.

16.

Eder, W., and E. von Mutius. 2004. Hygiene hypothesis and endotoxin: what is the evidence? Curr Opin Allergy Clin Immunol 4:113-117.

17.

Matricardi, P. M., F. Rosmini, S. Riondino, M. Fortini, L. Ferrigno, M. Rapicetta, and S. Bonini. 2000. Exposure to foodborne and orofecal microbes versus airborne viruses in relation to atopy and allergic asthma: epidemiological study. Bmj 320:412-417.

18.

Yazdanbakhsh, M., and S. Wahyuni. 2005. The role of helminth infections in protection from atopic disorders. Curr Opin Allergy Clin Immunol 5:386-391.

19.

van der Kleij, D., E. Latz, J. F. Brouwers, Y. C. Kruize, M. Schmitz, E. A. KurtJones, T. Espevik, E. C. de Jong, M. L. Kapsenberg, D. T. Golenbock, A. G. Tielens, and M. Yazdanbakhsh. 2002. A novel host-parasite lipid cross-talk. Schistosomal lyso-phosphatidylserine activates toll-like receptor 2 and affects immune polarization. J Biol Chem 277:48122-48129.

95

20.

Adams, V. C., J. R. Hunt, R. Martinelli, R. Palmer, G. A. Rook, and L. R. Brunet. 2004. Mycobacterium vaccae induces a population of pulmonary CD11c+ cells with regulatory potential in allergic mice. Eur J Immunol 34:631-638.

21.

Le Souef, P. N., J. Goldblatt, and N. R. Lynch. 2000. Evolutionary adaptation of inflammatory immune responses in human beings. Lancet 356:242-244.

22.

Rakes, G. P., E. Arruda, J. M. Ingram, G. E. Hoover, J. C. Zambrano, F. G. Hayden, T. A. Platts-Mills, and P. W. Heymann. 1999. Rhinovirus and respiratory syncytial virus in wheezing children requiring emergency care. IgE and eosinophil analyses. Am J Respir Crit Care Med 159:785-790.

23.

Kraft, M., G. H. Cassell, J. Pak, and R. J. Martin. 2002. Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae in asthma: effect of clarithromycin. Chest 121:17821788.

24.

Webley, W. C., P. S. Salva, C. Andrzejewski, F. Cirino, C. A. West, Y. Tilahun, and E. S. Stuart. 2005. The bronchial lavage of pediatric patients with asthma contains infectious Chlamydia. Am J Respir Crit Care Med 171:1083-1088.

25.

Strachan, D. P., and D. G. Cook. 1998. Health effects of passive smoking. 6. Parental smoking and childhood asthma: longitudinal and case-control studies. Thorax 53:204-212.

26.

Strachan, D. P., and D. G. Cook. 1998. Health effects of passive smoking .5. Parental smoking and allergic sensitisation in children. Thorax 53:117-123.

27.

Withers, N. J., L. Low, S. T. Holgate, and J. B. Clough. 1998. The natural history of respiratory symptoms in a cohort of adolescents. Am J Respir Crit Care Med 158:352-357.

28.

Hasday, J. D., R. Bascom, J. J. Costa, T. Fitzgerald, and W. Dubin. 1999. Bacterial endotoxin is an active component of cigarette smoke. Chest 115:829835.

29.

Park, J. H., D. R. Gold, D. L. Spiegelman, H. A. Burge, and D. K. Milton. 2001. House dust endotoxin and wheeze in the first year of life. Am J Respir Crit Care Med 163:322-328.

96

30.

Michel, O., R. Ginanni, J. Duchateau, F. Vertongen, B. Le Bon, and R. Sergysels. 1991. Domestic endotoxin exposure and clinical severity of asthma. Clin Exp Allergy 21:441-448.

31.

Dahl, M. E., K. Dabbagh, D. Liggitt, S. Kim, and D. B. Lewis. 2004. Viralinduced T helper type 1 responses enhance allergic disease by effects on lung dendritic cells. Nat Immunol 5:337-343.

32.

Quirce, S., and J. Sastre. 1998. Occupational asthma. Allergy 53:633-641.

33.

Van Eerdewegh, P., R. D. Little, J. Dupuis, R. G. Del Mastro, K. Falls, J. Simon, D. Torrey, S. Pandit, J. McKenny, K. Braunschweiger, A. Walsh, Z. Liu, B. Hayward, C. Folz, S. P. Manning, A. Bawa, L. Saracino, M. Thackston, Y. Benchekroun, N. Capparell, M. Wang, R. Adair, Y. Feng, J. Dubois, M. G. FitzGerald, H. Huang, R. Gibson, K. M. Allen, A. Pedan, M. R. Danzig, S. P. Umland, R. W. Egan, F. M. Cuss, S. Rorke, J. B. Clough, J. W. Holloway, S. T. Holgate, and T. P. Keith. 2002. Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness. Nature 418:426-430.

34.

Allen, M., A. Heinzmann, E. Noguchi, G. Abecasis, J. Broxholme, C. P. Ponting, S. Bhattacharyya, J. Tinsley, Y. Zhang, R. Holt, E. Y. Jones, N. Lench, A. Carey, H. Jones, N. J. Dickens, C. Dimon, R. Nicholls, C. Baker, L. Xue, E. Townsend, M. Kabesch, S. K. Weiland, D. Carr, E. von Mutius, I. M. Adcock, P. J. Barnes, G. M. Lathrop, M. Edwards, M. F. Moffatt, and W. O. Cookson. 2003. Positional cloning of a novel gene influencing asthma from chromosome 2q14. Nat Genet 35:258-263.

35.

Laitinen, T., M. J. Daly, J. D. Rioux, P. Kauppi, C. Laprise, T. Petays, T. Green, M. Cargill, T. Haahtela, E. S. Lander, L. A. Laitinen, T. J. Hudson, and J. Kere. 2001. A susceptibility locus for asthma-related traits on chromosome 7 revealed by genome-wide scan in a founder population. Nat Genet 28:87-91.

36.

Nicolae, D., N. J. Cox, L. A. Lester, D. Schneider, Z. Tan, C. Billstrand, S. Kuldanek, J. Donfack, P. Kogut, N. M. Patel, J. Goodenbour, T. Howard, R. Wolf, G. H. Koppelman, S. R. White, R. Parry, D. S. Postma, D. Meyers, E. R. Bleecker, J. S. Hunt, J. Solway, and C. Ober. 2005. Fine mapping and positional

97

candidate studies identify HLA-G as an asthma susceptibility gene on chromosome 6p21. Am J Hum Genet 76:349-357. 37.

Noguchi, E., Y. Yokouchi, J. Zhang, K. Shibuya, A. Shibuya, M. Bannai, K. Tokunaga, H. Doi, M. Tamari, M. Shimizu, T. Shirakawa, M. Shibasaki, K. Ichikawa, and T. Arinami. 2005. Positional identification of an asthma susceptibility gene on human chromosome 5q33. Am J Respir Crit Care Med 172:183-188.

38.

Brasch-Andersen, C., Q. Tan, A. D. Borglum, A. Haagerup, T. R. Larsen, J. Vestbo, and T. A. Kruse. 2006. Significant linkage to chromosome 12q24.32q24.33 and identification of SFRS8 as a possible asthma susceptibility gene. Thorax 61:874-879.

39.

Moffatt, M. F., M. Kabesch, L. Liang, A. L. Dixon, D. Strachan, S. Heath, M. Depner, A. von Berg, A. Bufe, E. Rietschel, A. Heinzmann, B. Simma, T. Frischer, S. A. Willis-Owen, K. C. Wong, T. Illig, C. Vogelberg, S. K. Weiland, E. von Mutius, G. R. Abecasis, M. Farrall, I. G. Gut, G. M. Lathrop, and W. O. Cookson. 2007. Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma. Nature 448:470-473.

40.

Lee, J. H., N. Kaminski, G. Dolganov, G. Grunig, L. Koth, C. Solomon, D. J. Erle, and D. Sheppard. 2001. Interleukin-13 induces dramatically different transcriptional programs in three human airway cell types. Am J Respir Cell Mol Biol 25:474-485.

41.

Yuyama, N., D. E. Davies, M. Akaiwa, K. Matsui, Y. Hamasaki, Y. Suminami, N. L. Yoshida, M. Maeda, A. Pandit, J. L. Lordan, Y. Kamogawa, K. Arima, F. Nagumo, M. Sugimachi, A. Berger, I. Richards, S. L. Roberds, T. Yamashita, F. Kishi, H. Kato, K. Arai, K. Ohshima, J. Tadano, N. Hamasaki, S. Miyatake, Y. Sugita, S. T. Holgate, and K. Izuhara. 2002. Analysis of novel disease-related genes in bronchial asthma. Cytokine 19:287-296.

42.

Sheppard, D. 2002. Roger S. Mitchell lecture. Uses of expression microarrays in studies of pulmonary fibrosis, asthma, acute lung injury, and emphysema. Chest 121:21S-25S.

98

43.

Sakata, Y., K. Arima, T. Takai, W. Sakurai, K. Masumoto, N. Yuyama, Y. Suminami, F. Kishi, T. Yamashita, T. Kato, H. Ogawa, K. Fujimoto, Y. Matsuo, Y. Sugita, and K. Izuhara. 2004. The squamous cell carcinoma antigen 2 inhibits the cysteine proteinase activity of a major mite allergen, Der p 1. J Biol Chem 279:5081-5087.

44.

Takayama, G., K. Arima, T. Kanaji, S. Toda, H. Tanaka, S. Shoji, A. N. McKenzie, H. Nagai, T. Hotokebuchi, and K. Izuhara. 2006. Periostin: a novel component of subepithelial fibrosis of bronchial asthma downstream of IL-4 and IL-13 signals. J Allergy Clin Immunol 118:98-104.

45.

Cho, S. H., S. W. Tam, S. Demissie-Sanders, S. A. Filler, and C. K. Oh. 2000. Production of plasminogen activator inhibitor-1 by human mast cells and its possible role in asthma. J Immunol 165:3154-3161.

46.

Okumura, S., H. Sagara, T. Fukuda, H. Saito, and Y. Okayama. 2005. FcepsilonRI-mediated amphiregulin production by human mast cells increases mucin gene expression in epithelial cells. J Allergy Clin Immunol 115:272-279.

47.

Wang, S. W., C. K. Oh, S. H. Cho, G. Hu, R. Martin, S. Demissie-Sanders, K. Li, M. Moyle, and Z. Yao. 2005. Amphiregulin expression in human mast cells and its effect on the primary human lung fibroblasts. J Allergy Clin Immunol 115:287294.

48.

Zimmermann, N., N. E. King, J. Laporte, M. Yang, A. Mishra, S. M. Pope, E. E. Muntel, D. P. Witte, A. A. Pegg, P. S. Foster, Q. Hamid, and M. E. Rothenberg. 2003. Dissection of experimental asthma with DNA microarray analysis identifies arginase in asthma pathogenesis. J Clin Invest 111:1863-1874.

49.

Litonjua, A. A., J. A. Lasky-Su, K. Schneiter, K. G. Tantisira, R. Lazarus, B. Klanderman, J. J. Lima, C. G. Irvin, S. P. Peters, J. P. Hanrahan, S. B. Liggett, G. A. Hawkins, D. A. Meyers, E. R. Bleecker, C. Lange, and S. T. Weiss. 2008. ARG1 is a Novel Bronchodilator Response Gene: Screening and Replication in Four Asthma Cohorts. Am J Respir Crit Care Med.

50.

Karp, C. L., A. Grupe, E. Schadt, S. L. Ewart, M. Keane-Moore, P. J. Cuomo, J. Kohl, L. Wahl, D. Kuperman, S. Germer, D. Aud, G. Peltz, and M. Wills-Karp.

99

2000. Identification of complement factor 5 as a susceptibility locus for experimental allergic asthma. Nat Immunol 1:221-226. 51.

Zou, J., S. Young, F. Zhu, F. Gheyas, S. Skeans, Y. Wan, L. Wang, W. Ding, M. Billah, T. McClanahan, R. L. Coffman, R. Egan, and S. Umland. 2002. Microarray profile of differentially expressed genes in a monkey model of allergic asthma. Genome Biol 3:research0020.

52.

Valencia-Sanchez, M. A., J. Liu, G. J. Hannon, and R. Parker. 2006. Control of translation and mRNA degradation by miRNAs and siRNAs. Genes Dev 20:515524.

53.

Bentwich, I., A. Avniel, Y. Karov, R. Aharonov, S. Gilad, O. Barad, A. Barzilai, P. Einat, U. Einav, E. Meiri, E. Sharon, Y. Spector, and Z. Bentwich. 2005. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet 37:766-770.

54.

Berezikov, E., G. van Tetering, M. Verheul, J. van de Belt, L. van Laake, J. Vos, R. Verloop, M. van de Wetering, V. Guryev, S. Takada, A. J. van Zonneveld, H. Mano, R. Plasterk, and E. Cuppen. 2006. Many novel mammalian microRNA candidates identified by extensive cloning and RAKE analysis. Genome Res 16:1289-1298.

55.

Sevignani, C., G. A. Calin, L. D. Siracusa, and C. M. Croce. 2006. Mammalian microRNAs: a small world for fine-tuning gene expression. Mamm Genome 17:189-202.

56.

Gaidatzis, D., E. van Nimwegen, J. Hausser, and M. Zavolan. 2007. Inference of miRNA targets using evolutionary conservation and pathway analysis. BMC Bioinformatics 8:69.

57.

Rodriguez, A., E. Vigorito, S. Clare, M. V. Warren, P. Couttet, D. R. Soond, S. van Dongen, R. J. Grocock, P. P. Das, E. A. Miska, D. Vetrie, K. Okkenhaug, A. J. Enright, G. Dougan, M. Turner, and A. Bradley. 2007. Requirement of bic/microRNA-155 for normal immune function. Science 316:608-611.

58.

Tili, E., J. J. Michaille, A. Cimino, S. Costinean, C. D. Dumitru, B. Adair, M. Fabbri, H. Alder, C. G. Liu, G. A. Calin, and C. M. Croce. 2007. Modulation of miR-155

and

miR-125b

levels

100

following

lipopolysaccharide/TNF-alpha

stimulation and their possible roles in regulating the response to endotoxin shock. J Immunol 179:5082-5089. 59.

Taganov, K. D., M. P. Boldin, K. J. Chang, and D. Baltimore. 2006. NF-kappaBdependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A 103:1248112486.

60.

Dunnill, M. S. 1960. The pathology of asthma, with special reference to changes in the bronchial mucosa. J Clin Pathol 13:27-33.

61.

Humbert, M., G. Menz, S. Ying, C. J. Corrigan, D. S. Robinson, S. R. Durham, and A. B. Kay. 1999. The immunopathology of extrinsic (atopic) and intrinsic (non-atopic) asthma: more similarities than differences. Immunol Today 20:528533.

62.

Ying, S., M. Humbert, Q. Meng, R. Pfister, G. Menz, H. J. Gould, A. B. Kay, and S. R. Durham. 2001. Local expression of epsilon germline gene transcripts and RNA for the epsilon heavy chain of IgE in the bronchial mucosa in atopic and nonatopic asthma. J Allergy Clin Immunol 107:686-692.

63.

Crimi, E., A. Spanevello, M. Neri, P. W. Ind, G. A. Rossi, and V. Brusasco. 1998. Dissociation between airway inflammation and airway hyperresponsiveness in allergic asthma. Am J Respir Crit Care Med 157:4-9.

64.

Galli, S. J., S. Nakae, and M. Tsai. 2005. Mast cells in the development of adaptive immune responses. Nat Immunol 6:135-142.

65.

Henz, B. M., M. Maurer, U. Lippert, M. Worm, and M. Babina. 2001. Mast cells as initiators of immunity and host defense. Exp Dermatol 10:1-10.

66.

Frandji, P., C. Oskeritzian, F. Cacaraci, J. Lapeyre, R. Peronet, B. David, J. G. Guillet, and S. Mecheri. 1993. Antigen-dependent stimulation by bone marrowderived mast cells of MHC class II-restricted T cell hybridoma. J Immunol 151:6318-6328.

67.

Malaviya, R., N. J. Twesten, E. A. Ross, S. N. Abraham, and J. D. Pfeifer. 1996. Mast cells process bacterial Ags through a phagocytic route for class I MHC presentation to T cells. J Immunol 156:1490-1496.

101

68.

Yang, W., D. Kaur, Y. Okayama, A. Ito, A. J. Wardlaw, C. E. Brightling, and P. Bradding. 2006. Human lung mast cells adhere to human airway smooth muscle, in part, via tumor suppressor in lung cancer-1. J Immunol 176:1238-1243.

69.

Bradding, P., A. F. Walls, and S. T. Holgate. 2006. The role of the mast cell in the pathophysiology of asthma. J Allergy Clin Immunol 117:1277-1284.

70.

Williams, C. M., and S. J. Galli. 2000. Mast cells can amplify airway reactivity and features of chronic inflammation in an asthma model in mice. J Exp Med 192:455-462.

71.

Takeda, K., E. Hamelmann, A. Joetham, L. D. Shultz, G. L. Larsen, C. G. Irvin, and E. W. Gelfand. 1997. Development of eosinophilic airway inflammation and airway hyperresponsiveness in mast cell-deficient mice. J Exp Med 186:449-454.

72.

John, M., S. Lim, J. Seybold, P. Jose, A. Robichaud, B. O'Connor, P. J. Barnes, and K. F. Chung. 1998. Inhaled corticosteroids increase interleukin-10 but reduce macrophage inflammatory protein-1alpha, granulocyte-macrophage colonystimulating factor, and interferon-gamma release from alveolar macrophages in asthma. Am J Respir Crit Care Med 157:256-262.

73.

Spiteri, M. A., R. A. Knight, J. Y. Jeremy, P. J. Barnes, and K. F. Chung. 1994. Alveolar macrophage-induced suppression of peripheral blood mononuclear cell responsiveness is reversed by in vitro allergen exposure in bronchial asthma. Eur Respir J 7:1431-1438.

74.

Tang, C., C. Ward, D. Reid, R. Bish, M. O'Byrne P, and E. H. Walters. 2001. Normally suppressing CD40 coregulatory signals delivered by airway macrophages to TH2 lymphocytes are defective in patients with atopic asthma. J Allergy Clin Immunol 107:863-870.

75.

Holt, P. G., and C. McMenamin. 1989. Defence against allergic sensitization in the healthy lung: the role of inhalation tolerance. Clin Exp Allergy 19:255-262.

76.

Sung, S. S., S. M. Fu, C. E. Rose, Jr., F. Gaskin, S. T. Ju, and S. R. Beaty. 2006. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol 176:21612172.

102

77.

Akbari, O., R. H. DeKruyff, and D. T. Umetsu. 2001. Pulmonary dendritic cells producing IL-10 mediate tolerance induced by respiratory exposure to antigen. Nat Immunol 2:725-731.

78.

Gett, A. V., F. Sallusto, A. Lanzavecchia, and J. Geginat. 2003. T cell fitness determined by signal strength. Nat Immunol 4:355-360.

79.

Matzinger, P. 2002. The danger model: a renewed sense of self. Science 296:301305.

80.

de Heer, H. J., H. Hammad, T. Soullie, D. Hijdra, N. Vos, M. A. Willart, H. C. Hoogsteden, and B. N. Lambrecht. 2004. Essential role of lung plasmacytoid dendritic cells in preventing asthmatic reactions to harmless inhaled antigen. J Exp Med 200:89-98.

81.

Moser, M., and K. M. Murphy. 2000. Dendritic cell regulation of TH1-TH2 development. Nat Immunol 1:199-205.

82.

Yukawa, T., R. C. Read, C. Kroegel, A. Rutman, K. F. Chung, R. Wilson, P. J. Cole, and P. J. Barnes. 1990. The effects of activated eosinophils and neutrophils on guinea pig airway epithelium in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol 2:341-353.

83.

Adamko, D., P. Lacy, and R. Moqbel. 2002. Mechanisms of eosinophil recruitment and activation. Curr Allergy Asthma Rep 2:107-116.

84.

Woolley, M. J., J. A. Denburg, R. Ellis, M. Dahlback, and P. M. O'Byrne. 1994. Allergen-induced changes in bone marrow progenitors and airway responsiveness in dogs and the effect of inhaled budesonide on these parameters. Am J Respir Cell Mol Biol 11:600-606.

85.

Tachimoto, H., and B. S. Bochner. 2000. The surface phenotype of human eosinophils. Chem Immunol 76:45-62.

86.

Wardlaw, A. J. 1999. Molecular basis for selective eosinophil trafficking in asthma: A multistep paradigm. J Allergy Clin Immunol 104:917-926.

87.

Pilewski, J. M., and S. M. Albelda. 1995. Cell adhesion molecules in asthma: homing, activation, and airway remodeling. Am J Respir Cell Mol Biol 12:1-3.

88.

Park, C. S., Y. S. Choi, S. Y. Ki, S. H. Moon, S. W. Jeong, S. T. Uh, and Y. H. Kim. 1998. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor is the main

103

cytokine enhancing survival of eosinophils in asthmatic airways. Eur Respir J 12:872-878. 89.

Simon, H. U. 2001. Regulation of eosinophil and neutrophil apoptosis-similarities and differences. Immunol Rev 179:156-162.

90.

Blease, K., N. W. Lukacs, C. M. Hogaboam, and S. L. Kunkel. 2000. Chemokines and their role in airway hyper-reactivity. Respir Res 1:54-61.

91.

Gibson, P. G., J. L. Simpson, and N. Saltos. 2001. Heterogeneity of airway inflammation in persistent asthma : evidence of neutrophilic inflammation and increased sputum interleukin-8. Chest 119:1329-1336.

92.

Jatakanon, A., C. Uasuf, W. Maziak, S. Lim, K. F. Chung, and P. J. Barnes. 1999. Neutrophilic inflammation in severe persistent asthma. Am J Respir Crit Care Med 160:1532-1539.

93.

Sur, S., T. B. Crotty, G. M. Kephart, B. A. Hyma, T. V. Colby, C. E. Reed, L. W. Hunt, and G. J. Gleich. 1993. Sudden-onset fatal asthma. A distinct entity with few eosinophils and relatively more neutrophils in the airway submucosa? Am Rev Respir Dis 148:713-719.

94.

Lommatzsch, M., P. Julius, M. Kuepper, H. Garn, K. Bratke, S. Irmscher, W. Luttmann, H. Renz, A. Braun, and J. C. Virchow. 2006. The course of allergeninduced leukocyte infiltration in human and experimental asthma. J Allergy Clin Immunol 118:91-97.

95.

Cox, G. 1995. Glucocorticoid treatment inhibits apoptosis in human neutrophils. Separation of survival and activation outcomes. J Immunol 154:4719-4725.

96.

Robinson, D. S., Q. Hamid, S. Ying, A. Tsicopoulos, J. Barkans, A. M. Bentley, C. Corrigan, S. R. Durham, and A. B. Kay. 1992. Predominant TH2-like bronchoalveolar T-lymphocyte population in atopic asthma. N Engl J Med 326:298-304.

97.

Huang, S. K., H. Q. Xiao, J. Kleine-Tebbe, G. Paciotti, D. G. Marsh, L. M. Lichtenstein, and M. C. Liu. 1995. IL-13 expression at the sites of allergen challenge in patients with asthma. J Immunol 155:2688-2694.

104

98.

Mosmann, T. R., and R. L. Coffman. 1989. TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 7:145-173.

99.

Huang, T. J., P. A. MacAry, P. Eynott, A. Moussavi, K. C. Daniel, P. W. Askenase, D. M. Kemeny, and K. F. Chung. 2001. Allergen-specific Th1 cells counteract efferent Th2 cell-dependent bronchial hyperresponsiveness and eosinophilic inflammation partly via IFN-gamma. J Immunol 166:207-217.

100.

Iwamoto, I., H. Nakajima, H. Endo, and S. Yoshida. 1993. Interferon gamma regulates antigen-induced eosinophil recruitment into the mouse airways by inhibiting the infiltration of CD4+ T cells. J Exp Med 177:573-576.

101.

Hansen, G., G. Berry, R. H. DeKruyff, and D. T. Umetsu. 1999. Allergen-specific Th1 cells fail to counterbalance Th2 cell-induced airway hyperreactivity but cause severe airway inflammation. J Clin Invest 103:175-183.

102.

Stephens, R., D. A. Randolph, G. Huang, M. J. Holtzman, and D. D. Chaplin. 2002. Antigen-nonspecific recruitment of Th2 cells to the lung as a mechanism for viral infection-induced allergic asthma. J Immunol 169:5458-5467.

103.

Sheikh, A., L. Smeeth, and R. Hubbard. 2003. There is no evidence of an inverse relationship between TH2-mediated atopy and TH1-mediated autoimmune disorders: Lack of support for the hygiene hypothesis. J Allergy Clin Immunol 111:131-135.

104.

Murphy, K. M., W. Ouyang, J. D. Farrar, J. Yang, S. Ranganath, H. Asnagli, M. Afkarian, and T. L. Murphy. 2000. Signaling and transcription in T helper development. Annu Rev Immunol 18:451-494.

105.

Stoll, S., H. Jonuleit, E. Schmitt, G. Muller, H. Yamauchi, M. Kurimoto, J. Knop, and A. H. Enk. 1998. Production of functional IL-18 by different subtypes of murine and human dendritic cells (DC): DC-derived IL-18 enhances IL-12dependent Th1 development. Eur J Immunol 28:3231-3239.

106.

Yoshimoto, T., K. Takeda, T. Tanaka, K. Ohkusu, S. Kashiwamura, H. Okamura, S. Akira, and K. Nakanishi. 1998. IL-12 up-regulates IL-18 receptor expression on T cells, Th1 cells, and B cells: synergism with IL-18 for IFN-gamma production. J Immunol 161:3400-3407.

105

107.

Akbari, O., J. L. Faul, E. G. Hoyte, G. J. Berry, J. Wahlstrom, M. Kronenberg, R. H. DeKruyff, and D. T. Umetsu. 2006. CD4+ invariant T-cell-receptor+ natural killer T cells in bronchial asthma. N Engl J Med 354:1117-1129.

108.

Ouyang, W., S. H. Ranganath, K. Weindel, D. Bhattacharya, T. L. Murphy, W. C. Sha, and K. M. Murphy. 1998. Inhibition of Th1 development mediated by GATA-3 through an IL-4-independent mechanism. Immunity 9:745-755.

109.

Finotto, S., M. F. Neurath, J. N. Glickman, S. Qin, H. A. Lehr, F. H. Green, K. Ackerman, K. Haley, P. R. Galle, S. J. Szabo, J. M. Drazen, G. T. De Sanctis, and L. H. Glimcher. 2002. Development of spontaneous airway changes consistent with human asthma in mice lacking T-bet. Science 295:336-338.

110.

Iwakura, Y., and H. Ishigame. 2006. The IL-23/IL-17 axis in inflammation. J Clin Invest 116:1218-1222.

111.

Koppelman, B., J. J. Neefjes, J. E. de Vries, and R. de Waal Malefyt. 1997. Interleukin-10 down-regulates MHC class II alphabeta peptide complexes at the plasma membrane of monocytes by affecting arrival and recycling. Immunity 7:861-871.

112.

Braunstahl, G. J., S. E. Overbeek, W. J. Fokkens, A. Kleinjan, A. R. McEuen, A. F. Walls, H. C. Hoogsteden, and J. B. Prins. 2001. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. Am J Respir Crit Care Med 164:858-865.

113.

Abi-Younes, S., M. Si-Tahar, and A. D. Luster. 2001. The CC chemokines MDC and TARC induce platelet activation via CCR4. Thromb Res 101:279-289.

114.

Moritani, C., S. Ishioka, Y. Haruta, M. Kambe, and M. Yamakido. 1998. Activation of platelets in bronchial asthma. Chest 113:452-458.

115.

Sullivan, P. J., Z. H. Jafar, P. L. Harbinson, L. J. Restrick, J. F. Costello, and C. P. Page. 2000. Platelet dynamics following allergen challenge in allergic asthmatics. Respiration 67:514-517.

116.

Upham, J. W., and S. M. Stick. 2006. Interactions between airway epithelial cells and dendritic cells: implications for the regulation of airway inflammation. Curr Drug Targets 7:541-545.

106

117.

Lukacs, N. W., D. M. Prosser, M. Wiekowski, S. A. Lira, and D. N. Cook. 2001. Requirement for the chemokine receptor CCR6 in allergic pulmonary inflammation. J Exp Med 194:551-555.

118.

Ito, T., Y. H. Wang, O. Duramad, T. Hori, G. J. Delespesse, N. Watanabe, F. X. Qin, Z. Yao, W. Cao, and Y. J. Liu. 2005. TSLP-activated dendritic cells induce an inflammatory T helper type 2 cell response through OX40 ligand. J Exp Med 202:1213-1223.

119.

Wang, Y. H., P. Angkasekwinai, N. Lu, K. S. Voo, K. Arima, S. Hanabuchi, A. Hippe, C. J. Corrigan, C. Dong, B. Homey, Z. Yao, S. Ying, D. P. Huston, and Y. J. Liu. 2007. IL-25 augments type 2 immune responses by enhancing the expansion and functions of TSLP-DC-activated Th2 memory cells. J Exp Med 204:1837-1847.

120.

Zhou, B., M. R. Comeau, T. De Smedt, H. D. Liggitt, M. E. Dahl, D. B. Lewis, D. Gyarmati, T. Aye, D. J. Campbell, and S. F. Ziegler. 2005. Thymic stromal lymphopoietin as a key initiator of allergic airway inflammation in mice. Nat Immunol 6:1047-1053.

121.

Schmitz, J., A. Owyang, E. Oldham, Y. Song, E. Murphy, T. K. McClanahan, G. Zurawski, M. Moshrefi, J. Qin, X. Li, D. M. Gorman, J. F. Bazan, and R. A. Kastelein. 2005. IL-33, an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines. Immunity 23:479-490.

122.

Schleimer, R. P., S. A. Sterbinsky, J. Kaiser, C. A. Bickel, D. A. Klunk, K. Tomioka, W. Newman, F. W. Luscinskas, M. A. Gimbrone, Jr., B. W. McIntyre. 1992. IL-4 induces adherence of human eosinophils and basophils but not neutrophils to endothelium. Association with expression of VCAM-1. J Immunol 148:1086-1092.

123.

Temann, U. A., B. Prasad, M. W. Gallup, C. Basbaum, S. B. Ho, R. A. Flavell, and J. A. Rankin. 1997. A novel role for murine IL-4 in vivo: induction of MUC5AC gene expression and mucin hypersecretion. Am J Respir Cell Mol Biol 16:471-478.

107

124.

Coyle, A. J., G. Le Gros, C. Bertrand, S. Tsuyuki, C. H. Heusser, M. Kopf, and G. P. Anderson. 1995. Interleukin-4 is required for the induction of lung Th2 mucosal immunity. Am J Respir Cell Mol Biol 13:54-59.

125.

Corry, D. B., H. G. Folkesson, M. L. Warnock, D. J. Erle, M. A. Matthay, J. P. Wiener-Kronish, and R. M. Locksley. 1996. Interleukin 4, but not interleukin 5 or eosinophils, is required in a murine model of acute airway hyperreactivity. J Exp Med 183:109-117.

126.

Broide, D. H., M. M. Paine, and G. S. Firestein. 1992. Eosinophils express interleukin 5 and granulocyte macrophage-colony-stimulating factor mRNA at sites of allergic inflammation in asthmatics. J Clin Invest 90:1414-1424.

127.

Keatings, V. M., B. J. O'Connor, L. G. Wright, D. P. Huston, C. J. Corrigan, and P. J. Barnes. 1997. Late response to allergen is associated with increased concentrations of tumor necrosis factor-alpha and IL-5 in induced sputum. J Allergy Clin Immunol 99:693-698.

128.

Clutterbuck, E. J., E. M. Hirst, and C. J. Sanderson. 1989. Human interleukin-5 (IL-5) regulates the production of eosinophils in human bone marrow cultures: comparison and interaction with IL-1, IL-3, IL-6, and GMCSF. Blood 73:15041512.

129.

Yamaguchi, Y., Y. Hayashi, Y. Sugama, Y. Miura, T. Kasahara, S. Kitamura, M. Torisu, S. Mita, A. Tominaga, and K. Takatsu. 1988. Highly purified murine interleukin 5 (IL-5) stimulates eosinophil function and prolongs in vitro survival. IL-5 as an eosinophil chemotactic factor. J Exp Med 167:1737-1742.

130.

Lopez, A. F., C. J. Sanderson, J. R. Gamble, H. D. Campbell, I. G. Young, and M. A. Vadas. 1988. Recombinant human interleukin 5 is a selective activator of human eosinophil function. J Exp Med 167:219-224.

131.

Collins, P. D., S. Marleau, D. A. Griffiths-Johnson, P. J. Jose, and T. J. Williams. 1995. Cooperation between interleukin-5 and the chemokine eotaxin to induce eosinophil accumulation in vivo. J Exp Med 182:1169-1174.

132.

Mould, A. W., K. I. Matthaei, I. G. Young, and P. S. Foster. 1997. Relationship between interleukin-5 and eotaxin in regulating blood and tissue eosinophilia in mice. J Clin Invest 99:1064-1071.

108

133.

Kips, J. C., B. J. O'Connor, S. J. Langley, A. Woodcock, H. A. Kerstjens, D. S. Postma, M. Danzig, F. Cuss, and R. A. Pauwels. 2003. Effect of SCH55700, a humanized anti-human interleukin-5 antibody, in severe persistent asthma: a pilot study. Am J Respir Crit Care Med 167:1655-1659.

134.

Leckie, M. J., A. ten Brinke, J. Khan, Z. Diamant, B. J. O'Connor, C. M. Walls, A. K. Mathur, H. C. Cowley, K. F. Chung, R. Djukanovic, T. T. Hansel, S. T. Holgate, P. J. Sterk, and P. J. Barnes. 2000. Effects of an interleukin-5 blocking monoclonal antibody on eosinophils, airway hyper-responsiveness, and the late asthmatic response. Lancet 356:2144-2148.

135.

Wills-Karp, M., J. Luyimbazi, X. Xu, B. Schofield, T. Y. Neben, C. L. Karp, and D. D. Donaldson. 1998. Interleukin-13: central mediator of allergic asthma. Science 282:2258-2261.

136.

Stampfli, M. R., R. E. Wiley, G. S. Neigh, B. U. Gajewska, X. F. Lei, D. P. Snider, Z. Xing, and M. Jordana. 1998. GM-CSF transgene expression in the airway allows aerosolized ovalbumin to induce allergic sensitization in mice. J Clin Invest 102:1704-1714.

137.

Allakhverdi, Z., M. R. Comeau, H. K. Jessup, B. R. Yoon, A. Brewer, S. Chartier, N. Paquette, S. F. Ziegler, M. Sarfati, and G. Delespesse. 2007. Thymic stromal lymphopoietin is released by human epithelial cells in response to microbes, trauma, or inflammation and potently activates mast cells. J Exp Med 204:253258.

138.

Eisenbarth, S. C., D. A. Piggott, J. W. Huleatt, I. Visintin, C. A. Herrick, and K. Bottomly. 2002. Lipopolysaccharide-enhanced, toll-like receptor 4-dependent T helper cell type 2 responses to inhaled antigen. J Exp Med 196:1645-1651.

139.

Li Kam Wa, T. C., A. H. Mansur, J. Britton, G. Williams, I. Pavord, K. Richards, D. A. Campbell, N. Morton, S. T. Holgate, and J. F. Morrison. 1999. Association between - 308 tumour necrosis factor promoter polymorphism and bronchial hyperreactivity in asthma. Clin Exp Allergy 29:1204-1208.

140.

Wilson, A. G., J. A. Symons, T. L. McDowell, H. O. McDevitt, and G. W. Duff. 1997. Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcriptional activation. Proc Natl Acad Sci U S A 94:3195-3199.

109

141.

Gutierrez-Ramos, J. C., C. Lloyd, and J. A. Gonzalo. 1999. Eotaxin: from an eosinophilic chemokine to a major regulator of allergic reactions. Immunol Today 20:500-504.

142.

Gonzalo, J. A., C. M. Lloyd, L. Kremer, E. Finger, A. C. Martinez, M. H. Siegelman, M. Cybulsky, and J. C. Gutierrez-Ramos. 1996. Eosinophil recruitment to the lung in a murine model of allergic inflammation. The role of T cells, chemokines, and adhesion receptors. J Clin Invest 98:2332-2345.

143.

Campbell, E. M., I. F. Charo, S. L. Kunkel, R. M. Strieter, L. Boring, J. Gosling, and N. W. Lukacs. 1999. Monocyte chemoattractant protein-1 mediates cockroach allergen-induced bronchial hyperreactivity in normal but not CCR2-/mice: the role of mast cells. J Immunol 163:2160-2167.

144.

Sousa, A. R., S. J. Lane, J. A. Nakhosteen, T. Yoshimura, T. H. Lee, and R. N. Poston. 1994. Increased expression of the monocyte chemoattractant protein-1 in bronchial tissue from asthmatic subjects. Am J Respir Cell Mol Biol 10:142-147.

145.

Szalai, C., G. T. Kozma, A. Nagy, A. Bojszko, D. Krikovszky, T. Szabo, and A. Falus. 2001. Polymorphism in the gene regulatory region of MCP-1 is associated with asthma susceptibility and severity. J Allergy Clin Immunol 108:375-381.

146.

Lloyd, C. M., T. Delaney, T. Nguyen, J. Tian, A. C. Martinez, A. J. Coyle, and J. C. Gutierrez-Ramos. 2000. CC chemokine receptor (CCR)3/eotaxin is followed by CCR4/monocyte-derived chemokine in mediating pulmonary T helper lymphocyte type 2 recruitment after serial antigen challenge in vivo. J Exp Med 191:265-274.

147.

Berin, M. C., L. Eckmann, D. H. Broide, and M. F. Kagnoff. 2001. Regulated production of the T helper 2-type T-cell chemoattractant TARC by human bronchial epithelial cells in vitro and in human lung xenografts. Am J Respir Cell Mol Biol 24:382-389.

148.

Sekiya, T., M. Miyamasu, M. Imanishi, H. Yamada, T. Nakajima, M. Yamaguchi, T. Fujisawa, R. Pawankar, Y. Sano, K. Ohta, A. Ishii, Y. Morita, K. Yamamoto, K. Matsushima, O. Yoshie, and K. Hirai. 2000. Inducible expression of a Th2type CC chemokine thymus- and activation-regulated chemokine by human bronchial epithelial cells. J Immunol 165:2205-2213.

110

149.

Baggiolini, M., and M. P. Wymann. 1990. Turning on the respiratory burst. Trends Biochem Sci 15:69-72.

150.

Jarjour, N. N., and W. J. Calhoun. 1994. Enhanced production of oxygen radicals in asthma. J Lab Clin Med 123:131-136.

151.

Montuschi, P., M. Corradi, G. Ciabattoni, J. Nightingale, S. A. Kharitonov, and P. J. Barnes. 1999. Increased 8-isoprostane, a marker of oxidative stress, in exhaled condensate of asthma patients. Am J Respir Crit Care Med 160:216-220.

152.

Teramoto, S., C. Y. Shu, Y. Ouchi, and Y. Fukuchi. 1996. Increased spontaneous production and generation of superoxide anion by blood neutrophils in patients with asthma. J Asthma 33:149-155.

153.

Muijsers, R. B., G. Folkerts, P. A. Henricks, G. Sadeghi-Hashjin, and F. P. Nijkamp. 1997. Peroxynitrite: a two-faced metabolite of nitric oxide. Life Sci 60:1833-1845.

154.

Sadeghi-Hashjin, G., G. Folkerts, P. A. Henricks, A. K. Verheyen, H. J. van der Linde, I. van Ark, A. Coene, and F. P. Nijkamp. 1996. Peroxynitrite induces airway hyperresponsiveness in guinea pigs in vitro and in vivo. Am J Respir Crit Care Med 153:1697-1701.

155.

Duguet, A., H. Iijima, S. Y. Eum, Q. Hamid, and D. H. Eidelman. 2001. Eosinophil peroxidase mediates protein nitration in allergic airway inflammation in mice. Am J Respir Crit Care Med 164:1119-1126.

156.

Gutteridge, J. M. 1995. Lipid peroxidation and antioxidants as biomarkers of tissue damage. Clin Chem 41:1819-1828.

157.

Uchida, K., M. Shiraishi, Y. Naito, Y. Torii, Y. Nakamura, and T. Osawa. 1999. Activation of stress signaling pathways by the end product of lipid peroxidation. 4-hydroxy-2-nonenal is a potential inducer of intracellular peroxide production. J Biol Chem 274:2234-2242.

158.

Pratico, D., S. Basili, M. Vieri, C. Cordova, F. Violi, and G. A. Fitzgerald. 1998. Chronic obstructive pulmonary disease is associated with an increase in urinary levels of isoprostane F2alpha-III, an index of oxidant stress. Am J Respir Crit Care Med 158:1709-1714.

111

159.

Morrow, J. D., and L. J. Roberts. 1997. The isoprostanes: unique bioactive products of lipid peroxidation. Prog Lipid Res 36:1-21.

160.

Kinsella, B. T., D. J. O'Mahony, and G. A. Fitzgerald. 1997. The human thromboxane A2 receptor alpha isoform (TP alpha) functionally couples to the G proteins Gq and G11 in vivo and is activated by the isoprostane 8-epi prostaglandin F2 alpha. J Pharmacol Exp Ther 281:957-964.

161.

Leitinger, N., T. R. Tyner, L. Oslund, C. Rizza, G. Subbanagounder, H. Lee, P. T. Shih, N. Mackman, G. Tigyi, M. C. Territo, J. A. Berliner, and D. K. Vora. 1999. Structurally similar oxidized phospholipids differentially regulate endothelial binding of monocytes and neutrophils. Proc Natl Acad Sci U S A 96:1201012015.

162.

Poli, G., G. Leonarduzzi, F. Biasi, and E. Chiarpotto. 2004. Oxidative stress and cell signalling. Curr Med Chem 11:1163-1182.

163.

Kamata, H., S. Honda, S. Maeda, L. Chang, H. Hirata, and M. Karin. 2005. Reactive oxygen species promote TNFalpha-induced death and sustained JNK activation by inhibiting MAP kinase phosphatases. Cell 120:649-661.

164.

Ito, K., T. Hanazawa, K. Tomita, P. J. Barnes, and I. M. Adcock. 2004. Oxidative stress reduces histone deacetylase 2 activity and enhances IL-8 gene expression: role of tyrosine nitration. Biochem Biophys Res Commun 315:240-245.

165.

Ito, K., P. J. Barnes, and I. M. Adcock. 2000. Glucocorticoid receptor recruitment of histone deacetylase 2 inhibits interleukin-1beta-induced histone H4 acetylation on lysines 8 and 12. Mol Cell Biol 20:6891-6903.

166.

Li, X. Y., K. Donaldson, I. Rahman, and W. MacNee. 1994. An investigation of the role of glutathione in increased epithelial permeability induced by cigarette smoke in vivo and in vitro. Am J Respir Crit Care Med 149:1518-1525.

167.

Schwartz, J., and S. T. Weiss. 1994. Relationship between dietary vitamin C intake and pulmonary function in the First National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES I). Am J Clin Nutr 59:110-114.

168.

Mezzetti, A., D. Lapenna, S. D. Pierdomenico, A. M. Calafiore, F. Costantini, G. Riario-Sforza, T. Imbastaro, M. Neri, and F. Cuccurullo. 1995. Vitamins E, C and

112

lipid peroxidation in plasma and arterial tissue of smokers and non-smokers. Atherosclerosis 112:91-99. 169.

Fogarty, A., S. A. Lewis, S. L. Scrivener, M. Antoniak, S. Pacey, M. Pringle, and J. Britton. 2003. Oral magnesium and vitamin C supplements in asthma: a parallel group randomized placebo-controlled trial. Clin Exp Allergy 33:1355-1359.

170.

Pearson, P. J., S. A. Lewis, J. Britton, and A. Fogarty. 2004. Vitamin E supplements in asthma: a parallel group randomised placebo controlled trial. Thorax 59:652-656.

171.

Borok, Z., R. Buhl, G. J. Grimes, A. D. Bokser, R. C. Hubbard, K. J. Holroyd, J. H. Roum, D. B. Czerski, A. M. Cantin, and R. G. Crystal. 1991. Effect of glutathione aerosol on oxidant-antioxidant imbalance in idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet 338:215-216.

172.

Gillissen, A., J. H. Roum, R. F. Hoyt, and R. G. Crystal. 1993. Aerosolization of superoxide dismutase. Augmentation of respiratory epithelial lining fluid antioxidant screen by aerosolization of recombinant human Cu++/Zn++ superoxide dismutase. Chest 104:811-815.

173.

De Benedetto, F., A. Aceto, B. Dragani, A. Spacone, S. Formisano, R. Pela, C. F. Donner, and C. M. Sanguinetti. 2005. Long-term oral n-acetylcysteine reduces exhaled hydrogen peroxide in stable COPD. Pulm Pharmacol Ther 18:41-47.

174.

Hand, C. E., N. J. Taylor, and J. F. Honek. 2005. Ab initio studies of the properties of intracellular thiols ergothioneine and ovothiol. Bioorg Med Chem Lett 15:1357-1360.

175.

Rahman, I., P. S. Gilmour, L. A. Jimenez, S. K. Biswas, F. Antonicelli, and O. I. Aruoma. 2003. Ergothioneine inhibits oxidative stress- and TNF-alpha-induced NF-kappa B activation and interleukin-8 release in alveolar epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun 302:860-864.

176.

Moretti, M., P. Bottrighi, R. Dallari, R. Da Porto, A. Dolcetti, P. Grandi, G. Garuti, E. Guffanti, P. Roversi, M. De Gugliemo, and A. Potena. 2004. The effect of long-term treatment with erdosteine on chronic obstructive pulmonary disease: the EQUALIFE Study. Drugs Exp Clin Res 30:143-152.

113

177.

Subramanian, A., P. Tamayo, V. K. Mootha, S. Mukherjee, B. L. Ebert, M. A. Gillette, A. Paulovich, S. L. Pomeroy, T. R. Golub, E. S. Lander, and J. P. Mesirov. 2005. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 102:15545-15550.

178.

Fairbairn, S. M., C. P. Page, P. Lees, and F. M. Cunningham. 1993. Early neutrophil but not eosinophil or platelet recruitment to the lungs of allergic horses following antigen exposure. Clin Exp Allergy 23:821-828.

179.

Ohkawara, Y., X. F. Lei, M. R. Stampfli, J. S. Marshall, Z. Xing, and M. Jordana. 1997. Cytokine and eosinophil responses in the lung, peripheral blood, and bone marrow compartments in a murine model of allergen-induced airways inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol 16:510-520.

180.

Lewis, C. C., J. Y. Yang, X. Huang, S. K. Banerjee, M. R. Blackburn, P. Baluk, D. M. McDonald, T. S. Blackwell, V. Nagabhushanam, W. Peters, D. Voehringer, and D. J. Erle. 2008. Disease-specific gene expression profiling in multiple models of lung disease. Am J Respir Crit Care Med 177:376-387.

181.

Vigorito, E., K. L. Perks, C. Abreu-Goodger, S. Bunting, Z. Xiang, S. Kohlhaas, P. P. Das, E. A. Miska, A. Rodriguez, A. Bradley, K. G. Smith, C. Rada, A. J. Enright, K. M. Toellner, I. C. Maclennan, and M. Turner. 2007. microRNA-155 regulates the generation of immunoglobulin class-switched plasma cells. Immunity 27:847-859.

182.

Gabriely, G., T. Wurdinger, S. Kesari, C. C. Esau, J. Burchard, P. S. Linsley, and A. M. Krichevsky. 2008. MiR-21 Promotes Glioma Invasion by Targeting MMP Regulators. Mol Cell Biol.

183.

Lu, Z., M. Liu, V. Stribinskis, C. M. Klinge, K. S. Ramos, N. H. Colburn, and Y. Li. 2008. MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene. Oncogene 27:4373-4379.

184.

Nagel, R., C. le Sage, B. Diosdado, M. van der Waal, J. A. Vrielink, A. Bolijn, G. A. Meijer, and R. Agami. 2008. Regulation of the adenomatous polyposis coli gene by the miR-135 family in colorectal cancer. Cancer Res 68:5795-5802.

114

185.

Zhu, S., H. Wu, F. Wu, D. Nie, S. Sheng, and Y. Y. Mo. 2008. MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis. Cell Res 18:350-359.

186.

Mackness, M. I., S. Arrol, C. Abbott, and P. N. Durrington. 1993. Protection of low-density lipoprotein against oxidative modification by high-density lipoprotein associated paraoxonase. Atherosclerosis 104:129-135.

187.

Rozenberg, O., M. Shiner, M. Aviram, and T. Hayek. 2008. Paraoxonase 1 (PON1) attenuates diabetes development in mice through its antioxidative properties. Free Radic Biol Med 44:1951-1959.

188.

Mackness, B., R. Quarck, W. Verreth, M. Mackness, and P. Holvoet. 2006. Human paraoxonase-1 overexpression inhibits atherosclerosis in a mouse model of metabolic syndrome. Arterioscler Thromb Vasc Biol 26:1545-1550.

189.

Aviram, M., M. Rosenblat, S. Billecke, J. Erogul, R. Sorenson, C. L. Bisgaier, R. S. Newton, and B. La Du. 1999. Human serum paraoxonase (PON 1) is inactivated by oxidized low density lipoprotein and preserved by antioxidants. Free Radic Biol Med 26:892-904.

190.

Isik, A., S. S. Koca, B. Ustundag, H. Celik, and A. Yildirim. 2007. Paraoxonase and arylesterase levels in rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol 26:342-348.

191.

Tanimoto, N., Y. Kumon, T. Suehiro, S. Ohkubo, Y. Ikeda, K. Nishiya, and K. Hashimoto. 2003. Serum paraoxonase activity decreases in rheumatoid arthritis. Life Sci 72:2877-2885.

192.

Gur, M., M. Aslan, A. Yildiz, R. Demirbag, R. Yilmaz, S. Selek, O. Erel, and I. Ozdogru. 2006. Paraoxonase and arylesterase activities in coronary artery disease. Eur J Clin Invest 36:779-787.

193.

van den Berg, S. W., E. H. Jansen, M. Kruijshoop, P. K. Beekhof, E. Blaak, C. J. van der Kallen, M. M. van Greevenbroek, and E. J. Feskens. 2008. Paraoxonase 1 phenotype distribution and activity differs in subjects with newly diagnosed Type 2 diabetes (the CODAM Study). Diabet Med 25:186-193.

194.

Elkiran, E. T., N. Mar, B. Aygen, F. Gursu, A. Karaoglu, and S. Koca. 2007. Serum paraoxonase and arylesterase activities in patients with lung cancer in a Turkish population. BMC Cancer 7:48.

115

195.

Bhattacharyya, T., S. J. Nicholls, E. J. Topol, R. Zhang, X. Yang, D. Schmitt, X. Fu, M. Shao, D. M. Brennan, S. G. Ellis, M. L. Brennan, H. Allayee, A. J. Lusis, and S. L. Hazen. 2008. Relationship of paraoxonase 1 (PON1) gene polymorphisms and functional activity with systemic oxidative stress and cardiovascular risk. Jama 299:1265-1276.

196.

Flekac, M., J. Skrha, K. Zidkova, Z. Lacinova, and J. Hilgertova. 2007. Paraoxonase 1 gene polymorphisms and enzyme activities in diabetes mellitus. Physiol Res.

197.

San Millan, J. L., M. Corton, G. Villuendas, J. Sancho, B. Peral, and H. F. Escobar-Morreale. 2004. Association of the polycystic ovary syndrome with genomic variants related to insulin resistance, type 2 diabetes mellitus, and obesity. J Clin Endocrinol Metab 89:2640-2646.

198.

Humbert, R., D. A. Adler, C. M. Disteche, C. Hassett, C. J. Omiecinski, and C. E. Furlong. 1993. The molecular basis of the human serum paraoxonase activity polymorphism. Nat Genet 3:73-76.

199.

Brophy, V. H., M. D. Hastings, J. B. Clendenning, R. J. Richter, G. P. Jarvik, and C. E. Furlong. 2001. Polymorphisms in the human paraoxonase (PON1) promoter. Pharmacogenetics 11:77-84.

200.

Shaheen, S. O., J. A. Sterne, R. L. Thompson, C. E. Songhurst, B. M. Margetts, and P. G. Burney. 2001. Dietary antioxidants and asthma in adults: populationbased case-control study. Am J Respir Crit Care Med 164:1823-1828.

201.

Fuhrman, B., and M. Aviram. 2002. Preservation of paraoxonase activity by wine flavonoids: possible role in protection of LDL from lipid peroxidation. Ann N Y Acad Sci 957:321-324.

202.

Deakin, S., I. Leviev, S. Guernier, and R. W. James. 2003. Simvastatin modulates expression of the PON1 gene and increases serum paraoxonase: a role for sterol regulatory element-binding protein-2. Arterioscler Thromb Vasc Biol 23:20832089.

203.

Sparrow, C. P., C. A. Burton, M. Hernandez, S. Mundt, H. Hassing, S. Patel, R. Rosa, A. Hermanowski-Vosatka, P. R. Wang, D. Zhang, L. Peterson, P. A. Detmers, Y. S. Chao, and S. D. Wright. 2001. Simvastatin has anti-inflammatory

116

and antiatherosclerotic activities independent of plasma cholesterol lowering. Arterioscler Thromb Vasc Biol 21:115-121. 204.

McKay, A., B. P. Leung, I. B. McInnes, N. C. Thomson, and F. Y. Liew. 2004. A novel anti-inflammatory role of simvastatin in a murine model of allergic asthma. J Immunol 172:2903-2908.

205.

Kim, D. Y., S. Y. Ryu, J. E. Lim, Y. S. Lee, and J. Y. Ro. 2007. Antiinflammatory mechanism of simvastatin in mouse allergic asthma model. Eur J Pharmacol 557:76-86.

206.

Menzies, D., A. Nair, K. T. Meldrum, D. Fleming, M. Barnes, and B. J. Lipworth. 2007. Simvastatin does not exhibit therapeutic anti-inflammatory effects in asthma. J Allergy Clin Immunol 119:328-335.

207.

Howarth, P. H., K. S. Babu, H. S. Arshad, L. Lau, M. Buckley, W. McConnell, P. Beckett, M. Al Ali, A. Chauhan, S. J. Wilson, A. Reynolds, D. E. Davies, and S. T. Holgate. 2005. Tumour necrosis factor (TNFalpha) as a novel therapeutic target in symptomatic corticosteroid dependent asthma. Thorax 60:1012-1018.

208.

Nickel, R. G., V. Casolaro, U. Wahn, K. Beyer, K. C. Barnes, B. S. Plunkett, L. R. Freidhoff, C. Sengler, J. R. Plitt, R. P. Schleimer, L. Caraballo, R. P. Naidu, P. N. Levett, T. H. Beaty, and S. K. Huang. 2000. Atopic dermatitis is associated with a functional mutation in the promoter of the C-C chemokine RANTES. J Immunol 164:1612-1616.

209.

Gerard, H. C., Z. Wang, J. A. Whittum-Hudson, H. El-Gabalawy, R. GoldbachMansky, T. Bardin, H. R. Schumacher, and A. P. Hudson. 2002. Cytokine and chemokine mRNA produced in synovial tissue chronically infected with Chlamydia trachomatis and C. pneumoniae. J Rheumatol 29:1827-1835.

210.

Rudmann, D. G., M. W. Moore, J. S. Tepper, M. C. Aldrich, J. W. Pfeiffer, H. Hogenesch, and D. B. Tumas. 2000. Modulation of allergic inflammation in mice deficient in TNF receptors. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279:L1047-1057.

211.

Zuany-Amorim, C., C. Manlius, I. Dalum, M. R. Jensen, A. Gautam, G. Pay, S. Mouritsen, and C. Walker. 2004. Induction of TNF-alpha autoantibody production by AutoVac TNF106: a novel therapeutic approach for the treatment of allergic diseases. Int Arch Allergy Immunol 133:154-163.

117

212.

Kips, J. C., J. Tavernier, and R. A. Pauwels. 1992. Tumor necrosis factor causes bronchial hyperresponsiveness in rats. Am Rev Respir Dis 145:332-336.

213.

Thomas, P. S., D. H. Yates, and P. J. Barnes. 1995. Tumor necrosis factor-alpha increases airway responsiveness and sputum neutrophilia in normal human subjects. Am J Respir Crit Care Med 152:76-80.

214.

Thomas, P. S., and G. Heywood. 2002. Effects of inhaled tumour necrosis factor alpha in subjects with mild asthma. Thorax 57:774-778.

215.

Randolph, A. G., C. Lange, E. K. Silverman, R. Lazarus, and S. T. Weiss. 2005. Extended haplotype in the tumor necrosis factor gene cluster is associated with asthma and asthma-related phenotypes. Am J Respir Crit Care Med 172:687-692.

118

12. Az értekezés témájában megjelent közlemények

12.1. Külföldi, impakt faktorral rendelkező tudományos folyóiratokban megjelent publikációk 1. Tolgyesi, G., M. Keszei, I. Ungvari, A. Nagy, A. Falus, and C. Szalai. Involvement of TNFalpha -308A promóter polymorphism in the development of asthma in children infected with Chlamydophila pneumoniae. Pediatr Res. 2006 Nov ; 543-8. IF= 2,619 2. Ungvari, I., Tolgyesi G., A.F. Semsei, A. Nagy, K. Radosits, M. Keszei, G.T. Kozma, A. Falus, and C. Szalai, CCR5 Delta 32 mutation, Mycoplasma pneumoniae infection, and asthma. J Allergy Clin Immunol, 2007. 119(6): p. 1545-7. IF= 8,115 3. Szalai, C., I. Ungvari, L. Pelyhe, Tolgyesi G., and A. Falus, Asthma from a pharmacogenomic point of view. Br J Pharmacol, 2008. 153(8): p. 1602-14. IF=3,767 4. Nagy, A., M. Keszei, Z. Kis, I. Budai, Tolgyesi G., I. Ungvari, A. Falus, and C. Szalai, Chlamydophila pneumoniae infection status is dependent on the subtypes of asthma and allergy. Allergy Asthma Proc, 2007. 28(1): p. 58-63. IF= 0,970 5. Keszei, M., A. Nagy, G.T. Kozma, K. Radosits, Tolgyesi G., A. Falus, and C. Szalai, Pediatric asthmatic patients have low serum levels of monocyte chemoattractant protein-1. J Asthma, 2006. 43(5): p. 399-404. IF=1,476

13. Egyéb közlemények 1. Wiener, Z., B. Kohalmi, P. Pocza, J. Jeager, Tolgyesi G., S. Toth, E. Gorbe, Z. Papp, and A. Falus, TIM-3 is expressed in melanoma cells and is upregulated in

119

TGF-beta stimulated mast cells. J Invest Dermatol, 2007. 127(4): p. 906-14. IF= 4,829 2. Mamo, S., S. Bodo, J. Kobolak, Z. Polgar, Tolgyesi G., and A. Dinnyes, Gene expression profiles of vitrified in vivo derived 8-cell stage mouse embryos detected by high density oligonucleotide microarrays. Mol Reprod Dev, 2006. 73(11): p. 1380-92.

IF= 2,379

14. Hazai tudományos konferenciák 1. Tölgyesi Gergely, Ungvári Ildikó, Keszei Márton, Nagy Adrienne, Falus András, Szalai Csaba: A TNF-α -308A promóter polimorfizmus asthma kialakulásában betöltött szerepe Chlamydophila pneumoniae fertőzött gyermekekben (poszter). Semmelweis Egyetem PhD Napok, 2007. április.

120

15. Köszönetnyilvánítás Köszönetemet szeretném kifejezni a doktori munkám elkészítésével kapcsolatban: •

Dr. Szalai Csabának, témavezetőmnek, aki tanított, a munkámat végig figyelemmel követte, és segített az eredmények értékelésében és publikálásában;

•

Dr. Falus András Professzor Úrnak, aki lehetőséget biztosított a kutatási munkám elvégzésére, valamint lelkesedésével és támogatásával nagymértékben segítette munkámat;

•

Dr. Komlósi Zsoltnak, aki rengeteg szakmai segítséget nyújtott, elsősorban az allergiás asthma egér modellen elvégzett kutatási munkák során;

•

Dr. Losonczy György Professzor Úrnak, aki laboratóriumában lehetőséget adott az állatkísérletes munkák elvégzésére;

•

Dr. Gálffy Gabriellának, Dr. Kunos Lászlónak, Dr. Nagy Adriennek és Dr. Radosics Károlynak a humán asthmás klinikai minták rendelkezésémre bocsájtásáért;

•

Dr. Wiener Zoltánnak, aki rengeteg hasznos tanácsával és építő kritikájával sokat segített a kísérletek tervezésében és értékelésében;

•

Molnár

Viktor

és

Pócza

Péter

doktorandusz

társaimnak

a

szakmai

beszélgetésekért és szövettani, statisztikai valamint molekuláris technikákban való együttműködésért; •

Félné Semsei Ágnesnek, Ungvári Ildikónak és Kiszel Petrának a genotipizális munkák elvégzésében nyújtott segítségükért;

•

Farkasné Nagy Krisztina és Orbán Andrea asszisztenseknek a szövettenyésztési munkákban nyújtott segítségükért;

•

Rácz Melindának a microarray mérések során nyújtott segítségért;

•

Köszönettel tartozom továbbá a Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet összes dolgozójának, hogy barátsággal és szeretettel vettek körül.

Végül, de semmiképpen sem utolsó sorban külön köszönettel tartozom családomnak, hogy munkám elkészítése során mindvégig türelemmel és szeretettel támogattak. 121

122